Khóa luận chiết xuất, phân lập stipuleanosid r2 từ sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC BÙI THỊ THANH VÂN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Ph arm ac y Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân ,V KHOA Y DƯỢC ed ici ne an d CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Co p yri gh t@ Sc ho ol of (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận này, bên cạnh tơi ,V ln có giúp đỡ vơ quý giá đến từ thầy cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội với bạn bè gia đình thân yêu tơi Thời điểm hồn Ph arm ac y thành khóa luận lúc dành lời tri ân chân thành đến người dạy, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn – TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy dành nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt ed ici ne an d tình dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận tơi hồn thiện Tơi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy anh Nguyễn Hoàng Việt – Đại học Dược Hà Nội; PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc giúp tơi có kết để tiếp bước thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược, đặc biệt mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều M kiện cho tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt of bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đồng hành suốt thời gian nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2019 Sinh viên Bùi Thị Thanh Vân Co p yri gh t@ Sc ho ol Cuối cùng, xin dành lời tri ân sâu sắc tới gia đình thân u tơi, ni nấng tạo động lực để tơi có kết ngày hôm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma MỤC LỤC NU LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ,V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Ph arm ac y ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Ứng dụng 1.1.3 Phân loại ed ici ne an d 1.1.4 Sự cần thiết việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu 1.1.5 Phương pháp thiết lập chất chuẩn 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.4 Công dụng M 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 of 1.2.1 Cơng thức hóa học đặc điểm 1.2.2 Tác dụng sinh học 10 Sc ho ol 1.2.3 Các nghiên cứu stipuleanosid R2 10 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 11 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 11 t@ 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 11 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 12 yri gh 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 Co p 2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế, xác định cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 13 2.3.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất 14 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU 2.3.3 Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 SVD HPLC 14 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16 ,V 3.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế Stipuleanosid R2 Sâm vũ diệp 16 Ph arm ac y 3.1.1 Chiết xuất 16 3.1.2 Phân lập 17 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết stipuleanosid R2 phân lập SKLM 18 3.2 Xây dựng liệu nhận dạng stipuleanosid R2 19 3.2.1 Đặc điểm cảm quan 19 3.2.2 Điểm chảy 19 ed ici ne an d 3.2.3 Kết đo phổ 19 3.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế HPLC 22 3.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 22 3.3.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập 23 3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập 24 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29 4.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 29 M 4.2 Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng 30 of 4.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập HPLC30 4.3.1 Xây dựng phương pháp 30 Sc ho ol 4.3.2 Phân tích định tính định lượng stipuleanosid R2 phân lập 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Co p yri gh t@ PHỤ LỤC PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma n-Butanol CCĐC Chất chuẩn đối chiếu EtOH Ethanol GC Sắc ký khí HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao MeOH Methanol MS Khối phổ NRM Phổ cổng hưởng từ proton LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng RDS Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng SVD Sâm vũ diệp UV Tử ngoại Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y ,V BuOH NU DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU So sánh loại chất chuẩn Bảng 3.1 Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp Bảng 3.2 Kết đo điểm chảy stipuleanosid R2 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H 13C-NMR, DEPT stipuleanosid R2 21 Bảng 3.4 Chương trình dung mơi 25 Bảng 3.5 Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết 26 Bảng 3.6 Kết định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 28 17 20 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y ,V Bảng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp Hình 1.3 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 ,V Hình 1.1 NU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 3.1 Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 Ph arm ac y Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào 11 Cai Hình 3.2 Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 18 19 ed ici ne an d Hình 3.3 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun TT H2SO4 20 10% /EtOH Hình 3.4 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 24 Hình 3.5 SKĐ HPLC stipuleanosid R2 phân lập (A), cao BuOH (B) 26 chất chuẩn đối chiếu (C) 27 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ĐẶT VẤN ĐỀ NU Đất nước Việt Nam ta ln tự hào thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho ,V nguồn dược liệu “giàu có” so với nước khu vực giới Thống kê Viện Dược liệu cho thấy, nước ghi nhận 5.117 loài thực Ph arm ac y vật nấm, 408 loài động vật 75 loại khống có cơng dụng làm thuốc, có nhiều lồi dược liệu q hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba kích, ngân đằng, thông đỏ… Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) dược liệu quý, phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác ed ici ne an d dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học, đặc biệt nói đến stipuleanosid R2 – saponin quan trọng có sâm vũ diệp Để nâng cao chất lượng nghiên cứu stipuleanosid R2 nói riêng hợp chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm sốt chất lượng dược liệu vô quan trọng M Song thực tế nước ta cịn gặp khó khăn việc phân tích, kiểm nghiệm thiếu chất chuẩn cần thiết Phần lớn chất chuẩn sử dụng phải nhập từ nước với giá cao thời gian đặt hàng kéo dài Nhằm khắc phục nhược điểm này, of với mục tiêu phát triển tiềm vị dược liệu quý sâm vũ diệp, - Sc ho ol tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu” Mục tiêu đề tài: Chiết xuất, phân lập tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết 95% từ dược liệu sâm vũ diệp Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập Kết đề tài góp phần xây dựng sở liệu thành phần hóa học, yri gh - t@ Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, liệu phổ xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm sở cho nghiên cứu hoạt tính Co p sinh học stipuleanosid R2, tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp điều trị PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG - TỔNG QUAN NU 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU ,V 1.1.1 Khái niệm Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference Ph arm ac y standards) chất cần thiết để đánh giá nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm… theo quy trình xác định nhằm đảm bảo kết phân tích đạt độ xác, đáng tin cậy [28] Chất chuẩn đối chiếu phần quan trọng đo lường thiết lập tính khả thi so sánh (comparability) truy nguyên (traceability)[6] Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu chất đồng xác định để dùng phép thử quy định hóa học, vật lý ed ici ne an d sinh học Trong phép thử tính chất chất đối chiếu so sánh với tính chất chất thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3] Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) lô hay mẻ hợp chất làm thuốc điều chế đặc biệt cách tổng hợp độc lập cách tinh chế bổ sung nguyên liệu điều chế chứng minh loạt thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nguyên liệu xác M thực có độ tinh khiết tối đa, đạt cách hợp lý Nó thường dùng of cho việc phân giải cấu trúc chất làm chuẩn cho chất chuẩn làm việc (working standards) [19] Sc ho ol 1.1.2 Ứng dụng Chất đối chiếu dùng phép thử sau: - Định tính phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại Định lượng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến, - quang phổ huỳnh quang Các phép thử định tính định lượng phương pháp sắc ký - t@ - - Các phép thử sinh học - Một số phép thử khác có hướng dẫn chun luận riêng [3] Ngồi chất đối chiếu cịn dùng để: - Thẩm định phương pháp Chuẩn hóa chất đối chiếu khác Co p yri gh Định lượng phương pháp vi sinh vật Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma phương pháp định lượng hợp chất saponin HPLC [26], tiến hành NU khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinity Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) Detector DAD phát bước sóng 203nm - Tốc độ dịng: 0,8mL/phút - Thể thích bơm mẫu: 20µl Nhiệt độ: 25oC - Dung môi pha mẫu: Methanol - Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient bảng 3.4 Ph arm ac y ,V - Bảng 3.4 Chương trình dung mơi (phút) 0-5 25-15 15-20 20-30 Acid acetic 0,5% (%) (%) 20 80 20→40 80→60 40 60 40→100 60→0 100 100→20 0→80 20 80 M 30-35 of 35-40 40-45 Acetonitril ed ici ne an d Thời gian Sc ho ol 3.3.