Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của tinh dầu cây ngũ sắc (ageratum conyzoides l ) thu hái ở một số địa phương

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây ngũ sắc như tác dụng hạ sốt, chống viêm, chống dị ứng… của dịch chiết cũng như nhiều công bố nói về

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

THU HÁI Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

THU HÁI Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

1 DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng

2 Ths Đào Anh Hoàng

Nơi thực hiện:

1 Khoa Bào chế-Chế biến – Viện Dược Liệu

2 Bộ môn Dược Liệu

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự

giúp đỡ đáng quý của thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths Đào Anh Hoàng – Khoa

Bào chế-Chế biến – Viện Dược Liệu và DS NCS Nguyễn Thanh Tùng – Bộ môn

Dược liệu là hai người thầy, người anh đã luôn nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo

mọi điều kiện cho em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm là người

đã hết lòng giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành

khóa luận này

Em xin cảm ơn TS Trần Huy Hoàng - Khoa Vi khuẩn - Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà

Nội và các anh chị trong khoa Bào Chế – Chế biến – Viện Dược liệu đã nhiệt tình

giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Cuối cùng, em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè là những người luôn động

viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống

Mặc dù bản thân em đã có nhiều cố gắng tuy nhiên do thời gian thực hiện có

hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự

đóng góp từ phía thầy cô và các bạn

Sinh viên

Lê Thị Giang

MỤC LỤC

Trang bìa chính

Trang bìa phụ

Lời cảm ơn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Cỏ hôi (Ageratum L.) 3

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.2 Tổng quan về loài ngũ sắc Ageratum conyzoides L 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 4

1.2.2 Một số loài cùng tên hoặc dễ nhầm lẫn 5

1.2.3 Thành phần hóa học chung của loài Ageratum conyzoides L 5

1.2.4 Một số nhóm hoạt chất chính trong cây Ageratum conyzoides L 7

1.2.4.1 Alcaloid 7

1.2.4.2 Flavonoid 7

1.2.4.3 Triterpene và Steroid 7

1.2.4.4 Tinh dầu 8

1.2.4.5 Các hợp chất khác 13

1.2.5 Tác dụng dược lý của loài Ageratum conyzoides L 13

1.2.5.1 Tác dụng của dịch chiết thô 13

1.2.5.2 Tác dụng dược lý của tinh dầu 15

1.2.6 Công dụng của loài Ageratum conyzoides L 18

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3.1 Định lượng tinh dầu 22

2.3.2 Phân tích thành phần và so sánh các mẫu tinh dầu 23

2.3.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC/MS 23

2.3.2.2 So sánh các mẫu tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng 23

2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 23

2.3.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán 23

2.3.3.2 Thử nghiệm chống nhiễm khuẩn trên bề mặt thạch 24

CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Thực nghiệm và kết quả 25

3.1.1 Định lượng tinh dầu 25

3.1.2 Phân tích thành phần và so sánh các mẫu tinh dầu 28

3.1.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC/MS 28

3.1.2.2 So sánh các mẫu tinh dầu bằng SKLM 32

3.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu A conyzoides L trên S aureus và E coli 36

3.1.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán 36

3.1.3.2 Thử nghiệm chống nhiễm khuẩn trên bề mặt thạch 38

3.2 Bàn luận 40

3.2.1 Về định lượng tinh dầu 40

3.2.2 Về phân tích thành phần hóa học 40

3.2.3 Về thử tác dụng kháng khuẩn 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 Kết luận 43

4.1.1 Về định lượng tinh dầu 43

4.1.2 Về phân tích thành phần hóa học tinh dầu 43

4.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 44

4.2 Kiến nghị 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

D



Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

LD50 Liều gây chết 50% số cá thể nghiên cứu

s Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

Bảng 1.3 Các amino acid có trong rễ, thân, lá và hoa A conyzoides L 7

Bảng 1.4 So sánh thành phần của tinh dầu A conyzoides L thu hái ở một

số nơi

12

Bảng 1.5 Tác dụng của tinh dầu A conyzoides L trên S aureus và E coli 16

Bảng 1.6 Tác dụng của tinh dầu A conyzoides L trên A flavus 16

Bảng 1.7 IC50 của một số tinh dầu trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt 17

Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định 21

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu Ageratum conyzoides L thu hái ở một số

địa phương

24, 25

Bảng 3.2 Thành phần hóa học 2 phần nặng và nhẹ của mẫu HY-11-H 29

Bảng 3.3 Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu Ageratum

conyzoides L

31

Bảng 3.4 Rf của các vết chính trên sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử

Vanilin/H2SO4 các mẫu tinh dầu A conyzoides L thu hái 3 tháng khác

nhau tại Hưng Yên

35

Bảng 3.5 Rf của các vết chính trên sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử

Vanilin/H2SO4 các mẫu tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng 04/2017

tại Hưng Yên, Hòa Bình và Bắc Giang

35

Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 2 phần nặng-nhẹ

của tinh dầu HY-11-H bằng phương pháp khuếch tán

37

Bảng 3.7 Tác dụng của tinh dầu hoa, lá ngũ sắc trên vi khuẩn kiểm định 38

Hình 1.5 Các dẫn chất chroman trong tinh dầu A conyzoides L 11

Hình 1.6 Các dẫn chất chromen trong tinh dầu A conyzoides L 11

Hình 1.7 Các phenylpropanoid và dẫn chất có nhân thơm trong tinh dầu A

conyzoides L

13

Hình 2.1 Các mẫu A conyzoides L thu hái được tại: (a).Hưng Yên tháng

11/2016; (b).Hưng Yên tháng 02/2017; (c).Hưng Yên tháng 04/2017;

