đánh giá chất lượng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn hà giang.pdf

đánh giá chất lượng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn hà giang.pdf

-

NGÔ VĂN DƯƠNG

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VÀ KHẢ NĂNG

CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2009

-

NGÔ VĂN DƯƠNG

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VÀ KHẢ NĂNG

CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN LAM ĐIỀN

Thái Nguyên - 2009

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lam Điền đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn KTV Cao Phương Thảo (phòng Thực vật học), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến (phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen), Khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các thầy cô giáo, cán bộ khoa sinh - KTNN, Ban giám hiệu Trường THPT Bắc Sơn, Sở GD&ĐT Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn

Tác giả luận văn

Ngô Văn Dương

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây lúa……… 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa……… 3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lúa……… 4

1.1.3 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam……… 5

1.1.4 Thành phần hoá sinh của hạt lúa 10

1.1.5 Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn……… 11

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật……… 13

1.2.1 Khái niệm về hạn……… 13

1.2.2 Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật……… 14

1.2.3 Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lúa……… 16

1.2.4 Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa……… 21

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa……… 22

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy……… 22

1.3.2 Một số thành tựu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng tế bào soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro……… 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu……… 25

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 25

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp phân loại các giống lúa cạn ……… 26

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 26

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả……… 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái của các giống lúa ………… 34

3.1.1 Phân loại các giống lúa……… 34

3.1.2 Đặc điểm hình thái các giống lúa……… 35

3.2 Đánh giá chất lượng hạt……….……… 37

3.2.1 Đánh giá chất lượng hạt trên phương diện cảm quan……… 37

3.2.2 Đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hóa sinh 38

3.3 Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa ……… 42

3.3.1 Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn nảy mầm… 42

3.3.2 Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn mạ……… 51

3.4 Khả năng chịu han của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mô sẹo 59

3.4.1 Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh của các giống lúa nghiên cứu……… 59

3.4.2 Độ mất nước của mô sẹo……… 60

3.4.3 Khả năng chịu mất nước của mô sẹo……… 61

3.4.4 Tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi sử lý thổi khô……… 62

3.4.5 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô……… 63

3.4.6 Xác định nhanh sức sống của tế bào mô sẹo bằng phương pháp nhuộm TTC 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 69

Bảng 1.1 Diện tích, năng xuất và sản lượng lúa của toàn Thế giới giai đoạn từ

Bảng 2.1 Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu……… 25

Bảng 3.1 Phân loại các giống lúa nghiên cứu……… 34

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống lúa 35

Bảng 3.3 Một số chỉ tiêu chất lượng hạt của các giống lúa……… 37

Bảng 3.4 Hàm lượng protein, đường tan của các giống lúa (% khối lượng khô) 39

Bảng 3.5 Hàm lượng axit amin dự trữ trong hạt của các giống lúa (g axit amin /100g mẫu) 40

Bảng 3.6 Thành phần và lượng axit amin trong protein hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein) 41

Bảng 3.7 Thành phần và hàm lượng các axit amin không thay thế trong hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein) 41

Bảng 3.8 Hoạt độ của -amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 5% ( ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm)……… 43

Bảng 3.9 Hàm lượng đường tan của các giố ng lúa khi xử lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm(%)……… 45

Bảng 3.10 Tương quan giữa hoạt đô enzyme α-amylase với hàm lượng đường tan của các giống lúa……… 46

Bảng 3.11 Hoạt độ protease của các giố ng lúa khi xử lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm (ĐVHĐ/mg)……… 47 Bảng 3.12 Hàm lượng protein của các giống lúa giai đoạn nảy mầm khi xử lý 49

nảy mầm của các giống lúa……… 50 Bảng 3.14 Tỷ lệ thiệt hại do hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ (%)……… 52 Bảng 3.15 Khả năng giữ nước của các giống lúa (%)……… 53 Bảng 3.16 Chiều dài rễ tại các thời điểm gây hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ

Bảng 3.17 Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lúa ở giai đoạn mạ……… 56 Bảng 3.18 Hàm lượng proline của các giống lúa ở giai đoạn mạ (mM/g khối lượng

tươi)……… 58 Bảng 3.19 Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh

của 5 giống lúa……… 60 Bảng 3.20 Kiểm tra sức sống của các giống lúa cạn bằng phương pháp nhuộm TTC 64

Hình 3.1 Hình thái hạt của các giống lúa nghiên cứu……… 36 Hình 3.2 Hàm lượng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cứu

với tiêu chuẩn của FAO……….……… 42 Hình 3.3 Sự biến động hoạt độ enzyme α-amylase của các giống lúa ……… 44 Hình 3.4 Định tính hoạt độ enzyme α-amylase của các giống lúa……… 44 Hình 3.5 Sự biến động hàm lượng đường tan các giống lúa ở giai đoạn nảy

mầm……… ……… 45 Hình 3.6 Sự biến động hoạt độ của enzyme protease của các giống

Hình 3.7 Ảnh định tính hoạt độ enzyme protease của các giống lúa………… 48 Hình 3.8 Hàm lượng protein các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm……… 49 Hình 3.9 Tỷ lệ thiệt hại do hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ……… 52 Hình 3.10 Chiều dài rễ của các giống lúa ở giai 7 ngày hạn……… 54 Hình 3.11 Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các giống lúa ở giai

đoạn mạ……… 55 Hình 3.12 Ảnh các giống lúa trước và sau 5 ngày gây hạn ở giai đoạn mạ…… 57 Hình 3.13 Sự biến động hàm lượng proline ở giai đoạn mạ của các giống lúa… 58 Hình 3.14 Tốc độ mất nước của mô sẹo các giống lúa sau khi xử lý thổi khô… 60 Hình 3.15 Khả năng sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô (%)………… 62 Hình 3.16 Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy……… 62 Hình 3.17 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô……… 63 Hình 3.18 Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo các giống lúa cạn…… 64 Hình 3.19 Khả năng phục hồi và tái sinh sau thổi khô của các giống lúa cạn ở

mức độ mô sẹo……… 65

ATPaza Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng năng lượng)ADN Deoxyribose Nucleic Acid

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản)

ASTT Áp suất thẩm thấu

ĐVMS Đơn vị mô sẹo

EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase

MS Murashige Skoog (Môi trường theo Murashige và Skoog)

LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài các phân đoạn ADN cắt hạn chế)

sHSP Small heat shock protein (Protein sốc nhiệt nhỏ từ 10 - 30 kDa)

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lúa ( oryza Sativa L.) là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số

trên thế giới Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Nghề trồng lúa ở Việt Nam có từ cổ xưa và là trung tâm đa dạng về cây lúa trồng hiện nay [52] Hiện hay hơn 60% dân số nước ta sống bằng nghề trồng lúa , nên lúa không chỉ có ý nghĩa vế mặt an ninh lương thực mà còn có giá trị về mặt kinh tế cho nông dân trồng lúa và đặc biệt quan trọng đối với những bà con dân tộc miền núi Nước ta có địa hình phức tạp 3/4 lãnh thổ là đồi núi, địa hình chia cắt và diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng và các miền trong năm [8], nên hạn có thể xảy ra bất cứ mùa nào, vùng nào trong năm

