LUẬN văn THẠC sĩ bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên thực nghiệm

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Panax L

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)

Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax L

1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L

Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ Thân rễ ngắn hoặc thon dài, phân nhánh Các loài khác nhau của chi Panax L có sự khác nhau về độ bền của rễ (rễ các loài P japonicus C A Mayer, P vietnamensis Ha &

Grushv., và P wangianus S C Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ

Lá kép chân vịt, mọc vòng từ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5 Bầu 2-3 có khi đến 5 ô Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41]

Trên thế giới, theo trang The plant list, đã có 261 loài đã được định danh Trong đó, có 13 tên khoa học đã được chấp thuận, 235 tên đồng nghĩa và 13 tên loài chưa xác định chính xác thông tin Có 2 loài phân bố ở Đông Bắc Mỹ Seemann 1868; Burkill 1902; Graham 1966; Proctor and Bailey

1987) Các loài khác phân bố ở châu Á (Burkill 1902; Hara 1970; Wen and Zimmer 1996) Ở châu Á, vùng Đông Nam Trung Quốc và phía Đông của dãy Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L (Burkill 1902; Hara 1970; Hu 1976; Wen and Zimmer 1996) [32]

1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L

Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L Ngoài ra, nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, các polysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben… cũng đã được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L

Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoid khung dammaran hoặc oleanan Các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau Dựa vào cấu trúc của các sapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khác nhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác Trong đó, sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổ biến nhất [49]

Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon

1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L

1.1.5.1 Nhâm sâm (Panax ginseng C.A Mey)

Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần và mệt mỏi Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác dụng khác nhau Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của hệ tim mạch, hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu [29]

1.1.5.2 Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen) (Sanchi ginseng )

Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau Dịch chiết saponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp và tăng hoạt động của tinh trùng [40]

Các nghiên cứu cho thấy Sâm Mỹ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, nhờ sự kích thích sản sinh tế bào lympho B, tăng (interleukin) IL-2, IL-10, interferon- γ và làm tăng tế bào diệt tự nhiên (NK) Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơ tim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim Tương tự như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tập tiểu cầu Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39]

1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm (Araliaceae) Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng Các nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế

Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem

Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

Về thành phần hóa học:

Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang a Sâm vũ diệp

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá Sâm vũ diệp ở Trung Quốc, trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [50] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được cấu trúc của 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũ diệp trong dịch chiết methanol Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là các bifinoside A—C và 7 hợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl ester [46]

Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β- D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid:

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và những nguyên tố vi lượng [5, 6] Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen được nhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6] b Tam thất hoang

Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [34]

Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48]

Tổng quan về gốc tự do

Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có một điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [31], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [4, 20] Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình [4]

Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử

Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do) [18] (Bảng 1.6)

Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47]

Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit [18]

Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [1,18] Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tím hiệu làm nhiệm vụ: [1]

• Điều hòa phân ly tế bào

• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm

• Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: [1]

1.2.3 Stress oxy hóa 1.2.3.1 Khái niệm

Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa sự sản xuất các gốc tự do và khả năng của cơ thể sống trong việc khử các chất trung gian hoạt tính cao hay sửa chữa các hư hại do những chất này gây ra Sự nhiễu loạn của trạng thái oxy hóa khử của các mô có thể gây ra các ảnh hưởng độc hại thông qua sự sản sinh của các peroxid và gốc tự do làm hư hại tất cả các thành phần của tế bào, trong đó bao gồm protein, chất béo và DNA [13]

1.2.3.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa

Stress oxy hóa là nguyên nhân quan trọng trong các bệnh gây thoái triển thần kinh, bao gồm bệnh xơ cứng teo cơ một bên (Amyotrophic Lateral Sclerosis - ALS) hay bệnh Lou Gehrig, bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer

[30] Sự sản xuất ROS, RNS liên quan đến con đường bệnh sinh của các bệnh này Sự tích lũy quá trình stress oxy hóa cùng với sự rối loạn quá trình hô hấp của ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson và các bệnh lý thần kinh khác [44]

