Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS PHOSPHORYL hóa và một số cơ trơn cô lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VN U KHOA Y DƢỢC dP rm ac y, HỒ THỊ THU HÀ an NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG ine (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) dic TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA Sc ho ol of Me VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP Co p yri gh t© KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, VN U KHOA Y DƢỢC dP rm HỒ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG an (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) ine TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL Me dic HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP t© Khóa Sc ho ol of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC : QH.2013.Y PGS TS DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG Co p yri gh Ngƣời hƣớng dẫn : TS VŨ THỊ THƠM Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN VN U Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược ac y, học sở tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập suốt năm qua rm Em xin bày tỏ tri ân lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm PGS TS Dƣơng Thị Ly Hƣơng, người ln tận tình hướng dẫn, tạo dP điều kiện giúp em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học sở giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận an Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp Me dic ine khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/1318 tài trợ kinh phí để em thực nội dung nghiên cứu Em xin cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y giúp đỡ em thực thí nghiệm of Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân ln quan tâm, động viên, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2018 Sinh viên Co p yri gh t© Sc ho ol Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hồ Thị Thu Hà DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Giải thích ACh Acetylcholin BH4 Tetrahydrobiopterin CaM Camodulin CD Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation) cGMP GMP vịng (Cyclic guanosine monophosphate) COX Cyclooxygenase COX-1 Cyclooxygenase-1 COX-2 Cyclooxygenase-2 eNOS Endothelial nitric oxide synthase FAD Flavin adenine dinucleotide FMN Flavin mononucleotide GTP Guanosine-5'-triphosphate HUVEC Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein endothelial cell) ac y, dP rm gh yri Co p NADPH an ine dic Me of ol ho Inducible nitric oxide synthase t© iNOS LPS Phân tử kết dính liên bào (Intercellular adhesion molecule 1) Sc ICAM - LD50 VN U Ký hiệu Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) Lipopolyshaccharide Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate nNOS Neuronal nitric oxide synthase NO Nitric oxide NOS Nitric oxide synthase Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti- NSAIDs inflammatory drugs) Nhiễm sắc thể PDGF Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth factor) PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandine E2 PGI2 Prostacyclin PS27 Cao giàu saponin Tam thất hoang PSBt Cao chiết dung môi n - butanol Tam thất hoang PSnH Cao chiết dung môi n - hexan Tam thất hoang PST Cao tổng chiết dung môi ethanol 70% Tam thất hoang ine an dP rm ac y, VN U NST reaction) dic PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain RT-PCR Serine sGC Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase) Thr Threonin TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M.Feng) Sc Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion molecule) Co p yri gh t© VCAM-1 ho ol of Me Ser DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang VN U STT Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch Hình 1.4 Cấu trúc eNOS Hình 1.5 Sự điều hịa vị trí phosphoryl hóa eNOS 11 Hình 1.6 12 Hình 1.7 Sự tổng hợp NO eNOS chức sinh lý NO nội mạc Sinh tổng hợp prostaglandin Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Tam