Lúa là loài cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh và là cây chịu hạn kém [40] Những yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa như lượng mưa nhiệt độ, ánh sáng không thuận lợi Trên thế giới, hàng năm hạn có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng nói chung [68] Ở Việt Nam, hàng năm trung bình mất khoảng 30 vạn tấn lương thực do thiên tai, trong đó hạn được xem là nhân tố chình làm giảm năng xuất lúa [1] Bên cạnh lúa nước, lúa cạn cũng chiếm một vị trí quan trọng đối với nông dân, đặc biệt là dân miền núi Lúa cạn phân bố ở vùng núi, địa hình đồi dốc Việt Nam lúa cạn phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc, Đông Bắc Bộ và Tây Nguyên, nơi có địa hình đồi núi, mưa nhiều nhưng lượng mưa phân bố không đều dẫn đến hạn cục bộ xảy ra thường xuyên Do đó việc nghiên cứu tính chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn cho cây lúa cạn là một thực tiễn quan trọng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [1], [40]

Cây lúa cạn năng xuất thấp nhưng lại thể hiện tính ưu việt về khả năng chống chịu hạn tốt, thích nghi cao với điều kiện sinh thái khó khăn, có chất lượng gạo tốt, thơm, dẻo, phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng và có tiềm năng phát triển để phục vụ cho xuất khẩu Hiện nay các giống lúa được canh tác phân tán, tự phát, chưa có

mất dần, diện tích trồng lúa bị thu hẹp Vì vậy sưu tập và tuyển chọn các giống lúa cạn có chất lượng tốt, khả năng chống chịu cao làm cơ sở cho chọn tạo giống trở thành một vấn đề cấp thiết

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Đánh giá chất

lượng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang” 2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng và khả năng chịu hạn của 5 giống lúa cạn trồng ở tỉnh Hà Giang

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân loại các giống lúa nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng hạt các giống lúa nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm

- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá - Đánh giá khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Cây lúa (Oryza sativa L) còn được gọi là lúa châu Á vì nó được thuần hoá từ

lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan – Myanmarr, Trung du Tây Bắc Việt Nam [30] Theo tài liệu của Trung Quốc thì khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa [6] Markey và De Candolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [30] Có tài liệu lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [22], [30] Có giả thuyết lại cho rằng tổ tiên của lúa Oryza

là một cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa [60] Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [6]

Tuy có nhiều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cây lúa đã lan rộng ra các vùng khác nhau [22], [30]

Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono

Cotyledones), bộ hòa thảo có hoa (Graminales), họ hòa thảo (Graminae), lúa trồng

thuộc chi Oryza (có 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể), có 23 loài phân bố khắp thế giới trong đó có hai loài lúa trồng Loài Oryza sativa L trồng phổ biến trên thế giới và phần lớn tập trung ở Châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở những nơi

có vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh

Indica ( được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan,

Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng

xuất thấp, mẫn cảm với ánh sáng Javanica có đặc điểm trung gian, hạt dài, dày và

gluberrima S được trồng với một diện tích nhỏ thuộc Tây Phi Sự tiến hóa của cây

lúa gắn liền với sự tiến hóa của loài người đặc biệt ở châu Á [61]

Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nước Lúa cạn, được trồng vào mùa mưa trên đất cao, đất thoát nước tự nhiên, trên những chân ruộng không đắp bờ hoặc không có bờ và không có nước dự trữ trên bề mặt

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nước biến đổi thành và những giống lúa này có khả năng trồng được ở những vùng khô hạn, vẫn có khả năng sinh trưởng phát triển bình thường trên ruộng có nước Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây trồng khác

Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm:

Nhóm lúa cạn cổ truyền, bao gồm những giống lúa cạn địa phương, thích nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuy nhiên giống lúa này có hạn chế là năng xuất thấp

Nhóm lúa không chủ động nước hoặc sống nhờ nước trời Loại này được phân bố trên những nương bằng, chân đồi thấp cố độ dốc dưới 5o Đây là những giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong những giai đoạn sinh trưởng nhất định, hiệu xuất sử dụng nước và tiềm năng năng xuất cao [16].

Năng xuất của các giống lúa cạn thường thấp do hai nguyên nhân chủ yếu: Giống xấu và đất nghèo dinh dưỡng, phát triển trên những vùng dân trí thấp và điều kiện canh tác kém [16] Tuy năng xuất lúa cạn không cao, trung bình đạt 15 tạ/ha, nhưng cây lúa cạn đã góp phần vào tổng sản lượng lúa một cách đáng kể (từ 20% - 40% ở những vùng sản xuất lương thực khó khăn), góp phần giải quyết lương thực tại chỗ cho nhân dân, giảm được công vận chuyển và chủ động lương thực trong một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện của nhiều địa phương

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lúa

Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5% Sản lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm Đặc biệt trong

những năm gần đây với sụ phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng lên [6]

Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nước 11% [22] Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu như lizin, triptophan, threonin… chất lượng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống [58] Do thành phần các chất dinh dưỡng tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như:

- Lúa gạo được chế biến thành trên 200 món ăn khác nhau [16], [61]

- Lúa gạo được dùng làm thức ăn cho gia súc với một lượng khá lớn Ở các nước phát triển lượng lúa gạo dành cho chăn nuôi chiếm một tỷ lệ cao

- Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, sản xuất bánh kẹo, sản xuất rượu bia…

Sản phẩm phụ của cây lúa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Tấm được dùng để sản xuất rượu, cồn axeton, phấn viết mịn… Cám được dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp, sản xuất các vitamin nhóm B, chế tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng… Vỏ trấu để sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc, vật liệu đóng lót hàng, vật liệu độn phân hữu cơ, làm chất đốt… Rơm rạ dùng cho công nhiệp sản xuất giấy, catông xây dựng, đồ gỗ gia dụng Gạo là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp phần ổn định an ninh lương thực nhân loại [21], [61]

1.1.3 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.3.1 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới

Theo thống kê của FAO năm 2006 có 114 nước trồng lúa và phân bố ở tất cả các Châu lục trên Thế giới Trong đó Châu Phi có 41 nước, Châu Á có 30 nước, Bắc

nước Diện tích trồng lúa biến động và đạt khoảng 152.000 triệu ha, năng suất bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha [61] Châu Á là khu vực có diện tích trồng lúa lớn nhất Thế giới chiếm 90%, Châu Phi 3,6%, Nam Mỹ 3,1%, Bắc Mỹ và Trung Mỹ 1,3% [59]

Bảng 1.1 Diện tích, năng xuất và sản lượng lúa của toàn Thế giới

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008 [64])

Bảng 1.1 thể hiện, diện tích canh tác lúa có xu hướng tăng Song tăng mạnh nhất vào thập kỷ 60, 70 của thế kỷ XX sau đó tăng chậm dần và có xu hướng ổn định vào những năm đầu của thế kỷ XXI Về năng suất lúa trên đơn vị diện tích cũng có chiều hướng tương tự Trong 4 thập kỷ cuối của thế kỷ XX năng suất lúa tăng gấp 2 lần từ: 23,8 tạ/ha năm 1970 đến 38,9 tạ/ha năm 2000, sau đó năng suất lúa vẫn tăng nhưng chậm dần Đến năm 2007 sản lượng lúa trên toàn thế giới là 651,70 triệu tấn