(d).Hòa Bình tháng 04/2017 và (e).Bắc Giang tháng 04/2017

19

Hình 3.1 Hàm lượng tinh dầu trong lá và hoa A conyzoides L các mẫu

thu hái tại Hưng Yên

27

Hình 3.2 Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu A conyzoides L thu hái

tháng 4/2017 tại Hưng Yên, Hòa Bình, Bắc Giang

28

Hình 3.3 Tỉ lệ precocen I/precocen II trong hoa và lá các mẫu A

conyzoides L thu hái tại Hưng Yên

30

Hình 3.4 Hàm lượng precocen I, precocen II và các sesquiterpen trong các

mẫu tinh dầu A conyzoides L nghiên cứu

32

Hình 3.5 Sắc ký đồ tinh dầu A conyzoides L thu hái 3 tháng tại Hưng

Yên triển khai với hệ dung môi (I) quan sát ở: (a) UV 254nm, (b) 366 nm,

(c) sau khi phun vanilin/H2SO4 quan sát ở ánh sáng thường

34

Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng 04/2017 tại 3

tỉnh triển khai với hệ dung môi (I) quan sát ở: a UV 256nm, b 366 nm, c

sau khi phun vanilin/H2SO4 quan sát ở ánh sáng thường

34

Hình 3.7 Vòng vô khuẩn ức chế E coli của (1) tinh dầu nhẹ, (2) tinh dầu

nặng và (3) Streptomycin

37

Hình 3.8 Vòng vô khuẩn ức chế S aureus của (1) tinh dầu nhẹ, (2) tinh

dầu nặng và (3) Benzathin penicillin

37

Hình 3.9 Sự phát triển của E coli trên các đĩa thạch khác nhau (a):

chứng; (b): đĩa chứa 200µg mẫu H; (c): đĩa chứa 200µg mẫu

HY-3-L

39

Hình 3.10 Sự phát triển của S aureus trên các đĩa thạch khác nhau

(a): chứng; (b): đĩa chứa 200µg mẫu HY-3-H; (c): đĩa chứa 200µg mẫu

HY-3-L

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây ngũ sắc, hay còn gọi là cỏ cứt lợn, tên khoa học là Ageratum conyzoides

L có nguồn gốc châu Mỹ, sau phát tán ra các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Ở Việt Nam, cây ngũ sắc mọc hoang phổ biến ở khắp nơi với trữ lượng vô cùng phong phú

và có thể khai thác hàng ngàn tấn mỗi năm [1]

A conyzoides L là một trong những cây thuốc được biết đến từ thời cổ đại

như một loài có hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh khác nhau Ở một vài nước châu Phi và Nam Mỹ, ngũ sắc được dùng để hạ sốt, giảm đau, chống co thắt và cầm máu, băng bó vết bỏng, Tại Ấn Độ, cây ngũ sắc còn được sử dụng trong điều trị bệnh phong và sỏi thận Ở Việt Nam, ngoài những công dụng kể trên, cây này còn được dùng để trị ngứa, chữa bệnh rong kinh ở phụ nữ sau sinh, đặc biệt lá và hoa được vắt lấy nước để chữa viêm mũi xoang [9] Từ kinh nghiệm dân gian, dịch chiết ngũ sắc đã được Viện Dược Liệu nghiên cứu bào chế ra chế phẩm điều trị viêm xoang có tác dụng rất tốt, giá thành rẻ mà lại ít tác dụng không mong muốn [1]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây ngũ sắc như tác dụng hạ sốt, chống viêm, chống dị ứng… của dịch chiết cũng như nhiều công bố nói về tính chống viêm, chống oxy hóa, giảm đau, chống tăng sinh một số dòng tế bào ung thư và đặc biệt là tác dụng kháng khuẩn kháng nấm rất tốt của tinh dầu loài này [23] Tại Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần tinh dầu ngũ sắc đã được tiến hành với các mẫu thu hái tại Hà Nội và Bắc Ninh [7], [10] Tuy nhiên ngũ sắc lại là loài có tính phân ly cao và phân bố rộng, chưa có nghiên cứu so sánh giữa các vùng miền với nhau và tác dụng sinh học của tinh dầu ngũ này thì vẫn còn bỏ ngỏ

Vì những lí do trên, để góp phần nghiên cứu toàn diện cây ngũ sắc cũng như góp phần khai thác, sử dụng một cách hợp lý tinh dầu loài này, chúng tôi tiến hành

đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của tinh dầu cây

ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.) thu hái ở một số địa phương” với 3 mục tiêu:

1 Xác định hàm lượng tinh dầu ngũ sắc A conyzoides L thu hái ở một số địa

phương khác nhau

2 Xác định và so sánh thành phần hóa học tinh dầu của các mẫu thu được

3 Sơ bộ xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu ngũ sắc A conyzoides L

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Cỏ hôi (Ageratum L.)