Stress oxy hóa cũng được cho là có liên quan đến một số bệnh tim mạch, do sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein - LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và nhiều bệnh tim mạch khác [1] Đồng thời, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân gây đột quỵ, nhồi máu cơ tim, bệnh tiểu đường

Ngoài ra, stress oxy hóa cũng tham gia vào quá trình phát triển bệnh ung thư liên quan đến tuổi Các chất hoạt động ROS và RNS gây stress oxy hóa có thể phá hủy trực tiếp DNA, gây ra đột biến và có thể gây ngăn chặn quá trình phân ly tế bào; từ đó thúc đẩy quá trình phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào khối u [20] Nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sự sản xuất của ROS và RNS trong dạ dày của người, là nguyên nhân của sự phát triển ung thư dạ dày [23]

1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 1.2.4.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH

Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl;

DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất So với các phương pháp khác, phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp nhanh, đơn giản và ít tốn kém hơn

1.2.4.2 Phương pháp đánh giá sự khử màu của 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)

Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu

Phương pháp sử dụng quang phổ diod-array để đo sự mất màu khi thêm một chất chống oxy húa gốc cú màu xanh lam ABTSã + (2,2-azino-bis (3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) ABTSã + là một gốc tự do ổn định không tìm thấy trong cơ thể của người Chất chống oxy hóa sẽ làm chuyển ABTSã + thành ABTS và do đú làm mất màu [11]

1.2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl

Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan

Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh có ở tất cả các hạch thần kinh tự chủ và các cơ quan nội tạng được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ, ở các khớp nối thần kinh cơ và có ở nhiều các synap ở hệ thần kinh trung ương ACh là chất dẫn truyền thần kinh ở sợi tiền hạch của các tế bào thần kinh giao cảm và phó giao cảm, đồng thời chất dẫn truyền thần kinh ở tuyến thượng thận và ở các cơ quan được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ Tại hệ thần kinh trung ương, ACh được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào thần kinh liên lạc

ACh được tổng hợp từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym Cholin acetyltransferase, rồi bị đóng gói vào các túi màng bi ̣ ràng buô ̣c Sau sự xuất hiện của mô ̣t tín hiê ̣u thần kinh ở đầu tận cùng của mô ̣t sợi tru ̣c, các túi màng hợp nhất với màng tế bào sẽ giải phóng ra ACh vào khe synap Đối với các tín hiê ̣u thần kinh để được dẫn truyền đi tiếp tu ̣c thì ACh phải khuyếch tán sang một tế bào thần kinh hoă ̣c tế bào cơ bắp ở gần ngay đó, nơi nó sẽ ràng buộc và kích hoa ̣t mô ̣t protein thu ̣ thể Sau khi ACh được giải phóng, nó sẽ gắn vào các thụ thể của ACh (thụ thể Nicotinic và Muscarinic) [15]

Trong hệ thố ng thần kinh trung ương, ACh đóng vai trò quan tro ̣ng trong việc dẫn truyền các xung đô ̣ng thần kinh, đảm bảo cho các hoa ̣t đô ̣ng cao cấp củ a vỏ não như các quá trình nhâ ̣n thức, quá trình trí nhớ, chú ý…

Khi mức nồng độ ACh giảm xuống thấp, không đủ để gây khử cực, tín hiệu thần kinh sẽ không được truyền đi Vì vâ ̣y ACh có liên quan chă ̣t chẽ với bệnh Alzheimer

Enzym Acetylcholinesterase (AChE) hay acetylhydrolase, là cholinesterase chính trong cơ thể Nó là enzym xúc tác cho sự phân hủy của acetylcholin và của một vài ester cholin khác có chức năng là các chất dẫn truyền thần kinh AChE được tìm thấy chủ yếu ở các khớp nối thần kinh cơ và các khớp nối thần kinh của hệ cholinergic [15]

Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, mặc dù sự kết hợp ban đầu của enzym AChE diễn ra ở rìa ngoài, ở vùng ngoại biên Ở vị trí trên cùng của hẻm, nơi mà quá trình thủy phân xảy ra, có 4 vị trí hoạt động chính của enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl Các vị trí hoạt động được minh họa như trên hình 1.3 [24]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE [24]

