Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thƣơng gan Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) thực nghiệm

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thƣơng gan Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) thực nghiệm Mã số: ĐH2015-TN05-02 Chủ nhiệm đề tài: ThS Hoàng Thái Hoa Cƣơng Thái Nguyên, tháng năm 2019 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thƣơng gan Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) thực nghiệm Mã số: ĐH2015-TN05-02 Xác nhận tổ chức chủ trì (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) ThS Hoàng Thái Hoa Cƣơng i DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Các thành viên tham gia STT Họ tên Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên mơn Nhiệm vụ đƣợc giao ThS Hồng Thái Hoa Cương Bộ môn Dược lâm sàng, Chủ nhiệm kiêm Trường ĐH Y Dược, thư ký ĐHTN PGS TS Vũ Thị Ngọc Thanh Bộ môn Dược lý, Nghiên cứu viên Trường Đại học Y Hà Nội PGS.TS Phạm Thị Vân Anh Bộ môn Dược lý, Nghiên cứu viên Trường Đại học Y Hà Nội Đơn vị phối hợp Bộ mơn Dược lý, Trường Đại học Y Hà Nội ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết vấn đề nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu: Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc chức gan 1.1.1 Giải phẫu mô học gan 1.1.2 Chức sinh lý sinh hoá gan 1.1.2.1 Chức tiết mật 1.1.2.2 Chức chuyển hoá chất 1.1.2.3 Chức khử độc tác dụng bảo vệ gan: 1.1.2.4 Chức tạo phá huỷ hồng cầu 1.2 Bệnh viêm gan 1.2.1 Viêm gan cấp 1.2.2 Viêm gan mạn 1.3 Một số xét nghiệm thƣờng dùng để đánh giá tổ thƣơng gan 10 1.4 Các phƣơng pháp điều trị gan mật 11 1.5 Một số thuốc thuốc y học cổ truyền đƣợc nghiên cứu điều trị bệnh gan mật 12 1.6 Tổng quan dứa dại 15 1.6.1 Phân loại thực vật phân bố dứa dại 15 1.6.2 Trữ lượng loài Dứa dại Việt Nam 19 1.6.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học dứa dại 20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 iii 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.1 Thuốc nghiên cứu 23 2.1.2 Động vật thực nghiệm 23 2.1.3 Thuốc, hóa chất máy móc phục vụ nghiên cứu 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm có đối chứng 23 2.2.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan: 24 2.2.2 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan: 25 2.3 l số liệu 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Tác dụng bảo vệ gan 27 3.2.Tác dụng làm tăng phục hồi tổn thƣơng gan 29 3.2.1 Sau gây độc b ng P R ngày 29 3.2.2 Sau gây độc b ng P R ngày 36 Chƣơng BÀN LUẬN 41 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên hoạt độ AST, ALT huyết chuột bị gây độc b ng PAR 33 Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên h nh ảnh mô bệnh học gan chuột 35 Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên hoạt độ AST ALT huyết chuột sau gây độc b ng PAR ngày 36 Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên h nh ảnh mô bệnh học gan chuột sau gây độc b ng PAR ngày 37 Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên hoạt độ AST ALT huyết chuột sau gây độc b ng PAR ngày 43 Bảng Ảnh hưởng CTP PĐE lên h nh ảnh mô bệnh học gan chuột sau gây độc b ng PAR ngày 44 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ H nh Sơ đồ nghiên cứu 30 H nh 