thất hoang 18 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19 Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn trơn vào bình ni hệ thống ghi Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu thuốc thử Griess với NO2- Hình 3.1 Sự giãn trơn khí quản cao tổng Tam thất hoang Hình 3.2 Sự giãn trơn cổ bàng quang cao tổng Tam thất hoang Hình 3.3 Ảnh hưởng phân đoạn Tam thất hoang tổng hợp NO Ảnh hưởng phân đoạn Tam thất hoang biểu protein eNOS phosphoryl hóa Ảnh hưởng phân đoạn Tam thất hoang biểu mARN COX-2 26 Ảnh hưởng phân đoạn Tam thất hoang biểu protein COX-2 29 rm an ine dic Me of ol ho Sc t© gh Hình 3.4 dP Hình 1.2 ac y, Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) Cấu trúc hóa học chất 1–15 phân lập từ Panax stipuleanatus Hình 1.1 Co p yri Hình 3.5 Hình 3.6 15 20 23 25 25 27 28 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang VN U STT Các dạng NOS Bảng 3.1 Tác dụng phân đoạn Tam thất hoang trơn lập 24 Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine an dP rm ac y, Bảng 1.1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT VN U DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ac y, CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất hoang .2 rm 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Sinh thái phân bố dP 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng dược lý .4 an 1.1.5 Công dụng ine 1.2 Tổng quan nội mạc mạch máu eNOS dic 1.2.1 Nội mạc mạch máu 1.2.2 eNOS Me 1.3 Tổng quan viêm COX-2 14 of 1.3.1 Viêm prostaglandin viêm 14 ol 1.3.2 COX – 15 ho CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Sc 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 t© 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19 gh 2.2 Dung mơi, hóa chất thiết bị 20 yri 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 Co p 2.3.1 Nghiên cứu tác dụng trơn cô lập 21 2.3.2 Nghiên cứu biểu COX-2 eNOS phosphoryl hóa .22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết 24 3.1.1 Tác dụng trơn cô lập 24 3.1.2 Tác dụng biểu eNOS phosphoryl hóa 26 VN U 3.1.3 Tác dụng biểu COX-2 28 3.2 Thảo luận 30 ac y, 3.2.1 Tác dụng trơn cô lập 30 3.2.2 Tác dụng biểu eNOS phosphoryl hóa 31 rm 3.2.3 Tác dụng biểu COX-2 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine an dP TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ VN U Nội mạc mạch máu lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt lịng mạch [1] Các tế bào có khả sản xuất nitric oxid (NO), chất giãn mạch quan trọng có nhiều vai trò điều hòa chức sinh lý mạch máu trương lực mạch, kết tập tiểu cầu, sinh mạch, kết dính bạch cầu – nội mơ… ac y, Tại nội mạc mạch máu, NO tổng hợp nhờ enzym nitric oxide synthase nội rm mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase) Hoạt động enzym điều khiển nhiều chế có q trình phosphoryl hóa eNOS [41,69] Viêm nguyên nhân gây rối loạn chức nội mạc [67] Rối loạn chức nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS trình viêm an dP báo cáo nhiều bệnh lý tim mạch xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37] Trong năm gần đây, điều hòa eNOS thơng qua q trình phosphoryl hóa mục tiêu y học triển vọng điều trị nhiều bệnh lý [41] Me dic ine Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng ) thuộc chi Panax L., nước ta có vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9] Nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học cho thấy rễ Tam thất hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6] Đặc biệt, saponin loài thuộc chi Panax L chứng minh có tác dụng giãn trơn, tăng tổng hợp ho ol of NO, tăng biểu eNOS phosphoryl hóa [39,73] chống viêm [32,45,58] Tuy nhiên, đến nghiên cứu lồi cịn hạn chế Điều đặt câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có tác dụng kể hay khơng? Để làm sáng tỏ điều đó, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng Sc Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) biểu COX-2, eNOS phosphoryl hóa số trơn cô lập” với ba mục tiêu: t© Bước