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố

Vị trí của chi Ageratum L trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan

- Loài A housstonianum Mill., phân bố ở Lào Cai (Sapa), Vĩnh Phúc, Hà

Nội, Thừa Thiên - Huế, Lâm Đồng,

- Loài A conyzoides L., phổ biến khắp nước ta, từ đồng bằng, trung du tới

miền núi, mọc ven đồi, ven đường, các bãi hoang, bờ ruộng ẩm ướt

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Theo thực vật chí Việt Nam và thực vật chí Trung Quốc, chi Ageratum L

gồm các cây cỏ hàng năm hay lâu năm Lá mọc đối, có cuống Cụm hoa đầu, hợp thành ngù ở tận cùng hay nách lá; trong mỗi cụm hoa gồm nhiều hoa, tất cả lưỡng tính Lá bắc ở tổng bao có 2-3 hàng, xếp thành hình chuông; lá bắc hình mũi mác, đỉnh nhọn Đế hoa cụm hoa lồi, không lông Ống tràng hình chuông, màu tím nhạt hoặc trắng đục, có tuyến; phía đỉnh 5 thùy hình tam giác hẹp Bao phấn tù ở gốc, đỉnh nhọn Thùy vòi nhụy dạng sợi, hơi dày, núm tù, phủ lông, vươn ra phía ngoài cách xa ống tràng Quả bế, hình bầu dục – thuôn, có cạnh; vỏ có 5 cạnh, màu nâu

đen; mào lông trên đỉnh là 5 vảy hợp lại, ở gốc có răng viền, phía trên dạng lông cứng [2], [17]

1.2 Tổng quan về loài ngũ sắc Ageratum conyzoides L

Tên đồng nghĩa: A conyzoides Sieber ex Sieber ex Steudel; A conyzoides f album (Willd.) B.L.Rob.; A conyzoides f conyzoides; A conyzoides var conyzoides; A conyzoides subsp houstonianum (Mill.) Sahu; A conyzoides var inaequipaleaceum Hieron ; A conyzoides var mexicanum (Sims) DC.; A conyzoides f obtusifolia (Lam.) Miq.; ; A conyzoides var pilosum Blume [2], [27]

Tên Việt Nam: cây ngũ sắc, cỏ cứt lợn, cỏ cứt heo, cỏ hôi, bù xích, nhất bờ

hồ (K’ho) hoặc nhất menng (K’ dong) [1], [2]

Tên nước ngoài: White weed, Goat weed, Appa grass, Bastard agrimony (Anh), Agérate conyzoi de (Pháp) [1], [4]

Trong tự nhiên, loài A conyzoides L tồn tại hai kiểu hình là hoa tím và hoa

trắng Theo một nghiên cứu của PGS.TS.Nguyễn Thị Tâm [10], hai kiểu hình này

có một vài điểm khác nhau như sau:

Về hoa: 1 loại hoa màu trắng 1 loại hoa màu tím nhạt

Về thân: loại hoa trắng thường cao hơn (cao đến 70-100cm) và có màu xanh nhạt, loại hoa tím thân thường thấp hơn và có màu tím

Về lá: loại hoa trắng có lá màu nhạt hơn, phiến lá mỏng hơn và đầu lá nhọn hơn Loại hoa tím lá màu đậm hơn, phiến lá dầy hơn và đầu lá tù hơn

Ở Việt Nam,ngũ sắc mọc phổ biến từ đồng bằng, trung du đến miền núi Cây mọc nhiều ở các nương ngô, bãi sông, ven đường đi và trong vườn Cây ngũ sắc thuộc loại ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng Nguồn trữ lượng cây ngũ sắc ở Việt Nam vô cùng phong phú, ước tính có thể khai thác hàng ngàn tấn mỗi năm [1]

1.2.2 Một số loài cùng tên hoặc dễ nhầm lẫn

- Một số loài cùng tên Việt Nam: Trong dân gian, có nhiều loài mang tên cứt lợn như:

Anisomeles ovate R Br., họ Bạc Hà (Lamiaceae)

Lantana camara L., họ Cỏ roi ngựa (Verbenaveae)

Siegesbeckia orientalis L., họ Cúc (Asteraceae)

Bidens pilosa L., họ Cúc (Asteraceae)

- Loài dễ nhầm lẫn

Chi Ageratum L ở Việt Nam có 2 loài là A conyzoides L và A houstonianum Mill., hai loài này có nhiều đặc điểm khá tương đồng Tuy nhiên, có

thể phân biệt hai loài này nhờ các đặc điểm sau:

Loài A houstonianum Mill.: gốc lá hình tim, cắt ngang hay cụt Lá bắc ở

tổng bao dạng sợi, nhọn dần, mặt lưng phủ lông và tuyến Trong một cụm hoa có 75-100 hoa [2], [17], quả bế không lông [8]

Loài A conyzoides L.: gốc lá tù hoặc hình nêm rộng, tuyệt đối không hình

tim hay cắt ngang Lá bắc ở tổng bao hình bầu dục thuôn, đỉnh nhỏ dần, mặt lưng không có lông và tuyến Trong cụm hoa có 60-75 hoa [2], [17], quả bế có lông thưa [8]

