TỔNG QUAN
Tổng quan về paclitaxel
Hình 1.1 Công th ứ c hóa h ọ c paclitaxel
- Công thức phân tử: C47H51NO14.
- Khối lượng phân tử: 853,9 g/mol
- Tên khoa học: 4,10β-Bis(acetyloxy)-13α-[[(2R,3S)-3-benzamido-2-hydroxy-3- phenylpropanoyl]oxy]-I,7β-dihydroxy-9-oxo-5β,20-epoxytax-1l-en-2α-ylbenzoat
1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học
- Hình thức: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể [33]
- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, diclomethan và dễ tan trong methyl clorid [33], acetonitril [27], [39]
- Nhiệt độ nóng chảy: 216 ºC – 217 ºC [39], [40]
- Góc quay cực: dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực ở 20 ºC từ - 49,0 0 đến -55,0 0 ở dạng khan [32], [33]
- PTX phân hủy nhanh chóng trong dung dịch methanol chứa kiềm yếu và dung dịch methanol có tính acid mạnh [27]
Dung dịch PTX có pH từ 4-8 đạt độ ổn định trong 72 giờ Mặc khác ở pH , PTX phân hủy nhanh chóng và nhiều sản phẩm phân hủy quan sát thấy trong vòng 1,5 giờ và sự phân hủy gần như hoàn toàn sau 72 giờ [39]
PTX bền trong dung dịch methanol chứa 0,1% acid acetic (AcOH) trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng hoặc ba tháng ở 4 ºC [27]
3 Ở nhiệt độ 2-8 ºC và đựng trong lọ bằng polyolefin, polyethylene tỉ trọng thấp (LDPE), thủy tinh, nhận thấy PTX với nồng độ 0,3 mg/ml trong dung dịch natri clorid 0,9% duy trì độ ổn định từ 13 đến 16 ngày còn PTX nồng độ 1,2 mg/ml đạt độ ổn định từ 9 đến 12 ngày.Tương tự PTX với nồng độ 0,3 mg/ml trong dung dịch glucose 5% ổn định từ 13 đến 20 ngày còn nồng độ 1,2 mg/ml ổn định từ 10 đến 12 ngày Dung dịch PTX nồng độ 0,3 mg/ml và 1,2 mg/ml đều ổn định ở 25 ºC trong 3 ngày với tất cả sự kết hợp giữa dung môi pha loãng và vật liệu lọ đựng, ngoại trừ với nồng độ 0,3 mg/ml pha loãng bằng glucose 5% đựng trong lọ thủy tinh độ ổn định kéo dài đến 7 ngày và nồng độ 1,2 mg/ml trong natri clorid 0,9% kéo dài đến 5 ngày [6]
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh mạch và giảm theo mô hình hai pha Sau khi vào cơ thể thuốc phân bố rộng vào các mô và dịch, có thể bị ảnh hưởng bởi liều và thời gian truyền Tỷ lệ gắn với protein là 89% - 98% và không bị thay đổi khi dùng cùng cimetidin, ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố 5 - 6 lít/kg thể trọng, đối với người tiêm truyền từ 1 - 6 giờ là 67,1 lít/m 2 và của người tiêm truyền 24 giờ là 227 - 688 lít/m 2 cho thấy thuốc khếch tán nhiều ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô Thời gian bán thải trong huyết thanh là 6 - 13 giờ; nếu thời gian tiêm truyền từ 1 - 6 giờ thì thời gian bán thải là 6,4 giờ; nếu thời gian tiêm truyền từ 24 giờ trở lên, thời gian bán thải là 15,7 - 52 giờ Sau khi truyền tĩnh mạch, có khoảng 2 - 13% lượng thuốc được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, như vậy ngoài thận thì còn đào thải theo đường khác (đào thải qua phân ~ 70% trong đó 5% là dạng chưa chuyển hóa) PTX chuyển qua tại gan qua cytochrom P450, isoenzym CYP2C8 và CYP3A4; tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α-hydroxypaclitaxel Độ thanh thải dao động từ 0,3 - 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 - 15,6 lít/giờ/m 2 ) Độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 – 6 giờ là 5,8 - 16,3 lít/giờ/m 2 và trong trường hợp tiêm truyền 24 giờ là 14,2 - 17,2 lít/giờ/m 2 [2]
Chế phẩm nano paclitaxel liên kết với albumin, thể tích phân bố và độ thanh thải tăng lên đáng kể (45 - 55%) so với dạng quy ước Ngoài ra, tỷ lệ PTX tự do trong máu cũng cao hơn với dạng thông thường [2]
1.1.5 Dược lý, cơ chế tác dụng và chỉ định
PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và ức chế quá trình giải trùng hợp để ổn định ống vi thể sẵn có Dẫn đến sự bất thường về cấu trúc của mạng vi ống ở kì trung gian của chu kì tế bào Vì các vi ống di chuyển nhiễm sắc thể trong quá trình phân chia tế bào nên sự bất thường của mạng lưới vi ống
4 làm tế bào tích tụ ở pha G2 hoặc pha M của chu kỳ tế bào Do đó ngăn chặn sự phân chia tế bào và sự tăng sinh tiếp theo của tế bào ung thư [6], [7], [30]
Hiện nay chế phẩm chứa PTX được chỉ định điều trị ung thư buồng trứng di căn, ung thư vú di căn và tái phát trong 6 tháng sau điều trị bổ trợ, ung thư phổi không tế bào nhỏ và tế bào nhỏ, ung thư dạ dày - thực quản, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bàng quang, ung thư đầu và cổ, ung thư Kaposi liên quan đến AIDS [2], [42]
1.1.6 Các dạng bào chế của PTX
1.1.6.1 PTX hòa tan trong Cremophor EL và ethanol
Taxol ® là chế phẩm đầu tiên được bào chế dưới dạng dung dịch tiêm truyền, trong đó PTX được hòa tan trong hỗn hợp Cremophor EL và ethanol (1:1) để tăng độ hòa tan trong nước Trước khi tiêm truyền, dung dịch này được pha loãng gấp 5 đến 20 lần bằng nước muối sinh lý hoặc dung dịch dextrose 5% Dạng bào chế này ổn định trong lọ chưa mở trong 5 năm ở 4 ºC [39] Mặc dù chứng minh được hiệu quả điều trị nhưng còn nhiều nhược điểm liên quan đến công thức này:
- Tác dụng phụ nghiêm trọng của CrEL bao gồm phản ứng quá mẫn, độc với thận và thần kinh Ngoài ra, CrEL có thể làm thay đổi các tính chất sinh học của lipoprotein, chẳng hạn như lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) [39]
- Đặc tính dược động học phi tuyến tính: độ thanh thải phụ thuộc nồng độ thuốc và liều ở trạng thái ổn định trong máu không tỷ lệ với liều dùng và thời gian truyền [23] Dẫn đến nồng độ dược chất trong máu không tỷ lệ thuận với thời gian truyền thuốc gây khó khăn trong việc hiệu chỉnh liều [20]
- Một phần PTX giữ lại trong micell Cremophor nên làm giảm phân tử PTX tự do và do đó giảm khả năng thẩm thấu qua biểu mô [47]
Những nhược điểm của công thức PTX-Cremophor El/Ethanol đã thúc đẩy việc phát triển các công thức an toàn hơn, tăng cường độ hòa tan, đồng thời thúc đẩy việc phân phối thuốc được kiểm soát và hướng đích để có hiệu quả điều trị tốt hơn Do đó, hiện nay hướng phát triển tiềm năng là các hệ phân phối thuốc không chứa Cremophor EL
1.1.6.2 Hệ mang thuốc nano chứa PTX