đầu đánh giá tác dụng phân đoạn Tam thất hoang trơn cô lập khí quản, bàng quang thể hang yri gh Đánh giá tác dụng phân đoạn Tam thất hoang biểu eNOS phosphoryl hóa tổng hợp NO Co p Đánh giá tác dụng phân đoạn Tam thất hoang biểu gen COX-2 protein COX-2 6,73 9,61 lần so với nhóm chứng Như kết Western blot tương đồng với kết định lượng sản phẩm NO VN U 3.1.3 Tác dụng gen COX-2 protein COX-2 Bên cạnh tác dụng co giãn mạch, hoạt tính chống viêm dịch chiết thử nghiệm tế bào đại thực bào COX-2 biết ac y, protein liên quan tới đáp ứng viêm tế bào Biểu mARN phản ánh gián tiếp biểu protein COX-2 Tế bào đại thực bào Raw 246.7 kích thích gây viêm LPS (Lipopolysaccharid) µg/ml ủ với dịch rm chiết phân đoạn TTH (nồng độ 30 µg/ml) 24 Kết phân tích Sc ho ol of Me dic ine an dP  Tác dụng biểu gen COX-2: mARN protein COX-2 trình bày hình 3.5 hình 3.6 gh t© Hình 3.5 Ảnh hƣởng phân đoạn Tam thất hoang biểu mARN COX-2 (Số liệu trình bày dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5); yri (*): p < 0,05 so với nhóm chứng; LPS: Lipopolysaccharide) Co p Nhận xét: Kết phân tích RT-PCR cho mARN COX-2 hình 3.5 cho thấy, tế bào RAW 246.7 sau kích thích gây viêm LPS biểu mARN COX-2 tăng lên so với nhóm chứng khơng bị kích thích (p < 0,05) Tất phân đoạn TTH (30 µg/ml) khơng làm giảm biểu gen COX-2 so với nhóm LPS (p > 0,05) 28 VN U  Tác dụng biểu protein COX-2: (B) Me dic ine an dP rm ac y, (A) ol of Hình 3.6 Ảnh hƣởng phân đoạn Tam thất hoang biểu protein COX-2 gh t© Sc ho Nhận xét: Phân tích Western blot cho protein COX-2 cho kết tương đồng với phân tích biểu mARN COX-2: nhóm tế bào ủ với LPS làm tăng biểu protein COX-2 so với nhóm chứng (băng đậm, rõ nét so với nhóm đối chứng) Các tế bào kích thích gây viêm LPS ủ với dịch chiết dược liệu, phân đoạn TTH không làm thay đổi nhiều biểu protein COX-2 so với nhóm LPS (kích thước độ đậm băng khơng thay đổi nhiều, Co p yri hình 3.6.A) Định lượng lại kết Western blot phần mềm Image J hình 3.6.B cho kết tương tự Phân đoạn n-hexan, phân đoạn tổng phân đoạn n-butanol có làm giảm biểu protein COX-2 mức độ giảm so với nhóm LPS Tuy nhiên, phân tích băng protein β-actin nhóm khơng đồng đều, băng khơng rõ nét; điều gây ảnh hưởng đến kết nghiên cứu 29 3.2 Thảo luận Chi Panax L chi thuốc quý với nhiều loài khẳng định giá trị VN U sử dụng Nhân sâm (Panax ginseng), Tây dương sâm (Panax quinquefolium), Tam thất (Panax notoginseng), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)… Nghiên cứu thành phần hóa học lồi saponin thành phần ac y, [76] Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng ) thuộc chi Panax L., thuốc có giá trị, nước ta có vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9] Nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học cho thấy rễ rm tam thất hoang có chứa saponin khung oleanan với hàm lượng cao số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [6] Tuy nhiên, đến dP nghiên cứu loài cịn hạn chế Mặt khác, saponin lồi thuộc chi Panax L chứng minh có tác dụng giãn trơn, tăng tổng hợp NO dic 3.2.1 Tác dụng trơn cô lập ine an [39,73] chống viêm [32,45,58] Chính vậy, chúng tơi chọn đối tượng nghiên cứu Tam thất hoang tiến hành đề tài với mong muốn làm rõ tác dụng tam thất hoang trơn cô lập biểu eNOS, COX-2 từ nâng cao giá trị sử dụng cho loài Me Theo kết bảng 3.1, phân đoạn tổng phân đoạn n-butanol TTH ho ol of gây giãn trơn khác đặc biệt rõ trơn khí quản trơn bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều Tác dụng giãn trơn bắt đầu xuất từ liều mg/ml giãn mạnh từ nồng độ mg/ml Các phân đoạn nhexan (PSnH) diclomethan (PS_DCM) tác dụng hệ trơn tất nồng độ gh t© Sc Nghiên cứu tác giả Lê Thị Tâm (2016) cho kết phân đoạn tổng phân đoạn n-butanol TTH cho tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [7] Mặc dù nghiên cứu đánh giá tác dụng khác cho thấy phân đoạn tổng phân đoạn n-butanol TTH phân đoạn có hoạt tính sinh học yri cao, chứa thành phần hóa học có tiềm Gợi ý nghiên cứu sâu phân đoạn Co p Liên quan đến tác dụng