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân xác khoảng 1,0 mg chất pha thành dung dịch tương ứng với nồng độ 1000 µg/mL methanol, sau siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm t@ Pha mẫu thử: dùng cân phân tích cân xác khoảng 100,0 mg cao nbutanol thân rễ SVD hòa tan methanol với nồng độ 100,0 mg/mL, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết lọc qua màng lọc 0,45 µm yri gh Pha mẫu chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 hòa tan methanol với nồng độ 400,0 Co p µg/mL, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập cao butanol so sánh với SKĐ thu mẫu chất chuẩn 23 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU ,V Ph arm ac y ed ici ne an d M Hình 3.5 SKĐ HPLC stipuleanosid R2 phân lập (A), cao BuOH (B)và chất chuẩn đối chiếu (C) Nhận xét: Kết phân tích HPLC minh họa cho thấy stipuleanosid R2 hợp chất of thiên nhiên có SVD với thơng số thời gian lưu dung dịch cao butanol Sc ho ol chuẩn bị thời điểm chạy sắc ký với điều kiện chiết xuất chuẩn thường quy 15,565 15.564 phút, giá trị tương đương với thời gian lưu chất chuẩn 15.565 phút 3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập t@ Yêu cầu: Hàm lượng khơng thấp 95,0% tính theo ngun trạng Tiến hành: Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân yri gh xác mẫu, mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hịa tan pha lỗng vừa đủ MeOH, sau siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm Co p Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 mL, hịa tan pha 24 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma loãng vừa đủ MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết lọc qua màng NU lọc 0,45 µm Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký nêu mục 3.3.1 Thu kết sắc ký trình bày bảng 3.6 Diện tích pic (mAU*s) Khối lượng (mg) Pic 9,45 1353,027 10,17 1428,131 9,34 1249,639 9,61 1397,682 10,28 10,74 1411,314 95,87 1483,772 96,25 1299,271 96,18 1444,782 96,74 1442,078 1499,042 96,20 1482,191 1542,503 96,09 Hàm lượng trung bình (%) RSD (%) Tổng pic ed ici ne an d Hàm lượng (%) Ph arm ac y Mẫu thử ,V Bảng 3.6 Kết định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 96,22  0,11 0,26 Nhận xét: Các mẫu thử có hàm lượng lớn 95,0% (tính theo nguyên trạng), Co p yri gh t@ Sc ho ol xác of M theo lý thuyết đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu, nhiên chưa thể kết luận cách chắn, cần phải tiến hành thêm phương pháp đặc hiệu 25 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN NU 4.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 4.1.1 Chiết xuất ,V Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD phương pháp chiết siêu âm sử dụng dung môi ethanol 70o, cất quay thu cắn toàn phần, phương pháp chiết siêu âm Ph arm ac y có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ áp suất chiết Từ cao chiết toàn phần phân đoạn phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat n-butanol thu cắn phân đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu Hợp chất stipuleanosid R2 chất saponin phân cực, việc chiết lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần nhằm ed ici ne an d mục đích loại bỏ thành phần không phân cực phân cực tan dung môi ether ethyl acetat, chuẩn bị cho bước phân lập tiến hành nhanh xác 4.1.2 Phân lập tinh chế Phân đoạn n-butanol thu với hàm lượng cao sử dụng để tiến hành phân lập stipuleanosid R2 sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ Kết hợp với SKLM để đánh giá M phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ mỏng có vết màu hồng tím rõ nét phù hợp so với đặc tính hợp chất cần phân lập Sau of chúng tơi tiến hành sắc ký cột pha đảo để tinh chế stipuleanosid R2 Sc ho ol dược liệu SVD thu 180 mg bột màu trắng Kiểm tra độ tinh khiết chất tinh chế phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế vết màu hồng sau chuyển sang màu tím, đặc trưng dẫn xuất triterpen Kết góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế có độ tinh khiết cao, ứng dụng phương pháp việc phân lập hợp chất stipuleanosid t@ R2 SVD dược liệu khác chứa thành phần Như trình bày phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược yri gh lý có ý nghĩa lâm sàng, sử dụng để điều trị nhiều bệnh có tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư Hiện tác dụng stipuleanosid R2 chưa dùng nhiều lâm sàng tương lai Co p stipuleanosid R2 nghiên cứu sử dụng rộng rãi người phâp lập tinh chế stipuleanosid R2 cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học 29 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế mà chúng tơi đưa NU ứng dụng ,V 4.2 Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng Việc xác minh lại cấu trúc stipuleanosid R2 tinh chế dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp phổ cộng hưởng Ph arm ac y từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) phân tích khối phổ (ESI-MS) khẳng định công thức phân tử cấu trúc stipuleanosid R2 tinh chế phù hợp với lý thuyết Đồng thời kết nhiệt độ nóng chảy đo chất phân lập góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế hợp chất stipuleanosid R2 HPLC 4.3.1 Xây dựng phương pháp ed ici ne an d 4.