1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến Bệnh Alzheimer liên quan đến việc mất các tế bào thần kinh cholinergic ở não và sự giảm nồng độ của ACh [1] Bệnh này thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi [3], tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1 trên 85 vào năm 2050 [3]

Các nhà khoa học đã đưa ra một số nguyên nhân để giải thích cơ chế bệnh Alzheimer Giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh bằng ACh (cholinergic) Trong đó, bệnh Alzheimer được cho là do giảm tổng hợp ACh Các chất ức chế Cholinesterase sẽ làm tăng chức năng của hệ cholinergic bởi nó ức chế enzym phân hủy ACh, do đó làm tăng nồng độ của ACh, kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não

Trong thực hành lâm sàng, các chất ức chế ChE vẫn là được sử dụng chính để điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer [20] Các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế AChE, giúp duy trì được nồng độ ACh bằng cách giảm tốc độ phân hủy ACh

Các loại thuốc hiện đang được các cơ quan quản lý: Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) chấp thuận để điều trị các biểu hiện về nhận thức của bệnh Alzheimer và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân gồm: donepezil, rivastigmine và galantamine là thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là một chất đối kháng thụ thể NMDA Tacrine là chất ức chế AChE đầu tiên được chấp thuận cho điều trị AD năm 1993, nhưng việc sử dụng nó đã bị bỏ vì có nhiều tác dụng phụ bao gồm gan nhiễm độc gan [15]

1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.3.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng Trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB)

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế enzym AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng

❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym

Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]

Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [9]

1.3.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Sâm vũ diệp cao giàu saponin Mẫu nghiên cứu thân rễ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3 -

2016 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu

Cao chiết Sâm vũ diệp giàu saponin được tiến hành tại khoa Y – Dược, ĐHQGHN, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Tam thất hoang cao giàu saponin Mẫu nghiên cứu toàn cây tươi Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) được thu hái ở Sa Pa, Lào Cai Mẫu được giám định tên khoa học Tam thất hoang - Panax stipuleanatus Tsai & Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu

Cao chiết Tam thất hoang phân đoạn giàu saponin được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang

Bột thô tam thất hoang

Cô dưới áp suất giảm

- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

- Sấy chân không tại 55-60 o C, 24 h Kiểm tra TLC Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở

Dung môi, hóa chất

• 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck), L-acid ascorbic (Merck)

• Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore); 5,5’-dithiobis- (2- nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ)

- Dung môi: MeOH (Merck), DMSO 100% (Merk), nước cất.

Máy móc, dụng cụ

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ

- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ)

Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin

❖ Nguyên tắc của phương pháp

DPPH có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm (hình 2.3) [42]

Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH

❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro

Tiến hành pha dung dịch DPPH, dung dịch mẫu thử, mẫu mẫu chứng ở nồng độ thí nghiệm

- Pha dung dịch DPPH: cân chính xác 24 mg DPPH, pha trong 100 ml methanol, thu được dung dịch có nồng độ 0,6 mM

- Pha dung dịch mẫu chứng: cân chính xác 9,3 mg vitamin C, pha trong 1 ml dung dịch DMSO 0,1% Từ dung dịch vitamin C có nồng độ 9,3 mg/ml pha loãng trong dung dịch methanol thành các nồng độ 1,86 mg/ml, 0,93 mg/ml, 0,46 mg/ml, 0,2325 mg/ml, 0,11625 mg/ml, 0,058125 mg/ml, 0,0290625 mg/ml

- Pha dung dịch mẫu thử: cân chính xác 124 mg Sâm vũ diệp cao giàu saponin trong 1 ml DMSO 0,1 % Từ dung dịch Tam thất hoang có nồng độ 124 mg/ml pha loãng trong dung dịch methanol thành các nồng độ: 49,6 mg/ml, 24,8 mg/ml, 12,4 mg/ml, 6,2 mg/ml

Dung dịch thử của Tam thất hoang tiến hành tương tự như trên

- Xác định dung dịch làm việc (mẫu chuẩn): hòa tan dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH để thu được dung dịch có độ hấp thụ quang trong khoảng 0,98 ± 0,02 tại bước sóng 517 nm