trơn, nghiên cứu mức liều 0,5 mg/ml, mg/ml mg/ml Đây mức liều nghiên cứu tác dụng chống đông chống kết tập tiểu cầu in vitro trước [7,11] Theo nghiên cứu Choi Y D (1998) dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc P.ginseng bắt đầu gây 30 giãn trơn thể hang thỏ kích thích gây co phenylephrin (5 x 10-6 M) liều mg/ml gây giãn cực đại liều 40 mg/ml, tác dụng phụ thuộc nồng độ VN U [20] Tương tự, theo Kim Sun Ouck (2008), dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc P.ginseng (chiết dung môi ethanol 50 %) bắt đầu gây giãn trơn âm đạo thỏ từ liều mg/ml gây giãn 85 % liều 20 mg/ ml (p < 0,05) [42] Nghiên ac y, cứu Wen Fei Chiou (2000) cho thấy ginsenosid tổng P ginseng (dịch chiết n-butanol) gây giãn thể hang thỏ kích thích gây co phenylephrin (3 x 10-6 M) theo phương thức phụ thuộc liều từ – 20 mg/ml với EC50 3,65 ± 0,27 rm mg/ml [18] Nghiên cứu tiến hành đối tượng trơn khác, yếu tố kích thích gây co dược liệu khác cho kết tương dP đồng với nghiên cứu Tuy nhiên, dừng lại bước đầu đánh giá định tính sơ tác dụng phân đoạn TTH với khoảng liều hẹp Me dic ine an Nghiên cứu Jang H A cộng (2012) cho kết saponin P.ginseng gây giãn trơn bàng quang niệu đạo đoạn tiền liệt in vitro in vivo [12] Theo nghiên cứu khác Tamaoki J cộng (2000) ginsenosid P.ginseng gây giãn trơn phế quản người theo phương thức phụ thuộc liều [39] Tác dụng gây giãn trơn saponin chứng minh qua nhiều nghiên cứu khác [18,73] Trong nghiên cứu chúng tơi, n-butanol dung mơi hịa tan tương đối chọn lọc saponin, phân đoạn n-butanol thể tác of dụng gây giãn trơn tốt phân đoạn n-hexan diclomethan Như vậy, saponin thành phần cho tác dụng gây giãn trơn TTH gh t© Sc ho ol Những kết nghiên cứu cho đánh giá sàng lọc ban đầu tác dụng TTH trơn Tác dụng giãn trơn TTH liên quan đến giải phóng NO Một số nghiên cứu chứng minh saponin số loài thuộc chi Panax L có tác dụng gây giãn trơn thơng qua chế tăng giải phóng NO [39,73] Do vậy, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết TTH biểu eNOS phosphoryl hóa tổng hợp NO, đồng thời để đánh giá vai trị saponin, ngồi phân đoạn chúng tơi yri tiến hành thêm với cao giàu saponin TTH Co p 3.2.2 Tác dụng biểu eNOS phosphoryl hóa Theo kết hình 3.3 3.4, phân đoạn tổng cao giàu saponin TTH có tác dụng tăng sản phẩm NO tăng biểu eNOS phosphoryl hóa so với nhóm chứng tế bào HUVEC nồng độ 30 µg/ml Trong đó, cao giàu saponin TTH thể tác dụng mạnh phân đoạn tổng TTH 31 Nghiên cứu biểu protein eNOS phosphoryl hóa tổng hợp NO cho kết tương đồng với Điều cho thấy vai trò quan trọng eNOS phosphoryl hóa điều hịa hoạt động eNOS tổng hợp NO VN U Theo Kim Young Mi cộng (2007) dịch chiết nước Hồng sâm Hàn Quốc (P ginseng) nồng độ 500 µg/ml có tác dụng tăng sản xuất NO so với nhóm ac y, chứng tế bào HUVEC (p < 0,01) sau ủ tăng eNOS phosphoryl hóa phụ thuộc thời gian [53] Theo nghiên cứu Ahn Hee Yoon (2013), nồng độ 150 µg/ml dịch chiết thô EtOH 70% dịch chiết giàu gingsenosid P.ginseng có tác rm dụng làm tăng NO dịch chiết giàu gingsenoside loại protopanaxatriol làm tăng biểu eNOS phosphoryl hóa TB HUVEC có ý nghĩa so với nhóm dP chứng (p 0,05), so với phân đoạn lại phân đoạn n-hexan phân đoạn diclomethan phân đoạn nbutanol lại cho tác dụng mạnh Theo Trần Công Luận (2009), phân đoạn chiết ethanol 70 % TTH có chứa nhóm hợp chất: saponin, polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic acid amin; hàm lượng saponin tổng 6,14 % [6] Điều đặt cho Co p yri gh chúng tơi giả thiết: 1) Đóng góp cho tác dụng TTH sản xuất NO biểu eNOS phosphoryl hóa có tham gia thành phần khác ngồi saponin; 2) Có thể hàm lượng saponin phân đoạn n-butanol thấp cao giàu saponin nên chưa đủ để gây tác dụng liều thử Đây vấn đề mà chưa giải thích nghiên cứu cần có thêm nghiên cứu khác để làm sáng tỏ 32 NO eNOS đóng vai trị quan trọng giãn trơn thành mạch Kết hợp với kết nghiên cứu trơn thấy chế gây giãn trơn VN U TTH có liên quan đến giải phóng NO hoạt hóa eNOS Nghiên cứu Tamaoki J cộng (2000) chứng minh tác dụng gây giãn trơn phế