Trong hệ mang thuốc nano, PTX được vận chuyển nhờ các chất mang như liposomes, nano polyme, nano lipid, nano lipid-polyme, dendrimer, micelle, nano vô cơ, ống nano carbon, hydrogel và cycloderxtrin Hệ nano chứa PTX ngày càng phát triển do sự đa dạng về chất mang và đặc biệt có nhiều ưu điểm hơn so với CrEL-PTX [7], [23] Một số ưu điểm quan trọng của hệ nano chứa PTX [18]:
- Giảm nguy cơ gây phản ứng quá mẫn so với dạng CrEl-PTX do không sử dụng tá dược Cremophor El [13]
- Cải thiện độ hòa tan của thuốc: khả năng hòa tan trong nước của PTX tăng lên đáng kể khi liên hợp với các polyme hòa tan trong nước hoặc được bao gói trong nano lipid [23]
- Kích thước nhỏ giúp phân phối thuốc đến khối u dễ dàng hơn: hiệu ứng tăng thấm và lưu giữ (EPR) cho phép hệ mang thuốc nano xâm nhập vào các mạch máu bị rò rỉ gần khối u, giải phóng thuốc trực tiếp tại đó [23]
- Tránh được sự nhận diện của hệ thống lưới nội mô (RES): RES là một phần của hệ thống miễn dịch bao gồm các tế bào thực bào có khả năng bắt giữ các tiểu phân kích thước lớn và đặc điểm bề mặt không phù hợp Do đó các tiểu phân nano có kích thước nhỏ và bề mặt của tiểu phân nano được gắn polyethylen glycol (PEG) sẽ tránh bị RES loại bỏ Dẫn đến thời gian lưu thông máu lâu hơn và cải thiện các đặc tính dược động học [26]
Tổng quan về albumin
Albumin là loại protein có nhiều nhất trong huyết tương, chiếm khoảng 60% tổng lượng protein trong máu Albumin có dạng hình cầu nhỏ, khả năng hòa tan trong nước cao và ổn định ở pH từ 4-9 Có thể chiết xuất albumin từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm huyết thanh người, huyết thanh bò, huyết thanh chuột và lòng trắng trứng Trong đó hai loại sử dụng nhiều nhất để phân phối thuốc là albumin huyết thanh người (HSA) và albumin huyết thanh bò (BSA) [40]
HSA (albumin huyết thanh người, khối lượng phân tử 66500 Da) là protein đơn phân bao gồm 585 gốc acid amin cấu tạo thành ba vùng có cấu trúc tương tự nhau (I, II và III), mỗi vùng gồm hai vùng phụ (A và B) và được ổn định bởi 17 cầu nối disulfid [8], [40] Có hai vị trí quan trọng liên kết với thuốc là Sudlow I và Sudlow II được đặt tương ứng trong các vùng IIA và IIIA Trong đó Sudlow I chủ yếu liên kết với acid dicacboxylic và các phân tử dị vòng cồng kềnh và Sudlow II liên kết với các acid cacboxylic thơm [17]
BSA (albumin huyết thanh bò, khối lượng phân tử 69323 Da) là protein được cấu tạo từ ba vùng tương đồng (I, II và III) được chia thành chín vòng (L1-L9) bởi 17 liên kết disulfid và mỗi vùng gồm 2 vùng phụ (A và B) [8] BSA có điểm đẳng điện (pI) là 4,7 nên tích điện âm ở pH trung tính và tích điện dương ở pH acid.Vì vậy liên kết được với chất mang điện dương hoặc chất mang điện âm [40]
HSA và BSA có trình tự tương đồng 80%, khối lượng phân tử khác nhau ít hơn 1% và điểm đẳng điện của chúng giống nhau Nhưng có một điểm khác biệt trong cấu trúc là số lượng tryptophan (Trp), trong đó HSA có một tiểu phần Trp-214 còn BSA có hai tiểu phần Trp-212 và Trp-134 [8], [40] Mặc khác, BSA có thể gây ra phản ứng miễn dịch ở người và ở chuột [16], [40] Nhưng BSA vẫn được sử dụng rộng rãi làm chất vận chuyển thuốc vì có cấu trúc tương đồng với HSA, chi phí thấp và dễ dàng tinh chế [40] Hiện nay albumin là chất mang đang được ứng dụng nhiều trong y học nano điều trị ung thư do nhiều ưu điểm của nó [40]:
- Albumin có khả năng tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học và an toàn cao
- Cấu trúc hóa học của albumin cho phép tương tác với nhiều loại thuốc khác nhau, có khả năng bảo vệ thuốc giảm đào thải và chuyển hóa trong cơ thể Do đó cải thiện đặc tính dược động học của thuốc
- Albumin có thể tương tác với các thụ thể biểu hiện quá mức trong nhiều mô và tế bào bệnh giúp đưa thuốc đến vị trí đích mà không cần gắn thêm các phối tử đặc hiệu vào hệ mang thuốc nano
Hình 1.2 C ấ u trúc không gian c ủ a (a) HSA và (b) BSA
Tổng quan về hệ tiểu phân nano albumin
1.3.1 Sơ lược về hệ tiểu phân nano albumin
Hệ tiểu phân nano albumin là hệ nano polyme sử dụng albumin làm chất mang dược chất Cấu trúc của albumin gồm nhiều amino acid có nhóm thiol, amino và carboxyl nên hệ tiểu phân nano albumin có khả năng liên kết được nhiều thuốc có đặc tính khác nhau (tích điện dương/âm, ưu/kỵ nước, ) và có thể gắn thêm phối tử trên bề mặt để đưa thuốc đến vị trị đích [21], [35] Do đó, hệ tiểu phân nano albumin mang lại những lợi ích như khả năng giữ thuốc cao, tương thích sinh học và phân hủy sinh học tốt Ngoài ra, còn có một số ưu điểm khác như chi phí thấp, điều chế dễ dàng, kích thước được kiểm soát và có thể tái tạo lại [10], [16], [19], [21] Điểm độc đáo của tiểu phân nano albumin là khả năng đưa thuốc đến khối u theo kiểu hướng đích thụ động và chủ động Theo kiểu hướng đích thụ động, mạch máu của khối u có hình dạng gấp khúc, đường kính không đều và dễ bị rò rỉ Vì vậy các đại phân tử dễ dàng thoát mạch, tăng sự xâm nhập vào khoảng gian bào của khối u Mặt khác, việc dẫn lưu bạch huyết trong mô khối u bị giảm do áp suất ở bên trong nhân khối u cao hơn áp suất ở ngoại vi Sự kết hợp giữa mạch máu bị rò rỉ và sự giảm dẫn lưu bạch huyết dẫn đến tăng hiện tượng tính thấm và lưu giữ (EPR) giúp các đại phân tử dễ dàng tích tụ và lưu giữ trong mô khối u [25], [34], [35] Đối với kiểu hướng đích chủ động, albumin liên kết với thụ thể glycoprotein 60 (albondin) trên bề mặt của tế bào nội mô trong mạch máu, thụ thể này kích thích caveolin-1 (protein nội bào), dẫn đến hình thành túi chuyển bào (Caveolae) vận chuyển albumin vào bên trong khối u Hơn nữa, protein có tính acid giàu cystein (SPARC) được biểu hiện quá mức ở nhiều loại khối u đóng vai trò trong việc thu hút và tích tụ albumin bên trong khối u [18], [40]
1.3.2 Phương pháp bào chế tiểu phân nano albumin bằng bốc hơi dung môi từ nhũ tương
Nhũ tương dùng để tạo tiểu phân nano thường là nhũ tương dầu/nước (D/N), trong đó pha nước là dung dịch albumin, pha dầu là dung dịch chứa dược chất pha trong dung môi hữu cơ thích hợp Sau đó pha dầu được phối hợp vào pha nước, đồng nhất để tạo nhũ tương thô Nhũ tương thô tiếp tục được đồng nhất hóa bằng cách khuấy ở tốc độ cao, siêu âm hoặc đồng nhất hóa áp suất cao làm nhỏ các tiểu phân của hệ phân tán tạo thành nhũ tương nano Bốc hơi dung môi hữu cơ để thu được hỗn dịch nano albumin chứa dược chất Sau đó đông khô để đảm bảo độ ổn định cho chế phẩm [12], [28], [31]
