[ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP] NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH THÀNH PHẦN TERPENOID – STEROID TRONG HOA CÚC LA MÃ

Tinh dầu hoa cúc La Mã với thành phần chính là các terpenoid – steroid có vai trò quan trọng được ứng dụng vào nhiều trong các lĩnh vực như: y sinh, thực phẩm và làm đẹp,.... Một số mono

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề Tài NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH THÀNH PHẦN TERPENOID –

STEROID TRONG HOA CÚC LA MÃ

Trình độ đào tạo: ĐẠI HỌC

Ngành: CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Chuyên ngành: HÓA DẦU

Giảng viên hướng dẫn: Ts ĐẶNG THU THUỶ

GV NGUYỄN VĂN TOÀN Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ THU THUỶ MSSV: 1152010225 Lớp: DH11H2

Bà Rịa – Vũng Tàu, Tháng 07, Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thu Thuỷ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến,

GV Nguyễn Văn Toàn, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể giảng viên khoa hoá và công nghệ thực phẩm trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu đã tạo mọi điều kiện, hỗ trợ và giúp đỡ chúng tôi thực hiện và hoàn thiện đồ án này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến hai cộng sự của tôi là bạn Nguyễn Thị Thu Tươi và Huỳnh Thị Thuý Ngân, đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này

Xin ghi nhận những đóng góp và giúp đỡ nhiệt tình của các bạn sinh viên khoá DH11HD dành cho tôi trong qá trình thực hiện đồ án

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã là động lực và niềm tin để tôi hoàn thành đồ án này

Vũng Tàu, tháng 07 năm 2015 Sinh viên thực hiện Trần Thị Thu Thuỷ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về hoa cúc la mã 2

1.1.1 Nguồn gốc 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái, điều kiện sinh trưởng và phát triển 2

1.1.3 Thành phần dược liệu có trong hoa cúc La Mã 3

1.2 Đặc điểm các hợp chất Terpenoid – Steroid 4

1.3 Quá trình sinh tổng hợp terpenoid 15

1.4 Tính chất tạo hương và hoạt tính sinh học 16

1.5 Tính chất tạo hương của terpenoid 16

1.6 Hoạt tính sinh học của terpenoid – Steroid 18

1.7 Các phương pháp chiết tách Terpenoid-steroid 22

1.8 Phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi (chưng ninh) 22

1.8.1 Phương pháp chưng lôi cuốn hơi nước 23

1.8.2 Phương pháp ngâm kiệt 24

1.8.3 Phương pháp chiết bằng soxhlet 25

1.8.4 Các phương pháp chiết hiện đại 26

1.8.5 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm 26

1.8.6 Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng 27

1.8.7 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn 28

1.8.8 Chiết dưới áp suất cao 29

1.9 Các phương pháp định tính thành phần terpenoid 29

1.9.1 Phản ứng Liebermann-Burchard để phát hiện steroid-triterpenoid 29

1.9.2 Phản ứng Rosenheim để phát hiện steroid-triterpenoid 30

1.9.3 Phản ứng Rosenthaler để phát hiện steroid-triterpenoid 30

1.9.4 Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid 30

1.9.5 Phản ứng Noller để phát hiện Steroid-triterpenoid 30

1.9.6 Phản ứng Carr-Price để phát hiện Steroid- triterpenoid 31

1.9.7 Thuốc thử pentaclorur antimony SbCl5 để phát hiện terpenoid 31

1.9.8 Thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric để phát hiện dẫn xuất của terpenoid 31

1.9.9 Thuốc thử komarowsky: để phát hiện terpenoid 31

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 32

2.1.Nguyên liệu, hoá chất và dụng cụ 32

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất 32

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 32

2.2 Phương Pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Nghiên cứu các phương pháp chiết tách thành phần terpenoid-steroid 33

2.3 Phương pháp phân tích sản phẩm 40

2.3.1 Phương pháp định tính thành phần terpenoid – steroid 40

2.3.2 Xác định các chỉ tiêu hoá học của terpenoid- steroid 41

2.3.3 Phương Pháp sắc ký khí ghép khối phổ 42

2.3.4 Thử hoạt tính sinh học 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 So sánh hiệu suất chiết terpenoid-steroid 46

3.2 Định tính terpenoid-steroid 47

3.3 Các chỉ tiêu hoá – lý của terpenoid- steroid 48

3.4 Thành phần hoá học của phân đoạn terpenoid-steroid 49

3.5 Hoạt tính sinh học của phân đoạn terpenoid-steroid có trong tinh dầu hoa cúc La Mã 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết terpenoid từ hoa cúc La Mã 33 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tách chiết terpenoid – steroid bằng phương pháp soxhlet 37 Hình 2.3: Sơ đồ chiết xuất terpenoid bằng phương pháp soxhlet bằng dung môi erter dầu hoả 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại terpenoid 5

Bảng 3.1: Hiệu suất chiết terpenoid-steroid 46

Bảng 3.2: Kết quả định tính thành phần terpenoid – steroid 48

Bảng 3.4:Thành phần hoá học của phân đoạn terpenoid-steroid 50

Bảng 3.5 : Đường kính vòng vô khuẩn ứng với một số vi khuẩn của terpenoid – steroid 54