quản ginsenosid từ P ginseng thông qua chế tăng giải phóng NO [39] ac y, Theo Kim Sun Ouck cộng (2008), tác dụng giãn trơn âm đạo thỏ dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc thơng qua nhiều chế bao gồm qua trung gian NO [42] Những nghiên cứu củng cố thêm giả thiết mà đặt rm Trong nghiên cứu TTH thể tác dụng giãn trơn, tăng giải phóng NO biểu eNOS phosphoryl hóa Các nghiên cứu trước cho dP thấy TTH có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu, kéo dài thời gian đông máu in vitro gợi ý tiềm TTH điều trị bệnh tim mạch [7,11] an 3.2.3 Tác dụng biểu COX-2 dic ine Theo kết hình 3.5 3.6, tất phân đoạn TTH không ức chế biểu COX-2 tế bào đại thực bào Raw 246.7 kích thích gây viêm LPS liều 30 µg/ml Me Chống viêm tác dụng nghiên cứu phổ biến loài thuộc chi Panax L Theo Bak Min Ji cộng (2012), dầu P.ginseng chiết Sc ho ol of phương pháp CO2 siêu tới hạn mức liều 10 - 100 µg/ml làm ức chế biểu mARN protein COX-2 tế bào RAW 246.7 kích thích gây viêm LPS (p < 0,05) [57] Theo Seo Jin Joung cộng (2005), dịch chiết lên men giàu ginsenosid Rg3 Rh2 P.ginseng ức chế biểu protein COX-2 tế bào RAW 246.7 mức liều µg/ml; 10 µg/ml (p < 0,05) 50 µg/ml (p < 0,001) [40] gh t© Trên TTH, nghiên cứu Chun Liang cộng (2013), cho thấy chất araloside a methyl ester, 3-O-b-D-xylopyranosyl (12)-b-D-glucopyranosyl-28-Ob-D-glucopyranosyl oleanolic acid chikusetsusaponin IVa phân lập từ rễ TTH thu hái Việt Nam sử dụng dung môi chiết methanol (MeOH) ức chế biểu Co p yri COX-2 tế bào HepG2 (tế bào ung thư gan) kích thích TNF-α 10 ng/ml (Tumor necrosis factor alpha – yếu tố hoại tử mô alpha) tác dụng phụ thuộc nồng độ; nồng độ 10 µM giảm sử biểu mARN COX-2 30, 17 lần so với nhóm chứng [45] Nghiên cứu chúng tơi cho kết âm tính ức chế biểu COX-2 tất phân đoạn liều 30 µg/ml Sự khác kết Chun Liang cộng nghiên cứu chất tinh 33 khiết nghiên cứu dùng phân đoạn thô Hơn nữa, hai nghiên cứu sử dụng dòng tế bào khác (tế bào đại thực bào RAW 246.7 tế bào ung thư VN U gan HepG2) yếu tố kích thích gây viêm khác (LPS TNF) nên dẫn đến kết khác Hạn chế nghiên cứu ac y, Nghiên cứu chúng tơi cịn số hạn chế sau: rm  Nghiên cứu tác dụng gây giãn trơn phân đoạn Tam thất hoang cịn mang tính chất định tính với khoảng liều hẹp số lần lặp lại Chúng đánh giá trơn cô lập bàng quang, khí quản thể dP hang mà chưa đánh giá trơn thành mạch vị trí có liên quan đến NO nội mạc eNOS  Thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết chưa nghiên cứu Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine an đầy đủ gây khó khăn việc biện luận kết nghiên cứu 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Qua q trình nghiên cứu chúng tơi rút số kết luận sau: VN U Kết luận Phân đoạn tổng phân đoạn n-butanol Tam thất hoang gây giãn trơn rm ac y, khí quản, trơn bàng quang trơn thể hang chuột kích thích gây co acetylcholin theo phương thức phụ thuộc liều, tác dụng bắt đầu xuất từ liều mg/ml, giãn rõ liều mg/ml Phân đoạn tổng cao giàu saponin Tam thất hoang làm tăng sản phẩm NO tăng biểu eNOS phosphoryl hóa tế bào HUVEC dP mức liều 30 µg/ml an Ở liều 30 µg/ml, phân đoạn Tam thất hoang không ức chế biểu COX-2 tế bào đại thực bào Raw 246.7 kích thích gây viêm ine lipopolysaccharid µg/ml dic Đề xuất Me Qua q trình nghiên cứu chúng tơi đưa số đề xuất sau: Nghiên cứu tác dụng phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol cao giàu of saponin Tam thất hoang trơn thành mạch để xây dựng khoảng liều phụ thuộc đánh giá chế gây giãn trơn Co p yri gh t© Sc ho ol Nghiên cứu xác định thành phần chất có mặt phân đoạn phân đoạn n-butanol, phân đoạn tổng cao giàu saponin để đánh giá kết rõ ràng 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trịnh Bình (2013), Mơ - Phơi, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 101-111 [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 700 [3] Phạm Thị Minh Đức (2011), Sinh lý học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 173, 335-336 [4] Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh Miễn dịch - Phần rm ac y, VN U [1] Sinh lý bệnh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 113-125 Trần Công Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng dP [5] an dược lý loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 8(2), 93 - 94 [6] Trần Công Luận cộng (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học dic ine loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 1(14), 17-23 Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất Me [7] of hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) in vitro, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội Nguyễn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), 71-76 [9] Nguyễn Văn Tập cộng (2006), "Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp Tam thất hoang Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), 177-180 [10] Mai Tất Tố (2012), Dược lý học, Nhà xuất Y học, 264-274 ho Sc t© gh Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017), Nghiên cứu tác dụng chống đông máu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) in vitro, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội Co p yri [11] ol [8] TÀI LIỆU TIẾNG ANH [12] Jang H A, Cho S et al (2012), "The relaxant effect of ginseng saponin on VN U the bladder and prostatic urethra: an in vitro and in vivo study", Urol Int, 88(4), 463-469 [13] Wendy K A., Chris E C et al (2001), "Nitric oxide synthases: structure, ac y, function and inhibition", Biochemical journal, 357(Pt 3), 593–615 Garg U C., Hassid A (1989), "Nitric oxide-generating vasodilators and 8bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and rm [14] proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells", J Clin Invest, 83(5), 1774–1777 Liang C., Ding Y et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(23), 7110-7115 [16] Wann-Hansson C., Hallberg I R et al (2005), "Healthrelated quality of life after revascularization for peripheral arterial occlusive disease: long-term follow-up", J Adv Nurs, 51(3), 227-235 [17] Redmond E M., Cahill P A (2016), "Vascular endothelium - Gatekeeper of Me dic ine an dP [15] vessel health", Atherosclerosis, 248, 97-109 Wen Fei Chiou, Woan Ching Jan et al (2000), "Non major ginsenosides contribute to the relaxation of panax ginseng in rabbit corpus cavernosum ", J Chin Med, 11(4), 197-204 [19] Yang Chongren, Zhidong Jiang et al (1985), "Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 103108 [20] Choi Y D, Xin Z C et al (1998), "Effect of Korean red ginseng on the rabbit corpus cavernosal smooth muscle", Int J Impot Res, 10(1), 37-43 gh Funk C D (2001), "Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology", Science, 294(5548), 1871-1875 Co p yri [21] t© Sc ho ol of [18] [22] Rudic R D., Shesely E G et al (1998), "Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling", The Journal of Clinical Investigation, 101(4), 731-736 [23] Salvado M D., Alfranca A et al (2012), "Prostanoids in tumor angiogenesis: therapeutic intervention beyond COX-2", Trends Mol Med, 18(4), 233-243 Dinh Q N., Drummond G R et al (2014), "Roles of Inflammation, Oxidative Stress, and Vascular Dysfunction in Hypertension", Biomed Res Int [25] John Alexander Donald (2015), "Nitric Oxide", Handbook of Hormones, Elsevier, 603-e103A-604 [26] Dierk H E., Ernesto L S et al (2004), "Endothelial Dysfunction", J Am Soc rm ac y, VN U [24] Galley H F., Webster N R (2004), "Physiology of the endothelium", British journal of anaesthesia, 93(1), 105-113 dP [27] Nephrol, 15(8), 1983-1992 Linton M F., Fazio S (2004), "Cyclooxygenase-2 and inflammation in atherosclerosis", Curr Opin Pharmacol, 4(2), 116-123 [29] Mount P F., Kemp B E et al (2007), "Regulation of endothelial and myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation", Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 42(2), 271-279 [30] Michel Félétou (2011), "Multiple Functions of the Endothelial Cells", The Me dic ine an [28] of Endothelium - Part 1: Multiple