2: Đại thể gan chuột Lô (chứng sinh học) 38 H nh 3: Đại thể gan chuột Lơ (Mơ hình – Gây độc không dùng thuốc) 39 H nh 4: Đại thể gan chuột Lô (Silymarin) 39 H nh 5: Đại thể gan chuột Lô (CTP) 40 H nh 6: Đại thể gan chuột Lô (PĐE) 40 Hình 7: Hình ảnh vi thể gan chuột số lơ chứng sinh học (Gan thối hóa nh , bào tương tế bào gan có t hốc sáng nhỏ) 41 Hình 8: Hình ảnh vi thể gan chuột số 15 lơ mơ hình ( Gan có thối hóa nặng kèm theo hoại tử tế bào gan, xen kẽ có vùng hoại tử chảy máu, có xâm nhập viêm) 41 Hình 9: Hình ảnh vi thể gan chột số 29 lơ (Có h nh ảnh gan thối hóa v a, bào tương tế bào gan có nhiều hốc sáng nhỏ, nhân tế bào không đều) 42 Hình 10: Hình ảnh vi thể gan chột số 44 lơ ( Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ, gan thối hóa nh ) 42 Hình 11: Hình ảnh vi thể gan chột số 46 lô ( Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ, gan thối hóa nh ) 43 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AST Aspartat aminotransferase ALT Alanin aminotransferase CTP Cao toàn phần PDE Phân đoạn ethyl acetat PAR Paracetamol CYP Cytochrom P450 NAPQI N-acetyl-p-benzoquinoneimin vii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) thực nghiệm - Mã số: ĐH2015-TN05-02 - Chủ nhiệm đề tài: ThS Hoàng Thái Hoa Cương - Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: 24 tháng (T tháng 1/2015 đến tháng 12/2016) Mục tiêu: - Đánh giá tác dụng bảo vệ tổn thương gan gây paracetamol chuột nhắt trắng Dứa dại - Đánh giá tác dụng phục hồi tổn thương gan gây paracetamol chuột nhắt trắng Dứa dại Tính sáng tạo: Đề tài tập trung vào nghiên cứu phát triển chế phẩm t thảo dược, tăng hội lựa chọn cho người bệnh, giảm chi ph điều trị, giảm ảnh hưởng bất lợi t phương pháp điều trị theo y học đại Kết nghiên cứu: CTP PĐE chiết xuất t dứa dại với hai liều tương đương 7,2g dược liệu/kg 14,4g dược liệu/kg có tác dụng bảo vệ gan làm tăng phục hồi tổn thương gan mô h nh gây tổn thương gan b ng P R chuột nhắt trắng Sản phẩm: a, Sản phẩm khoa học: báo đăng tạp chí khoa học viii - Hồng Thái Hoa Cương, Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Duy Thuần, (2016), “Tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan dứa dại thực nghiệm”, Tạp chí Y học thực hành, (1005), tr 709 - 714 - Hoàng Thái Hoa Cương, Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Duy Thuần, (2017), “Tác dụng bảo vệ gan dứa dại thực nghiệm”, Tạp chí Y học thực hành, (1062), tr.60 b, Sản phẩm đào tạo: 02 chuyên đề luận án tiến sĩ chủ nhiệm đề tài: - Chuyên đề 1: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan dứa dại động vật thực nghiệm, Quyết định số 1859/QĐ-ĐHYD ngày 05/10/2016 Trường Đại học Y Dược việc thành lập Hội đồng nghiệm thu chuyên đề số thuộc đề tài cấp Đại học, Biên họp Hội đồng đánh giá nghiệm thu ngày 10/10/2016; - Chuyên đề 2: Nghiên cứu tác dụng phục hồi tổn thương gan dứa dại động vật thực nghiệm, Quyết định số 1860/QĐ-ĐHYD ngày 05/10/2016 Trường Đại học Y Dược việc thành lập Hội đồng nghiệm thu chuyên đề số thuộc đề tài cấp Đại học, Biên họp Hội đồng đánh giá nghiệm thu ngày 10/10/2016; Phƣơng thức chuyển giao, địa ứng dụng, tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu: - Hỗ trợ số liệu cho luận án nghiên cứu sinh - Chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào gan làm tăng phục hồi tổn thương gan thực nghiệm Dứa dại Làm tiền đề cho nghiên cứu pha tiếp theo, tiến tới sản xuất thuốc có tác dụng điều trị bệnh gan sử dụng cho bệnh nhân Ngày 20 tháng năm 2019 Tổ chức chủ trì (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài ThS Hoàng Thái Hoa Cƣơng 38 Chƣơng BÀN LUẬN Để đánh giá khả bảo vệ phục hồi tổn thương gan, trước hết phải gây mơ hình gây viêm gan thực nghiệm Mơ hình gây viêm gan gần với thực tế rõ ràng chế tính ứng dụng cao Như tr nh bày phần tổng quan, có ba nhóm nguyên nhân gây viêm gan virus, thuốc hóa chất Vì việc xây dựng mơ hình gây viêm gan thực nghiệm thường dựa vào ba nhóm ngun nhân Nếu gây mơ hình viêm gan virus mơ hình tốt, có phạm vi ứng dụng lớn viêm gan virus vấn đề cộm Việt Nam giới Tuy nhiên nay, chưa t m thấy tài liệu tham khảo xây dựng mơ hình Hiện giới Việt Nam, để nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan, thường sử dụng mơ hình gây viêm gan b ng thuốc hóa chất Có nhiều loại thuốc/ hóa chất sử dụng để gây mơ h nh viêm gan PAR [11], [29], [52], [57], [59], [73], [74], [75], carbon tetrachlorid [11], [24], [52], [57], [60], [61], [66], [67], [82], [84], D- galactosamin [57], [68], ethanol [71], erythromycin estolat [76], aflatoxin B1 [57], thioacetamid [59] Tất mơ hình chứng minh rõ ràng chế gây tổn thương gan, việc lựa chọn mơ hình cho nghiên cứu tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu điều kiện thực tế Trong đề tài chọn mô hình gây viêm gan b ng PAR liều cao Sở dĩ chúng tơi lựa chọn mơ hình PAR thuốc hạ sốt , giảm đau thông thường sử dụng rộng rãi toàn giới Việt Nam Paracetamol dùng để điều trị triệu chứng nhiều bệnh, thuốc dễ dung nạp, gây tai biến đường tiêu hóa, mua dễ dàng mà không cần kê đơn Ch nh v lý mà t nh trạng lạm dụng thuốc sử dụng liều dẫn đến độc tính thuốc thường xảy Liều dùng thông thường P R cho người lớn t 0,5- 1,0g / lần, lần dùng cách giờ, khơng dùng 4,0g/ ngày Với liều điều trị thông thường này, PAR t gây độc cho gan Chỉ dùng liều cao ( > 10,0g), sau thời gian tiềm tàng 24 giờ, tế bào gan bị viêm cấp hoại tử tạo lượng lớn chất chuyển hóa N-acetyl-p-benzoquinoneimin (NAPQI) gây độc cho gan, tiến triển tới chết sau 5-6 ngày [2], [21], [34], [69] 39 Sau vào thể, paracetamol chuyển hóa theo đường sau: UDP- glucuronosyl Acetaminophen (PAR) 90% transferase Acetaminophen glucuronid (CYP2E1, CYP1A2, CYP3A4) 5-15% Phenolsulfo transferase Acetaminophen sulfat N-acetyl-p-benzoquinoneimin (NAPQI) Glutathion (GSH) Acetaminophen liên hợp glutathion Liên hợp mercapate Thơng qua q trình glucuro – hợp sulfo – hợp, khoảng 90% P R chuyển hoá tạo thành chất khơng cịn hoạt tính Chỉ có – 15% chuyển hoá qua cytochrom P450 (CYP), isoenzym CYP2E1, CYP1 2, CYP3 4, chủ yếu CYP2E1 để tạo thành NAPQI chất chuyển hoá gây độc với tế bào gan [64] NAPQI chất độc với tế bào, gắn vào protein tế bào gan, gây viêm hoại tử tế bào gan Với liều điều trị, lượng nhỏ NAPQI tạo liên hợp với glutathion - chất chống oxy hóa tự nhiên thể s n có gan để tạo hợp chất không gây độc đào thải Tuy nhiên, tốc độ sinh NAPQI lớn tốc độ khử độc GSH gan th lượng N PQI dư th a oxy hoá chất có trọng lượng phân tử lớn gan protid, lipid, làm biến đổi nội mơi, thay đổi tính thấm màng tế bào