- Thờm 100 àl dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng ở cỏc nồng độ khác nhau vào 3 ml dung dịch làm việc đã tìm được ở trên Sau đó ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Đo độ hấp thụ quang dung dịch tại bước sóng 517 nm

- Sử dụng MeOH là mẫu trắng

Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần

Phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:

𝐴 𝑐 là độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn

𝐴 𝑠 là độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử/ chứng

2.4.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay

❖ Nguyên tắc của phương pháp:

Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’- dithiobis-2- nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio- 2- nitrobenzoic có màu vàng Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE Dựa vào xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của enzym AChE [31]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Tiến hành pha đệm Natri phosphat pH 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử và mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm

➢ Pha dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: hòa tan 31,2g Na𝐻 2 P𝑂 4 2𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch a)

➢ Pha dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: hòa tan 71,6 g

𝑁𝑎 2 HP𝑂 4 12𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch b)

➢ Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất, định mức trong bình định mức 1000ml

➢ Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M

➢ Pha enzym AChE: Cân chính xác 1mg bột AChE (mã số EC 3.1.1.7) tương ứng với 265 đơn vị (265 IU) pha trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl tạo thành dung dịch 5 IU/ml Từ dung dịch này pha loãng 10 lần thu được dung dịch enzym nồng độ 0,5 IU/ml sử dụng cho phương pháp đo quang

➢ Pha cơ chất: cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ATCI) pha trong 25ml nước cất thu được dung dịch nồng độ 20 mM Từ dung dịch này pha loãng 8 lần thành dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM

➢ Pha thuốc thử: Cân 0,1982g thuốc thử DTNB pha trong 25ml dung dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM

➢ Pha dung dịch mẫu chứng: Cân chính xác 10 mg berberin clorid hòa tan trong 10 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1mg/ml Từ dung dịch này pha loóng thành nồng độ 100 àg/ml, sau đú pha loóng tiếp thành cỏc nồng độ 20 àg/ml; 10 àg/ml; 5 àg/ml; 2 àg/ml; 0,1 àg/ml và 0,05 àg/ml để tiến hành thử

➢ Pha dung dịch mẫu thử:

Cân chính xác 100 mg Sâm vũ diệp cao giàu saponin, pha trong 10 ml dung dịch DMSO 0,1%, thu được dung dịch nồng độ 10 mg/ml Từ dung dịch này pha loóng thành cỏc nồng độ 4000 àg/ml, 2000 àg/ml, 1000 àg/ml, 500 àg/ml và 250 àg/ml để tiến hành thử

Dung dịch thử Tam thất hoang cao giàu saponin được tiến hành tương tự như trên

- Thờm lần lượt 700 àl dung dịch đệm phosphat 0,1 M, 100 àl dung dịch thử/ chuẩn và 100 àl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml Sau đú, trộn đều và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Thờm lần lượt 50 àl dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 àl dung dịch ACTI 2,5 mM vào hỗn hợp trên Sau đó, trộn đều và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 412 nm

- Mẫu chuẩn: được tiến hành như trên nhưng không cho dung dịch thử hoặc chứng

- Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat

Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần

Phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế (% I) được tính theo công thức:

%I: phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế

𝐴 𝑐 : độ hấp thu quang của mẫu chuẩn

𝐴 𝑠 : độ hấp thu quang của mẫu thử/ mẫu chứng

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Sai số giữa các lần đo của cùng một mẫu thử được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn (SD)

Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

𝑥 𝑖 là giá trị đo được lần thứ i 𝑥̅ là giá trị trung bình các lần đo n là số lần đo

Số liệu thực nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp thống kê thường dùng trong sinh học với sự trợ giúp của phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ).