Sang những năm đầu của thế kỷ XXI, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào trong thâm canh lúa, chú trọng chỉ tiêu chất lượng hơn số lượng làm cho năng suất lúa có xu hướng chững lại hoặc tăng không đáng kể Tuy nhiên ở những nước

có nền khoa học kỹ thuật phát triển, năng suất vẫn cao hơn hẳn Điều này được chứng minh qua số liệu thống kê của 10 nước có sản lượng lúa đứng đầu thế giới (FAOSTAT, 2008) [64]

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa của 10 nước có sản lượng lúa

hàng đầu thế giới năm 2007

Tên nước (triệu ha) Diện tích Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (triệu tấn)

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008)

Theo số liệu của bảng 1.2, trong 10 nước trồng lúa có sản lượng trên 10 triệu tấn/năm có 9 nước nằm ở Châu Á, chỉ có một đại diện Brazin là ở Nam Mỹ Trung Quốc và Nhật Bản là hai nước có năng suất cao hơn hẳn đạt 63,41 tạ/ha (Trung Quốc) và 65,37 tạ/ha (Nhật Bản) Điều đó có thể lý giải vì Trung Quốc là nước đi tiên phong trong lĩnh vực phát triển lúa lai và người dân có tính cần cù, trình độ thâm canh cao Còn Nhật Bản là nước có trình độ khoa học kỹ thuật cao, đầu tư lớn [19] Việt Nam là nước có năng suất lúa cao đứng hàng thứ 3 trong 10 nước trồng lúa, đạt 48,68 tạ/ha Thái Lan tuy là nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới trong nhiều năm liên tục, song năng suất chỉ đạt 26,91 tạ/ha, Thái Lan chú trọng nhiều hơn đến canh tác các giống lúa dài ngày, chất lượng cao [6] Xét về diện tích trồng lúa thì Ấn Độ là nước có diện tích lớn nhất (44,00 triệu ha) còn nước đứng thứ

10 là Myanma (0,82 triệu ha) Về sản lượng Trung Quốc đứng đầu 187,04 triệu tấn và đứng thứ 10 là Nhật Bản 10,97 triệu tấn

Bên cạnh cây lúa nước, cây lúa cạn chiếm tỉ lệ đáng kể chiếm 15% sản lượng gạo trên Thế giới Lúa cạn được trồng ở khắp Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh Diện tích trồng lúa trên Thế giới khoảng 148 triệu ha (năm 1991), trong đó 19 triệu ha là lúa cạn: Châu Á có 12 triệu ha, Châu Mỹ La Tinh 3,3 triệu ha, Châu Phi 2,5 triệu ha, năng suất bình quân đạt 1 tấn/ha [76]

1.1.3.2 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Việt Nam là một trong 10 nước sản xuất lúa gạo lớn nhất trên thế giới Năm 1980 diện tích trồng lúa là 5,6 triệu ha, sản lượng là 23,5 triệu tấn Đến năm 2007 diện tích trồng lúa là 7,30 triệu ha, năng suất đạt 36,56 triệu tấn

Việt Nam là nước nông nghiệp , trong đó nghề trồng lúa đóng vai trò chủ đạo trong cơ cấu cây trồng, nên lúa có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế , xã hội nước ta Nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, lượng bức xạ mặt trời cao và đất đai phù hợp cho trồng lúa nên Việt Nam có thể trồng nhiều vụ lúa trong năm và với nhiều giống khác nhau Cùng với việc áp dụng các biện pháp chọn , tạo giống mới có năng suất, chất lượng cao và khả năng chống chịu tốt nên sản lượng lúa gạo nước ta không ngừng tăng lên, đã góp phần quan trọng đưa bình quân lương thực đầu người tăng lên Năm 1994 bình quân lương thực đầu người nước ta đạt 359 kg/người/năm nhưng đến năm 2005 đã tăng lên 476 kg

Mặc dù diện tích trồng lúa ở nước ta giai đoạn 1990 -2007 không tăng nhưng sản lượng và lượng gạo xuất khẩu không ngừng tăng được thể hiện ở bảng 1.3 [39], [62]

Năm 1990 Việt Nam xuất khẩu gạo được 1,62 triệu tấn, đến năm 2000 chúng ta đã đạt 3,50 triệu tấn Năm 2007 Việt Nam có sản lượng gạo xuất khẩu lớn nhất đạt 5,23 triệu tấn và giữ vững là nước xuất khẩu gạo lớn thứ hai trên Thế giới

Năm 2008 tuy diện tích trồng lúa giảm xong năng xuất và sản lượng đều tăng điều đó đã khẳng định vị thế cây lúa của Việt Nam Đặc biệt sản lượng xuất khẩu gạo vẫn được duy trì ổn định ở mức trên 5 triệu tấn Theo dự đoán của các chuyên

gia thì năm 2009 năng xuất, sản lượng và giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam sẽ giữ ở mức ổn định và có thể đạt 5,3 triệu tấn (theo dự báo của FAO)

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam

giai đoạn 1990 - 2007

Năm Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Xuất khẩu (triệu tấn)

(Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam, 2008 [39],[62])

1.1.3.3 Tình hình sản xuất lúa cạn trên thế giới và ở Việt Nam

Tổng diện tích lúa cạn ở trên thế giới khoảng 18,960 triệu ha , chiếm 13% diện tích trồng lúa thế giới , năng suất b ình quân chỉ đạt 1tấn/ha [74] Tuy diện tích không lớn, song nó đóng vai trò rất quan trọng và không thể thiếu được đối với nhân dân vùng núi cao, vùng sâu, vùng xa

Diện tích trồng lúa cạn phân bố không đều , chủ yếu tập trung ở châu Á , châu Mỹ La Tinh , châu Phi Trong từng khu vực diện tích gieo trồng lúa cạn cũn g khác nhau Những nước trồng nhiều là Ấn Độ , Bzazil, Indonesia, Banglades…Về tỷ lệ diện tích lúa cạn so với lúa nước ở từng vùng cũng rất khác nhau , có những nước trồng 94% diện tích lúa cạn như Liberia , Bzazil (76%)….Ở châu Á tỷ lệ này thấp hơn: Philippin (11,3%), Indonesia (21%), Malaixia (5%)…[74]

Ở Việt Nam diện tích lúa cạn chiếm 7,5% diện tích trồng lúa , được phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc (210.000 ha), vùng duyên hải Trung Bộ (77.000 ha), vùng Cao Nguyên (128.000 ha), vùng Đông Nam Bộ (233.000 ha) và một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long (2.000 ha) [21]

1.1.4 Thành phần hoá sinh của hạt lúa

Trong hạt lúa khô có 1,79 – 3,07 % lipit, 5,5 – 13% protein, 62,40 – 82,51%, tinh bột, 5,7% tro và 0,48 – 1,19% đường Ngoài ra còn chứa một số chất khoáng và vitamin, nhất là vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, PP lượng vitamin B1 là 0,45mg/100g hạt, trong đó ở phôi chiếm 47%, vỏ cám 34,5%, ở hạt gạo chỉ có 3,8% nên nếu khi xát kĩ hàm lượng B1 trong hạt gạo còn rất thấp [20], [21], [22], [43]