Functions of the Endothelial Cells—Focus on Endothelium-Derived Vasoactive Mediators, Morgan & Claypool Life Sciences García-Carda G., Fan R et al (1998), "Dynamic activation of endothelial nitric oxide synthase by Hsp90", Nature, 392(6678), 821-824 [32] Li S H, Chu Y (1999), "Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax notoginseng", Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20(6), 551-554 [33] Aaron N Hata., Richard M Breyer (2004), "Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation and immune modulation", Pharmacology & Therapeutics, 103, 147-166 yri gh t© Sc ho ol [31] Co p [34] Fleming I., Busse R (2003), "Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase", American Journal of PhysiologyRegulatory, Integrative and Comparative Physiology, 284(1), R1-12 [35] Gomez I., Foudi N et al (2013), "The role of prostaglandin E2 in human vascular inflammation", Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 89(2-3), 55-63 Clària J (2003), "Cyclooxygenase-2 Biology", Current Pharmaceutical Design, 9(27), 2177-2190 [37] Davignon J, Ganz P (2004), "Role of Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis", Circulation, 109(23 Suppl 1), III27-32 [38] Herrmann J., Lerman A (2001), "The endothelium: dysfunction and beyond", J Nucl Cardiol, 8(2), 197-206 rm ac y, VN U [36] [39] Tamaoki J., Nakata J et al (2000), "Ginsenoside-induced relaxation of an dP human bronchial smooth muscle via release of nitric oxide", British Journal of Pharmacology, 130(8), 1859-1864 [40] Seo Jin Young, Lee Jun Ho et al (2005), "Effect of a fermented ginseng ine extract, BST204, on the expression of cyclooxygenase-2 in murine macrophages", International immunopharmacology, 5(5), 929-936 Kolluru G K., Siamwala J H et al (2010), "eNOS phosphorylation in health and disease", Biochimie, 92(9), 1186-1198 [42] Sun‐Ouck Kim, Kim Min Kyung et al (2008), "The effect of Korean red ginseng extract on the relaxation response in isolated rabbit vaginal tissue and its mechanism", The journal of sexual medicine, 5(9), 2079-2084 [43] Zou Kun Zhu Shu Katsuko Komatsu (2002), "Analysis of Saponins of Panax Stipuleanatus by Using HPLC andAPIMS/MS Techniques [J]", Journal of University of Hydraulic and Electric Engineering/yichang, [44] Chen L., Yang G et al (2013), "Prostanoids and inflammatory pain", Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 104, 58-66 ho Sc t© gh Chun L., D Yan et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of ginseng research, 37(1), 74 yri [45] ol of Me dic [41] Co p [46] Chun L., Yan Ding et al (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and Their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells", Korean Chemical Society, 32(9), 3513-3516 [47] Huang P L., Huang Z et al (1995), "Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase", Nature, 377(6546), 239-242 Kargman S L., et al (1995), "Expression of prostaglandin G/H synthase-1 and -2 protein in human colon cancer", Cancer Res, 55, 2556-2559 [49] Wang J L., Cheng H F VN U [48] et al (2000), "A selective cyclooxygenase-2 ac y, inhibitor decreases proteinuria and retards progressive renal injury in rats", Kidney Int, 57(6), 2334-2342 Fischer S M., Hawk E T et al (2011), "Coxibs and other nonsteroidal rm [50] Cancer Prev Res (Phila), 4(11), 1728-1735 antiinflammatory drugs in animal models of cancer chemoprevention", Hogan M., Cerami A et al (1992), "Advanced glycosylation endproducts block the antiproliferative effect of nitric oxide Role in the vascular and renal complications of diabetes mellitus", J Clin Invest, 199, 1110–1115 [52] Khazaei M., Moien-Afshari F et al (2008), "Vascular endothelial function in health and diseases", Pathophysiology, 15(1), 49-67 [53] Kim Y M., Namkoong S et al (2007), "Water Extract of Korean Red Ginseng Stimulates Angiogenesis by Activating the PI3K/Akt-Dependent Me dic ine an dP [51] of ERK1/2 and eNOS Pathways in Human Umbilical Vein Endothelial Cells", Biol