Trong phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương, đặc tính của tiểu phân nano bị ảnh hưởng bởi các thông số của công thức như tỉ lệ albumin và dược chất, dung môi hữu cơ sử dụng hoặc các thông số quy trình như thời gian, cường độ của quá trình đồng nhất hóa và tốc độ bốc hơi dung môi [3], [31]
1.3.3 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano albumin
Yi Xiaoli cùng các cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ mang thuốc nano đồng vận chuyển pirarubicin (THP) và PTX bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương Pha nước là dung dịch HSA 2%, pha dầu gồm THP, PTX hòa tan trong cloroform Sau đó phối hợp pha dầu vào pha nước tạo nhũ tương thô, đồng nhất hóa bằng áp suất cao với áp suất 20000 psi trong 10 chu kỳ để tạo nhũ tương nano Cất quay hệ thu được ở
25 ºC dưới áp suất giảm để loại cloroform thu được hệ tiểu phân nano chứa THP, PTX Kết quả cho thấy KTTP TB 156,9 ± 3,2 nm, PDI bằng 0,16 ± 0,02 và thế zeta -26,2 ± 3,0; tỷ lệ dược chất được nano hóa EE (%) cao (THP :87,91 ± 2,85% , PTX : 80,02 ± 2,21%) Sự kết hợp này cho thấy hiệu quả chống ung thư vú vượt trội hơn so với phối hợp THP tự do và PTX tự do bằng cách khắc phục tình trạng kháng thuốc của khối u, tích lũy thuốc cao hơn tại các vị trí khối u và giảm phân phối thuốc đến các cơ quan và mô bình thường [48]
Kim Tae Hyung cùng các cộng sự đã phát triển bào chế hệ tiểu phân nano HSA chứa curcumin (CCM) bằng công nghệ nab HSA được hòa tan trong nước bão hòa cloroform tạo thành pha nước, pha dầu gồm CCM hòa tan trong cloroform bão hòa nước Trộn hai pha lại, sau đó đồng nhất bằng áp suất cao 20000 psi trong 9 chu kì Cô quay để loại cloroform ở 25 ºC trong 15 phút dưới áp suất giảm thu được hỗn dịch nano chứa CCM Sau đú lọc qua màng lọc 0,25 àm và đụng khụ để bảo quản Kết quả đỏnh giỏ độ ổn định sau 3 tháng bảo quản ở điều kiện 25 ºC và độ ẩm tương đối 60% cho thấy bánh đông khô không bị xẹp hay co ngót lại, KTTP TB và PDI không có sự thay đổi đáng kể giữa thời điểm ban đầu và mỗi tháng trong thời gian bảo quản 3 tháng với KTTP TB khoảng 140 nm và PDI khoảng 0,3 Kết quả in vivo thử trên chuột mang khối u ung thư
10 tuyến tụy ở người cho thấy hệ tiểu phân nano HSA chứa CCM vượt trội hơn so với CCM tự do về tỷ lệ dược chất được phân bố vào khối u cũng như hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư và độc tính toàn thân giảm đáng kể [22]
Dreis cùng các cộng sự đã bào chế hệ tiểu phân nano HSA chứa doxorubicin (DOX) bằng cách hấp phụ DOX lên hệ cốt nano HSA: thêm dung dịch DOX vào hạt nano HSA rỗng có liên kết ngang sau đó thêm nước để đạt tổng thể tích hỗn hợp, khuấy hỗn hợp trong 2 giờ, tốc độ 650 vòng/phút ở nhiệt độ phòng để DOX hấp thụ lên bề mặt hạt nano Kết quả thu được tiểu phân nano có KTTP TB 158,5 ± 5,0 nm ; thế zeta -31,9 ± 2,8 mV và nghiên cứu độ ổn định bảo quản trong nước ở 4 ºC trong 1,5 năm cho thấy sau 1 tuần bảo quản, các hạt nano lắng xuống nhưng dễ dàng phân tán trở lại bằng cách lắc trong 1 phút; sau 6 tháng, hạt nano có KTTP TB dưới 500 nm nhưng PDI tăng nhẹ (0,2) Sau thời gian bảo quản 1 đến 1,5 năm, tiểu phân nano khó phân tán trở lại, KTTP
TB tăng đến micromet Kết quả nghiên cứu trên tế bào ung thư thần kinh cho thấy tác dụng chống ung thư của các tiểu phân nano HSA chứa DOX tăng lên đáng kể so với dung dịch DOX tự do [15]
Tang và các cộng sự đã phát triển các hạt nano HSA chứa docetaxel (DTX) bằng phương pháp tự lắp ráp đơn giản HSA được hòa tan trong nước cất với nồng độ 4 mg/ml và thêm Dithiothreitol (DTT) vào và khuấy đều Sau đó, DTX hòa tan trong ethanol nồng độ 60 mg/ml được nhỏ thêm từ từ vào hỗn hợp trên Dung dịch chuyển sang màu xanh nhạt, cho thấy sự hình thành các hạt nano Mẫu được lọc qua màng thẩm tích 10 kDa để loại bỏ DTT, sau đú lọc qua màng lọc 0,22 àm và cuối cựng đụng khụ để bảo quản Kết quả cho thấy tỉ lệ DTX/HSA đến 20% thì KTTP TB 150 nm, đây là kích thước mà các hạt nano dễ tích tụ trong khối u do hiệu ứng EPR, tỉ lệ DTX/HSA từ 20% đến 25% KTTP TB tăng lên 183 nm và tỉ lệ này tăng đến 30% thì các hạt nano không ổn định Trên mô hình chuột mang khối u ung thư phổi A549 thì DTX⁃NPs có tác dụng ức chế khối u tốt hơn so với DTX tự do Khi các hạt nano chứa DTX gắn thêm phối tử trên bề mặt thì có thể nhận biết các thụ thể cụ thể trên bề mặt khối u [41].
Nghiên cứu độ ổn định thuốc
Theo hướng dẫn của WHO và ASEAN, việc nghiên cứu độ ổn định thuốc nhằm hai mục tiêu: một là, xác định công thức, quy trình bào chế, lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản phù hợp; hai là, xác định tuổi thọ thuốc dựa trên các số liệu độ ổn định thu được từ nghiên cứu [1], [45] Độ ổn định của thuốc là khả năng một dược chất hoặc một thành phẩm thuốc duy trì được các đặc tính vốn có như hóa học, vật lý, vi sinh và sinh dược… trong những giới hạn nhất định trong giới hạn tuổi thọ của nó [1] Độ ổn định thuốc phụ thuộc vào một số yếu tố sau [45]:
- Các yếu tố từ môi trường như: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, hàm lượng oxy cùng các yếu tố bên ngoài khác
- Tính chất hóa lý của hoạt chất và tá dược được dùng để bào chế thuốc.Ví dụ: dạng tinh thể, tạp chất trong nguyên liệu, hàm lượng nước
- Dạng bào chế của thuốc
- Quy trình sản xuất thuốc
- Nguyên liệu làm đồ đựng, bao bì, đóng gói