Lipit chủ yếu tập trung ở vỏ gạo Nếu ở gạo xay có hàm lượng lipit là 2,02% khối lượng khô thì gạo xát lượng lipit chỉ còn 0,52% Hàm lượng lipit liên quan đến chất lượng trên hai phương diện là giá trị dinh dưỡng và giá trị bảo quản Hàm lượng lipit càng cao thì bảo quản càng phức tạp [13], [63]

Tinh bột chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần vật chất khô trong hạt lúa, chiếm 62,4 – 82,51%, nó là nguồn chủ yếu cung cấp calo [20] Tinh bột được cấu tạo bởi amylose và amylopectin Amylose có cấu tạo mạch thẳng có nhiều ở gạo tẻ, độ dẻo thấp Amylopectin có cấu tạo mạch nhánh có nhiều ở gạo nếp tạo nên độ dẻo đặc trưng ở cơm [11], [15]

Protein trong hạt lúa chiếm từ 5,5 - 13,0% khối lượng khô của hạt Khoảng 80% protein là glutelin, 18 – 20% là prolalin, 2 – 8% là globulin, abumin chiếm 5% Glutelin là một loại protein quan trọng, có thành phần axit amin cân đối với gần 3% lizin, khối lượng phân tử lớn (20 - 22KDa và 35 - 37KDa) Prolamin gạo là một trong những protein dễ tan, dạng chính là 13KDa còn lại là những thành phần phụ, thành phần axit amin rất giàu glutamin, prolin, lơxin nhưng thấp về metionin, cystein, threonin và tyrozin Globulin là thành phần chính của protein trong phôi hạt thóc, khối lượng phân tử 26 KDa [73] Albumin trong gạo là loại protein không đồng nhất, gồm nhiều thành phần điện di và phân li mạnh [58]

Trong lúa nước hàm lượng protein chiếm từ 5,50 – 10,77%, các giống lúa cạn thì hàm lượng cao hơn từ 8,00 – 11,62%, lúa nếp cao hơn lúa tẻ và lúa thơm cao hơn lúa thường Hàm lượng protein trong hạt lúa không cao nhưng là protein dễ tiêu hoá và hấp thu với người và vật nuôi Trong hạt lúa protein có 17 loại axit amin trong đó có các axit amin không thay thế là : valine, lơxin, isolơxin, metionin, phenylalanin, lizin, threonin [13]

Kỹ thuật điện di cho phép phân tách hỗn hợp phức hệ protein thành những tiểu phần khác nhau dựa trên nguyên tắc tốc độ dịch chuyển khác nhau theo khối lượng của tiểu phần đó Dựa vào các băng điện di có thể so sánh thành phần điện di giữa các mẫu nghiên cứu, xác định tính đa dạng sinh học trên cơ sở phân tích đa hình protein [33], [34]

Khi nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của các giống lúa cạn địa phương cho thấy các giống lúa nghiên cứu có số băng điện di khác nhau dao động từ 17- 20 băng, trong đó cao nhất là giống nếp lai tẻ là 20 băng Điều này chứng tỏ hàm lượng của các tiểu phần protein hạt ở giống lúa nếp lai tẻ cao hơn so với các giống lúa khác [58] Nghiên cứu về thành phần hoá sinh hạt của một số giống lúa cạn trồng phổ biến ở Bắc Kạn và Cao Bằng, kết quả phân tích thành phần điện di protein dự trữ hạt đã xác định được sự khác nhau về số lượng các băng điện di giữa các giống (17- 21 băng), protein dự trữ hạt biểu hiện tính đa hình [37]

1.1.5 Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn

Thời gian sinh trưởng và phát triển của cây lúa kể từ khi tra hạt đến khi thu hoạch gồm 3 thời kỳ Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, thời kỳ sinh trưởng sinh thực, thời kì hình thành hạt và chín (IRRI 1991)[76]

Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, cây lúa hình thành nhánh, lá và một phần thân, cần có sự cân đối giữa sinh trưởng nhánh và sinh trưởng lá sao cho số nhánh mới sinh ra đều có khả năng tạo ra được số lá vốn có của giống Yếu tố này rất quan trọng vì nó tạo ra số nhánh hữu hiệu tạo năng xuất cho cây [76]

Thời kỳ sinh trưởng sinh thực Cây lúa hình thành hoa, tập hợp hoa thành bông lúa, thời tiết thuận lợi thì số hoa của bông lúa sẽ hình thành tối đa tạo điều kiện để có nhiều hạt trên bông [76]

Thời kỳ chín, ở các hoa lúa được thụ tinh xảy ra quá trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi (nếu dinh dưỡng đủ, thời tiết tốt, không sâu bệnh) – sự hình thành hạt chắc – sản phẩm chủ yếu của cây lúa sẽ cao [76]

Thời gian sinh trưởng và phát triển của cây lúa cạn giao động từ 3 đến 5 tháng Đặc điểm hình thái của cây lúa gồm 3 phần chính, rễ, thân, lá Rễ lúa gồm 3 loại chính (rễ mầm, rễ phụ, rễ bất định), rễ mầm hình thành từ rễ phôi tồn tại 5 - 7 ngày sau đó rụng đi, rễ phụ hình thành từ các đốt trên của thân lúa phát triển nhanh thành bộ rễ chùm và làm nhiệm vụ chính trong hút chất dinh dưỡng phục vụ cho đời sống của cây lúa, rễ bất định là loại rễ phụ hình thành từ các đốt phía trên cao của thân chúng tham gia một phần vào hút chất dinh dưỡng Số lượng rễ, số lông rễ, độ lớn của rễ phụ thuộc vào từng giống, những giống lúa cạn có số lượng rễ, độ lớn, độ dài và đặc biệt có độ dày của vỏ rễ lớn hơn nhiều so với lúa nước Điều đó giúp lúa cạn có bộ rễ ăn sâu và phát triển tốt trong điều kiện khô hạn [21]

Trong số các tính trạng của bộ rễ được nghiên cứu thì tính trạng tổng chiều dài rễ có mối liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nương Khả năng thu thập nước và cung cấp đủ nước thông qua rễ tới các bộ phận của cây trong điều kiện khó khăn về nước được coi là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn [30]

Thân lúa: Có thân giả và thân thật Thân giả do các bẹ lá kết hợp với nhau tạo thành (thời kỳ lúa con gái) Thân thật chỉ hình thành khi cây lúa vươn đốt, phần cuối của thân là bông lúa (IRRI, 1991) [76]

Lá lúa có hai loại, lá không hoàn toàn và lá hoàn toàn (lá thật) Lá lúa có màu sắc khác nhau, tùy giống Đa số lá có màu xanh và ở các mức độ khác nhau Trên thân lúa, lá ra kế tục nhau và xếp so le Số lá trên thân chính phụ thuộc vào số gióng Giống có thời gian sinh trưởng càng dài thì số lá càng nhiều Chỉ số diện tích lá của lúa cạn thường cao nhưng tổng số lá trên cây lại ít hơn so với lúa nước [40]

Lúa cạn có bộ lá dày hơn, tuy hô hấp nhiều nhưng giữ nước tốt Trên bề mặt lá có nhiều lông do vậy có thể hấp thụ sương đêm Đặc điểm của các giống lúa cạn khi độ ẩm đất giảm thì lá cuộn lại và khí khổng đóng lại để giảm sự mất nước [78] Việc đóng mở khí khổng được điều khiển thông qua điều chỉnh áp suất thẩm thấu hoặc hormon ABA (acid Abscisic) [40]

