Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm khảo sát tác dụng bảo vệ của kháng thể IgY nguồn gốc lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên vi khuẩn tả và kháng nguyên độc tố tả trên chuột nhắt trắng sơ sinh nhiễm vi khuẩn tả thực nghiệm.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ CỦA KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ VÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG SƠ SINH Hoàng Trung Kiên*; Lê Thu Hồng**; Nguyễn Đặng Dũng* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng bảo vệ kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả (VKT) IgY kháng độc tố tả (ĐTT) động vật nhiễm VKT V cholerae thực nghiệm Phương pháp: chuột nhắt trắng sơ sinh (3 - ngày tuổi) gây nhiễm VKT theo đường tiêu hóa, sau uống dung dịch chứa kháng thể IgY kháng VKT kháng ĐTT Đánh giá tác dụng bảo vệ kháng thể IgY tỷ lệ thời gian sống thêm nhóm chuột nhiễm VKT uống kháng thể so với nhóm đối chứng (khơng uống kháng thể) Kết quả: 60 sau gây nhiễm VKT, 40% chuột uống kháng thể IgY kháng VKT 23,3% chuột uống kháng thể IgY kháng ĐTT sống (so với 0% chuột nhóm đối chứng) Kết luận: kháng thể IgY kháng VKT IgY kháng ĐTT có tác dụng bảo vệ chuột nhắt trắng sơ sinh nhiễm VKT * Từ khóa: IgY; Vi khuẩn tả; Độc tố tả; huột nhắt sơ sinh Protective Effect of Anti - V cholerae and Anti-choleratoxin IgYs in Suckling Mice Challenged with Live V cholerae Summary Objectives: To evaluate in vivo protective effect of anti - V cholerae and anti-choleratoxin IgYs in suckling mice challenged with live V cholerae Methods: IgY antibodies was extracted from eggs laid of hens immunized with V.cholerae or with choleratoxin antigens Protective effect of the antibodies in suckling mice orally infected with live V cholearae were investigated using recorded survival time of mice receiving the antibodies or placebo at the time point that all negative control mice died Results: 60 hours subsequent to being infected with V cholerae, 100% of mice receiving placebo died, meanwhile 40% of mice receiving anti - V cholerae IgY and 23.6% of mice receiving anti-choleratoxin IgY still survived Conclusions: Anti - V cholerae IgY and anti-choleratoxin IgY exerted protective effect on suckling mice challenged with live V cholerae * Key words: IgY; V cholerae; Choleratoxin ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tả bệnh truyền nhiễm VKT (Vibrio cholerae) gây sau nhiễm VKT vào thể người theo đường tiêu hóa Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (2014), năm 2013 ghi nhận 129 064 trường hợp mắc bệnh tả 47 quốc gia thuộc tất châu lục, với 2.102 trường hợp tử vong, tỷ lệ tử vong 1,63% [3] * Häc viÖn Qu©n y ** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng (dzungmd@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/01/2015 Ngày báo đăng: 29/01/2015 26 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Trong năm gần đây, Việt Nam quốc gia có lưu hành bệnh tả: năm 2008 có 853 ca bệnh tả; năm 2009 có 479 ca, có người chết; năm 2010 có 606 ca năm 2011 có ca mắc tả báo cáo [4] Sử dụng kháng sinh điều trị nhiễm VKT góp phần làm giảm thời gian điều trị Tuy nhiên, xuất số chủng VKT kháng thuốc kháng sinh [5, 6] Việc nghiên cứu phát triển biện pháp dự phòng điều trị bệnh tả ln hướng nghiên cứu quan tâm Kháng thể IgY lớp kháng thể quan trọng có huyết lồi gia cầm, vận chuyển sang lòng đỏ trứng gia cầm Nhiều nhóm nghiên cứu thu kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên cách gây miễn dịch cho gà mái, sau phân lập kháng thể IgY từ trứng gà gây miễn dịch Nghiên cứu thành công việc chế tạo IgY đặc hiệu với số vi sinh vật gây bệnh người động vật phương pháp phân lập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên vi sinh vật Nghiên cứu nhằm: Khảo sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY nguồn gốc lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên VKT kháng nguyên ĐTT chuột nhắt trắng sơ sinh nhiễm VKT thực nghiệm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu - Chuột nhắt trắng sơ sinh từ - ngày tuổi (150 con) không phân biệt giới, 27 an ung cấp Động vật th nghiệm, Học viện Quân y cung cấp - VKT (chủng V50) Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y 103 cung cấp, phân lập từ phân BN mắc bệnh tả Việt Nam năm 2006 - Phân lập lgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với VKT, ĐTT, với tá chất Freund gà không gây miễn dịch Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng theo phương pháp kết tủa nước cất lạnh muối amoni sulfate, quy tr nh mô tả nghiên cứu trước [1] - Protein GM1, ĐTT chuẩn, kháng thể cộng hợp HRP-IgG cừu kháng IgY (Sigma, Hoa Kỳ) - ác hóa chất thơng thường khác dùng cho phản ứng ELISA Phƣơng pháp nghiên cứu * Kiểm tra hoạt tính in vitro kháng thể IgY: Khảo sát hoạt t nh kháng thể IgY kháng VKT IgY kháng ĐTT kỹ thuật ELISA: kháng nguyên VKT siêu nghiền ĐTT chuẩn gắn vào giếng khay phản ứng ELISA 96 giếng; pha loãng 100 l dung dịch kháng thể IgY nồng độ khác nhau, bổ sung vào giếng phản ứng Kháng thể IgY đặc hiệu kháng nguyên phát cộng hợp kháng thể cừu kháng IgY gà đánh dấu enzym HRP, với có mặt chất tạo mầu OPD; đo mật độ quang học dung dịch phản ứng giếng bước sóng 450 nm máy đo quang phổ DTX 880 (Beckman Coulter, Hoa Kỳ) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 * Khảo sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với VKT với ĐTT mơ hình gây bệnh tả thực nghiệm: Khảo sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với VKT với ĐTT mô h nh gây bệnh tả thực nghiệm chuột nhắt trắng sơ sinh (3 - ngày tuổi) theo mô tả Kazuyuki S (2010) [2] Tách 150 chuột nhắt trắng sơ sinh khỏi chuột mẹ trước tiến hành th nghiệm giờ, sau chia thành nhóm (mỗi nhóm 30 con) số nhóm chuột uống 50 l huyền dịch VKT (mật độ 108CFU/ml) cách bơm qua sonde dày; nhóm lại (nhóm đối chứng sinh học) uống dung dịch NaCl 0,9% sau gây nhiễm VKT, cho chuột uống 50 l Na l 0,9% (nhóm đối chứng âm - nhóm 2), 50 l dung dịch IgY nồng độ mg/ml, chế phẩm IgY kháng tá chất Freund (nhóm 3), IgY kháng VKT (nhóm 4) IgY kháng ĐTT (nhóm 5); nhóm đối chứng sinh học (nhóm 1, khơng gây nhiễm VKT) uống 50 l Na l 0,9% Theo dõi chuột, ghi nhận số lượng chuột bị chết nhóm thời điểm theo dõi, chuột nhóm đối chứng âm (nhóm 2) chết hồn tồn * Xử lý số liệu: phần mềm SPSS 20.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN OD 450(nm) Hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với VKT ĐTT IgY tõ trøng gà đ-ợc gây miễn dịch với VK tả IgY từ trứng gà không gây miễn dịch với VK tả Blank Độ pha lỗng kháng thể (x1.000) Hình 1: Phản ứng ELISA phát IgY đặc hiệu với VKT 28 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 IgY từ trứng gà đ-ợc gây miễn dịch với độc tố tả IgY từ trứng gà không gây miễn dịch với ®éc tè t¶ Blank Độ pha lỗng kháng thể (x1.000) Hình 2: Phản ứng ELISA phát IgY đặc hiệu với ĐTT Kháng thể IgY có hoạt t nh (-) đặc hiệu VKT ĐTT in vitro Kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà pha lỗng nồng độ khác nhau, sau thực phản ứng ELISA để xác định có mặt kháng thể IgY kháng VKT ĐTT lòng đỏ trứng Phản ứng ELISA xác định kháng thể IgY kháng VKT ĐTT lòng đỏ trứng gà cho kết dương t nh với kháng nguyên VKT ĐTT (ngay mức pha loãng 1/64 000 kháng thể kháng VKT, 1/200 000 kháng thể kháng ĐTT), mẫu đối chứng âm (kháng thể phân lập từ trứng gà không gây miễn dịch) khơng có phản ứng với kháng ngun VKT ĐTT * Tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với VKT ĐTT mơ hình gây bệnh tả thực nghiệm: Bảng 1: Tỷ lệ chuột sống sót nhóm NHĨM CHỈ SỐ THEO DÕI Gây nhiễm VKT ĐỐI CHỨNG SINH HỌC (n = 30) ĐỐI CHỨNG ÂM (n = 30) 50 l VKT UỐNG IgY KHÔNG ĐẶC HIỆU UỐNG IgY KHÁNG VKT UỐNG IgY KHÁNG ĐTT (n = 30) (n = 30) (n = 30) 50 l VKT 50 l VKT 50 l VKT (0 giờ) 50 l Nacl 0,9% 10 CFU/ml 10 CFU/ml 10 CFU/ml 10 CFU/ml Điều trị (3 sau nhiễm VKT) 50 l NaCl 0,9% 50 l NaCl 0,9% 50 l IgY kháng tá chất Freund 50 l IgY kháng VKT 50 l kháng ĐTT Số chuột sống sau 60 17 0 12 56,7% 0% 0% 40% 23,3% Tỷ lệ chuột sống sau 60 29 8 8 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Hình 3: Thời gian sống thêm động vật th nghiệm gây nhiễm VKT theo đường uống - Nhóm chuột uống NaCl 0,9% thời gian sống thêm tương đương sử dụng làm nhóm đối chứng sinh học, Trong nhóm chuột nhiễm VKT nhằm đảm bảo việc thực thao tác uống dung dịch IgY đặc hiệu với cho chuột uống qua sonde dày không kháng nguyên VKT (nhóm 4) nhóm gây chết động vật th nghiệm, không gây chuột nhiễm VKT uống dung dịch nhiễu kết nghiên cứu IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT nhóm động vật th nghiệm lại Kết (nhóm 5), thời gian sống thêm cao rõ cho thấy, nhóm 17/30 chuột rệt so với nhóm nêu (p < 0,0001) Như vậy, nghiên cứu chứng minh (56,7%) sống sót đến 60 kể từ bắt tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc đầu th nghiệm - Nhóm 3: chuột nhiễm VKT không hiệu với kháng nguyên VKT ĐTT phân điều trị đặc hiệu (nhóm - chuột lập từ lòng đỏ trứng gà chuột th uống dung dịch IgY phân lập từ nghiệm gây nhiễm VKT trứng gà không gây miễn dịch với kháng nguyên VKT) chuột nhận chế phẩm placebo (dung dịch Na l 0,9%) có tổng 30 Với cách thiết kế th nghiệm sử dụng chế phẩm kháng thể IgY cho động vật th nghiệm sau gây nhiễm VKT, TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 mong muốn khảo sát khả tạo miễn dịch thụ động sau nhiễm khuẩn; nói cách khác, chế phẩm IgY đặc hiệu kháng VKT ĐTT sử dụng theo phương thức điều trị Kết nghiên cứu hướng cho việc sử dụng kháng thể IgY kháng VKT ĐTT điều trị cho BN nhiễm VKT Một phương thức sử dụng khác kháng thể IgY kháng VKT ĐTT đáng quan tâm nghiên cứu đánh giá hiệu sử dụng dự phòng: uống kháng thể kháng VKT ĐTT có nguy nhiễm VKT Tuy nhiên, nghiên cứu chưa tiến hành đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm VKT kháng thể IgY kháng VKT ĐTT Kháng thể IgY kháng VKT ĐTT phân lập từ lòng đỏ trứng gà loại thực phẩm thơng thường Do đó, việc sử dụng theo đường uống t gây tác dụng khơng mong muốn Mặt khác, với công nghệ chế tạo IgY, có kháng thể IgY kháng VKT ĐTT với số lượng lớn giá thành rẻ Với kết nghiên cứu này, chúng tơi có thêm sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ IgY kháng VKT ĐTT, tác dụng dự phòng chế phẩm có nguy nhiễm VKT, góp phần vào việc kiểm soát bệnh tả, loại bệnh dịch nguy hiểm cộng đồng 31 KẾT LUẬN Kháng thể IgY kháng VKT IgY kháng ĐTT có tác dụng bảo vệ chuột nhắt trắng sơ sinh nhiễm VKT thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại CS Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra công nghệ tạo kháng thể IgY gà Tạp ch Thông tin Y Dược 2010, số 3, tr.71-76 Kazuyuki H, Hideyuki A CS Passive oral immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents cholera Acta Medica Okayama 2010, 64 (3), pp.163-170 World Health Organization Cholera 2013 Weekly Epidemiological Kecord 2014, No 31, 89, pp 345-356 http://www.wpro.who.int/vietnam/topics/ cholera/factsheet/vi/index.html, truy cập 02/5/2013 Huu Dat Tran, Munirul Alam, Nguyen Vu Trung et al Multi-drug resistant Vibrio cholerae O1 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010 J Med Microbiol 2012, 61 (Pt 3), pp.431-437 Yu L, Zhou Y, Wang R Multiple antibiotic resistance of Vibrio cholerae serogroup O139 in China from 1993 to 2009 PLoS ONE 2012, (6), e38633 