LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên sự biểu hiện COX 2, eNOS PHOSPHORYL hóa và một số cơ trơn cô lập

TỔNG QUAN

Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et K M

Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]

Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá

Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2]

Hình 1.1 Tam thất hoang ( Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) [11]

1.1.2 Sinh thái và phân bố

Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng Cây mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m Tái sinh bằng hạt Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9 Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]

Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được

11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15] Năm 2013, nhóm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45] Ngoài ra

3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P stipuleanatus [45]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trong TTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố vi lượng [5,6]

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –

11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người (HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giỏ trị IC 50 lần lượt là 4,44 và 0,63 àM trờn 2 dũng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]

Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC 50 từ 3,1 – 18,9 àM Cỏc chất 8, 10 và 11 ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]

Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD 50 = 8,8 g/kg [5]

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]

Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” TTH có tác dụng tán ứ, định thống Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati [2]

Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS

Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3]

Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch [1]

Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch Lớp nội mô thuộc biểu mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng Các tế bào nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1] Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (10 13 ) tế bào, bao phủ một diện tích khoảng 1 - 7 m 2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]

1.2.1.2 Chức năng của nội mạc mạch máu

Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi

[30] Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các mô xung quanh [27,30] Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65] Rối loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết

Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI 2 ), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A 2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố

Willebrand, thromboxan A 2 , NO, PGI 2 , TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:

VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38]

Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn và các hội chứng viêm [26,27]

Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự có mặt của nội mô nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tố giãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR) Năm

1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25] Ngày nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai trò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41] NO tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69]

Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30 Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của

NO có một electron chưa ghép cặp [25,60] NO có khả năng phản ứng với các nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó Mặt khác, NO tan kém trong nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trình sinh lý Tuy nhiên, chất này không bền có thời gian bán thải (T 1/2 ) ngắn và bị chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25]

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO 2 - NOS là enzym xúc tác cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O 2 [69] Ở động vật có vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1) Con đường thứ hai để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2 -

, phản ứng này được tạo điều kiện bởi enzym NO 2 - reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể Phản ứng khử NO 2 - đóng vai trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn

Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO 2 - và NO 3 - Quá trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác Một phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O 2 - ) để hình thành nên peroxynitrit (ONOO - ) [25,69]

Bảng 1.1 Các dạng của NOS [13,69]

Tên phổ biến nNOS (Neuronal NOS) iNOS (Inducible NOS) eNOS (Endothelial NOS)

Neuron thần kinh và một số tế bào khác

Nhiều loại tế bào hệ thống miễn dịch như đại thực bào khi đáp ứng với lipopolysaccharid (LPS), cytokin và các chất khác

Gen NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc

Chức năng và các quá trình sinh học Ở hệ thần kinh trung ương: có liên quan đến quá trình học tập và ghi nhớ; kiểm soát huyết áp trung ương Ở hệ thần kinh ngoại vi: Chất dẫn truyền thần kinh, giãn cơ trơn và mạch

Tham gia vào sinh lý bệnh của quá trình viêm và hệ thống miễn dịch

Tổng quan về viêm và COX-2

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương, hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4] Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau Quá trình này có sự tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin, prostaglandin, leucotrien Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3]

PG và thromboxan A 2 (TXA 2 ) được gọi chung là prostanoid, là các chất được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa được giải phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A 2 Acid arachidonic được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/H synthase để hình thành nên PGG 2 và sau đó là PGH 2 PGH 2 không bền bị chuyển hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7)

Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E 2 (PGE 2 ), prostacyclin (PGI 2 ), prostaglandin D 2 (PGD 2 ) và prostaglandin F 2α (PGF 2α ) [33,61] Trong đó, PGE 2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm Cụ thể, PGE 2 gây giãn mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien,PGE 2 làm tăng tính thấm của thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện Đau là kết quả PGE 2 làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau Cuối cùng, PGE 2 được xem như một chất trung gian gây sốt Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36]

Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX Enzym này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase –

2) COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận Ngược lại, COX-2 là một enzym cảm ứng, nó không biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây viêm và tham gia vào bệnh lý viêm Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu hiện nay [44]

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

(Thromboxan A 2 , PGD 2 , PGE 2 , PGI 2 , và PGF 2α được tạo ra bởi các enzym prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX Enzym này xúc tác cho hai bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36] Ở người, gen mã hóa cho COX-2 nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63] COX-2 là enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm Sự tăng biểu hiện của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mô hình viêm khớp ở động vật cũng như trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75]

