Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng dược lý của cao giàu saponin tam thất hoang (panax stipuleanatus h tsai et k m feng) theo định hướng chống huyết khối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRƢƠNG QUYẾT THẮNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CAO GIÀU SAPONIN TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) THEO ĐỊNH HƢỚNG CHỐNG HUYẾT KHỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRƢƠNG QUYẾT THẮNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CAO GIÀU SAPONIN TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) THEO ĐỊNH HƢỚNG CHỐNG HUYẾT KHỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : DƢỢC LÝ DƢỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ : 8720203 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG PGS.TS ĐÀO THỊ VUI HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Để thực đƣợc luận văn này, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy cơ, phịng ban môn Trƣờng Đại học dƣợc Hà Nội, Khoa Y Dƣợc Đại học quốc gia Hà Nội, trực tiếp, gián tiếp dìu dắt giảng dạy để em hồn thành khóa học suốt năm rƣỡi qua Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo PGS TS Dương Thị Ly Hương, PGS TS Đào Thị Vui TS Vũ Thị Thơm trực tiếp tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ em Nhờ bảo hƣớng dẫn quý suốt q trình triển khai, nghiên cứu hồn thành đề tài đƣợc giao cách tốt Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Cô giáo – Các nhà khoa học trực tiếp gián tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức khoa học chuyên ngành bổ ích cho thân em năm tháng qua Em xin gửi tới ban lãnh đạo Bệnh viện Bạch Mai, Khoa Y Dƣợc Đại học quốc gia Hà Nội lời cảm tạ sâu sắc tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực nghiệm thu đƣợc số liệu tài liệu nghiên cứu cần thiết liên quan tới đề tài tốt nghiệp cách dễ dàng thuận tiện Em xin đƣợc cảm ơn ghi nhận công sức đóng góp q báu nhiệt tình bạn sinh viên nhóm nghiên cứu: Nguyễn Thị Giang, Hồ Thị Thu Hà, Lê Thị Thanh Hoa, Lưu Thị Huyền Trang lớp Dƣợc K2 Nguyễn Thị Thu Giang Lớp Y6 Khoa Y Dƣợc Đại học quốc gia Hà Nội, đóng góp cơng sức, ý kiến giúp đỡ em triển khai, thực nghiệm, thu thập số liệu quý báu đề tài Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng trung cấp Y tế Vĩnh Phúc nơi em công tác quan tâm động viên khuyến khích cảm thơng sâu sắc gia đình để em hồn thành luận văn Em xin cảm ơn chƣơng trình thuộc đề tài Tây Bắc: mã số KHCNTB.07C/13-18 tài trợ kinh phí để em thực nội dung nghiên cứu Cuối cùng, em mong nhận đƣợc đóng góp, nhận xét phê bình q Thầy Cơ tất bạn đọc để đề tài đƣợc hoàn thành tốt MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lý huyết khối 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh hình thành huyết khối 1.1.3 Các biện pháp phòng điều trị huyết khối 12 1.2 Tổng quan Tam thất hoang 15 1.2.1 Đặc điểm thực vật 15 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học 16 1.2.3 Các nghiên cứu tác dụng sinh học 17 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1.Nguyên liệu đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin rễ Tam thất hoang 21 2.3.2 Đánh giá tác dụng thời gian đông máu in vitro cao giàu saponin Tam thất hoang 23 2.3.3 Đánh giá tác dụng chống ngƣng tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin Tam thất hoang 25 2.3.4 Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo mơ hình gây huyết khối chuột 27 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 30 3.2 Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 34 3.3 Đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 35 3.4 Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo cao giàu saponin từ rễ Tam thất hoang 36 Chƣơng BÀN LUẬN 44 4.1 Đối tƣợng nghiên cứu 44 4.2 Kết nghiên cứu 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC PHIẾU CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU Ký hiệu Giải nghĩa AA Acid arachidonic ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphat APTT Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa (Activated Partial Thromboplastin Time) ATP Adenosin triphosphat CADP Collagen Adenosin diphosphat (Collagen +ADP CEPI Collagen Epinephrine COX-1 Cyclooxygenase DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HK Huyết khối HP Heparin LD50 Liều gây chết 50% đối tƣợng thử (Lathal Dose 50%) MPA Độ ngƣng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation) NTTC Ngƣng tập tiểu cầu PPP Huyết tƣơng nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP Huyết tƣơng giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) PST Cao tổng cồn 70% Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Total) PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TXA2 Thromboxan A2 v/v Thể tích/Thể tích vWF Willerbrand DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng, biểu STT Trang Bảng 2.1 Liều cao giàu saponin cho chuột uống thực nghiệm 22 Bảng 3.1 Số chuột chết lô thực nghiệm sau 72 31 Bảng 3.2 Biểu chuột lô thực nghiệm 72 32 Bảng 3.3 Tác dụng cao chiết giàu saponin từ Tam thất hoang lên trình đông máu Bảng 3.4 Tác dụng ngƣng tập tiểu cầu in vitro cao chiết giàu saponin từ Tam thất hoang 35 35 Bảng 3.5 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột sau 24 giờ, 48 giờ, 72 36 Bảng 3.6 Mức độ huyết khối sau 24 gây k-carrageenan 37 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng đƣờng tiêm đến hình thành huyết khối 39 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nhúng đuôi chuột nƣớc đá 40 Bảng 3.9 Tác dụng aspirin lên hình thành huyết khối 41 Bảng 3.10 Kết hình thành huyết khối lô thực nghiệm 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Trang Hình 1.1 Cơ chế ngƣng tập tiểu cầu ADP Hình 1.2 Cơ chế ngƣng tập tiểu cầu acid arachidonic Hình 1.3 Sơ đồ trình đơng máu Hình 1.4 Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu 11 Hình 1.5 Cơ chế ngƣng tập tiểu cầu aspirin 14 Hình 1.6 Cây Tam thất hoang 15 Hình 2.1 Quy trình chiết suất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 18 Hình 3.1 Hình ảnh nội tạng chuột sau thực nghiệm bị chết đƣợc mổ để quan sát Hình 3.2 Một số hình ảnh huyết khối chuột Hình 3.3 Mức độ gây huyết khối đuôi chuột k-carrageenan mức liều khác sau 24 Hình 3.4 Ảnh hƣởng đƣờng tiêm thuốc đến hình thành huyết khối Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhúng đuôi chuột nƣớc đá đến hình thành huyết khối Hình 3.6 Tác dụng aspirin lên hình thành huyết khối chuột Hình 3.7 Tác dụng cao giàu saponin Tam thất hoang lên hình thành huyết khối chuột 30 37 38 39 40 41 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao giới nhóm bệnh huyết khối Huyết khối nguyên nhân hàng đầu gây nên tắc nghẽn mạch máu gây tử vong, để lại di chứng nặng nề cho bệnh nhân Song song với thuốc đƣợc khẳng định giá trị phòng điều trị huyết khối nhƣ aspirin, clopidogrel,… việc tìm kiếm thuốc có tác dụng chống đơng máu chống huyết khối vấn đề đáng quan tâm nhà khoa học Đặc biệt, với xu quay trở với giá trị thiên nhiên, việc tìm kiếm thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc đối tƣợng đƣợc lƣu tâm nghiên cứu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M.Feng) thuộc chi Panax - họ Ngũ gia bì (Araliacea) lồi sâm mọc tự nhiên nƣớc ta, chủ yếu đƣợc tìm thấy khu vực dãy núi Hoàng Liên Sơn, Lào Cai, mang đặc điểm thực vật chung chi Nhân sâm Hiện đƣợc nhân dân tỉnh miền núi trồng sử dụng thay cho loại sâm nhƣ sâm ngọc linh, nhân sâm, tam thất Theo kinh nghiệm dân gian, Tam thất hoang có tác dụng hoạt huyết, kháng viêm, giảm đau, cầm máu Tuy nhiên nghiên cứu tác dụng dƣợc lý lồi cịn hạn chế Năm 2017, nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Tuyết Trinh Lê Thị Tâm tác dụng chống đông máu, chống kết tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang khoa y dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội cho thấy, cao tổng, cao phân đoạn n-hexan, phân đoạn butanol rễ Tam thất hoang làm giảm ngƣng tập tiểu cầu đáng kể Phân đoạn butanol kéo dài thời gian đông máu APTT lên cách có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng (ở liều mg/mL mg/mL) [8], [17] Một số nghiên cứu trƣớc thành phần hóa học Tam thất hoang cho thấy rễ, loài có chứa saponin khung dammaran hàm lƣợng oleanan cao [24], [48], [59] Các loài khác thuộc chi Panax đƣợc tìm thấy thành phần hóa học saponin [57] Butanol dung mơi hữu cơ, có độ hịa tan vừa phải nƣớc nhiệt độ thƣờng dung môi để chiết saponin tốt Tuy nhiên, butanol có tính độc, nên để chiết saponin quy mô công nghiệp, tiến tới thƣơng mại hóa sản phẩm, cần suy nghĩ đến phƣơng pháp chiết hợp lý hơn, giữ đƣợc thành phần saponin mà không gây độc Kế thừa kết nghiên cứu tác dụng chống đông, chống ngƣng tập tiểu cầu cao tổng, cao phân đoạn tam thất hoang tác giả Nguyễn Thị Tuyết Trinh Lê Thị Tâm, nghiên cứu này, tiến hành đánh giá độc tính cấp đánh giá tác dụng dƣợc lý theo định hƣớng chống huyết khối cao giàu saponin tam thất hoang với mục tiêu sau: Đánh giá độc tính cấp cao giàu saponin rễ Tam thất hoang Đánh giá đƣợc tác dụng chống đông, chống kết tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin rễ Tam thất hoang Đánh giá tác dụng chống huyết khối in vivo cao giàu saponin rễ Tam thất hoang mơ hình gây huyết khối đuôi chuột cho thấy cao giàu sapponin có độ an tồn nhiều so với bột củ Tam thất hoang So sánh nghiên cứu cao giàu saponin từ Tam thất hoang với hai tác giả cho thấy có khác biệt LD50 với nghiên cứu hai tác giả Trần Công Luận (2002) Nguyễn Quang Tuyển (2017) Có thể cách chiết cao, cách thu hái nơi thu hái dƣợc liệu, nên cần điều tra thêm để khẳng định LD50 Tam thất hoang Đánh giá tác dụng chống đông máu: Để đánh giá đƣợc tác dụng chống đông máu invitro cao giàu saponin Tam thất hoang, dùng số PT (đặc trƣng cho đông máu ngoại sinh) APTT (đặc trƣng cho đơng máu nội sinh), đƣợc tính theo thời gian giây Tiến hành đo máy đông máu ACL TOP 700 Mỹ Nguyên lý đo máy dựa tƣợng tán xạ ánh sáng hình thành sợi fibrin để đo thời gian đông máu huyết Khi thực phép đo, đèn Led phát ánh sáng đơn sắc truyền tới cuvets phản ứng Tia tới vng góc với ánh sáng tán xạ đƣợc đầu dò quang học thu nhận Cuối cƣờng độ ánh sáng chuyển sang chế độ tín hiệu điện Ánh sáng tán xạ có cƣờng độ tăng lên theo chu trình đơng máu cục máu đơng đƣợc hình thành cƣờng độ ánh sáng tán xạ dừng lại Ta phát đƣợc thay đổi liên tục cƣờng độ ánh sáng máy Máy phân tích liệu đƣa kết [17], [28], [37] Dựa vào mơ hình Li C cộng năm 2013[47], lựa chọn Heparin làm chất chống đông máu để làm chứng dƣơng mơ hình Tác dụng chống đông máu Heparin tác động lên antithrombin III có huyết tƣơng làm hiệu lực thrombin hoạt hóa yếu tố đơng máu IXh ; Xh ; XIh ; XIIh [38] Hơn Heparin tác dụng chống đông máu đƣợc ngồi thể, nên phù hợp với mơ hình nghiên cứu Tuy nhiên, yếu tố đơng máu XII, XI, IX, X kích hoạt đƣờng đơng máu nội sinh nên kết thí nghiệm bảng 3.3 cho thấy Heparin kéo dài thời gian APTT (đặc trƣng cho đông máu nội sinh) mà không ảnh hƣởng đến PT (đặc trƣng cho đông máu ngoại sinh) 46 Các thuốc kháng vitamin K tác động lên yếu tố VIIh (là yếu tố tham gia vào đƣờng đông máu ngoại sinh) nên lâm sàng, thƣờng dùng số PT để đánh giá ảnh hƣởng thuốc Trong nghiên cứu này, sử dụng thuốc kháng Vitamin K làm thuốc chứng dƣơng đƣợc, thuốc kháng Vitamin K có tác dụng chống đơng máu thể, khơng có tác dụng đƣa máu ngồi thể (tác dụng in vitro) Theo mơ hình nghiên cứu Lau A J cộng (2009) sử dụng Heparin với nồng độ 0,033 – 0,176 UI/ml để chống đơng máu Vì mơ hình dùng Heparin 0,2UI/ml phù hợp với mơ hình nghiên cứu Từ kết nghiên cứu bảng 3.3 cho thấy Heparin 0,2UI/mL kéo dài thời gian APTT lên cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm DMSO (p