Chỉ tiêu chất lượng chế phẩm đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano bao gồm các chỉ tiêu chất lượng chung của thuốc tiêm, chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm đông khô và chỉ tiêu đặc thù của tiểu phân nano Thuốc tiêm nói chung cần đạt các chỉ tiêu chất lượng chung như hình thức, màu sắc, định lượng, độ vô khuẩn, giới hạn chí nhiệt tố/nội độc tốc, pH, định lượng, sản phẩm phân hủy, độ trong, thể tích …[1] Đối với chế phẩm thuốc tiêm chứa tiểu phân nano, ngoài các chỉ tiêu chung, cần đánh giá các tính chất của tiểu phân nano như KTTP, phân bố KTTP, trạng thái phân tán, hình thái tiểu phân, đặc tính và chức năng bề mặt của tiểu phân, thành phần và độ tinh khiết, khả năng giải phóng dược chất [3] Điều kiện bảo quản thuốc trong đánh giá độ ổn định thuốc được chia làm 5 vùng khí hậu, khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm, tương ứng với khí hậu của quốc gia thuốc được đăng ký lưu hành Thuốc còn được quy định thử độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc với yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm: 40 ºC ± 2 ºC và 75% RH ± 5% RH Ngoài ra, còn có thêm hai điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp (bảo quản lạnh), chỉ yêu cầu về nhiệt độ mà không yêu cầu về độ ẩm, đó là: điều kiện đông lạnh (5 ºC ± 3 ºC) và điều kiện đông đá (-15 ºC ± 5 ºC) Thuốc bảo quản ở nhiệt độ thấp có yêu cầu riêng về điều kiện lão hóa cấp tốc Tại Việt Nam, việc đánh giá độ ổn định của thuốc được áp dụng theo vùng khí hậu IVb, áp dụng cho các vùng địa lý có khí hậu nóng ẩm, với điều kiện của bảo quản dài hạn 30 ºC ± 2 ºC và 75% RH ± 5% RH Các yêu cầu về thử độ ổn định ở điều kiện bảo quản lạnh và lão hóa cấp tốc tuân theo các qui định chung áp dụng cho tất cả các vùng khí hậu
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
B ả ng 2.1 Các nguyên li ệ u và hóa ch ấ t s ử d ụ ng trong nghiên c ứ u
STT Nguyên liệu Tiêu chuẩn Xuất xứ
3 Acid acetic NSX Trung Quốc
4 Albumin huyết thanh bò NSX Trung Quốc
6 Ethanol tuyệt đối NSX Trung Quốc
8 Natri chlorid Phân tích Trung Quốc
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
B ả ng 2.2 Thi ế t b ị , d ụ ng c ụ s ử d ụ ng trong quá trình th ự c nghi ệ m
STT Tên thiết bị Model Xuất xứ
1 Bể siêu âm WUC - A10H Hàn Quốc
2 Cân phân tích AB204 Mettler Toledo –
3 Cân phân tích ES-2255M-DR Precisa – Thụy Sỹ
4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 Agilent Technologies
5 Màng lọc CA kích thước lỗ lọc
6 Màng lọc RC kích thước lỗ lọc 0,2 àm - Sartorius – Đức
7 Máy đồng nhất hóa áp suất cao Emusiflex-C5 Avestin – Canada
8 Máy ly tâm lạnh Z326K GmBH - Z326K HERMLE
9 Máy ly tâm Z300 Hermle Z300 Hermle – Đức
10 Máy phân tích nhiệt DSC 1 StarSystem Mettler Toledo -
11 Máy siêu âm đầu dò UP200Ht Hielscher – Đức
12 Máy đông khô Alpha 1-2 LD Plus - Đức
13 Máy đo nhiễu xạ tia X D8-advance
14 Máy đo phổ hồng ngoại
FTIRAffinity – IS FT-IR Shimadzu
15 Ống ly tâm chứa màng thẩm tích
10kDa Lỗ lọc 10kDa Millipore – Đức
16 Thiết bị đánh giá PB KTTP Zetasizer Ultra Blue
17 Tủ lạnh âm sâu BINDER UFV 500 - Đức
18 Máy cất quay chân không Hei-VAP Value Heidolph – Đức
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Đánh giá độ ổn định của hệ tiểu phân nano PTX trong quá trình bào chế
- Đánh giá độ ổn định của nhũ tương nano và hệ tiểu phân nano ở điều kiện nhiệt độ khác nhau
- Đánh giá độ ổn định của HD qua chu kỳ đông-rã đông
2.2.2 Đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano PTX
- Đánh giá phân bố kích thước tiểu phân, dạng thù hình của dược chất, tương tác phân tử dược chất-tá dược
- Đánh giá tỷ lệ nano hóa dược chất trong HD
2.2.3 Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX
- Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô và độ ổn định hỗn dịch chứa tiểu phân nano PTX sau hoàn nguyên
- Đánh giá độ ổn định khi pha loãng với môi trường khác nhau.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp bào chế chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX
Quá trình bào chế tiểu phân nano albumin chứa PTX đông khô bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương được thực hiện qua 4 giai đoạn chính: Tạo NT thô, tạo
NT nano, bay hơi NT tạo HD và đông khô HD
Bước 1 Tạo nhũ tương thô
Quá trình tạo NT thô được thực hiện ở nhiệt độ 0-10 ºC bằng máy siêu âm để hạn chế dung môi bay hơi
• Pha dầu: dung dịch PTX 10% (m/v) trong hỗn hợp cloroform : ethanol (9:1)
• Pha nước: dung dịch BSA 0,5% (m/v) trong nước
• Tỷ lệ pha dầu/ pha nước: 5%
- Thông số kỹ thuật bào chế NT thô: Công suất 100W Biên độ siêu âm: 40% Tần số 26kHz Nhiệt độ 5-10 ºC Thời gian siêu âm 30 giây
Bước 2 Đồng nhất hóa áp suất cao
Quá trình đồng nhất hóa được thực hiện trên hệ thống Avestin Emusiflex-C5, ở nhiệt độ được duy trì trong khoảng 0-10 ºC bằng cách ngâm cả thiết bị đồng nhất hóa trong nước đá Đưa NT thô vào ngăn chứa mẫu Điều chỉnh van khí để đồng nhất hóa ở áp suất
15000 - 20000 psi Thực hiện đồng nhất hoá 12 chu kỳ Mẫu ra khỏi hệ thống đồng nhất hóa áp suất cao được làm lạnh do ngăn chứa mẫu được ngâm trong nước đá có nhiệt độ dao động trong khoảng 0-10 ºC Sản phẩm thu được là NT nano
Bước 3 Bốc hơi dung môi tạo hỗn dịch
Cất quay: Cất quay NT nano ở nhiệt độ 40 ± 2 ºC, áp suất -0,1 bar, tốc độ 100 vòng/phút Thời gian cất quay 30 phút Sản phẩm thu được là hỗn dịch nano phức hợp albumin-PTX
Bước 4 Đông khô hỗn dịch
Quá trình loại nước bằng đông khô được thực hiện theo các bước như sau:
- Đưa mẫu hỗn dịch vào lọ thủy tinh
- Làm lạnh ở -80 ºC bằng tủ lạnh âm sâu Binder UFV 500 trong thời gian 24 giờ
- Chuyển mẫu vào ngăn chứa mẫu của hệ thống máy đông khô Alpha 1-2 LD Plus Cài đặt các thông số của hệ thống đông khô bao gồm: nhiệt độ -47 ºC, áp suất 0,2 mbar, thời gian đông khô trong 24 giờ
- Sau đó, mẫu được đưa về nhiệt độ thường và tiếp tục hút chân không đến áp suất 0,2 mbar trong 2 giờ
- Cuối cùng, mẫu được sấy thứ cấp 3 giờ ở nhiệt độ 35 ºC trong tủ sấy tĩnh thu được các bánh đông khô chứa tiểu phân nano BSA-PTX
- Đóng nút cao su, siết niềng nhôm lọ thủy tinh và bảo quản chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX-BSA chờ phân tích
2.3.2 Phương pháp đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano PTX
2.3.2.1 Phương pháp đánh giá phân bố KTTP
Phân bố kích thước giọt/tiểu phân của mẫu NT và HD được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) Phép đo được thực hiện trên thiết bị Zetasizer Ultra Blue (ZS3300)
Nguyên tắc: Chiếu một chùm tia laser vào hệ tiểu phân tạo ra chùm tia tán xạ Sự chuyển động của hệ tiểu phân sẽ khiến cường độ ánh sáng tán xạ thay đổi theo thời gian Phân bố KTTP được tính toán bởi phần mềm dựa trên phương trình Stockes - Einstein với biến đầu vào là sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ từ mẫu
- Thông số máy: Nhiệt độ: 25 ºC Góc đo 173°