1.3.2.1 COX-2 trong một số bệnh lý a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch gây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ Quá trình viêm xảy ra bên trong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35] Một số nghiên cứu cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa Trong mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào, bạch cầu mono, tế bào nội mô Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạch theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướng động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28]

Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 có thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54] Từ đó, có thể thấy được vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch Tuy nhiên, các chất ức chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35] b Sinh mạch và ung thư

Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy ra trong suốt quá trình phát triển của phôi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian gây viêm (như PGE 2 , CRP, IL-6, TNF α ) tăng trong ung thư [23,35] Sự tăng tổng hợp PGE 2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng không phải là COX-1 cũng đã được quan sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mô lành [48,71] Ngoài ra, cả hai loại NSAIDs tác dụng không chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mô hình động vật [50] Từ đó có thể gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35] c Suy thận

Các PG đặc biệt là PGE 2 và PGI 2 đóng vai trò quan trọng trong chức năng thận người trưởng thành PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ống thận; kiểm soát sự giải phóng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai Ở thận vai trò của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chức năng sinh lý và bệnh lý Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN

COX-2 và protein COX-2 cũng như hoạt tính của enzyme này tăng lên Sự tăng biểu hiện của COX-2 có liên quan đến sự sản xuất angiotensin II, tăng natri, tăng huyết áp cầu thận và viêm ống thận [62] Bên cạnh đó, các chất ức chế chọn lọc trên COX-2 cũng cho thấy tác dụng làm chậm sự xơ hóa cầu thận và protein niệu trên chuột bị cắt bỏ một phần thận gợi ý vai trò có lợi của các chất này trong suy thận [49]

1.3.2.2 Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2

Các thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drugs

- NSAIDs) được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng Tuy nhiên ngoài những tác dụng dược lý mà chúng mang lại như hạ sốt, giảm đau, chống viêm thì các NSAIDs cũng kèm theo nhiều tác dụng phụ đặc biệt là trên hệ tiêu hóa như viêm loét dạ dày tá tràng gây ra do sự ức chế không chọn lọc của chúng trên enzym COX-1 là enzym chịu trách nhiệm trong việc tạo ra các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường Chính vì vậy, xu hướng mới là tạo ra các NSAIDs có tác dụng chọn lọc trên enzym COX-2 để giảm các tác dụng phụ mà vẫn duy trì được tác dụng chống viêm của nó Một số thuốc tác dụng chọn lọc trên COX-2 hiện nay như rofecoxib, celecoxib, valdecoxib [10,36] Ngoài ra, các nghiên cứu về vai trò của COX-2 trong một số bệnh lý cũng tạo ra các hướng mới trong tác dụng có thể có khác của các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 như chống ung thư [48] Tuy nhiên, một trong những tác dụng phụ đáng chú ý nhất của các thuốc này là tăng nguy cơ trên các bệnh tim mạch Chính vì vậy, việc sử dụng các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 cũng cần đặc biệt thận trọng trên các bệnh nhân tim mạch [10]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dung môi, hóa chất và thiết bị

- Acetylcholin được mua từ Sigma-Aldrich và được pha với nước cất theo tỷ lệ 1:10 3 , 1:10 4 và 1:10 5

- Dung dịch nuôi Tyrode (Thành phần gồm: NaCl: 139,2 mM; KCl: 2,7 mM;

CaCl 2 : 1,8 mM; MgCl 2 : 0,49 mM; NaHCO 3 : 11,3 mM; Na 2 HPO 4 : 0,4 mM; glucose: 5,5 mM)

- Nghiên cứu biểu hiện của eNOS và COX-2: Bộ dụng cụ kiểm tra, chuẩn hóa chất, kháng thể, các dung môi được mua từ Promega, Sigma-Aldrich và Santa Cruz

- Hệ thống bình nuôi cô lập gồm 4 bình nuôi, với hệ thống ổn nhiệt và cung cấp oxy liên tục cho các bình nuôi

- Hệ thống ghi Powerlab 8.0 của công ty Austruments, Úc

- Máy đo mật độ quang Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific)

- Máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems)

- Máy chụp Western blot Odyssey Fc Imager (LI-COR Biosciences).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập được tiến hành tại Bộ môn Sinh lý học, Học viện Quân Y Quy trình thử thuốc như sau:

- Cơ trơn sau khi cô lập và được gắn vào bình nuôi, đặt một lực tác động cơ sở tương đương 2 g lên đoạn cơ trơn cô lập và chờ 30 phút để hoạt động của cơ trơn ổn định

