KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin sâm vũ diệp và tam thất hoang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƯỢC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học sở, thầy cô giáo khoa tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em thời gian qua, giúp em hồn thành chương trình học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Thị Thơm, PGS.TS Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ ngày đề tài, truyền cho em nhiều động lực kiến thức quý báu giúp em hoàn thành khoa luận cách tốt Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsaiet K.M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 tài trợ kinh phí giúp em hồn thành nội dung nghiên cứu Cảm ơn Khoa xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực thí nghiệm Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè, đặc biệt mẹ em quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hồn thành khóa luận Lần đầu viết khóa luận, cố gắng khó tránh sai sót Em mong nhận góp ý thầy để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu AA ADP AMP ATP CADP CEPI COX-1 CT EtOH GP IC 50 LC 50 MDA MPA FPA NTTC PPP PRP SVD TTH TXA2 vWF AUC HMWK PDGF CTAP Giải nghĩa Acid arachidonic Adenosin diphosphat Adenosin monophosphat Adenosin triphotphat Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) Collagen Epinephrin Cyclooxygenase Thời gian lấp kín (Closure time) Alcol etylic Glycoprotein Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) Malondialdehyde Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation) Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet aggregation) Ngưng tập tiểu cầu Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) Sâm vũ diệp Tam thất hoang Thromboxan A2 Von-Willerbrand Diện tích đường cong Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen) Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor) Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue activating peptid) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Tên Bảng Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Sâm vũ diệp Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Sâm vũ diệp Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin Sâm vũ diệp Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Tam thất hoang Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Tam thất hoang Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin Tam thất hoang Trang 26 27 27 29 30 30 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 3.1 Hình 3.2 Tên Hình Sâm vũ diệp Tam thất hoang Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng Cấu trúc tiểu cầu Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu ADP Quá trình ngưng tập tiểu cầu Nguyên lí xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu Đồ thị ngưng tập tiểu cầu in vitro với chất kết tập ADP Chỉ số Slope Chỉ số diện tích đường cong – AUC Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Tam thất hoang Trang 3 11 12 15 19 20 22 23 24 25 28 31 ỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thực trạng phân bố 1.1.3 Công dụng tác dụng dược lý Sâm vũ diệp Tam thất hoang 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Sinh lý học tiểu cầu 1.2.1 Cấu trúc tiểu cầu 1.2.2 Chức tiểu cầu 1.3 Các xét nghiệm đánh giá chức tiểu cầu 13 1.3.1 Thời gian máu chảy 13 1.3.2 Đo sức bền mao mạch 13 1.3.3 Đếm số lượng tiểu cầu 14 1.3.4.Quan sát hình thái độ tập trung tiểu cầu tiêu nhuộm Giêmsa .14 1.3.5 Co cục máu đông 14 1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu 15 1.3.7 Đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 1.4 Các thuốc kháng tiểu cầu 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết 26 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp 26 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang 29 3.2 Bàn luận 32 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu 32 3.2.2 Kết nghiên cứu 33 3.2.4 Hạn chế nghiên cứu 35 Kết luận 36 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, huyết khối ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao giới, nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu tim, đột quỵ thiếu máu cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41] Những nghiên cứu gần cho thấy yếu tố có vai trị quan trọng bậc đối q trình hình thành huyết khối tiểu cầu Sau kích hoạt, tiểu cầu thực q trình bám dính, thay đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục máu đông, dẫn đến hình thành huyết khối [23] Trên lâm sàng, thuốc kháng tiểu cầu liệu pháp lý tưởng Một số thuốc kháng tiểu cầu có như: aspirin, clopidogrel, prasugrel, dipyridamol sử dụng rộng rãi dự phòng điều trị huyết khối, bên cạnh lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu số tác dụng phụ như: gây chảy máu, loét dày, giảm tiểu cầu Những hạn chế thúc đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mạnh tác dụng phụ Bên cạnh thuốc tổng