- Pha loãng mẫu cần đo bằng dung dịch NaCl 0,9% đến nồng độ thích hợp sao cho thông số Count rate tối ưu từ 200-400 kcps Mẫu pha loãng được chuyển vào cuvet thủy tinh có 4 mặt trong suốt và đưa vào buồng đo mẫu ngay sau khi pha loãng Với mỗi mẫu, tiến hành đo lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình
2.3.2.2 Phương pháp đánh giá độ ổn định sau quá trình đông-rã đông
Tiến hành: Mẫu HD được đánh giá độ ổn định về trạng thái phân tán và kích thước tiểu phân qua 3 chu kỳ đông-rã đông Trong mỗi chu kỳ, mẫu đã được bảo quản trong tủ đông lạnh (-20 ± 2 ºC) trong 24 giờ được rã đông ở nhiệt độ phòng (20-25 ºC) trong
30 phút đến khi mẫu rã đông hoàn toàn và đạt được nhiệt độ phòng Sau khi rã đông, mẫu được lấy để đánh giá trước khi được đặt trở lại vào tủ đông lạnh để thực hiện tiếp hai chu kỳ tiếp theo Mẫu rã đông sau mỗi chu kỳ được đánh giá KTTP (2.3.2.1)
2.3.2.3 Phương pháp định lượng PTX bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1200
Qua tham khảo tài liệu [33], [32], tiến hành định lượng PTX trong các mẫu đánh giá bằng phương pháp HPLC với các điều kiện cụ thể như sau :
- Cột sắc ký: C18, kớch thước 4,6 x 150 mm, kớch thước hạt nhồi 5 àm (GL Science, Nhật)
- Pha động: H2O:ACN (35:65, v/v) Pha động được lọc qua màng lọc 0,45 àm và được siêu âm đuổi bọt khí
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 230 nm
- Dung môi pha mẫu gốc: MeOH:H2O:AcOH (87,5:12,4:0,1)
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg PTX chuyển vào bình định mức 50 ml Thêm khoảng 30 ml dung môi pha mẫu gốc vào lắc đều, sau đó thêm vừa đủ đến vạch, lắc đều
- Dãy dung dịch chuẩn để định lượng: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng pha động để thu được dóy dung dịch chuẩn cú nồng độ trong khoảng 0,625 – 20 (àg/ml)
- Dung dịch thử: Chế phẩm đông khô phân tán lại bằng dung dịch NaCl 0,9% Hút chính xác thể tích mẫu cần định lượng vào bình định mức, sau đó pha loãng 200 lần với nước và pha loãng tiếp với ACN theo tỷ lệ thể tích 1:2
3 Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng Độ đặc hiệu:
- Tiến hành: Phân tích sắc ký các dung dịch: dung dịch chuẩn, các dung dịch thử, dung dịch placebo, hỗn hợp dung môi hòa tan PTX từ HD
- Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có thời gian lưu của PTX tương tự thời gian lưu của PTX trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ của mẫu placebo không xuất hiện píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc PTX trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Độ lặp lại:
- Tiến hành: Phân tích sắc ký một dung dịch chuẩn lặp lại 6 lần
- Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 1% và RSD của diện tích píc ≤ 2% Độ tuyến tính:
- Tiến hành: Phân tích sắc ký đồ các dung dịch chuẩn PTX có nồng độ xác định Lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ dung dịch chuẩn và diện tích píc tương ứng Xác định hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ PTX và diện tích píc
2.3.2.4 Phương pháp xử lý mẫu HD chứa PTX
Nguyên tắc: Sử dụng hỗn hợp dung môi thích hợp để hòa tan PTX có trong hệ tiểu phân, sau đó định lượng PTX trong dung dịch thu được
Phương pháp xử lý kết quả và biểu diễn số liệu
Kết quả thí nghiệm được biểu diễn dưới dạng trung bình (TB) ± độ lệch chuẩn (SD) từ các lần thí nghiệm khác nhau Số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2016
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thẩm định phương pháp định lượng PTX
Tiến hành đánh giá tính đặc hiệu theo phương pháp HPLC (mục 2.3.2.3) Kết quả phân tích sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu placebo cho thấy (Hình PL.1.): Trên sắc ký đồ của các mẫu thử xuất hiện píc chính có thời gian lưu khoảng 3,7 phút, tương ứng với thời gian PTX trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Trên sắc ký đồ của mẫu placebo và dung môi hòa tan không xuất hiện píc có thời gian lưu tương ứng với PTX trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Phổ UV-Vis tại đỉnh của píc chính trên sắc ký đồ mẫu chuẩn giống với phổ hấp thụ UV-Vis tại đỉnh của píc chính trên sắc ký đồ của mẫu thử Do vậy, có thể kết luận rằng phương pháp HPLC chọn lọc với PTX
3.1.2 Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn của PTX trong pha động Ghi lại thời gian lưu và diện tích píc Kết quả thể hiện trong Bảng 3.1
B ả ng 3.1 K ế t qu ả kh ảo sát độ thích h ợ p c ủ a h ệ th ố ng
Lần phân tích Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (mAu.s)
Kết quả cho thấy thời gian lưu của PTX có RSD < 1%, diện tích píc có RSD < 2% Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp cho định lượng PTX
Chạy sắc ký với dóy dung dịch chuẩn cú nồng độ 0,66 – 10,54 àg/ml Diện tớch píc của các mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau được trình bày trong Bảng 3.2
B ả ng 3.2 Di ệ n tớch pớc ở cỏc m ẫ u chu ẩ n cú n ồng độ t ừ 0,66 -10,54 àg/ml
Nồng độ PTX ( àg/ml ) 0,66 1,32 2,64 5,27 10,54
Hình 3.1 Đồ th ị bi ễ u di ễ n m ố i tương quan giữ a n ồng độ và di ệ n tích píc c ủ a
PTX trong kho ả ng 0,66 – 10,54 àg/ml
Kết quả cho thấy có mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của PTX trong khoảng nồng độ từ 0,66 đến 10,54 àg/ml với hệ số tương quan R 2 = 1 > 0,998 Do đó, đường chuẩn phù hợp để định lượng PTX trong các dung dịch thử
3.1.4 Độ ổn định trong autosampler
Tiến hành sắc ký với một dung dịch chuẩn của PTX và một dung dịch thử ở các thời điểm ban đầu, 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ bảo quản hệ thống tiêm mẫu tự động Diện tích píc của dung dịch chuẩn và dung dịch thử sau các thời gian khác nhau được thể hiện trong Bảng 3.3
B ả ng 3.3 K ế t qu ả độ ổn đị nh c ủ a m ẫ u ở th ời điể m khác nhau
Nồng độ PTX trong mẫu chuẩn (àg/ml)
Nồng độ PTX trong mẫu thử (àg/ml)
Nồng độ PTX (àg/ml)
23 Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự thay đổi đáng kể về nồng độ PTX trong các mẫu chờ phân tích trong bộ lấy mẫu tự động giữa thời điểm ban đầu và các thời điểm khác nhau của cả mẫu chuẩn và mẫu thử Chứng tỏ ở các thời điểm khác nhau PTX trong mẫu chuẩn và mẫu thử chưa phân hủy và ổn định đến 5 giờ trong bộ lấy mẫu tự động.
Kết quả bào chế tiểu phân nano PTX
Thực hiện bào chế 3 mẻ hệ tiểu phân nano phức hợp PTX-BSA, đánh giá phân bố KTTP của mẫu nhũ tương và mẫu hỗn dịch theo phương pháp được nêu ở mục 2.3.2.1 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4
B ả ng 3.4 Phân b ố KTTP theo c ủa nhũ tương và hỗ n d ị ch nano
(nm) PDI Di90 (nm) KTTP TB
Nhận xét: KTTP TB của nhũ tương trước khi bay hơi dung môi và hỗn dịch thu được không có sự khác biệt đáng kể giữa 3 mẻ thử nghiệm Hỗn dịch tạo thành ở cả 3 mẻ đều có KTTP TB nhỏ hơn kích thước giọt nhũ tương Việc bay hơi cloroform trong các giọt phân tán làm giảm thể tích giọt và do đó làm giảm kích thước của các tiểu phân rắn thu được
Hỗn dịch nano bào chế được có KTTP TB nhỏ hơn 200 nm tạo thuận lợi cho việc hướng đích thụ động vào các mô khối u nhờ hiệu ứng tăng thấm và lưu giữ (EPR), nhờ đó có thể làm tăng nồng độ thuốc trong khối u [3], [34]
Hình 3.2 Bi ểu đồ phân b ố kích thướ c ti ểu phân theo cường độ tín hi ệ u c ủ a các m ẻ h ỗ n d ị ch: m ẻ 1(A), m ẻ 2(B), m ẻ 3(C)
3.2.1 Đánh giá độ ổn định của NT nano (trước khi bay hơi dung môi)
Tiến hành bảo quản NT tạo ra ở cả 3 mẻ trong vòng 24 giờ ở 2 điều kiện 2-8 ºC (nhiệt độ ngăn mát tủ lạnh) và nhiệt độ 20-30 ºC (nhiệt độ phòng thí nghiệm) Xác định phân bố KTTP theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.1 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5
B ả ng 3.5 Đặc điể m PB kích thướ c gi ọ t c ủa nhũ tương tạ i các th ời điể m (n= 3) Điều kiện 2-8 ºC 20-30 ºC
(nm) PDI Di90 (nm) KTTP TB
Hình 3.3 Đồ th ị bi ể u di ễ n KTTP c ủa nhũ tương nano ở các điề u ki ệ n b ả o qu ả n khác nhau theo th ờ i gian (n=3) Nhận xét: Trong vòng 10 giờ ở điều kiện 2-8 ºC và 8 giờ ở điều kiện 20-30 ºC, KTTP TB của nhũ tương nano (khoảng 170 nm) không có sự khác biệt đáng kể giữa các thời điểm khác nhau Ở điều kiện 2-8 ºC từ 10 giờ đến 24 giờ KTTP TB tăng lên đến khoảng 200 nm Ở điều kiện 20-30 ºC, từ 8 giờ đến 10 giờ KTTP có xu hướng tăng nhẹ nhưng đến 24 giờ nhũ tương nano kết tụ lại nên KTTP tăng đến gần 1000 nm Do đó, có thể bảo quản NT nano sau khi bào chế trong vòng 10 giờ ở điều kiện 2-8 ºC và 8 giờ ở điều kiện 20-30 ºC Sau khi tạo nhũ tương, cần thực hiện bay hơi dung môi để tạo hỗn dịch nano trong khoảng thời gian này để đảm bảo kích thước tiểu phân
3.2.2 Đánh giá độ ổn định của hỗn dịch
Tiến hành bảo quản các mẻ ở 3 điều kiện khác nhau: 20-30 ºC (nhiệt độ phòng TN), 2-8 ºC (nhiệt độ ngăn mát tủ lạnh), -20 ± 2 ºC (nhiệt độ ngăn đá tủ lạnh) Xác định phân bố KTTP theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.1 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6, Bảng 3.7, Bảng 3.8 và Hình 3.4
B ả ng 3.6 Phân b ố KTTP c ủ a HD ở nhi ệt độ 20-30 ° C (n=3)
Thời điểm Ban đầu 1 ngày 2 ngày 4 ngày
KTTP TB (nm) 141,4 ± 5,16 141,3 ± 2,50 152,5 ± 7,91 1392,6 ± 356,03 PDI 0,138 ± 0,024 0,129 ± 0,056 0,199 ± 0,082 0,509 ± 0,169 Di90 (nm) 252,3 ± 28,07 248,9 ± 36,13 265,0 ± 4,10 1403,0 ± 50,91
B ả ng 3.7 Phân b ố KTTP c ủ a HD ở nhi ệt độ 2-8 ° C (n=3)
Thời điểm Ban đầu 1 ngày 2 ngày 4 ngày
KTTP TB(nm) 143,6 ± 1,98 145,4 ± 0,25 149,2 ± 1,27 3904,9 ± 1779,22 PDI 0,152 ± 0,004 0,159 ± 0,048 0,185 ± 0,007 0,681 ± 0,281 Di90 (nm) 273,3 ± 1,63 264,7 ± 18,46 266,9 ± 4,45 3000,3 ± 945,05
B ả ng 3.8 Phân b ố KTTP c ủ a HD ở nhi ệt độ -20 ± 2 ° C (n=3)
Ban đầu 1 ngày 2 ngày 4 ngày 8 ngày 16ngày 32ngày 64ngày
Hình 3.4 Đồ th ị bi ể u di ễ n KTTP c ủ a h ỗ n d ị ch ở các điề u ki ệ n b ả o qu ả n khác nhau (n=3)
Nhận xét: Trong vòng 2 ngày ở điều kiện 20-30 ºC và điều kiện 2-8 ºC(Bảng 3.6,
Bảng 3.7 và Hình 3.4), đặc điểm phân bố KTTP không có sự thay đổi đáng kể Đến ngày thứ 4 ở cả 2 điều kiện trên chúng tôi quan sát thấy sự sa lắng tiểu phân, KTTP TB đều tăng lên đến hơn 1000 nm và giá trị PDI > 0,5 cho thấy sự phân bố rộng của KTTP Các tiểu phân nano đã kết tụ hoặc sát nhập lại với nhau thành các tiểu phân lớn và giảm sự đồng nhất của phân bố KTTP Sau 64 ngày ở điều kiện -20 ± 2 °C (Bảng 3.8 và Hình 3.4), đặc điểm phân bố KTTP không có sự thay đổi đáng kể Do đó, sau khi tạo được
HD nano, cần tiến hành đông khô trong vòng 2 ngày nếu bảo quản ở điều kiện 2-8 °C và 20-30 °C Ở điều kiện đông lạnh -20 ± 2 °C, hỗn địch có thể bảo quản được trên 2 tháng trước khi phải tiến hành đông khô
3.2.3 Đánh giá độ ổn định trong chu kỳ đông-rã đông của HD
Tiến hành đánh giá đặc điểm phân bố KTTP của HD nano qua 3 chu kỳ đông-rã đông theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.2 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.9
B ả ng 3.9 Phân b ố KTTP c ủa HD trong chu kì đông - rã đông c ủ a HD (n=3)
Chu kỳ KTTP TB (nm) PDI Di10 (nm) Di50 (nm) Di90 (nm)
Nhận xét: Không có sự thay đổi đáng kể về đặc điểm phân bố KTTP của HD sau
3 chu kỳ đông-rã đông Hỗn dịch bào chế được tương đối bền vững với sự thay đổi nhiệt độ và trạng thái vật lý của hệ, gợi ý rằng hệ tiểu phân nano có thể ổn định trong quá trình đông khô HD bào chế có thể được đông lạnh để chờ phân tích hoặc làm các thí nghiệm nhiều lần.
Đánh giá các đặc tính của chế phẩm đông khô
3.3.1 Kết quả bào chế 3 mẻ chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX
Tính chất của 3 mẻ chế phẩm đông khô và hỗn dịch chứa tiểu phân nano sau hoàn nguyên được đánh giá bằng phương pháp cảm quan
Nhận xét: Bánh đông khô màu trắng, xốp, không bị co ngót lại (Hình 3.5A) Hỗn dịch sau hoàn nguyên có màu đục mờ, không lắng cặn, đồng nhất (Hình 3.5B)
Hình 3.5 Hình ảnh bánh đông khô (A) và hỗ n d ị ch sau hoàn nguyên (B) 3.3.1.2 Đánh giá phân bố KTTP của hỗn dịch nano PTX sau hoàn nguyên
Các mẻ hỗn dịch nano sau hoàn nguyên được tiến hành đánh giá phân bố KTTP theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.1 Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10 và Hình 3.6
B ả ng 3.10 Phân b ố KTTP c ủ a h ỗ n d ị ch nano PTX sau hoàn nguyên (n=3)
Mẻ KTTP TB (nm) PDI Di90 (nm)
Hình 3.6 Bi ểu đồ phân b ố KTTP theo cường độ tín hi ệ u c ủ a h ỗ n d ị ch sau hoàn nguyên c ủ a các m ẻ : m ẻ 1(A), m ẻ 2(B) và m ẻ 3(C)
Nhận xét: Không có sự thay đổi đáng kể về đặc điểm phân bố KTTP của HD nano chứa PTX sau hoàn nguyên giữa 3 mẻ (Bảng 3.10 và Hình 3.6) với kích thước tiểu phân trung bình khoảng 140 nm và chỉ số PDI < 0,2
3.3.1.3 Kết quả hàm lượng dược chất trong chế phẩm đông khô
Tiến hành phân tán lại chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX, sau đó xử lý hỗn dịch sau khi hoàn nguyên theo phương pháp được trình bày ở mục 2.3.2.4 Kết quả được trình bày ở Bảng 3.11
B ả ng 3.11 K ế t qu ả hàm lượng dượ c ch ấ t c ủ a ch ế ph ẩm đông khô (n=3)
Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy PTX chiếm khoảng trên 10% khối lượng chế phẩm đông khô Sự dao động hàm lượng giữa 3 mẻ thí nghiệm tương đối lớn, RSD
> 5%, tuy các giá trị vẫn ở trong khoảng ± 10% so với giá trị trung bình Điều này có thể giải thích do việc bào chế được thực hiện ở quy mô nhỏ nên tỷ lệ hư hao tương đối lớn và không đồng đều, một phần hỗn hợp công thức có thể đọng lại trong thể tích chế của thiết bị Thêm vào đó pha dung môi rất dễ bay hơi, khó lấy chính xác, làm cho sai số trong quá trình có thể lớn Kết quả này gợi ý rằng cần chú trọng về việc cân đong và có biện pháp giảm thiểu bay hơi trong quá trình bào chế
3.3.2 Đánh giá phân bố dược chất trong hỗn dịch nano
PTX trong HD có thể tồn tại ở 5 dạng: PTX tự do, phức hợp PTX-BSA tự do, tiểu phõn nano PTX < 0,22 àm, tiểu phõn nano PTX và/hoặc phức hợp PTX-BSA trong khoảng 0,22 - 0,45 àm, PTX ở dạng tiểu phõn lớn và/hoặc phức hợp PTX-BSA > 0,45 àm Cỏc dạng tồn tại này của PTX cú trong khoảng KTTP được trỡnh bày ở mục 2.3.2.5 Để đánh giá tỷ lệ dược chất được nano hóa, tiến hành hoàn nguyên chế phẩm đông khô bằng dung dịch NaCl 0,9% Phân đoạn mẫu theo KTTP và định lượng PTX trong từng khoảng KTTP theo phương pháp được trình bày ở mục 2.3.2.5 Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 3.12
B ả ng 3.12 K ế t qu ả định lượ ng PTX t ừ các kho ả ng KTTP c ủ a ch ế ph ẩm đông khô sau khi hoàn nguyên (n=3)
Lọc qua ly tâm qua
Tỷ lệ PTX sau lọc hoặc ly tâm(%)
Hình 3.7 T ỷ l ệ PTX d ạ ng t ự do, trong ph ứ c h ợ p phân t ử PTX-BSA, trong ti ể u phân
< 0,22àm, trong ti ể u phõn 0,22 àm - 0,45 àm và trong ti ể u phõn > 0,45 àm
Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các tiểu phân đều đi qua màng lọc
0,45 àm, là bằng chứng cho việc dược chất được nano húa hoàn toàn Khụng phỏt hiện được PTX ở dạng tự do chứng tỏ dược chất hoặc tồn tại dưới dạng tiểu phân nano hoặc tạo phức hợp với albumin tự do Điều này là phù hợp vì PTX thực tế không tan trong nước [27], [33] Hầu hết PTX tồn tại trong dạng hệ tiểu phân nano có thể lọc loại khuẩn (84,5%) Lượng PTX tồn tại ở dạng tiểu phân lớn không qua được màng lọc loại khuẩn chỉ chiếm tỷ lệ 7% PTX trong dạng tạo phức hợp với BSA cũng chỉ chiếm một tỷ lệ 8,6% Sau khi ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút, chúng tôi quan sát thấy phần lớn tiểu phân có cặn màu trắng và phần dịch trên trong suốt Do vậy, một lượng nhỏ PTX tồn tại ở dạng phức hợp phân tử PTX-BSA do PTX có ái lực cao với albumin [29], [43]
3.3.3 Kết quả phân tích nhiệt lượng quét vi sai
Tiến hành phân tích nhiệt lượng quét vi sai (DSC) các mẫu nguyên liệu PTX, nguyên liệu BSA, mẫu chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX và mẫu chế phẩm đông khô placebo theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.7 Kết quả DSC được trình bày ở Hình 3.8
PTX dạng tự do Phức hợp phân tử
PTX-BSA PTX trong tiểu phân nano
PTX trong tiểu phõn nano 0,22àm
Hình 3.8 Ph ổ quét nhi ệ t vi sai c ủ a (a) nguyên li ệ u PTX, (b) placebo, (c) ch ế ph ẩ m và (d) nguyên li ệ u BSA
Nhận xét: Trên giản đồ nhiệt của mẫu nguyên liệu PTX xuất hiện một píc thu nhiệt ở khoảng 225 ºC, gợi ý rằng nguyên liệu PTX tồn tại ở trạng thái tinh thể và nhiệt độ nóng chảy là 225 ºC Ngay sát sau píc thu nhiệt của PTX là píc tỏa nhiệt ở khoảng gần
240 ºC tương ứng với sự phân hủy của PTX Như vậy, PTX nóng chảy và đồng thời phân hủy luôn sau đó Trên giản đồ nhiệt của nguyên liệu BSA có một píc thu nhiệt ở
180 ºC chứng tỏ nguyên liệu tồn tại ở dạng tinh thể Trên giản đồ DSC của BSA đông khô không xuất hiện píc thu nhiệt nào, gợi ý rằng BSA được chuyển sang trạng thái vô định hình trong quá trình đông khô Tương tự mẫu placebo, giản đồ nhiệt của mẫu đông khô hỗn dịch nano không có các píc thu nhiệt hay tỏa nhiệt nào, chứng tỏ PTX trong chế phẩm ở dạng vô định hình Điều ngạc nhiên là píc tỏa nhiệt tương ứng với sự phân hủy của PTX nguyên liệu không xuất hiện trong giản đồ nhiệt của chế phẩm Có thể việc tạo phức hợp với albumin hoặc bao bọc bởi BSA trong tiểu phân nano làm thay đổi tính nhạy cảm với nhiệt của PTX
3.3.4 Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X
Thực hiện quét phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu nguyên liệu PTX, mẫu placebo (đông khô không chứa PTX) và mẫu chế phẩm đông khô theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.8 Phổ đồ XRD của các mẫu được trình bày trong hình 3.9 c d
Hình 3.9 Ph ổ nhi ễ u x ạ tia X c ủ a nguyên li ệ u PTX, m ẫ u placebo và m ẫ u ch ế ph ẩm đông khô
Nhận xét: Phổ XRD của nguyên liệu PTX khẳng định trạng thái kết tinh của nguyên liệu ban đầu Phổ XRD của mẫu placebo và mẫu chế phẩm đông khô đều không có các píc nhiễu xạ chứng tỏ chúng ở dạng vô định hình Kết quả quét phổ XRD khẳng định lại các kết quả của phép đo DSC trình bày ở trên, rằng PTX chuyển từ trạng thái kết tinh sang tồn tại ở trạng thái vô định hình trong chế phẩm đông khô
3.3.5 Kết quả phổ hồng ngoại FT-IR
Thực hiện quét phổ hồng ngoại của các mẫu nguyên liệu BSA, mẫu nguyên liệu PTX, mẫu placebo (đông khô không chứa PTX) và mẫu chế phẩm đông khô theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.6 Các phổ đồ FT-IR của các mẫu được trình bày trong hình 3.10
Nhận xét: Phổ hồng ngoại cung cấp thông tin về các nhóm chức trong phân tử Do vậy, khi có sự tương tác, tạo liên kết hoặc chuyển dịch điện tử của các nhóm chức có thể làm dịch chuyển, thay đổi hình dạng píc đặc hiệu hoặc/và thay đổi cường độ của các píc tương ứng với các liên kết của nhóm chức đó Thí nghiệm này nhằm mục đích đánh giá những thay đổi đối với tín hiệu của các nhóm chức trong phân tử dược chất
Hình 3.10 Ph ổ FT-IR c ủ a các m ẫ u nguyên li ệ u PTX, m ẫ u nguyên li ệ u BSA , m ẫ u placebo và ch ế ph ẩm đông khô
Phổ hồng ngoại của PTX thể hiện các nhóm chức đặc trưng của hoạt chất này, đặc biệt đáng chú ý là các đỉnh ở dải số sóng 1740 - 1640 cm -1 đặc trưng cho các liên kết C=O, là các nhóm chức có thể tạo liên kết với nhiều nhóm amin của BSA Trên phân tử BSA cũng có nhiều liên kết C=O có thể tạo ra các liên kết hydro với các nhóm chức N-
Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX
3.4.1 Đánh giá độ ổn định của quá trình đông khô Để đánh giá độ ổn định của quá trình đông khô, chúng tôi tiến hành đánh giá phân bố KTTP của hỗn dịch chứa tiểu phân nano PTX trước và sau quá trình đông khô Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.13
Chế phẩm Placebo PTX BSA
B ả ng 3.13 Phân b ố KTTP c ủa HD trước và sau quá trình đông khô (n=3)
(nm) PDI Di10 (nm) Di50 (nm) Di90 (nm)
Nhận xét: Phân bố KTTP của hỗn dịch nano trước và sau quá trình đông khô không có sự khác biệt đáng kể Do đó, HD ổn định trong quá trình đông khô, phù hợp để tiếp tục thực hiện các đánh giá độ ổn dịnh của chế phẩm đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX
3.4.2 Đánh giá độ ổn định về KTTP khi pha loãng hỗn dịch Để đánh giá tác động của pha loãng lên độ ổn định của tiểu phân nano sau khi tiêm tĩnh mạch, chế phẩm đông khô sau khi hoàn nguyên được pha loãng bằng dung dịch NaCL 0,9% và dung dịch BSA 4,5% với số lần pha loãng khác nhau theo phương pháp được trình bày trong mục 2.3.5.1 a Đánh giá độ ổn đị nh khi pha loãng b ằ ng dung d ị ch NaCl 0,9%
Tiến hành đánh giá độ ổn định của tiểu phân nano với dung dịch NaCl 0,9 % thông qua đặc điểm phân bố KTTP Kết quả được trình bày ở Bảng 3.14 và Hình 3.11.