1.2.3 Thành phần hóa học chung của loài Ageratum conyzoides L

Các chất đã được phát hiện trong rễ, thân, lá và hoa A conyzoides L gồm có

alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, glycosid, steroid, coumarin, terpenoid, resin, cardenoid, phenol, các chất dinh dưỡng đa lượng, chất béo và tinh dầu [15]

Bảng 1.1: Kết quả định tính các thành phần hóa học trong lá, thân, rễ và hoa A

Ghi chú: + + +: hàm lượng cao + : hàm lượng thấp

+ +: hàm lượng trung bình - : không có

Các chất dinh dưỡng đa lượng có mặt trong rễ, thân, lá và hoa A conyzoides

L [15] được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Các chất dinh dưỡng đa lượng trong rễ, thân, lá và hoa A conyzoides L

+ + + + + + +

+ + + + + + +

+ + + + + + +

Ghi chú: + +: hàm lượng trung bình

+: hàm lượng thấp

Các amino acid cũng được tìm thấy trong cây A conyzoides, bao gồm các

amino acid thiết yếu như leucin, histidin, valin, phenylalanin, threonin và các amino acid không thiết yếu khác như cystein, arginin, serin, alanin, tyrosin và glycin [15] (bảng 1.3)

Bảng 1.3: Các amino acid có mặt trong rễ, thân, lá và hoa A conyzoides L

Ghi chú: + + + hàm lượng cao + hàm lượng thấp

+ + hàm lượng trung bình - không có

1.2.4 Một số nhóm hoạt chất chính trong cây Ageratum conyzoides L

1.2.4.3 Triterpene và Steroid

Triterpen friedelin và sitosterol, stigmasterol đã được phân lập từ cây ngũ sắc

Ngoài 2 steroid chính, các sterol khác như brassicasterol và dihydrobrassicasterol, spinasterol, dihydrospinasterol cũng được cô lập với hàm lượng nhỏ từ cây này [1]

1.2.4.4 Tinh dầu

Trong cây A conyzoides L., tinh dầu chiếm khoảng 0,13-2,0% [1], [7], [10]

Có khoảng 51 thành phần đã được xác định trong tinh dầu ngũ sắc [1], [19], gồm:

- 20 dẫn chất monoterpen, trong đó có 13 dẫn chất không có oxy (5,0%) và 7 dẫn chất có oxy (1,4%)

- 20 dẫn chất sesquiterpen: 16 dẫn chất không có oxy (4,3%) và 4 dẫn chất có oxy (0,8%)

- 3 chất phenylpropanoid và dẫn chất có nhân thơm (2,33%)

- 6 chất chromen (85,2%)

- 2 chất chroman (0,9%)

a) Các dẫn chất monoterpen

- Dẫn chất monoterpen có oxy: một số dẫn chất monoterpen có oxy có trong

tinh dầu cây ngũ sắc gồm: 1,8-cineol (2,9%), terpinen-4-ol (0,6%), α-terpineol

(0,5%), linalol (0,04%), borneol (0,25%), bornyl acetat (0,1-1,5%) và hydroxycineol acetat (0,08%) [22], [23], [26]

O

Borneol Bornyl acetat Exo-2-hydroxycineole acetat

Hình 1.1: Một số dẫn chất monoterpen có oxy trong tinh dầu A conyzoides L

- Dẫn chất monoterpen không có oxy (chiếm khoảng 5,0% tinh dầu): các dẫn chất monoterpen không có oxy chiếm hàm lượng cao trong tinh dầu gồm sabinen, phellandren (1,5%), β-pinen (1,6%), α-pinen, limonen, ocimen được tìm thấy với lượng rất thấp trong tinh dầu ngũ sắc Nigeria trong khi đó ở Ấn Độ là khoảng 5,3%, camphen (1,53%), 2-caren (0,54%), β-myrcen (0,12%) và α-thujen [16], [22], [23]

Hình 1.2: Một số dẫn chất monoterpen không có oxy trong tinh dầu A

H

H

H

H

HHO

H

Hình 1.3 Một số dẫn chất sesquiterpen có oxy trong tinh dầu A conyzoides L

- Các dẫn chất sesquiterpen không có oxy gồm: β-caryophyllen có hàm lượng dao động từ 1,9% trong tinh dầu ngũ sắc Nigeria đến 14-17% trong tinh dầu ngũ sắc Pakistan, đáng chú ý là tinh dầu ngũ sắc Việt Nam chứa tới 23,3% β-caryophyllen; δ-cadinen có hàm lượng sấp sỉ 4,3% (dầu ngũ sắc Ấn Độ); β-sesquiphellandren, humulen và germacren-D cũng chiếm hàm lượng cao trong tinh

dầu A conyzoides L., tương ứng 1,2%, 2,3% và 3,16% [16], [23], [26]

c) Các chất chroman

Có 2 chất chroman đã được phát hiện trong tinh dầu ngũ sắc gồm dihydroencecalin và dihydrodemethoxyencecalin, hai dẫn chất chroman này chiếm lượng nhỏ (khoảng 0,9%) trong tinh dầu ngũ sắc [19], [23]

OO

O

OH

O

CH3

CH3O

R

R= -H : precocen I

R= -OCH3 : precocen II

R= -OCH3: Encecalin R= -CH3: Demethoxyencecalin R= -OH: Demethylencecalin

Preccocen I và precocen II là hai dẫn chất chromen chính trong tinh dầu A conyzoides L [23] Về tỷ lệ giữa hai hợp chất trên, các nghiên cứu khác nhau thì

cho những kết quả khác nhau như sau:

- Theo nghiên cứu của G.B Lockwood (mẫu thu hái tại Ai Cập) và nghiên cứu của Robert Vera (mẫu thu hái tại đảo Réunion của Pháp): precocen I nhiều hơn precocen II [24], [26]

- Theo nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm (mẫu thu hái tại Hà Nội) và nghiên cứu của Pertamawati (mẫu thu hái tại Indonesia), precocen II nhiều hơn precocen I [10], [22]

Theo nghiên cứu của Robert Vera so sánh thành phần chính của tinh dầu ngũ sắc ở các nơi khác nhau [26], kết hợp đối chiếu với hai nghiên cứu về tinh dầu ngũ sắc trong nước ta [10], [7] có thể thấy rằng precocene I, precocene II, β-caryophyllen là 3 thành phần chiếm tỉ lệ lớn nhất trong tinh dầu loài này , cụ thể như sau :

Bảng 1.4 So sánh thành phần của tinh dầu A.conyzoides L ở một số nơi

e) Phenylpropanoid và các dẫn chất có nhân thơm

Gồm có coumarin chiếm hàm lượng 0,52-1,44% tinh dầu, eugenol (4,4%) và methyleugenol (1,8%) [1], [22]

Hình 1.7: Các phenylpropanoid và dẫn chất có nhân thơm trong tinh dầu A

conyzoides L

1.2.4.5 Các hợp chất khác

Các hợp chất khác được phân lập từ A conyzoides L bao gồm: salamin,

aurantiamid acetat, fumaric acid, axit caffeic, phytol và các hydrocarbon (từ

n-C27H56 đến n-C32H66), (Z)12-6-methyl-heptadecenoic acid cũng được phân lập từ tinh dầu ngũ sắc và cho thấy có tác dụng ức chế sự phát triển của châu chấu

Schistocera gregaria Các axit béo được tìm thấy trong hạt và các axit amin cũng

như vitamin A, B cũng được tìm thấy trong hoa [1], [23]

1.2.5 Tác dụng dược lý của loài Ageratum conyzoides L

1.2.5.1 Tác dụng của dịch chiết thô

- Điều trị bỏng:

Nghiên cứu của các nhà khoa học người Nigeria đã chỉ ra rằng cắn dịch chiết ether dầu hỏa của toàn cây ngũ sắc có tác dụng tốt hơn vaselin trong băng bó vết thương [13] [18]

tâm thu ở chuột gây mê và có tác dụng chẹn kênh canxi tương tự verapamil [23]

Dịch chiết nước của lá có tác dụng chống đông máu, giảm thời gian chảy máu [1], [23]

Với nồng độ thấp, dịch chiết toàn thân ngũ sắc có tác dụng giãn mạch ngoại biên; nồng độ cao có tác dụng co mạch nhẹ [1]

Chỉ số tan huyết của cây ngũ sắc là 20, tương đối thấp và gần tương đương với chỉ số tan huyết của tam thất [1]

- Tác dụng kháng khuẩn:

Cắn dịch chiết ether dầu hỏa của toàn cây ngũ sắc có tác dụng ức chế sự phát

triển của Staphylococus aureus Dịch chiết methanol có tác dụng kháng khuẩn yếu,

các dịch chiết khác như dịch chiết nước, dịch chiết ethanol lại cho tác dụng kháng

Staphylococus aureus không rõ rệt [18], [23]

- Tác dụng giảm đau- chống viêm:

Tác dụng giảm đau được chứng minh bằng phương pháp mâm nóng cho thấy dịch chiết lá ngũ sắc làm giảm hoạt động và giảm nhiệt độ trực tràng Phần hòa tan trong nước (WSF) của dịch chiết này có tác dụng giảm đau ngoại vi và chống viêm tốt trong các trường hợp viêm phụ thuộc bạch cầu; giảm co thắt cơ trơn không đặc hiệu và giãn cơ Margort Silva và các cộng sự đã tiến hành điều tra hiệu quả của WSF trên cơ trơn tử cung chuột và cơ trơn ruột và kết luận rằng WSF chứa chất giãn trực tiếp cơ trơn và ức chế sự co lại do một số chất chủ vận trên kênh canxi hoặc ức chế AMP vòng Tác dụng dược lý này có thể được giải thích bằng việc cây ngũ sắc được sử dụng phổ biến trong dân gian để giảm đau bụng kinh Ngoài ra thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân viêm khớp cũng cho thấy dịch chiết lá ngũ sắc cũng có tác dụng giảm đau trên 66% bệnh nhân và cải thiện khả năng đi lại trên 24% tổng số bệnh nhân mà không gây tác dụng không mong muốn nào [23]

Theo Đoàn Thị Nhu và cộng sự (1975), LD50 của dịch chiết cây ngũ sắc trên chuột nhắt trắng là 82g/kg thể trọng Thử độc tính bán trường diễn trên thỏ được uống 5g/kg thể trọng trong 30 ngày không thấy những biến đổi bất thường trên xét nghiệm sinh hóa chức năng gan thận Thí nghiệm trên động vật còn cho thấy có tác

dụng chống viêm, chống phù nề, dị ứng phù hợp với thực tế lâm sàng điều trị viêm mũi cấp và mãn [1], [9]