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả thực nghiệm

Phương pháp quét gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa, với ưu điểm là đơn giản, tiết kiệm và được sử dụng phổ biến

Kết quả về khả năng chống oxy hóa in vitro của vitamin C, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 và hình 3.1, 3.2

Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C

Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số

Bảng 3.2 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin

Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin

Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa Sai số

Sâm vũ diệp cao giàu saponin Tam thất hoang cao giàu saponin

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của vitamin C

Bảng 3.4 Giá trị IC 50 chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong phương pháp DPPH

Sâm vũ diệp cao giàu saponin 18,000 Tam thất hoang cao giàu saponin 31,620

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy cao giàu saponin Sâm vũ diệp cho tác dụng chống oxy hóa tốt hơn Tam thất hoang trong phương pháp DPPH, với giá trị IC 50 lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml Tuy nhiên, giá trị IC 50 chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao hơn rất nhiều so với giá trị IC 50 của vitamin C (0,126 mg/ml)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.5, 3.6, 3.7 và hình 3.3

Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin

Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym

Giỏ trị IC 50 = 1,454 àg/ml

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin

Bảng 3.6 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin

Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym

Bảng 3.7 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin

Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym

Giỏ trị IC 50 của berberin là 1,454 àg/ml Tuy nhiờn, trong quỏ trỡnh thớ nghiệm, chúng tôi chưa tính được giá trị IC 50 của mẫu thử Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

% Hoạt tính enzym AChE bị ức chế của cả Sâm vũ diệp và Tam thất hoang không có sự khác nhau nhiều giữa các nồng độ thử Khi tăng nồng độ thử thì % hoạt tính enzym AChE bị ức chế của mẫu thử không tăng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bước đầu thí nghiệm cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE.

Bàn luận

Sâm vũ diệp và Tam thất hoang là 2 loài thuộc chi Panax L Các kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của 2 loài này là saponin với hàm lượng cao

Nhiều loài cây thuốc thuộc chi Panax L đã được khẳng định giá trị sử dụng như Panax ginseng C.A Meyer , Panax quinquefolius L., Panax notoginseng, Panax japonicus và Panax vietnamensis… Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài cây đều cho thấy thành phần hóa học chính là các saponin Đây cũng là thành phần chính cho tác dụng sinh học của các loài cây này [26] Trong đó có tác dụng chống oxy hóa

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các loài Panax ginseng C.A Meyer và Panax quinquefolius L Dịch chiết của Nhân sâm châu Á và Nhân sâm Bắc Mỹ đều có khả năng ngăn cản phản ứng mạnh của gốc tự do hydroxyl trong in vitro và cản trở quá trình lấy oxy trong quá trình oxy hóa nhũ tương acid linoleic có xúc tác của sắt [30,

51] Trong một thử nghiệm ex vivo, các ginsenosid Rb1 và Rg1 có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan và não chuột [16] Các ginsenosid Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Re, Rg1, Rg2 và Rh1 có tác dụng làm giảm mức độ superoxid trong hệ thống enzym xanthin oxidase [26] Gần đây, hỗn hợp saponin được phân lập từ lá và thân loài sâm Mỹ (Panax quinquefolius L.) được trồng tại Trung Quốc được báo cáo là có tác dụng ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) với sự có mặt của ion đồng [36] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, hoạt tính chống oxy hóa của các loài thuộc họ Nhâm sâm và một số loài thực vật khác liên quan đến quét các gốc tự do có thể liên quan đến thành phần ginsenoside Rb1/Rb2 trong chúng [26]

Năm 2001, Hu, C., & Kitts, D D đã tiến hành đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các loài thuộc chi Panax L với thành phần các ginsenosid chiếm tỷ lệ cao, sử dụng phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyd

Kết quả cho thấy ở mức liều 5 mg/ml, % chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ của P ginseng C.A Meyer và P quinquefolium L lần lượt là 64,7% ± 2,1 và 52,1% ± 1,5 [26]

Với thành phần tương tự như các loài khác trong chi Panax L., Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của 2 loài này được tiến hành sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH Đây là phương pháp phổ biến, nhanh và tiết kiệm hơn so với các phương pháp khác

Bước đầu nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin có tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp quét gốc tự do DPPH Tuy nhiên, khả năng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin thấp, thấp hơn nhiều lần so với khả năng chống oxy hóa của vitamin C