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập Chúng thực xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin HPLC phương pháp Dược điển nước cơng nhận đạt u cầu tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp M khối lượng phần lớn chuyên luận dược liệu Đây phương pháp có nhiều ưu điểm tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung of môi pha động đến tiến hành sắc ký Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ Phương pháp Sc ho ol đảm bảo độ độ đặc hiệu cao Tham khảo số tài liệu kết hợp với điều kiện có sẵn, chúng tơi lựa chọn chương trình sắc ký mơ tả mục 3.3.1 Với điều kiện sắc ký lựa chọn, chất nghiên cứu mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD chất phân lập tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp t@ để định lượng thành phần thân rễ SVD yri gh 4.3.2 Phân tích định tính định lượng stipuleanosid R2 tinh chế 4.3.2.1 Định tính Kết SKĐ chạy HPLC mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, Co p cao BuOH chất chuẩn đối chiếu cho pic thời gian lưu khoảng phút thứ 15 Theo tài liệu nghiên cứu nay, khẳng định thời gian lưu hợp chất stipuleanosid R2 4.3.2.2 Định lượng 30 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Bằng phương pháp HPLC với detector UV xây dựng để định tính, định NU lượng stipuleanosid R2 xác định giới hạn tạp chất liên quan stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tơi xác định xác hàm lượng stipuleanosid R2 ,V tinh chế 96,22  0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu Ph arm ac y Stipuleanosid R2 tinh chế xây dựng thành chất đối chiếu sử dụng phân tích, xây dựng tiêu chuẩn Với mục đích xa thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau xác định độ tinh khiết SKLM HPLC saponin phân lập được, thời gian có hạn, chúng tơi dừng lại việc chiết xuất, phân lập tinh chế Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 cần đánh giá thêm vài tiêu khác theo tiêu chí Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d DĐVN Dược điển quốc tế 31 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ,V NU KẾT LUẬN Với kết thực nghiệm thu đề tài đạt mục tiêu đề là: Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế Stipuleanosid R2 từ dược liệu Ph arm ac y sâm vũ diệp Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng liệu nhận dạng chất tinh chế Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 góp phần ý nghĩa vào sở liệu hóa thực vật tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD làm sở định hướng cho nghiên cứu ed ici ne an d hoạt tính sinh học đối tượng tiềm thuộc chi Panax Và thêm vào kết cịn có ý nghĩa thực tiễn cơng tác kiểm nghiệm thuốc nói chung kiểm nghiệm dược liệu nói riêng KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu tiếp theo, xin phép kiến nghị: M Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ sung chất chuẩn đối chiếu vào Dược điển Việt Nam xuất lần thứ of Tiến hành nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc Sc ho ol dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu sản Co p yri gh t@ phẩm từ dược liệu 32 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU TÀI LIỆU THAM KHẢO ,V A TIẾNG VIỆT: [1] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong Ph arm ac y cộng (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 711 - 714 [3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất y học, tr PL-113, phụ lục [4] Bộ Y tế, Vụ khoa học đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 79-82, 84-110 ed ici ne an d [5] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 263-266 [6] GS.TS.Nguyễn Minh Đức (2013), Tổng quan chất chuẩn, Đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh [7] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội of Quốc Gia Hà Nội M [8] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic saponin tổng số rễ sâm vũ diệp thu hái Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Sc ho ol [9] Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stipuleanosid R2 thân rễ Sâm vũ diệp, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội [10] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T sai et K M Feng) in vitro, Khoá luận tốt t@ nghiệp đại học, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội [11] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết nghiên yri gh cứu phân bố, sinh thái Sâm Vũ Diệp Tam thất hoang Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr 177-180 [12] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam”, Tạp chí Co p dược liệu, 10(3), tr 71-76 [13] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr 191-213 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma [14] Ngơ Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược NU thành phố Hồ Chí Minh, tr 109-114 [15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, ,V tr.17, 99-146, 173-222 [16] Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), “Triterpene thuộc chi phân loại học báo cáo, 13(2), 29-44 Ph arm ac y nhân sâm mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý”, Thực vật B TIẾNG ANH [17] Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp 1307-1330 [18] Satinder Ahuja, Elsevier Publiccations (2003), Hand Book of Isolation and ed ici ne an d Characterization of Impurities In Pharmaceuticals, p.119 [19] Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration Department of Health and Human Services (1987), Guideline for submitting supporting documentation in drug applications for the manufacture of drugs substances, p.29 [20] Choi K T (2008), "Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer", M ActaPharmacologica Sinica, 29(9), 1109 – 1118 [21] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anti- of cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Sc ho ol Scientific Reports, 25462 [22] Y Fan, D Y Guo, Q Song, and T Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", Zhong Yao Cai, 36(4), pp 604607 [23] Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a t@ complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp 1517-1575 [24] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et yri gh al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420 Co p [25] C Liang, Y Ding, H T Nguyen, J A Kim, H J Boo, H K Kang, et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett, 20(23), pp 7110-7115 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma [26] Liu F et al (2008), Method Development for Gypenosides Fingerprint by High NU Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection and the Addition of Internal Standard, pp 389-393 ,V [27] Y Satoh, S Sakai, M Katsumata, M Nagasao, M Miyakoshi, Y Ida, et al (1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata", Ph arm ac y Phytochemistry, 36(1), pp 147-152 [28] Schwarz M et al (2009), “Herbal Reference Standards”, Planta Med, 75, 689– 703 [29] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", Yao XueXue Bao, 32(9), pp 685-90 ed ici ne an d [30] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic Activity and Saponin Coposition of the Roots of Panax bipinnatifidus Seem Growing in Vietnam”, Pharmacognosy Research, 10(4), pp 333-338 [31] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599 [32] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), M "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", J of Ethnopharmacol, 152(3), pp 553-560 Sc ho ol [33] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva [34] World Health Organization (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, Genève, 3-24 t@ [35] Yuchi Zhang et al (2016), “Saponins from Panax bipinnatifidus Seem: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity yri gh based on mathematical calculations”, Journal of Chromatography B, 1039:7987 Co p C TRANG WEB [36] https://www.pharmacopoeia.com/ [37] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top [38] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU PHỤ LỤC Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu ,V Phụ lục 02 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y Phụ lục 03 Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y ,V NU Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y ,V NU Phụ lục 02 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph arm ac y ,V NU Phụ lục Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma NU ,V Ph arm ac y ed ici ne an d M of Sc ho ol t@ yri gh Co p PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... Thanh Vân ,V KHOA Y DƯỢC ed ici ne an d CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem. ) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... quý sâm vũ diệp, - Sc ho ol tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem. ) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu? ?? Mục... tài: Chiết xuất, phân lập tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết 95% từ dược liệu sâm vũ diệp Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập Kết đề tài góp phần xây dựng sở liệu