Bông lúa, có nhiều hình dạng khác nhau (bông thẳng, bông cong đầu, bông cong tròn) Bông lúa được phát triển từ cuối đốt cuối của thân, trải qua các thời kỳ phân hóa, trổ, phơi màu, thụ phấn, chín sữa, chín sáp và chín hoàn toàn [6]

Tóm lại, trong đời sống cây lúa, mỗi yếu tố cấu thành năng xuất được xác định bởi mỗi giai đoạn sinh trưởng xác định:

- Số bông/m2 đất phụ thuộc vào mật độ cấy (mật độ tra hạt), khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, được quyết định ngay giai đoạn đầu

- Số hạt/bông được quyết định trong thời kỳ làm đòng

- Tỷ lệ hạt chắc được quyết định vào trước, trong và sau khi trỗ bông

- Khối lượng 1000 hạt do giống quyết định, nhưng lượng bức xạ mặt trời ở kỳ sau trỗ, đặc biệt là nước và dinh dưỡng có ảnh hưởng nhất định đến tính trạng này

Các điều kiện thời tiết, chăm sóc, phân bón có ảnh hưởng đến từng yếu tố năng suất Hiểu biết về mối quan hệ đó là điều mấu chốt và cần thiết để tác động các biện pháp kỹ thuật, nhằm nâng cao năng suất lúa có hiệu quả

1.2 Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 1.2.1 Khái niệm về hạn

Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn , làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây

Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng huỷ hoại cây cối và mùa màng

Theo Robert và CS (1991) hạn được xem là nhân tố gây thiệt hại lớn nhất đối với năng suất lúa Trên thế giới , thiệt hại do khô hạn hàng năm gây ra đối với sản xuất lúa khoảng 1,024 triệu đôla [88]

1.2.2 Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật

1.2.2.1 Tính chịu hạn của thực vật

Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ (nóng, lạnh), nước, phèn, độ mặn… Nếu ở ngoài giới hạn đó, thì các nhân tố sinh thái này có thể gây hại, cản trở cho sự sinh trưởng và phát triển của cây dẫn đến giảm năng suất sinh học [1]

Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất diễn ra, như vậy nước có ý nghĩa sinh thái và sinh lý quyết định đời sống của thực vật Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật Mức độ tổn thương của cây trồng do thiếu nước gây ra có nhiều mức độ khác nhau như: chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [1]

Hạn là một hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật Khái niệm “khô hạn” dùng để chỉ tình trạng mất nước của cây Hiện tượng mất nước có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của sự thiếu nước trong môi trường hoặc có thể do tác động thứ cấp được gây ra bởi nhiệt độ thấp, sự đốt nóng, hay do độ mặn của muối…Tuy nhiên rất khó có thể xác định được thế nào là một trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được [81]

1.2.2.2 Các nguyên nhân gây hạn* Hạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (390

- 420) và độ ẩm thấp (<65%) Hiện tượng này thường gặp ở những tỉnh Miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc Bộ vào cuối thu , đầu đông Hiện tượng này cũng xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel , gió Mistral ở miền nam nước Pháp…làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loại cây trồng như phong lan, cam, chanh, đậu tương [7]

Hạn không khí ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây trên mặt đất như hoa, lá, chồi non…Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng hé o tạm thời, vì nhiệt độ cao, ẩm độ thấp làm cho tốc độ thoát hơi nước nhanh vượt quá mức bình thường , lúc đó rễ hút nước không đủ để bù đắp lại lượng nước mất , cây lâm vào trạng thái mất cân bằng về nước Mức độ phản ứng của cây đối với sự mất nước sẽ tuỳ thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng Riêng đối với cây lúa hạn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đặc biệt vào thời kỳ bắt đầu hình thành các cơ quan sinh sản cho đến lúc kết thúc quá trình thụ phấn Hạn không khí gây hại nhất ở giai đoạn lúa phơi màu và thậm chí gây nên mất mùa nếu gặp phải đợt nhiệt độ cao và độ ẩm không khí thấp (mặc dù nước trong đất không thiếu ) làm cho hạt phấn không có kh ả năng nẩy mầm , quá trình thụ tinh không xẩy ra và hạt bị lép [7]

* Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tuỳ thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đấ t tăng cao đến mức cây không cạnh tranh được nước của đất làm cho cây không thể lấy nước vào tế bào qua rễ, chính vì vậy hạn đất thường gây nên hiện tượng cây héo lâu dài Hạn đất có thể xẩy ra ở bất kỳ vùng đất nào và thường xẩy ra nhiều ở những vùng có điều kiện khí hậu , địa hình, địa chất, thổ nhưỡng đặc thù như sa mạc ở Châu Phi ; đất trống đồi trọc của châu Á ; mùa ít mưa và nhiệt độ thấp ở châu Âu Tóm lại hạn

đất tác động trự c tiếp lên bộ phận rễ của cây làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng [7]

* Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xẩy ra cùng một lúc Trong trường hợp này cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên , mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn , cây không có khả năng phục hồi [7]

Ở nước ta , hiện tượng hạn toàn diện thường xẩy ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An , Quảng Trị…) gây nên thiệt hại đá ng kể về năng suất lúa vào các tháng cuối hè

1.2.2.3 Tác động của hạn đến thực vật

Ảnh hưởng của hạn trước hết là sự mất nước của tế bào và mô Bất kỳ sự mất nước nào cũng dẫn đến sự vi phạm chế độ nước và gây sự thiếu hụt nước trong tế bào Sự thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu Thiếu nước nhẹ chỉ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng Thiếu nước nặng gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh chất kéo theo quá trình già hoá tế bào, làm cho cây bị héo Khi bị khô nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào bị tổn thương và chết [7]

1.2.3 Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lúa

1.2.3.1 Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn

Để chống lại khô hạn thực vật có những biến đổi sinh lý, hoá sinh nhằm không để mất nước Có hai cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước là cơ chế tránh mất nuớc và cơ chế chịu mất nước Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ [1]

Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước [7] Bên cạnh đó cây có hệ mạch phát triển, dẫn nước lên các cơ quan thoát

nước, có hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự mất nước của cây do sự thoát hơi nước Cơ chế tránh mất nước phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất nước một cách tối đa [1], [40]

Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ [86]

Cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi sinh hoá diễn ra trong tế bào, nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích luỹ các chất hoà tan, các protein, các axit amin ví dụ như axit amin prolin, mannitol, fructose, K+

, các enzym phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng:

- Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ - Thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá huỷ màng và các phức protein [1]

1.2.3.2 Cơ sở sinh hoá của tính chịu hạn

Thành phần hoá sinh của hạt như: Hàm lượng protein, đường tan, enzym, thành phần axit amin,… không chỉ là cơ sở để dánh giá chất lượng hạt mà còn là các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chống chịu của cây trồng [25], [26], [49]

Trong cơ thể thực vật, đường tập chung nhiều ở thành tế bào, mô nâng đỡ, mô dự trữ, là sản phẩm của quá trình quang hợp ở tế bào Đường có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể sống, đó là cung cấp năng lượng cho cơ thể, cấu trúc và tạo hình, góp phần bảo vệ tương tác đặc hiệu cho tế bào… Theo nhiều nghiên cứu, hàm lượng đường tan có liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây trồng Đuờng tan là một trong các chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Những nghiên cứu đã thấy rằng, tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thông qua các phân tử đường tan thì làm tăng khả năng chống chịu của cây trồng [29], [41], [65]

Tác giả Đỗ Thị Dương đã nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của năm giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chống chịu của các giống lúa có tương quan thuận với hàm

hình thái, hoá sinh hạt của một số giống lạc, nhận thấy có mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan, protein, hoạt độ enzym với khả năng chịu hạn [24], [45] Trên đối tượng là cây đậu tương, Hà Tiến Sỹ (2007) đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đỗ tương địa phương của tỉnh Cao Bằng ở giai đoạn mầm đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống có tương quan thuận với tỷ lệ tăng của hàm lượng đường tan, hoạt độ enzym amylase [46]

Axit amin prolin có vai trò quan trọng trong điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào, đồng thời nó là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tương tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và phức protein khác Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp prolin [50], [66], [85] Sự gia tăng hàm lượng prolin ở thực vật khi gặp phải điều kiện bất lợi như do hạn, mặn, nóng… có liên quan đến các gen tổng hợp prolin và các gen điều khiển quá trình vận chuyển prolin Khi môi trường đất thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của tế bào không thể cạnh tranh được với áp suất thẩm thấu của đất thì gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin sẽ được hoạt hoá, xúc tiến cho việc tổng hợp prolin và vận chuyển prolin đến các mô, tế bào có nhu cầu Khi cây ở tình trạng bình thường (không chịu tác động của stress môi trường) thì prolin trong cây sẽ được chuyển hoá thành glutamat Còn khi cây rơi vào tình trạng thiếu nước do hạn thì glutamat sẽ được chuyển hoá thành prolin [87], [90]

Enzym là chất xúc tác sinh học có hiệu quả cao Mỗi một loại enzym xúc tác cho một quá trình chuyển hoá theo một kiểu phản ứng đặc hiệu nhất định Trần Thị Phương Liên (1999) khi xử lí nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến hoạt tính protease của các giống đậu tương chịu hạn, không ảnh hưởng đến các giống chịu nóng, còn điều kiện áp suất thẩm thấu cao thì đều ảnh hưởng đến enzym này ở các giống [26] Các nghiên cứu khi xử lý hạn sinh lý ở giai đoạn nảy mầm đều nhận thấy giống có hàm lượng protein cao thì hoạt độ enzym protease cũng cao Tỷ lệ tăng hoạt độ enzym protease sau hạn so với trước gây hạn tỷ lệ thuận với khả năng chống chịu của các giống [9], [38] Trong giai đoạn nảy mầm enzym α – amylase là một trong những

enzym quan trọng trong quá trình thuỷ phân tinh bột thành dextrin và mantose Sự tăng hoạt độ của α – amylase làm tăng hàm lượng đường tan trong cây vì vậy làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào nên khả năng chịu hạn của cây cũng tăng lên [17]

Ngoài ra đã có nhiều công trình nghiên cứu vai trò của axit abscisic (ABA) [91] Skiver và Mundy (1990) đã nghiên cứu xác định chức năng của một số gen trong việc giải mã các protein và cơ chế biểu hiện gen ở thực vật khi gặp mất cân bằng thẩm thấu xử lý ABA

Như vậy cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp không chỉ liên quan đến đặc điềm hình thái giải phẫu của cây mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh trong tế bào và sự điều chỉnh các gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

1.2.3.3 Cơ chế phân tử của tính chịu hạn

Để khai thác tối đa tiềm năng của các giống cây trồng cần nắm vững phản ứng của các giống cây trồng đối với các điều kiện ngoại cảnh Phản ứng của cây trồng rất đa dạng và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen và mức độ khắc nghiệt của điều kiện ngoại cảnh bất lợi Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào liên quan đến điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào Được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là các protein sản phẩm của quá trình biểu hiện gen

Sự biểu hiện của các gen liên quan đến stress phụ thuộc vào khả năng nhận biết stress Bằng chứng là tăng cường các chất điều khiển phản ứng của cây trồng đối với stress Ví dụ như ABA, axit jasmonic, ethylen, Ca++,… Mức độ biểu hiện của một số gen tăng lên, một số yếu hẳn đi Điều hoà biểu hiện của các gen này khi gặp stress đang được tăng cường nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trước phiên mã và sau phiên mã [25]

Nghiên cứu tính chịu hạn của thực vật theo cơ chế chịu mất nước, các nhà khoa học nhận thấy rằng các nhóm chất liên quan đến việc bảo vệ cấu trúc của tế bào và điều chỉnh áp suất thẩm thấu có vai trò đặc biệt quan trọng Những nhóm

chất đặc biệt quan tâm đến là protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) trong đó có các chất môi giới phân tử - MGPT (molecular chaperone), Ubiquitin,…

Protein sốc nhiệt ở hầu hết các loại thực vật như: lúa mỳ, lúa gạo, đậu nành, hành tỏi, … chúng chiếm 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao Sự suất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá huỷ do stress nóng và mở rộng ngưỡng với sự chống chịu nhiệt độ cao Trong các tế bào thực vật, HSP trong tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (Heat Shock Granules – HSG) Người ta cho rằng các HSG gắn kết trên các ARN – polymease để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng Sau sốc nóng các HSG phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [25]

Dựa vào khối lượng phân tử HSP được chia thành 6 nhóm: HSP110, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP8,5 Trong đó nhóm HSP70 và HSP60 có đại diện của chất MGPT, HSP8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân giải protein không có hoạt tính enzym, ngăn chặn các protein gây độc cho tế bào Ubiquitin có khối lượng phân tử thấp, ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ nên chúng có vai trò tự sửa chữa khi gặp các yếu tố cực đoan nhất là nhiệt độ cao

MGPT làm một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau nhưng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào MGPT được tăng cường tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào nhất là do tác động của nhiệt độ

Các nhóm HSP90, HSP100 đều có tính bảo thủ cao, có hoạt tính ATPase Một số tìm thấy trong tế bào bình thường, nhưng phần lớn chúng sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, nóng, lạnh Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá protein biến tính [25], [32]

Protein LEA (Late embryogenesis abundant protein) là protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi và là một trong những

nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào Nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong tính chịu khô hạn của hạt Khi điều kiện mất nước xảy ra, LEA tham gia vào bảo vệ màng tế bào, cô lập ion, ổn định pH tế bào [25], [27], [32]

Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, hoá sinh, cấu trúc tế bào nhận thấy một loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác nhau trong các giai đoạn phát triển khác nhau Điều đó chứng tỏ tính chống chịu là đa gen, tức là do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây Ngày nay trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn

1.2.4 Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa

Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa đã thu hút được nhiều tác giả quan tâm Silva và Cs (1986) nghiên cứu đặc điểm hình thái của bộ rễ lúa nhận thấy tổng chiều dài bộ rễ có liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nương [84] Sau đó các nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, hoá sinh liên quan đến khả năng chịu hạn của lúa được quan tâm