Giá trị IC 50 chống oxy hóa của vitamin C là 0,126 mg/ml Giá trị này khá gần so với giá trị IC 50 của vitamin C trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa khác cũng sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH với vitamin C là chất chứng Trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al (2014) đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết saponin từ Radix Trichosanthis, sử dụng phương pháp DPPH, giá trị IC 50 của vitamin C là 0,9908 ± 0,08 mg/ml

[23] Sự khác nhau nhỏ về giá trị IC 50 của vitamin C trong nghiên cứu được công bố này với giá trị thu được từ nghiên cứu tiến hành có thể do sự khác nhau về nguyên liệu vitamin C sử dụng làm mẫu chứng và điều kiện tiến hành thí nghiệm Trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al (2014), 1 ml mẫu thử ở điều kiện khác nhau được thêm vào 2 ml dung dịch DPPH (dung dịch DPPH pha bằng cách thêm 10 mg DPPH pha trong 1 ml MeOH), hỗn hợp sau đó được ủ trong 30 phút.[14]

Kết quả nghiên cứu tiến hành cho giá trị IC 50 chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml Kết quả thu được cho thấy tác dụng chống oxy hóa của cao giàu saponin của 2 loài này không cao So với nghiên cứu trước đó, năm

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Tam thất hoang thể hiện tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl diandehyd ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml [5] Kết quả này cho thấy cao saponin toàn phần của Tam thất hoang cho tác dụng chống oxy hóa trên in vivo cao Sự khác biệt về kết quả thu được giữa nghiên cứu được tiến hành và nghiên cứu của Trần Công Luận có thể do sự khác nhau về đối tượng nghiên cứu và phương pháp tiến hành Nghiên cứu của Trần Công Luận được thực hiện trên in vivo và đánh giá cao saponin toàn phần Trong cao saponin toàn phần, thành phần các hợp chất khác trong 2 loài có thể cao hơn trong cao giàu saponin sử dụng trong nghiên cứu này Điều này có thể ảnh hưởng đến kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa bởi các thành phần phenolic và các flavonoid (là những thành phần hiện diện trong các loài thuộc chi Panax L.) cũng cho tác dụng chống oxy hóa cao [26] Ở các nghiên cứu trên các loài khác không thuộc chi Panax L., thành phần saponin trong dịch chiết các loài thực vật khác nhau cũng được đánh giá cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh Nghiên cứu của Chen, Ying, et al

(2014) cho thấy dịch chiết saponin các phân đoạn của Radix Trichosanthis cho tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH Tổng hàm lượng saponin trong dịch chiết các phân đoạn n-butanol, EtOAc và hỗn hợp dịch chiết 2 phân đoạn n-butanol và EtOAc lần lượt là 1,824, 1,678 và 2,3998 mg

Giá trị IC 50 chống oxy hóa trong phương pháp DPPH của các phân đoạn này lần lượt là 2,9246 ± 0,15, 2,8428 ± 0,11 và 4,3972 ± 0,23 mg/ml Giá trị này cho thấy dịch chiết saponin các phân đoạn khác nhau của Radix Trichosanthis cho tác dụng chống oxy hóa mạnh [14] Trong nghiên cứu được tiến hành, mặc dù Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng có hàm lượng saponin cao, tuy nhiên chưa thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh trong phương pháp DPPH

Sự sai khác về kết quả thu được với các nghiên cứu trước đó có thể do sự khác nhau về điều kiện thí nghiệm như đã trình bày ở trên cũng như đối tượng nghiên cứu Trong các phân đoạn chiết khác nhau, hàm lượng các saponin là khác nhau Các saponin cấu trúc khác nhau cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa là khác nhau Đồng thời, các thành phần không phải là saponin cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa

Hơn nữa, theo nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết các loài thuộc chi Panax L liên quan đến cả các hợp chất phân cực và không phân cực trong dịch chiết [26] Khi đó, phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH cũng có những hạn chế nhất định Phương pháp đánh giá qua sự khử màu ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic acid) có thể áp dụng cho cả các chất chống oxy hóa thân nước và các chất chống oxy hóa thân dầu cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu [11,

26] Khi đó, kết quả về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết thực vật có thể sẽ cao hơn khi sử dụng phương pháp này

3.2.2 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang