Đánh giá chất lượng và cơ chế tác dụng của globulin miễn dịch đặc hiệu nguồn gốc từ trứng gà kháng độc tố tả (cholera toxin)

Bài viết khảo sát chất lượng và có chế tác dụng của kháng thể IgY kháng độc tố tả được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên độc tố tả. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA GLOBULIN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU NGUỒN GỐC TỪ TRỨNG GÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ (CHOLERA TOXIN) Hoàng Trung Kiên*; Nguyễn Đặng Dũng* TÓM TẮT Theo số nghiên cứu gần động vật thực nghiệm, kháng thể kháng độc tố tả (ĐTT) (cholera toxin) kháng tiểu phần B ĐTT (CT-B subunit) sử dụng biện pháp tạo miễn dịch thụ động đặc hiệu nhằm điều trị và/hoặc dự phòng trường hợp nhiễm vi khuẩn (VK) tả đường tiêu hóa Trong nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát chất lượng có chế tác dụng kháng thể IgY kháng ĐTT phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên ĐTT Kết cho thấy kháng thể IgY kháng độc tố VK tả phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch thể hoạt tính đặc hiệu với độc tố VK tả in vitro, ngăn không cho độc tố gắn vào thụ thể GM1 * Từ khóa: Độc tố tả; Kháng thể IgY Study on quality and mechanism of action of yolk immunoglobulin (IgY) specific to cholera toxin Summary Recently, several papers revealed that antibodies against cholera toxin (CT) or CT-B subunit showed protective effect when used as preventive or therapeutic method on animal models orally infected with V.cholerae In the present study, we investigated the purity and tested the reactivity of IgY isolated from eggs laid of previously immunized hens The results showed that the IgY preparation isolated from eggs laid of immunized hens was relatively pure and could inhibit binding of CTB with GM1 in vitro * Key words: Cholera toxin; Immunoglobulin Y (IgY) ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tiêu chảy nguyên nhân gây tử vong hàng đầu toàn cầu, chủ yếu trẻ em, đặc biệt quốc gia phát triển Một tác nhân gây tiêu chảy cấp nhiễm K tả (Vibrio cholerae) theo đường tiêu hóa Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm 2013, năm 2012 ghi nhận 245.393 trường hợp mắc bệnh tả tất châu lục toàn giới, với 3.034 trường hợp tử vong [7] Cơ chế bệnh sinh bệnh có tham gia ĐTT (cholera toxin - CT), * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng (dzungmd@yahoo.com) Ngày nhận bài: 30/11/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/12/2013 Ngày báo đăng: 16/12/2013 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 VK tả tiết sau nhiễm vào ruột bệnh nguyên 0,1 mg/ml, sau gây miễn dịch nhân; ĐTT gây tổn thương tế bào niêm mạc cho gà mái, thu hoạch trứng tách chiết ruột, làm tăng tiết dịch ruột, dẫn đến ỉa kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng theo chảy cấp Một số nghiên cứu gần cho quy trình mơ tả nghiên cứu thấy, bên cạnh biện pháp dự phòng trước [1] điều trị kinh điển nhiễm VK tả (như sử dụng vắcxin, bổ sung nước, điện giải; sử dụng kháng sinh), việc sử dụng kháng thể đặc hiệu với VK tả với ĐTT biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị đặc hiệu có tác dụng bảo vệ rõ rệt mơ hình động vật thực nghiệm nhiễm VK tả đường tiêu hóa [4, 6] Trong nghiên cứu này, chúng tơi khảo * Kiểm tra khả gắn kết CT-B với GM1 in vitro: - Gắn GM1 lên phiến ELISA: ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) giếng phiến ELISA, thời gian nhiệt độ phòng - Tiến hành phản ứng: bổ sung vào giếng 50 µl cộng hợp HRP-CTB nồng độ khác nhau, cho lượng CTB giếng 1,25; 2,5 sát độ tinh sạch, đồng thời đánh giá hoạt ng; rửa giếng PBS-T, sau bổ sung tính kháng thể IgY phân lập từ trứng gà vào giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, gây miễn dịch với ĐTT in vitro 50 ml OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2 trước sử dụng); ủ phiến ELISA nhiệt ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP độ phòng 15 phút bóng tối; ngừng NGHIÊN CỨU phản ứng cách bổ sung 50 ul HCl 2N Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu - Độc tố VK tả (cholera toxin- CT) (Sigma, Hoa Kỳ) - Hố chất, sinh phẩm chủ yếu: hóa chất - Đo mật độ quang (OD) giếng bước sóng 492 nm * Ph¶n øng ELISA đánh giá hoạt tính kháng thể IgY kháng CT-B: chạy điện di SDS-PAGE; GM1, cộng hợp CTB - Ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) giếng (cholera toxin-B subunit)- HRP (horse radish phiến ELISA nhiệt độ phòng peroxidase) (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp) - Bổ sung cộng hợp HRP-CTB với Phƣơng pháp nghiên cứu kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà * Gây miễn dịch cho gà mái với kháng gây miễn dịch với kháng nguyên CT Giếng đối nguyên ĐTT phân lập IgY: - Tạo kháng nguyên ĐTT: trộn huyền dịch ĐTT với tá chất freund hoàn chỉnh chứng âm, sử dụng BSA thay cho IgY Bên cạnh đó, I Ig (intravenous immunoglobulin) sử dụng đối chứng dương thí nghiệm khơng hồn chỉnh (tỷ lệ 1:1 thể - Rửa phiến ELISA PBS-T Bổ sung tích); nồng độ ĐTT huyền dịch kháng vào giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, 50 ml TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2) Ủ phiến ELISA bóng tối 15 phút nhiệt độ phòng; ngừng phản ứng cách bổ sung 50 ul HCl 2N Đo OD giếng bước sóng 492 nm khoảng 70 kDa 35 kDa, tương ứng với chuỗi nặng (H) chuỗi nhẹ (L) IgY Khả gắn kết CTB với GM1 in vitro KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Độ tinh chế phẩm IgY sau phân lập Đánh giá độ tinh chế phẩm IgY sau thẩm tích loại muối kỹ thuật điện di SDS-PAGE điều kiện biến tính protein CT-B concentration (ng/well Hình 2: Khả gắn kết CTB với GM1 in vitro Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ khác nhau, CTB thể khả gắn kết đặc hiệu với GM1 in vitro Tác dụng IgY ức chế gắn kết CTB với GM1 Hình 1: Kết điện di SDS-PAGE điều kiện biến tính IgY Hình 3: Tác dụng IgY ức chế gắn kết CTB- GM1 in vitro (GM1: pmol/giếng; CTB: ng/giếng) Kết cho thấy, sản phẩm IgY thu sau thẩm tích loại bỏ muối amoni sulfate có độ tinh cao, với băng điện di SDS-PAGE có trọng lượng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Hình 4: Tác dụng IgY ức chế gắn kết CTB- GM1 in vitro (GM1: pmol/giếng; CTB: ng/giếng) Hình 5: Tác dụng IgY ức chế gắn kết CTB- GM1 in vitro (GM1: pmol/giếng; CTB: 0,2 ng/giếng) Kết phản ứng ELISA cho thấy: kháng thể IgY thu từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch độc tố VK tả phản ứng đặc hiệu với CTB, đồng thời thể tác dụng ức chế gắn kết CTB với GM1, BSA (đối chứng âm) tác dụng I Ig thể tác dụng ức chế gắn kết CTB với GM1 nồng độ CTB 1,0 0,2 ng/giếng (hình 4, 5), tác dụng nồng độ CTB ng/giếng (hình 3) Việc sử dụng I Ig đối chứng dương thí nghiệm dựa vào kết nghiên cứu Yuki N CS (1996) cơng bố, đó, nhóm nghiên cứu nhận thấy I Ig có tác dụng ngăn cản gắn kết ĐTT với GM1 in vitro [5] Kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm IgY 10 tạo thể hoạt tính ức chế gắn kết CTB với GM1 mạnh rõ rệt so với hoạt tính IVIg: tất nồng độ CTB khảo sát, IgY thể tác dụng ức chế Lý có kết IgY sử dụng thí nghiệm sản phẩm thu sau gây miễn dịch đặc hiệu với CT Do đó, IgY có khả gắn kết đặc hiệu với CTB, dẫn đến ức chế gắn kết CTB với GM1 Hoạt tính IgY kháng ĐTT chế tác dụng IgY đặc hiệu với CT tạo hiệu bảo vệ: IgY ức chế gắn CTB với thụ thể GM1 tế bào niêm mạc ruột, ngăn chặn ĐTT bám lên màng tế bào niêm mạc ruột, cuối cùng, giảm tác động gây tổn thương tế bào niêm mạc ruột ĐTT Bằng phương pháp gây miễn dịch gà mái thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch, Hoàng Trung Kiên CS thu IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng K E ictaluri (gây bệnh mủ gan cá tra) [1], kháng thể đặc hiệu với VK tả [2] Tim Sunnary CS với phương pháp tương tự thu kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng ức chế trực khuẩn mủ xanh mơ hình vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh [3] Trong nghiên cứu này, gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên ĐTT tự nhiên (CT), cho phép phân lập kháng thể IgY từ trứng gà gây miễn dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB Theo số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên CT-B, thể tác dụng bảo vệ mô hình động vật thí nghiệm nhiễm VK tả theo đường tiêu hóa [4] Kết thu nghiên cứu gợi ý: IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT (CT) và/hoặc CTB thể tác dụng bảo vệ TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 mơ hình động vật nhiễm VK tả đường tiêu hóa thông qua chế ức chế gắn kết CTB với GM1 KẾT LUẬN Chế phẩm kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên CT tương đối tinh khiết, có tác dụng ức chế gắn kết CTB với GM1 in vitro KẾT LUẬN Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Ngọc Tuấn Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra công nghệ tạo kháng thể IgY gà Tạp chí Thơng tin y dược 2010, số 3, tr.71-76 Hoàng Trung Kiên, Lê Thu Hồng, Lê Thu Hà, Nguyễn Đặng Dũng Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng K tả (Vibrio cholerae) gà mái Tạp chí Y - Dược học quân 2013, tập 38, số 1,tr 46-51 thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh vết thương bỏng thực nghiệm nhiễm trực khuẩn mủ xanh Tạp chí Y - Dược học quân 2011, tập 36, số 8, tr.44-49 Hirai K, Arimitsu H, Umeda K Passive oral immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents cholera ActaMedica Okayama 2010, 64 (3), pp.163-170 Nobuhiro Yuki, Fuminori Myiagi Possible mechanism of intravenous immunoglobulin treatment on anti-GM1 antibody-mediated neuropathies Journal of the Neurological Sciences 1996, Vol 139, Issue 1, pp.160-162 Osek J, Jonson G, Svennerholm AM, Holmgren J Role of antibodies against biotypespecific Vibrio cholerae pili in protection against experimental classical and El Tor cholera Infect Immun 1994, 62 (7), pp.2901-2907 World Health Organization Cholera, 2012 Weekly Epidemiological Record 2013, Vol 88, No 31, pp.321-336 Tim Sunnary, Đỗ Minh Trung, Lê Thu Hồng, Lê Văn Đông Tác dụng in vivo kháng 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 12 ... thấy: kháng thể IgY thu từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch độc tố VK tả phản ứng đặc hiệu với CTB, đồng thời thể tác dụng ức chế gắn kết CTB với GM1, BSA (đối chứng âm) tác dụng I Ig thể tác dụng. .. gây miễn dịch gà mái thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch, Hoàng Trung Kiên CS thu IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng K E ictaluri (gây bệnh mủ gan cá tra) [1], kháng thể đặc hiệu. .. gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên ĐTT tự nhiên (CT), cho phép phân lập kháng thể IgY từ trứng gà gây miễn dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB Theo số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY đặc