Đinh Thị Phòng (2001) đã chọn, tạo được giống lúa DR1 và DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn so với giống lúa gốc bằng phương pháp chọn dòng tế bào soma [40] Bằng xử lý mô sẹo lúa một tuần tuổi bằng NaCl , Lê trần Bình và Cs (1998) đã chọn được hai dòng lúa có khả năng chịu muối là C0 và C8 [1] Lê Xuân Đắc (1998) xử lý lạnh hai giống lúa C71 và TK90 ở nhiệt độ 1±0,50C đã thu được một số dòng lúa có khả năng chịu lạnh [5] Nguyễn Thu Hoài (2005) nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương thu thập ở Bắc Kạn, Cao Bằng, Sơn La đã so sánh được khả năng chịu hạn của các giống lúa để làm vật liệu khởi đầu cho việc chọn, tạo các giống lúa [17] Cũng theo hướng nghiên cứu này Bùi Thị Thu Thuỷ (2006) đã đánh giá được khả năng chịu hạn của các giống lúa CR203, U17, KD18, BT [54]

Price và Cs (2002) sử dụng RFLP và AFLP, SSR đã xác định được 142 chỉ thị

Từ thực trạng đang mất dần nguồn gen lúa cạn, đến nay đã có nhiều công trình sưu tập đánh giá khả năng chịu hạn, đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống lúa nhằm bảo tồn nguồn gen quý Đó là công trình nghiên cứu của Nguyễn Thu Hà và Cs (2003) về 47 giống lúa cạn sưu tập tại các tỉnh phía Bắc [14], Trần Văn Thuỷ (1999) đánh giá nguồn gen cây lúa ở Tây Nguyên [53] Các công trình nghiên cứu của Đỗ Thị Dương (2001) [11], của Nguyễn Thị Hải Yến (2002) [58], Vì Thị Xuân Thủy (2008) [61], của Nguyễn Đức Hoàng (2008) [18] đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa hạt, phân tích đa hình protein hạt và khả năng chịu hạn của các giống lúa

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ , các loại mô , cơ quan nuôi cấy phân lập và cây hoàn chỉnh Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể nghiên cứu một cách đơn độc hay tổ hợp các tác động bất lợi mà ngoài tự nhiên khó thực hiện được , qua đó cho phép tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu [1]

Đối với mỗi loại thực vật nhất thiết phải nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho việc đánh giá Những hệ thống nuôi cấy thường được sử dụng là nuôi cấy mô sẹo , nuôi cấy tế bào huyền phù , nuôi cấy tế bào trần Đánh giá khả năng chống chịu bằng nuôi cấy mô có thể được tiến hành theo hai cách : trực tiếp và gián tiếp Đa số trường hợp người ta tiến hành đánh giá trực tiếp Mô sẹo được gây stress bởi các tác nhân cực đoan Sau thời gian để mô sẹo phục hồi , đánh giá khả năng chống chịu thông qua các tế bào sống sót Các tế bào trên được cấy chuyể n lên môi trường tái sinh cây để tiếp tục đánh giá [5], [42] Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc thấp , chưa phân hoá , phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao Nhiều tác giả đã thôn g báo nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi về nhiễm sắc thể (dị bội , đa bội ) và những biến đổi di truyền khác Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những

biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa trong chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong phú hơn [1]

Hiện nay người ta đã tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô sẹo với hiệu suất rất cao ở nhiều loại cây trồng có ý nghĩa kinh tế như : lúa nước, lúa mì, lúa mạch, thuốc lá, củ cải đường, mía, chuối, đu đủ

1.3.2 Một số thành tựu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng tế bào

soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Những yếu tố bất lợ i của môi trường như nhiệt độ cực đoan (nóng, lạnh), lượng mưa không phù hợp (hạn), độc tố đất gây phèn (nhôm, pH thấp), mặn (muối

NaCl)…là những yếu tố gây hạn chế tới năng suất cây trồng

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào th ực vật đã đạt được những thành công nhất định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng như : chịu hạn [40], [41], chịu lạnh [5], chịu nhiệt độ cao [48], chịu muối NaCl [29]

Innis M.A., Gelfand D.H.,Sninsky J.J, White T.J (1990) tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất làm tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa Nồng độ ABA thích hợp cho việc tiền xử lý mô sẹo lúa là 10-5M và thời gian xử lý là 5 đến 7 ngày [77]

Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo in vitro, Nguyễn Hoàng Lộc và CS (1992) đã

thu được 4 dòng thuốc lá chịu NaCl 1%, các dòng này vẫn duy trì khả năng chịu NaCl sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trường không có NaCl và ở thế hệ thứ nhất (R1) [29]

Lê Xuân Đắc (1998), khi xử lý lạnh 2 giống lúa 71 và TK 90 ở nhiệt độ 10C0,50C đã thu được một dòng lúa duy trì khả năng chịu lạnh có triển vọng làm giống [5]

Đinh Thị Phòng (2001), Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa của các giống lúa CR 203, CH133, Lốc, X11, C70, đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn , tạo thành các quần thể R 0 làm nguyên liệu cho việc chọn lọc [40]

Nguyễn Hoàng Lộc (1992) sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA , manitol và saccharose đã thu được các dòng mô thuốc lá SC, SC2, SC3 có khả năng chịu mất nước trên 90% trọng lượng tươi [29]

Nguyễn Thị Tâm (2004), bằng phương pháp x ử lý mô sẹo các giống lúa CR203, CS4, Ml107, 79-1, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (400C, 420C) đã tạo ra được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [48]

Nghiên cứu khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đã và đang được nhiều tác giả quan tâm Tuy nhiên việc ứng dung kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc nghiên cứu khả năng chịu hạn vẫn còn nhiều hạn chế Trong những năm gần đây , với sự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều triển vọng cho việc nhiên cứu khả năng chịu hạn ở các đối tượng cây trồng khác nhau, trong đó có cây lúa.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Sử dụng 5 giống lúa sưu tầm ở Huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang (Tên giống lúa theo tên địa phương) bao gồm: Ngái nỏ, Khẩu tán, khẩu mang, Khẩu đen, Shan râu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

1 NN Ngái nỏ Bắc Quang - Hà Giang 2 KT Khẩu tán Bắc Quang - Hà Giang 3 KM Khẩu mang Bắc Quang - Hà Giang 4 KĐ Khẩu đen Bắc Quang - Hà Giang 5 SR Shan râu Bắc Quang - Hà Giang

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hoá chất: Hóa chất sử dụng được mua ở các nước Anh, Đức, Trung Quốc

gồm: Ethanol, agarose, Na2HPO4.12H2O, axit citric, NaOH, NaCl, CuSO4, Na2CO3, C4H4O6KNa.4 H2O, thuốc thử foling, petroleum ether, SDS, acrylamide, axit sunfosalysilic, các loại đệm phosphat citrat, tinh bột chuẩn, K3[Fe(CN)6], Fe2(SO4)3, H2SO4,gelatin, 2,4D (Axit Dichlorphenoxyacetic), -NAA (Axit Naphthylacetic), kinetin, các chất khoáng đa lượng , vi lượng, vitamin, prolin chuẩn, tinh bột chuẩn , toluen, và nhiều hóa chất thông dụng khác

Thiết bị: Các thiết bị chính được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu gồm: Máy

phân tích axit amin tự động – HP aminno Quan SeriesII (Hewlett Parkard), máy Quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia), bộ điện di protein của hãng Biorad (Mỹ), cân phân tích điện tử (Thụy Sỹ, Anh), máy ly tâm lạnh của hãng Hittich (Đức), máy đo pH (Metter Toledo), tủ lạnh sâu -850