- Tác dụng kháng histamin:

Trên chuột lang, dịch chiết ngũ sắc có tác dụng chống sốc phản vệ và đối kháng với tác dụng gây co bóp ruột cô lập của histamin [1]

- Tác dụng trên tế bào ung thư:

Các nhà khoa học Trung Quốc và Nigeria đã nghiên cứu tác dụng của dịch

chiết ethyl acetat của A.conyzoides L trên một số dòng tế bào ung thư của người

như tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp (K-251), ung thư vú (MDA-MB-231), ung thư tuyến tiền liệt (DU-145), ung thư gan (BEL-7402), tế bào ung thư ruột kết (HT-29)… Kết quả cho thấy dịch chiết ngũ sắc có tác dụng chống tăng sinh đáng kể trên các dòng tế bào ung thư phổi (A-549), ug thư dạ dày (SGC-7901) và ung thư ruột kết (HT-29) [14]

1.2.5.2 Tác dụng dược lý của tinh dầu

- Giảm đau, chống viêm:

Tác dụng chống viêm đáng kể trên chuột nhắt và chuột cống với liều tương ứng 3 và 4 ml/kg, tác dụng hạ sốt xuất hiện từ liều 3ml/kg và có thể so sánh được với acetyl salicylat lysin liều 50mg/kg (p<0,02) trong khi đó tác dụng giảm đau xuất hiện ở cả 3 mức liều 2, 3 và 4ml/kg; dùng hàng ngày và sau 7 ngày không thấy xuất hiện tác dụng không mong muốn trên dạ dày [23]

- Kháng khuẩn:

Tinh dầu A conyzoides L được báo cáo là kháng 22 loại vi khuẩn, gồm cả

cầu khuẩn và trực khuẩn Gram (+) và Gram (-) [23] Nghiên cứu của các nhà khoa học người Indonesia [22] về thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu ngũ sắc trên 2

chủng vi khuẩn là Staphylococus aureus ATCC 25923 và Escherichia coli ATCC

25922 bằng phương pháp khuếch tán, so sánh với chứng là Cloramphenicol cho kết

quả như trong bảng 1.5

Bảng 1.5: Tác dụng của tinh dầu A conyzoides L trên S aureus và E coli

Loại vi khuẩn

Đường kính vòng vô khuẩn

Tinh dầu A conyzoides

(10 μg/đĩa)

Chloramphenicol (10 μg/đĩa)

Kháng 12 loại nấm (3 nấm men và 9 nấm sợi) Đáng chú ý là tinh dầu này ức

chế tăng trưởng toàn phần của 4 loại nấm Candida albicans SP-14, Cryptococcus neoformas SP-16, Sclerotium rolfsii SP-5 và Trichophyton mentagrophytes SP-12

Thành phần chính của tinh dầu là demothoxyageratochromen có tác dụng trên

Penicillium chrysogenum và Penicillium javanicum và ức chế 100% sự phát triển của sợi nấm cũng như bào tử Didymella bryoniae [23]

Nuôi cấy A flavus trong môi trường thạch đường Sau đó chuyển hỗn dịch chứa bào tử vào dung dịch nuôi cấy có chứa tinh dầu A.conyzoides L ở các nồng độ giảm dần [21] Đo trọng lượng các sợi vi nấm phát triển và tính % lượng A flavus

bị ức chế cho kết quả như trong bảng 1.6

Bảng 1.6: Tác dụng của tinh dầu A conyzoides L trên A flavus

Ở nồng độ 0,1 µg/ml trở lên, tinh dầu A conyzoides có tác dụng ức chế 100% A flavus sản sinh aflatoxin B1 và ở mọi nồng độ tinh dầu đều có tác dụng ức chế A flavus tăng trưởng

Tinh dầu A conyzoides L cũng cho thấy tác dụng tốt trên A flavus với thí nghiệm đặt khoanh giấy tẩm tinh dầu A conyzoides L đặt vào môi trường chứa A flavus Kết quả là đường kính vòng vô khuẩn của khoanh giấy chứa tinh dầu đạt

khoảng 1.2mm trong khi chứng là thuốc diệt nấm (có cũng nồng độ) với đường kính vòng vô khuẩn đo được là 2.5 mm [21]

- Tính chống oxy hóa:

Hatano và cộng sự (1989) đã làm nghiên cứu về khả năng đào thải gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) của tinh dầu ngũ sắc bằng cách so sánh với một chất chống oxy hoá là butylated hydroxytoluen (BHT) hoặc quercetin Kết quả thí nghiệm cho thấy tinh dầu ngũ sắc có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ 100µg/ml [16], [22]

- Tác dụng trên tế bào ung thư:

Thử tác dụng của tinh dầu các loài Ageratum conyzoides, Ocimum basilicum, Zingiber officinale và Lippia multiflora trên 2 dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư

tuyến tiền liệt là LNCaP (loại nhạy cảm androgen) và PC3 (loại kháng androgen)

thấy tinh dầu A conyzoides có tác dụng chống tăng sinh mạnh nhất và có tác dụng

trên cả 2 dòng tế bào trên [16] IC50 của các loại tinh dầu kể trên được trình bày trong bảng 1.7