- Nhỏ vào bình nuôi 0,15 ml dung dịch acetylcholin với nồng độ tăng dần từ 1:10 3 đến 1:10 5 Khi có sự thay đổi lực co cơ rõ ràng trên đồ thị, tiến hành chuyển sang thử tác dụng của dược liệu

- Nhỏ 0,15 ml dung dịch mỗi loại dịch chiết dược liệu vào bình nuôi cô lập từ nồng độ 0,5 mg/ml đến nồng độ 2 mg/ml Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử 4 phân đoạn dược liệu (Cao tổng, phân đoạn n-hexan, phân đoạn diclomethan và phân đoạn n-butanol) với 3 mức liều: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml Mỗi phân đoạn dược liệu được thử 2 lần

- Theo dõi sự giãn cơ trơn của cơ quan cô lập trên đồ thị và đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dược liệu tới sự giãn cơ trơn cô lập

2.3.2 Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa

 Phân tích RT – PCR cho mARN của COX-2

ARN toàn phần được phân lập từ tế bào bằng cách sử dụng bộ Kit miRNeasy Mini Kit (Qiagen, #217004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mức độ biểu hiện của mARN được phân tích bằng máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems) sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Xanh (Qiagen, # 204156) và các cặp mồi xét nghiệm từ Qiagen: cặp mồi Ptgs2 (COX-2, QT00165347) có trình tự mồi xuôi 5’-GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3’ và mồi ngược 5’- GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3’; cặp mồi Mm_GADPH (QT01658692) có trình tự mồi xuôi 5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′ và mồi ngược 5′- CTCCACGACGTACTCAGCG-3′

- Sau khi nuôi cấy, các tế bào được thu gom và rửa bằng PBS (Phosphate buffer saline, thành phần gồm NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 2 HPO 4 10 mM và KH 2 PO 4 1,8 mM)

- Ly giải tế bào bằng 100 àl dung dịch đệm gồm NaCl 120 mM, Tris 40 mM (pH 8), NP40 0,1% trong đá ở thời gian 30 phút

- Ly tâm tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 20 phút Phần dung dịch phía trên được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford

- Ủ phần dung dịch chứa protein ở 95 °C trong 5 phút và điện di trên gel SDS - polyacrylamid 10%

- Chuyển protein trong gel sang màng nitrocellulose

- Ủ với kháng thể đơn dòng sơ cấp chuột chống COX-2 cho nghiên cứu biểu hiện của COX-2 hoặc phosphoryl-eNOS cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và beta-actin Để phát hiện kháng thể sơ cấp, các màng được tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase (Beverly, MA)

Trong các phân tích Western blot, beta-actin được sử dụng như là protein chứng cho biểu hiện của các protein khác

- Cuối cùng, protein được phát hiện bằng cách sử dụng chất tăng cường hóa phát quang cho phát hiện các băng protein đích trên màng nitrocellulose (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)

 Đo quang sản phẩm NO

Lượng NO trong môi trường nuôi cấy tế bào được xác định gián tiếp thông qua ion NO 2 - (nitrit) bằng cách sử dụng thuốc thử Griess (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA) NO có thời gian bán hủy ngắn, trong cơ thể NO bị chuyển hóa thành NO 2 - và NO 3 - (nitrat) do vậy để phân tích chính xác lượng NO tổng số được tạo ra ta phải theo dõi cả nồng độ NO2 - và NO 3 - Thuốc thử Griess gồm sulfanilamid và N-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid (NED) Đầu tiên, sulfanilamid sẽ phản ứng với NO 2 - tạo thành muối diazoni Sau đó muối này sẽ phản ứng với NED để hình thành nên hợp chất azo màu hồng và có cực đại hấp thụ ở bước sóng 540 nm (Hình 2.4)

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO 2 -

Mụi trường tế bào HUVEC (100 àl) sau khi được ủ 24 giờ với 30 àg/ml dịch chiết dược liệu, được ủ tiếp với enzym nitrit reductase trong 1 giờ ở 37 ° C để khử

NO 3 - thành NO 2 - Thờm thuốc thử Griess 100 àl sau đú và mẫu được đem đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm

Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa

Y, Đại học Lund, Thụy Điển (Department of Experimental Medical Science, Faculty of Medicine, Lund University, Sweden)

- Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0 Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lô Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

- Hình ảnh điện di protein được xử lý bằng phần mềm Image J 1.49u để đưa ra dữ liệu định lượng cho kết quả protein trên bản điện di

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	2,16 MB