Khóa luận nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƯỢC LÊ THỊ THANH HOA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN dP rm ac y, VN U Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học sở, thầy cô giáo khoa tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em thời gian qua, giúp em hồn thành chương trình học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Thị Thơm, PGS.TS Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ ngày đề tài, truyền cho em nhiều động lực kiến thức quý báu giúp em hoàn thành khoa luận cách tốt Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai an loài thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsaiet K.M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 ici ne tài trợ kinh phí giúp em hồn thành nội dung nghiên cứu Cảm ơn Khoa xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực thí nghiệm Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè, đặc biệt ed mẹ em quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hồn thành khóa luận fM Lần đầu viết khóa luận, cố gắng khó tránh sai sót lo Em mong nhận góp ý thầy để khóa luận hồn thiện Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Thanh Hoa Co py rig ht © Sc h oo Em xin chân thành cảm ơn! PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa AA ADP Acid arachidonic Adenosin diphosphat AMP ATP Adenosin monophosphat Adenosin triphotphat CADP Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) CEPI Collagen Epinephrin COX-1 CT Cyclooxygenase Thời gian lấp kín (Closure time) EtOH GP Alcol etylic Glycoprotein IC 50 Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration LC 50 50%) Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) MDA MPA Malondialdehyde Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet FPA aggregation) Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet fM ed ici ne an dP rm ac y, VN U Kí hiệu aggregation) Ngưng tập tiểu cầu Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP SVD Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) Sâm vũ diệp Sc h oo lo NTTC PPP TXA2 rig ht vWF AUC Tam thất hoang © TTH Von-Willerbrand Diện tích đường cong HMWK PDGF Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen) Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor) CTAP Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue py Co Thromboxan A2 activating peptid) PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Sâm vũ diệp Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Bảng 3.3 Sâm vũ diệp Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin dP rm ac y, VN U STT Sâm vũ diệp Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Bảng 3.5 Tam thất hoang Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Bảng 3.6 Tam thất hoang Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin an Bảng 3.4 27 27 29 30 30 Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici ne Tam thất hoang 26 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma DANH MỤC CÁC HÌNH Tên Hình Trang Sâm vũ diệp Hình 1.2 Hình 1.3 Tam thất hoang Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng Hình 1.4 Hình 1.5 Cấu trúc tiểu cầu Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu ADP 11 Hình 1.6 Quá trình ngưng tập tiểu cầu 12 Hình 1.7 Hình 2.1 Hình 2.2 Nguyên lí xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang 15 19 20 Hình 2.3 Hình 2.4 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu Đồ thị ngưng tập tiểu cầu in vitro với chất kết tập ADP 22 23 Hình 2.5 Chỉ số Slope 24 Hình 2.6 Hình 3.1 Chỉ số diện tích đường cong – AUC Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp 25 28 Hình 3.2 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Tam thất hoang 31 Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici an dP rm ac y, VN U Hình 1.1 ne STT PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ dP rm ac y, VN U CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp .3 1.1.1 Đặc điểm thực vật .3 1.1.2 Thực trạng phân bố 1.1.3 Công dụng tác dụng dược lý Sâm vũ diệp Tam thất hoang .4 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Sinh lý học tiểu cầu 1.2.1 Cấu trúc tiểu cầu an 1.2.2 Chức tiểu cầu ne 1.3 Các xét nghiệm đánh giá chức tiểu cầu 13 ici 1.3.1 Thời gian máu chảy 13 ed 1.3.2 Đo sức bền mao mạch .13 fM 1.3.3 Đếm số lượng tiểu cầu 14 1.3.4 Quan sát hình thái độ tập trung tiểu cầu tiêu nhuộm Giêmsa 14 lo 1.3.5 Co cục máu đông .14 oo 1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu 15 Sc h 1.3.7 Đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 1.4 Các thuốc kháng tiểu cầu 16 © CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 ht 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu .18 rig 2.2 Phương pháp nghiên cứu .21 Co py CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết 26 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp 26 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang .29 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 3.2 Bàn luận 32 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu 32 dP rm ac y, VN U 3.2.2 Kết nghiên cứu 33 3.2.4 Hạn chế nghiên cứu 35 Kết luận 36 Đề xuất 37 Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici ne an TÀI LIỆU THAM KHẢO PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, huyết khối ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao giới, nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu tim, đột quỵ thiếu máu dP rm ac y, VN U cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41] Những nghiên cứu gần cho thấy yếu tố có vai trị quan trọng bậc đối trình hình thành huyết khối tiểu cầu Sau kích hoạt, tiểu cầu thực q trình bám dính, thay đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục máu đơng, dẫn đến hình thành huyết khối [23] Trên lâm sàng, thuốc kháng tiểu cầu liệu pháp lý tưởng Một số thuốc kháng tiểu cầu có như: aspirin, clopidogrel, prasugrel, dipyridamol sử dụng rộng rãi dự phòng điều trị huyết khối, bên cạnh lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu số tác dụng phụ như: gây chảy máu, loét dày, giảm tiểu cầu Những hạn chế thúc an đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mạnh tác dụng phụ Bên cạnh thuốc tổng hợp, thuốc có nguồn gốc tự nhiên đối ne tượng quan tâm nghiên cứu [41] Việt Nam vùng đất nhiều lồi thảo dược q, có ici thuốc dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm loại nhân sâm, tam ed thất Tuy nhiên, thảo dược từ bao đời sử dụng trực tiếp fM chế biến thành nguyên liệu thô, chưa phát huy hết công dụng Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus lo H T Tsai et K M Feng) xác định lồi q có nguy tuyệt oo chủng cao Việt Nam Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp Tam thất hoang dùng làm thuốc bổ loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, © Sc h giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15] Một số loài thuộc chi Panax nghiên cứu đầy đủ dược lý, hóa học độc tính Tuy nhiên Việt Nam giới, số lượng nghiên cứu tác dụng sinh học thành phần hóa học hai lồi cịn hạn chế Các nghiên cứu thành phần hóa học rig ht cho thấy rễ, Sâm vũ diệp Tam thất hoang có chứa saponin (chất có khả chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36] Giai đoạn trước Co py đề tài, chứng minh Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ete mức liều 1-2-5 mg/mL Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng mức liều 1-2-5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma mg/mL, phân đoạn n-butanol mức liều mg/mL, phân đoạn n-hexan mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL [19] Saponin thành phần phân đoạn n-butanol, dP rm ac y, VN U nhiên butanol dung mơi hữu cơ, có nhiều độc tính nên sản xuất cơng nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất Để khắc phục hạn chế này, nhóm nghiên cứu PGS Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) Nguyễn Hữu Tùng (Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đưa quy trình chiết cao giàu saponin mà khơng dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang 20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp 14,44±0,14 % [8, 27] Liệu cao có cịn hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu khơng? Và tác dụng so với phân đoạn n-butanol nào? Để trả lời câu hỏi này, thực đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)”, với mục tiêu: an Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici ne diệp Tam thất hoang in vitro PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp 1.1.1 Đặc điểm thực vật dP rm ac y, VN U Sâm vũ diệp, gọi Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20] Sâm vũ diệp thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng năm để lại Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi vào mùa khơ Lá kép chân vịt, mọc vịng ba một, mang 3-7 chét mỏng, không lông, mép có đơi cạn hay sâu dạng thùy Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 thành tán đơn trục dài 15-20 cm thân, cuống hoa cỡ cm Qủa mọng, chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4] an Tam thất hoang gọi với tên khác Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất, Thổ tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H T Tsai et ne K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ ici mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm vết thân để lại, phân nhánh Mỗi khóm ed thường có thân mang Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, fM rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với lo năm đài nhỏ, cánh hoa, nhị bầu ô Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, chín màu đỏ Hạt 2, màu xám trắng [4, 25] Co py rig ht © Sc h oo Hai lồi Sâm vũ diệp Tam thất hoang có hình thái tương đối giống Điểm khác biệt Sâm vũ diệp có xẻ thùy, cịn Tam thất hoang khơng [20] Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 3.1.1.2 Ảnh hưởng cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Sâm vũ diệp N MPA (%) DMSO 0,1 % 100 Aspirin mg/mL 75,53±4,03 SVD 0,1 mg/mL 98,82±2,98 SVD 0,2 mg/mL 101,67±3,97 SVD 0,4 mg/mL 97,51±5,71 SVD 0,8 mg/mL 79,41±3,37 SVD 1,6 mg/mL 55,56±4,22 P so với lô dùng DMSO P so với lô dùng Aspirin dP rm ac y, VN U Thuốc dùng Lô 0,05 0,05 0,05 >0,05 0,05 0,05 an pANOVA 0,05 >0,05 TTH 0,2 mg/mL 232,71±30,07 >0,05 >0,05 TTH 0,4 mg/mL 204,70±19,81 >0,05 >0,05 TTH 0,8 mg/mL 149,89±15,46 0,05 TTH 1,6 mg/mL 67,84±15,38 0,05 © pANOVA