Bảng 1.7: IC 50 của một số tinh dầu trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt

Tinh dầu IC50 (mg/ml) tế bào ung thư tuyến tiền liệt

1.2.6 Công dụng của loài Ageratum conyzoides L

A conyzoides L là một trong những cây thuốc được biết đến từ thời cổ đại

như một loài có hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh khác nhau Ở một số nước châu

Phi, châu Á và Nam Mỹ, A conyzoides L được dùng để chữa một số bệnh như: hạ

sốt, giảm đau, chữa đau bụng, viêm loét, băng bó vết bỏng, điều trị các bệnh tâm thần, truyền nhiễm cũng như đau đầu và khó thở, tiêu chảy ở trẻ em, chống co thắt

và cầm máu… Tại Ấn Độ, toàn thân cây ngũ sắc còn được sử dụng trong điều trị bệnh phong và nước ép rễ cây này được dùng để chữa bệnh sỏi thận; lá dùng làm săn da, áp dụng trong băng bó các vết đứt và lở loét Ngoài ra ở Việt Nam nó còn được sử dụng để điều trị bệnh viêm mũi xoang, bệnh phụ khoa, chống ngứa, điều trị bệnh thấp khớp, nước súc miệng cho đau răng [1], [9], [18], [23] Đáng chú ý, đây

là cây thuốc duy nhất được người Igede ở Nigeria sử dụng trong điều trị HIV/AIDs [15]

Khoa tai mũi họng bệnh viện phú Thọ (1973) đã áp dụng cây ngũ sắc chữa viêm mũi dị ứng và đã có hiệu quả tốt Tại khoa tai mũi họng bệnh viện Việt Nam- Cuba và phòng khám tai mũi họng bệnh viện Hai Bà Trưng đã áp dụng các chế phẩm của cây ngũ sắc điều trị các bệnh viêm mũi xoang và cho kết quả như sau: tác dụng tốt trong điều trị viêm mũi xoang mạn tính và viêm mũi xoang dị ứng, tác dụng kéo dài, làm giảm viêm, giảm tiết dịch, giảm hắt hơi sổ mũi và chống nhức đầu, đồng thời không có tác dụng không mong muốn với cơ thể người trừ gây xót trong thời gian ngắn sau khi dùng thuốc ….[1]

Một số bài thuốc có cây ngũ sắc [1], [9]:

Chữa phụ nữ rong kinh sau đẻ: lá cây ngũ sắc (30-50g) giã nhỏ, thêm nước, vắt lấy nước cốt uống

Chữa viêm xoang dị ứng hay viêm tai: lá, hoa tươi vắt lấy nước cốt, tẩm bông

bôi vào mũi bên đau, hoặc ngoáy trong lỗ tai đau

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu cây tươi loài Ageratum conyzoides L mọc hoang được thu hái lúc

cây ra hoa tại 3 tỉnh Hưng Yên (tháng 11/2016, tháng 02/2017 và tháng 04/2017), Bắc Giang và Hòa Bình (tháng 04/2017)

Các mẫu được chụp ảnh và phân tích đặc điểm hình thái, kết hợp với khóa phân loại để xác định tên khoa học Tiêu bản các mẫu được lưu tại Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược Liệu

(d) (e)

Hình 2.1: Các mẫu A conyzoides L thu hái được tại: (a).Hưng Yên tháng

11/2016; (b).Hưng Yên tháng 02/2017; (c).Hưng Yên tháng 04/2017; (d).Hòa

Bình tháng 04/2017 và (e).Bắc Giang tháng 04/2017

- Để tiện cho việc nghiên cứu, các mẫu thu hái được của 2 loài Ageratum L được kí

hiệu như trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Các mẫu nghiên cứu và kí hiệu

thu hái mẫu

Ngày thu hái

Bộ phận dùng

Kí hiệu (nơi thu hái-tháng-bộ phận lấy mẫu)

A conyzoides L Hưng Yên 20/11/2016 Hoa HY-11-H

chính xác nhất hàm lượng tinh dầu trong cây Mẫu trong thời gian đợi cất tinh dầu

được giữ tươi bằng cách gói kín trong túi nilon miết đầu và bảo quản ở nhiệt độ

- Bếp hồng ngoại

- Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến theo Dược điển Việt Nam I

- Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ

 Dùng cho phân tích thành phần tinh dầu:

- Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến

- Tủ sấy Memmert ULM 500

- Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merk)

- Bình triển khai sắc lớp mỏng đáy gờ CAMAG

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) CAMAG

- Hệ thống sắc kí khí Agilent Technologies 7890A kết hợp khối phổ Agilent Technologies 5975C

- Micropipet Nichipet EX plus II

Vi khuẩn Gram (+): Tụ cầu vàng Staplylococus aureus ATCC 25923

Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922

d) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định

Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định

Thành phần NaCl (%) Pepton (%) Cao thịt (%) Thạch (%) Nước cất

100ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

Gồm 3 phần chính:

- Định lượng tinh dầu trong: lá và hoa tươi của loài Ageratum conyzoides L thu hái

ở các tỉnh Hưng Yên (tháng 11/2016, tháng 02/2017 và tháng 04/2017), Hòa Bình (tháng 04/2017) và Bắc Giang (tháng 04/2017