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 - Nhóm chuột uống NaCl 0,9% sử dụng làm nhóm đối chứng sinh học, nhằm đảm bảo việc thực thao tác cho chuột uống qua sonde dày không gây chết động vật th nghiệm, không gây nhiễu kết nghiên cứu nhóm động vật th nghiệm lại Kết cho thấy, nhóm 17/30 chuột (56,7%) sống sót đến 60 kể từ bắt đầu th nghiệm - Nhóm 3: chuột nhiễm VKT khơng điều trị đặc hiệu (nhóm - chuột uống dung dịch IgY phân lập từ trứng gà không gây miễn dịch với kháng nguyên VKT) chuột nhận chế phẩm placebo (dung dịch Na l 0,9%) có tổng thời gian sống thêm tương đương Trong nhóm chuột nhiễm VKT uống dung dịch IgY đặc hiệu với kháng nguyên VKT (nhóm 4) nhóm chuột nhiễm VKT uống dung dịch IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT (nhóm 5), thời gian sống thêm cao rõ rệt so với nhóm nêu (p < 0,0001) Như vậy, nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên VKT ĐTT phân lập từ lòng đỏ trứng gà chuột th nghiệm gây nhiễm VKT Với cách thiết kế th nghiệm sử dụng chế phẩm kháng thể IgY cho động vật th nghiệm sau gây nhiễm VKT, mong muốn khảo sát khả tạo miễn dịch thụ động sau nhiễm khuẩn; nói cách khác, chế phẩm IgY đặc hiệu kháng VKT ĐTT sử dụng theo phương thức điều trị Kết nghiên cứu hướng cho việc sử dụng kháng thể IgY kháng VKT ĐTT điều trị cho BN nhiễm VKT Một phương thức sử dụng khác kháng thể IgY kháng VKT ĐTT đáng quan tâm nghiên cứu đánh giá hiệu sử dụng dự phòng: uống kháng thể kháng VKT ĐTT có nguy nhiễm VKT Tuy nhiên, nghiên cứu chưa tiến hành đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm VKT kháng thể IgY kháng VKT ĐTT Kháng thể IgY kháng VKT ĐTT phân lập từ lòng đỏ trứng gà loại thực phẩm thơng thường Do đó, việc sử dụng theo đường uống t gây tác dụng không mong muốn Mặt khác, với công nghệ chế tạo IgY, có kháng thể IgY kháng VKT ĐTT với số lượng lớn giá thành rẻ Với kết nghiên cứu này, chúng tơi có thêm sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ IgY kháng VKT ĐTT, tác dụng dự phòng chế phẩm có nguy nhiễm VKT, góp phần vào việc kiểm soát bệnh tả, loại bệnh dịch nguy hiểm cộng đồng KÕT LUËN Kháng thể IgY kháng VKT IgY kháng ĐTT có tác dụng bảo vệ chuột nhắt trắng sơ sinh nhiễm VKT thực nghiệm TÀI LIƯU THAM KH¶O Hồng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại CS Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra công nghệ tạo kháng thể IgY gà Tạp ch Thông tin Y Dược 2010, số 3, tr.71-76 29 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Kazuyuki H, Hideyuki A CS Passive oral immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents cholera Acta Medica Okayama 2010, 64 (3), pp.163-170 World Health Organization Cholera 2013 Weekly Epidemiological Kecord 2014, No 31, 89, pp 345-356 http://www.wpro.who.int/vietnam/topics/cholera/factsheet/vi/index.html, truy cập 02/5/2013 Huu Dat Tran, Munirul Alam, Nguyen Vu Trung et al Multi-drug resistant Vibrio cholerae O1 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010 J Med Microbiol 2012, 61 (Pt 3), pp.431-437 Yu L, Zhou Y, Wang R Multiple antibiotic resistance of Vibrio cholerae serogroup O139 in China from 1993 to 2009 PLoS ONE 2012, (6), e38633 30 ... số vi sinh vật gây bệnh người động vật phương pháp phân lập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên vi sinh vật Nghiên cứu nhằm: Khảo sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY. .. sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với VKT với ĐTT mơ hình gây bệnh tả thực nghiệm: Khảo sát tác dụng bảo vệ kháng thể IgY đặc hiệu với VKT với ĐTT mô h nh gây bệnh tả thực nghiệm chuột. .. tạo IgY, có kháng thể IgY kháng VKT ĐTT với số lượng lớn giá thành rẻ Với kết nghiên cứu này, chúng tơi có thêm sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ IgY kháng VKT ĐTT, tác