hợp, thuốc có nguồn gốc tự nhiên đối tượng quan tâm nghiên cứu [41] Việt Nam vùng đất nhiều loài thảo dược quý, có thuốc dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm loại nhân sâm, tam thất Tuy nhiên, thảo dược từ bao đời sử dụng trực tiếp chế biến thành nguyên liệu thô, chưa phát huy hết công dụng Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) xác định loài quý có nguy tuyệt chủng cao Việt Nam Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp Tam thất hoang dùng làm thuốc bổ loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15] Một số loài thuộc chi Panax nghiên cứu đầy đủ dược lý, hóa học độc tính Tuy nhiên Việt Nam giới, số lượng nghiên cứu tác dụng sinh học thành phần hóa học hai lồi cịn hạn chế Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy rễ, Sâm vũ diệp Tam thất hoang có chứa saponin (chất có khả chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36] Giai đoạn trước đề tài, chứng minh Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ete mức liều 1-2-5 mg/mL Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol mức liều mg/mL, phân đoạn n-hexan mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL [19] Saponin thành phần phân đoạn n-butanol, nhiên butanol dung môi hữu cơ, có nhiều độc tính nên sản xuất cơng nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất Để khắc phục hạn chế này, nhóm nghiên cứu PGS Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) Nguyễn Hữu Tùng (Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đưa quy trình chiết cao giàu saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang 20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp 14,44±0,14 % [8, 27] Liệu cao có cịn hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu không? Và tác dụng so với phân đoạn n-butanol nào? Để trả lời câu hỏi này, thực đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)”, với mục tiêu: Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp Tam thất hoang in vitro CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp 1.1.1 Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp, gọi Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20] Sâm vũ diệp thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng năm để lại Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi vào mùa khơ Lá kép chân vịt, mọc vịng ba một, mang 3-7 chét mỏng, khơng lơng, mép có đôi cạn hay sâu dạng thùy Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 thành tán đơn trục dài 15-20 cm thân, cuống hoa cỡ cm Qủa mọng, chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4] Tam thất hoang gọi với tên khác Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất, Thổ tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm vết thân để lại, phân nhánh Mỗi khóm thường có thân mang Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thn hay mác thn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với năm đài nhỏ, cánh hoa, nhị bầu Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, chín màu đỏ Hạt 2, màu xám trắng [4, 25] Hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang có hình thái tương đối giống Điểm khác biệt Sâm vũ diệp có xẻ thùy, cịn Tam thất hoang khơng [20] Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang Nhận xét: Tốc độ thay đổi ngưng tập phút cao giàu saponin Sâm vũ diệp tất mức liều khơng có khác biệt so với lô chứng DMSO (p>0,05) 3.1.1.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp and Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation MPA) Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation FPA) Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp (A: DMSO; B: Aspirin mg/mL; C: Sâm vũ diệp 0,1 mg/mL; D: Sâm vũ diệp 0,2 mg/mL; E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL) Nhận xét: Từ hình 3.1 cho thấy, cao giàu saponin Sâm vũ diệp mức liều 0,8 mg/mL có tác dụng làm giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối tương đương với Aspirin mg/mL, mức liều 1,6 mg/mL có tác dụng giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối mạnh chứng dương Aspirin mg/mL, lơ chứng âm DMSO khơng có tác dụng Tiểu cầu sau ngưng tập tối đa, có xu hướng phục hồi Có nghĩa sau kết tập thời gian (5 phút) Aspirin, phân đoạn cao giàu saponin Sâm vũ diệp có xu hướng phân rã ngưng tập, độ ngưng tập tiểu cầu tiếp tục giảm, thể xu hướng lên phía cuối đồ thị ngưng tập 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang 3.1.2.1 Ảnh hưởng cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC) Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Tam thất hoang Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô P so với lô dùng DMSO dùng Aspirin DMSO 0,1 % 255,05±20,90 >0,05 Aspirin mg/mL 222,78±14,39 >0,05 TTH 0,1 mg/mL 270,83±30,82 >0,05 >0,05 TTH 0,2 mg/mL 232,71±30,07 >0,05 >0,05 TTH 0,4 mg/mL 204,70±19,81 >0,05 >0,05 TTH 0,8 mg/mL 149,89±15,46 0,05 TTH 1,6 mg/mL 67,84±15,38