C, box cấy, nồi khử trùng Tomy (Nhật Bản),

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các chỉ tiêu được nghiên cứu và phân tích được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thực vật học , Di truyền học, Công nghệ tế bào và Công nghệ gen Khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân loại các giống lúa cạn

Phân loại lúa nếp , lúa tẻ dựa theo phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lưu Ngọc Trình, 1997 [56]

Phân loại loài phụ dựa theo tỷ lệ dài /rộng và khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10% của vỏ hạt thóc theo phương pháp của Chang (1976) [70]

Đánh giá các tính trạng hình thái hạt thóc, đặc điểm chất lượng hạt gạo xay theo tiêu chuẩn của IRRI [76]

2.2.2 Phương pháp hó a sinh

2.2.2.1 Phương pháp phân tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh

(1) Xác định hàm lượng protein : Hàm lượng protein tan được xác định theo

phương pháp Lowry được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]

Hạt thóc được bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khô tuyệt đối ở 1050C Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml đệm chiết phostphat citrat pH=10, lắc đều bằng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40

C, đem ly tâm 12000 vòng/phút ở 40

C trong 30 phút, rồi thu lấy dịch để làm thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Dịch chiết được định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm ph osphat citrat (pH=10) và đo phổ hấp thụ trên máy U Vvis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling

Hàm lượng protein được tính theo công thức :

X (%) = A HSPLm

100 % (2.1)

Trong đó: X: hàm lượng protein (% khối lượng khô) A: nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml)

HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)

(2) Xác định hàm lượng đường tan : Hàm lượng đường được xác định theo

phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]

Mẫu được bóc vỏ, sấy khô tuyệt đối ở 1050C Cân 0,5g mẫu nghiền trong 4ml nước cất Ly tâm 12000 vòng/phút ở 40

C trong 30 phút, thu dịch Hàm lượng đường tan đo phổ hấp thụ ở bước sóng 585 nm Hàm lượng đường tan được tính dựa trên đồ thị đường chuẩn glucose

Tính kết quả tính theo công thức:

X (%) = a b HSPLm

(3) Phương pháp xác định thành phần axit amin

Hàm lượng axit amin được xác định trên máy HP - Amino Quant sử dụng ortho- phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với các axit amin bậc 1 và 9 – fluoreryl- metyl- clorofomat đối với các axit amin bậc 2 Mẫu được xử lý theo phư ơng pháp thủy phân pha lỏng theo hướng dẫn sử dụng máy phân tích axit amin tự động

2.2.2.2 Đánh giá khả năng chịu hạn sinh lý thông qua phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa ở giai đoạn hạt nảy mầm

trong 10 phút, ngâm nước trong 24h sau đó ủ trong dung dịch MS chứa sorbitol 5 % Hạt nẩy mầm sau các thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để xác định hoạ t độ của enzym protease và hàm lượng protein tan , hoạt độ của

(2) Xác định hoạt độ của enzym - amylase

Xác định hoạt độ enzym - amylase theo phương pháp của Heilken được mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [10]

Hoạt độ enzym - amylase được xác định dựa trên lượng tinh bột bị enzym thủy phân trong thời gian 30phút ở 300

C Giá trị mật độ quang được đo ở bước sóng 560nm trên máy quang phổ UVvis Cintra 40

dịch đệm phosphat 0,2 M pH = 6,8

Hạt thóc nẩy mầm bóc vỏ , cân khối lượng, nghiền trong đệm phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch để xác định hoạt độ của enzym Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym - amylase được tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra , cơ chất là tinh bột 1% đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm Hoạt độ của enzym - amylase được tính dựa trên đồ thị đường chuẩn xây dựng bằng tinh bột

Hoạt độ enzym - amylase được tính theo công thức:

A (ĐVHĐ/ mg) = (C2 C )1 HSPLh

(2.3)

Trong đó: A: hoạt độ enzym - amylase (ĐVHĐ/mg)

C2: lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml) C1: lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml) h: khối lượng mẫu (mg)

HSPL: hệ số pha loãng

Thành phần hỗn hợp dịch: Thạch agar 2%, tinh bột 1% và nước cất Cho hỗn dịch vào bình tam giác đun cách thuỷ cho tan thạch , đổ vào đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ đường kính 9mm Nhỏ 100µl dịch chiết chứa enzym vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzym khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300

C trong 24giờ Nhuộm bằng lugol 5phút và tráng lại bằng NaCl 1N

(3) Xác định hàm lượng đường tan

Hàm lượng đường tan được xác định như mô tả ở mục 2.2.2.1

(4) Xác định hoạt độ enzym protease

Hoạt độ enzym protease xác định theo phương pháp Anson theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [36]

Hạt thóc nẩy mầm bóc vỏ , cân khối lượng , nghiền trong đệm phosphat (pH=6,5), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym protease được tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra đo trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm Hoạt độ của enzym protease được tính dựa trên đồ thị đường chuẩn xây dựng bằng tyrozin Hoạt độ enzym protease tính theo công thức:

ĐVHĐ/ mg

T m

  

 (2.4)

Trong đó: n: Chỉ số đo được ở bước song 750nm của ống thí nghiệm (mg/ml) k: Chỉ số đo được ở bước song 750nm của ống kiểm tra (mg/ml) D: số ml dịch chiết

HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)

T: thời gian ủ enzym với cơ chất (phút)

Định tính hoạt độ enzym protease: Tiến hành tương tự như định tính hoạt độ

enzym - amylase, cơ chất là gelatin 1%

(5) Xác định hàm lượng protein tan

Hàm lượng protein tan được xác định như mô tả ở mục 2.2.2.1

2.2.3 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ bằng phương pháp gây hạn nhân tạo

Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ được tiến hành theo Lê Trần Bình và Cs (1998) [1]

Hạt lúa nảy mầm gieo vào các bát nhựa nhỏ có kích thước bằng nhau , mỗi hộp 50 hạt Cát vàng đãi sạch , phơi khô cho vào các hộp với lượng như nhau Thí

nhau Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm , khi cây được 3 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa Theo dõi các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn trước và sau khi gây hạn như sau:

(1) Khối lượng tươi của rễ, thân lá

(2) Khối lượng khô của rễ , thân lá các mẫu được sấy khô tuyệt đối ở 1050C đến khi khối lượng không đổi

(3) Xác định khả năng giữ nước qua các giai đoạ n xử lý bởi hạn Khả năng giữ nước được tính theo công thức:

Trong đó: W: khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khối lượng tươi của cây sau khi xử lý hạn (g) Wkxl : khối lượng tươi của cây không xử lý hạn (g) (4) Xác định chỉ số chịu hạn tương đối của các giống theo công thức:

Ssin (an.bn+bn.cn+ cn.dn +dn.en+ + kn.an)2

Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tương đối

: là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/9 a,b,c,d….k là các chỉ tiêu theo dõi

n : kí hiệu các giống nghiên cứu

(5) Xác định tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra được theo công thức:

0n b

Các trị số: số cây chết:trị số 3; số cây héo: trị số 1; số cây không bị ảnh hưởng: trị số 0