B ả ng 3.14.Phân b ố KTTP c ủ a h ỗ n d ị ch khi pha loãng b ằ ng dung d ị ch NaCl 0,9%
Hình 3.11 KTTP TB và PDI khi pha loãng v ớ i NaCl 0,9%
Nhận xét: Không có sự thay đổi đáng kể về đặc điểm phân bố KTTP khi pha loãng bằng NaCl 0,9% với số lần pha loãng khác nhau Chế phẩm đông khô sau khi hoàn nguyên tương đối ổn định khi pha loãng đến 144 lần với dung dịch NaCl 0,9% b Đánh giá độ ổn đị nh khi pha loãng b ằ ng dung d ị ch BSA 4,5%
Tiến hành đánh giá độ ổn định của tiểu phân nano với dung dịch BSA 4,5% thông qua đặc điểm phân bố KTTP Kết quả được trình bày ở Bảng 3.15 và Hình 3.12
B ả ng 3.15 Phân b ố KTTP c ủ a h ỗ n d ị ch khi pha loãng b ằ ng dung d ị ch BSA 4,5%
Hình 3.12 KTTP TB và PDI khi pha loãng v ớ i dung d ị ch BSA 4,5%
Nhận xét: Phân bố KTTP của tiểu phân nano PTX khi pha loãng bằng dung dịch
BSA 4,5% từ 6 lần đến 24 lần không có sự thay đổi đáng kể về KTTP TB Khi pha loãng 48 lần, KTTP TB giảm mạnh và PDI > 0,5 cho thấy sự phân bố rộng của KTTP Sau đó, từ 83 lần đến 144 lần thì đặc điểm phân bố KTTP không có sự thay đổi đáng kể, có thể do tiểu phân nano bị phá vỡ và PTX liên kết với BSA tạo thành phức hợp PTX- BSA
Khi pha loãng đến 48 lần bằng dung dịch BSA 4,5% thì KTTP TB giảm mạnh Do tiểu phân nano bị phân rã/hòa tan, PTX trong các hạt nano thoát ra ngoài chuyển sang dạng tạo phức hợp với BSA tự do trong pha nước (BSA tự do gồm một phần từ công thức và phần lớn từ dung dịch pha loãng) Sự chuyển dạng này xảy ra do PTX có ái lực lớn đối với BSA và tỷ lệ BSA tự do/BSA trong dạng tiểu phân nano đủ lớn Ngoài ra, tiểu phân nano phân rã làm mất tính ổn định về kích thước, dẫn đến giảm sự đồng nhất về phân bố KTTP
3.4.3 Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX
Tiến hành đánh giá bằng hình thức, tính chất của chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX trước và sau khi hoàn nguyên bằng cảm quan tại thời điểm ban đầu và
45 ngày Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.16 và hình PL.4
B ả ng 3.16 Hình th ứ c c ủ a ch ế ph ẩm đông khô sau thờ i gian b ả o qu ả n
Trước hoàn nguyên Sau hoàn nguyên
Ban đầu Bánh đông khô màu trắng, xốp Hỗn dịch màu đục mờ, không lắng cặn, đồng nhất
Bánh đông khô màu trắng, xốp Hỗn dịch màu đục mờ, không lắng cặn, đồng nhất
50 ºC Bánh đông khô màu hơi vàng, co vón lại, không còn xốp
Hỗn dịch màu đục mờ, không đồng nhất, không phân tán hết hoàn toàn chế phẩm đông khô
Nhận xét: Sau 45 ngày bảo quản, ở điều kiện nhiệt độ 50 ºC, chế phẩm đông khô có hiện tượng co vón lại khi hoàn nguyên, hỗn dịch không đồng nhất, không phân tán hết hoàn toàn Vì vậy, chúng tôi dừng đánh giá các chỉ tiêu khác của mẫu bảo quản ở 50ºC
3.4.3.2 Đánh giá phân bố KTTP và hàm lượng dược chất
Tiến hành đánh giá đặc điểm phân bố KTTP và hàm lượng dược chất sau khi hoàn nguyên của chế phẩm đông khô chứa tiểu phân nano PTX ở thời điểm ban đầu và sau
45 ngày bảo quản ở điều kiện 2-8 ºC, 30 ºC và 40 ºC Kết quả được trình bày ở Bảng 3.17
B ả ng 3.17 Độ ổn đị nh c ủ a ch ế ph ẩm đông khô ở th ời điểm ban đầ u và sau 45 ngày b ả o qu ả n ở các điề u ki ệ n khác nhau (n=3)
Hàm lượng (% so với banđầu)(*)
(*) hàm lượng dược chất trong chế phẩm đông khô chiếm 11,7%
Nhận xét: Đặc điểm phân bố KTTP của hỗn dịch nano sau phân tán lại ở thời điểm ban đầu và ở các điều kiện khác nhau sau 45 ngày bảo quản không có sự thay đổi đáng kể KTTP TB ở thời điểm ban đầu và sau 45 ngày bảo quản đều khoảng 140 nm và chỉ
38 số PDI < 0,2 Hàm lượng dược chất sau 45 ngày bảo quản ở các điều kiện trong tủ lạnh, bảo quản dài hạn và lão hóa cấp tốc đều có sự giảm hàm lượng Tuy có giảm so với thởi điểm ban đầu khoảng 2%, song chưa xác định được nguyên nhân là do dược chất bị phân hủy hoặc do sai số của phép định lượng
3.4.4 Đánh giá độ ổn định của hỗn dịch nano PTX sau hoàn nguyên
Chế phẩm đông khô chứa TP nano PTX sau 45 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau được hoàn nguyên để tạo hỗn dịch nano Sau đó, hỗn dịch được bảo quản ở điều kiện 2-8 ºC (nhiệt độ ngăn mát tủ lạnh) và 30 ºC (nhiệt độ tủ ấm) trong vòng 24 giờ Tiến hành đánh giá đặc điểm phân bố KTTP và hàm lượng dược chất của hỗn dịch hoàn nguyên nano PTX-BSA Kết quả đánh giá độ ổn định của hỗn dịch được bảo quản ở điều kiện 2-8 ºC và 30 ºC trong vòng 24 giờ được trình bày lần lượt ở Bảng 3.18 và Bảng 3.19
B ả ng 3.18 Độ ổn đị nh c ủ a h ỗ n d ị ch ch ứ a ti ể u phân nano PTX sau hoàn nguyên trong 24 gi ờ ở điề u ki ệ n 2-8 ° C (n=3) Điều kiện bảo quản sau 45 ngày
B ả ng 3.19 Độ ổn đị nh c ủ a h ỗ n d ị ch hoàn nguyên ch ứ a ti ể u phân nano PTX trong
24 gi ờ ở điề u ki ệ n 30 ° C (n=3) Điều kiện bảo quản
Nhận xét: Từ Bảng 3.18 và Bảng 3.19 cho thấy: chế phẩm đông khô sau 45 ngày bảo quản ở các điều kiện 2-8 ºC, 30 ºC và 40 ºC sau khi được phân tán lại có các đặc tính không khác nhau đáng kể so với hỗn dịch hoàn nguyên từ mẫu ở thời điểm vừa mới bào chế được Hỗn dịch hoàn nguyên sau khi bảo quản trong 24 giờ ở điều kiện 2-8 ºC (ngăn mát tủ lạnh) và điều kiện 30 ºC (nhiệt độ tủ ấm), không có sự thay đổi đáng kể về KTTP TB và phân bố kích thước tiểu phân Ở điều kiện bảo quản 2-8 ºC và điều kiện