Pharm Bull, 30(9), 1674-1679 Raval M., Frank P G et al (2010), "Celecoxib combined with atorvastatin prevents progression of atherosclerosis", J Surg Res, 163(2), e113-122 [55] Scherrer-Crosbie M., Ullrich R et al (2001), "Endothelial nitric oxide synthase limits left ventricular remodeling after myocardial infarction in mice", Circulation, 104(11), 1286-1291 [56] Zeiher A M., Fisslthaler B et al (1995), "Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein in cultured human gh t© Sc ho ol [54] yri endothelial cells", Circulation Research, 76(6), 980-986 Co p [57] Bak Min Ji, Hong Soon Gi et al (2012), "Red ginseng marc oil inhibits iNOS and COX-2 via NFκB and p38 pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages", Molecules, 17(12), 13769-13786 [58] Li Y N., Wu Y L et al (2008), "Interaction between COX-2 and iNOS aggravates vascular lesion and antagonistic effect of ginsenoside", J Ethnopharmacol, 119(2), 305-311 Feron O., Belhassen L et al (1996), "Endothelial nitric oxide synthase targeting to caveolae Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac VN U [59] ac y, myocytes and endothelial cells", Journal of Biological Chemistry, 271 22810–22814 [60] Jack R., Lancaster Jr (2015), "Nitric oxide: a brief overview of chemical rm and physical properties relevant to therapeutic applications", Future science OA, 1(1) Emanuela Ricciotti, A FitzGerald Garret (2011), "Prostaglandins and Inflammation", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31(5), 986–1000 [62] A Rios, Vargas-Robles H et al (2012), "Cyclooxygenase-2 and kidney an dP [61] ine failure", Prostaglandins Other Lipid Mediat, 98(3-4), 86-90 Bakhle Y S., Botting R M (1996), "Cyclooxygenase-2 and its regulation in inflammation", Mediators of Inflammation, 5(5), 305–323 [64] Dimmeler S., Zeiher A M (1996), "Nitric oxide an endothelial cell survival Me dic [63] factor", Cell Death Differ, 6(10), 964–968 Irie S., Tavassoli M (1991), "Transendothelial transport of macromolecules: The concept of tissue blood barriers", Cell Biol Rev, 25(4), 317–321 [66] Nadaud S., Bonnardeaux A et al (1994), "Gene structure, polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene", Biochemical and Biophysical research communications, 198(3), 1027-1033 [67] Curtis M Steyers, Francis J Miller (2014), "Endothelial Dysfunction in Chronic Inflammatory Diseases", Int J Mol Sci, 15(7), 11324–11349 ol ho Sc t© gh Alheid U., Frưlich J C et al (1987), "Endothelium-derived relaxing factor from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human platelets", Thrombosis Research, 47(5), 561-571 Co p yri [68] of [65] [69] Förstermann U., Sessa William C (2012), "Nitric oxide synthases: regulation and function", European Heart Journal, 33(7), 829–837 [70] Kenneth K W (2002), "Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity and Gene Expression", New York Academy of Sciences, 962(1), 122-130 Kutchera W et al (1996), "Prostaglandin H synthase is expressed abnormally in human colon cancer: evidence for a transcriptional effect", Proc Natl Acad Sci USA 93(10), 4816-4280 [72] Radomski M W., Palmer R M et al (1987), "The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide", Br J Pharmacol, 92(3), 639-646 [73] Chen X., Lee T J (1995), "Ginsenosides-induced nitric oxide-mediated rm ac y, VN U [71] relaxation of the rabbit corpus cavernosum", Br J Pharmacol, 115(1), 15-18 Ahn H Y, Hong S Y et al (2013), "Panax ginseng extract rich in ginsenoside protopanaxatriol offers combinatorial effects in nitric oxide production via multiple signaling pathways", Springerplus, 2(1), 96 [75] Kang R Y., Freire-Moar J et al (1996), "Expression of cyclooxygenase2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis", Br J Rheumatology, 35, 711-718 [76] Yang W Z., Hu Y et al (2014), "Saponins in the genus Panax L Me dic ine an dP [74] Co p yri gh t© Sc ho ol of (Araliaceae): A systematic Phytochemistry, 106, 7-24 review of their chemical diversity",