với Ca2+, dẫn đến peroxy hoá lớp lipid kép màng tế bào, tạo gốc tự gây huỷ hoại tế bào gan [2], [34],[64] Ở Việt Nam nay, tỷ lệ bệnh nhân bị ngộ độc P R ngày gia tăng Theo thống kê Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai năm 1998 – 2000, ngộ độc PAR chiếm 6,34% [50] Trong hai năm sau (2002 - 2003) Ngô Hữu Hà thống kê thấy tỷ lệ tăng lên 12,2% đứng thứ loại ngộ độc thuốc [21] Theo tổng kết trung tâm ADR quốc gia, ADR nhóm thuốc hạ sốt – giảm đau, chủ yếu P R đứng hàng thứ tổng số ADR tất nhóm thuốc (chỉ sau nhóm thuốc kháng sinh thuốc chống lao) [9] Vì để đánh giá tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan rễ Mạ mân, chúng tơi lựa 40 chọn mơ hình gây tổn thương gan b ng PAR liều cao cho phù hợp với thực tiễn lâm sàng Trong mô h nh gây độc với gan b ng PAR liều cao chuột nhắt trắng, mức độ tổn thương gan tùy thuộc vào liều lượng đường dùng Liều cao tổn thương tế bào gan nặng, dẫn đến tử vong Theo Anwar (1995) liều P R 1,0 g/ kg theo đường uống gây chết 100% số chuột nhắt trắng [53] Göksel sener cs (2006) tiêm màng bụng chuột PAR 900mg/kg gây độc tính nặng, làm tăng hoạt độ ST lên đến 1389,6 % ALT lên 3162,5% so với nhóm chứng sinh học [59] Theo Stephan U cộng sự, liều PAR 150mg/kg đường uống gây bán độc (subtoxic), liều 500mg/kg gây độc tính rõ [81] Nghiên cứu Mohamed A.F cộng r ng uống PAR liều 600mg/kg gây chết 80% liều 1g/kg PAR gây chết 100% chuột [70] Sau tham khảo tài liệu tác giả nước[11], [29], [59], [66] nghiên cứu thăm dị, chúng tơi chọn liều P R gây độc chuột nhắt 400mg/kg theo đường uống Với liều gây độc này, chuột không chết sau gây độc, quan sát tổn thương gan mức độ v a phải Lựa chọn gây độc b ng P R theo đường uống để phù hợp với thực tiễn lâm sàng, người bệnh chủ yếu bị ngộ độc thuốc theo đường uống Trên thị trường thuốc nước ta nay, có khoảng 200 biệt dược khác PAR, chủ yếu dạng dùng đường uống Quả dứa dại t lâu sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh gan với liều khoảng 30g phơi khô/ngày sắc nước uống Trong nghiên cứu này, sử dụng dạng thuốc thử chiết xuất t dứa dại cao toàn phần (CTP) phân đoạn ethyl acetate (PĐE) - ph n đoạn hoạt chất ch nh dứa dại, với hy vọng nhóm hoạt chất thành phần chủ yếu có tác dụng điều trị viêm gan dứa dại th dùng thành phần để sản xuất thuốc, tạo dạng thuốc tinh khiết hơn, dễ kiểm soát chất lượng, liều dùng xác thuận tiện sử dụng Paracetamol thuốc hạ sốt, giảm đau thông thường, sử dụng rộng rãi mà không cần kê đơn Với liều điều trị thông thường, P R không gây độc cho gan sử dụng liều cao có biểu độc với gan thơng qua chất chuyển hóa có hoạt t nh N-acetyl-p-benzoquinoneimin (N PQI)[4] V vậy, nghiên cứu chọn mô h nh gây tổn thương gan cấp b ng P R để đánh giá tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan CTP PĐE chiết xuất t dứa dại 41 Đây mô h nh nhiều tác giả giới nước sử dụng [5],[6],[7],[8] 4.1 Tác dụng bảo vệ gan Trong nghiên cứu này, lô mô h nh (gây độc không dùng thuốc), P R với liều 400mg/kg dùng đường uống chuột nhắt trắng làm tăng hoạt độ AST 59,4%, ALT 311,8% so với nhóm chứng Điều chứng tỏ P R gây tổn thương tế bào gan, làm giải phóng enzym vào máu Dùng CTP PĐE ngày trước gây độc có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ AST ALT so với lô mô h nh (p