- Phân tích thành phần và so sánh các mẫu tinh dầu

- Thử tác dụng sinh học: thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu A conyzoides L trên vi khuẩn S aureus và E coli

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định lượng tinh dầu

- Phương pháp: cất kéo hơi nước

- Nguyên tắc của phương pháp: Dựa trên nguyên tắc cất một hỗn hợp hai chất lỏng bay hơi không trộn lẫn vào nhau (nước và tinh dầu) Khi áp suất hơi bão hòa bằng

áp suất khí quyển, hỗn hợp bắt đầu sôi và hơi nước kéo theo hơi tinh dầu

- Lựa chọn bộ dụng cụ cất tinh dầu:

+) Tiến hành cất tinh dầu ngũ sắc bằng cả hai bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Mỹ - Clevenger Apparatus (loại cho tinh dầu nhẹ hơn nước và nặng hơn nước) thì thấy có một phần tinh dầu chảy qua nhánh hồi lưu đi xuống bình cầu chứa dược liệu Do đó khi dùng bộ Clevenger Apparatus để định lượng tinh dầu ngũ sắc thu hái được sẽ có thể có sai số

+) Tiến hành cất tinh dầu ngũ sắc bằng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến theo Dược điển Việt Nam I (PGS.TS Nguyễn Thị Tâm – 1985) [5] thì thấy hàm lượng tinh dầu thu được khá ổn định Do đó, bộ dụng cụ này được lựa chọn để định lượng tinh dầu các mẫu ngũ sắc nghiên cứu

- Tiến hành cất tinh dầu trong 3-4 giờ cho đến khi thể tích tinh dầu trong ống hứng

không tăng nữa và khi thay ống hứng mới thì không còn thấy tinh dầu chảy từ sinh

hàn xuống thì ngừng Để nguội, đọc kết quả thể tích tinh dầu thu được

Hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức:

X= x 100%

Trong đó V : thể tích tinh dầu thu được (ml)

m : khối lượng dược liệu (đã trừ độ ẩm) (g)

2.3.2 Phân tích thành phần và so sánh các mẫu tinh dầu

2.3.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC/MS

2.3.2.2 So sánh các mẫu tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng

- Khảo sát các hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng

- Triển khai các mẫu nghiên cứu trên cùng một bản mỏng bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG Sau khi triển khai xong, quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ trước khi phun thuốc thử ở UV 254nm và UV 366 nm, chụp ảnh sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử dưới ánh sáng trắng

- Phân tích sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng bằng cách sử dụng phần mềm VisionCATS

Từ đó kết hợp với kết quả GC-MS để so sánh thành phần các mẫu tinh dầu

2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn

2.3.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán [11]

- Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng

đã cấy vi khuẩn kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch

sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công

D i: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song (n =3)

2.3.3.2 Thử nghiệm chống nhiễm khuẩn trên bề mặt thạch [20]

- Nguyên tắc: mẫu thử được trộn đều vào môi trường thạch dinh dưỡng chưa có vi khuẩn kiểm định Tiếp đó vi khuẩn kiểm định được dàn đều trên bề mặt thạch, mẫu thử sẽ ức chế trực tiếp sự phát triển của vi khuẩn

- Đánh giá kết quả : Dựa trên số khuẩn lạc phát triển trên đĩa petri và tính khả năng kháng khuẩn của mỗi loại tinh dầu

Khả năng ức chế vi khuẩn = (1-

- Xác định độ ẩm: lấy 3 phần ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của nguyên liệu, mỗi

phần khoảng 1-2g, chia nhỏ dược liệu rồi đem xác định độ ẩm bằng cân phân tích

độ ẩm Precisa XM 60-HR

- Tiến hành định lượng:

Cân dược liệu cho vào nồi cất, thêm nước ngập dược liệu, cất kéo hơi nước cho đến khi thể tích tinh dầu trong ống hứng không tăng lên nữa và sau khi thay ống hứng không còn thấy tinh dầu xuất hiện trên ống hứng thì ngừng cất (khoảng 3-4 giờ), để nguội, đọc kết quả thể tích tinh dầu thu được

Khối lượng dược liệu cho mỗi lần cất dao động từ 105-750g tùy lượng mẫu thu được Lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy kết quả trung bình

Các mẫu tinh dầu sau khi cất được cho thêm natri sulfat khan để loại nước và bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu trong tủ lạnh (khoảng 4ºC)

Kết quả:

- Tinh dầu ngũ sắc thu được màu vàng nhạt đến vàng tươi, mùi hôi có khả năng gây

nôn, gồm 2 phần: một phần nổi lên trên bề mặt và một phần chìm xuống đáy ống hứng tinh dầu Thu riêng 2 phần này đem phân tích thành phần bằng GC/MS và so

sánh tác dụng kháng khuẩn trên S aureus và E coli

- Hàm lượng tinh dầu các mẫu A conyzoides L khảo sát được ở 3 tỉnh Hưng Yên,

Hòa Bình và Bắc Giang được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu Ageratum conyzoides L thu hái ở một số địa phương

Thể tích tinh dầu (ml)

Hàm lượng tinh dầu (%)

Hàm lượng tinh dầu trung bình (%)