MỞ ĐẦU

Tinh dầu có nguồn gốc từ động, thực vật ngày càng được con người chú

ý và ưa chuộng.Từ xa xưa, tinh dầu đã được mệnh danh là báu vật của thiên nhiên Con người đã phát hiện và biết sử dụng tinh dầu vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: y sinh, thực phẩm, mỹ phẩm, Một đặc điểm quan trọng, không thể thay thế của tinh dầu so với các hợp chất hữu cơ tổng hợp khác là

nó không gây hại cho môi trường và dễ phân huỷ Do có những công dụng thực tiễn quan trọng nên ngày càng có nhiều nghiên cứu cũng như khai thác

về tinh dầu trên toàn thế giới

Tinh dầu hoa cúc La Mã với thành phần chính là các terpenoid – steroid

có vai trò quan trọng được ứng dụng vào nhiều trong các lĩnh vực như: y sinh,

thực phẩm và làm đẹp,

Do có nhiều tính chất đặc biệt và ứng dụng rộng rãi nên việc nghiên cứu các phương pháp để chiết xuất terpenoid – steroid trong hoa cúc La Mã, để đạt hiệu xuất cao nhất là một trong những vấn đề cần được nghiên cứu Vì

vậy với đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu chiết tách thành phần steroi từ hoa cúc La Mã” được thực hiện nhằm góp phần nghiên cứu được

terpenoid-phương pháp chiết tách cho hiệu xuất cao nhất, cũng như đánh giá được một

số hoạt tính sinh học của thành phần terpenoid-steroid có trong hoa cúc la mã

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về hoa cúc la mã

Cúc La Mã là một loại thảo dược lâu đời nổi tiếng ở Ai Cập cổ đại, Hy Lạp và La Mã Suốt thời trung cổ mọi người xem nó như một phương thuốc trị các bệnh phổ biến như hen suyễn, đau bụng, sốt, viêm, buồn nôn, các bệnh thần kinh, bệnh ngoài da và ung thư [ 11]

1.1.1 Nguồn gốc

Hoa Cúc La Mã có nguồn gốc từ Nam và Đông Âu [5] Trước đây, hoa cúc La Mã là một cây cỏ mọc hoang Nhưng từ khi các nhà khoa học tìm ra được các thành phần dược liệu quý từ loài hoa này thì đã có nhiều nước trên thế giới quan tâm phát triển việc trồng loại cây này Ban đầu, hoa cúc La Mã được trồng ở Đức, Hungary, Pháp, Nga, Nam Tư và Brazil sau đó được du nhập rộng rãi đến Ấn Độ trong thời kỳ Mughal Loài này cũng có thể được tìm thấy ở Bắc Phi, các vùng ôn đới của Châu Á,Bắc và Nam Mỹ, Australia [6]

Cúc La Mã đã được di thực vào Việt Nam từ những năm 60 và đến năm

1978 Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bước đầu nghiên cứu

được kỹ thuật trồng hoa cúc La Mã nhưng chưa nhân rộng được cây này vì chưa có những công trình nghiên cứu và ứng dụng [1]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, điều kiện sinh trưởng và phát triển

Hoa cúc La Mã (Chamaemelum Nobille hay còn gọi là Roman

Chamomile) là cây thảo dược lâu năm với rể trục mỏng, thân mọc đứng gần

mặt đất và phân nhánh, lá kép dài và hẹp với các đoạn hình dải nhọn như gai, cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 10-30mm, với một vòng đơn các cánh hoa hình lưỡi trắng và ở giữa rất nhiều hoa con hình ống màu vàng xếp trên mặt đế hoa phồng lên tạo dạng nón sau

khi hoa nở [5] [6] Đặc điểm hình thái của hoa cúc La Mã được thể hiện ở hình sau:

− Hoa cúc La Mã là loài hoa dễ trồng nên chúng sống được trên nhiều loại đất, đặc biệt chúng thích hợp với loại đất cát, thoát nước tốt với độ pH trong

khoảng 4,8 đến 8,3 [21] và chịu nắng Tại Banthra trang trại của Viện Ngiên

cứu Bách Thảo Quốc gia ở Ấn Độ đã nghiên cứu và trồng thành công loài cúc

− Mặc dù hoa cúc là loài chịu hạn, nhưng nó cũng cần đủ nước để nảy mầm và cho sự phát triển của cây con Lượng mưa trung bình hàng năm từ

400 đến 1 400 mm mỗi mùa là đủ để có một vụ mùa tốt

− Khi cây trồng phát triển, nó phát triển thành nhiều cụm, cao khoảng 30cm Cúc La Mã ra hoa vào khoảng tháng 6-9, hoa có mùi thơm đậm và có

vị chát khi được sử dụng như trà [5] 6] Hoa được thu hoạch vào mùa hè khi đang nở rộ, thu hoạch tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 22-25oC Tại Nam Phi, năng suất hoa khô có thể thu hoạch được mỗi năm là từ 2-6 tấn/ha và đến năm

1995 ở thế giới là khoảng 500 tấn [21]

1.1.3 Thành phần dược liệu có trong hoa cúc La Mã

Theo nghiên cứu của George Nemeca, trong hoa cúc La Mã có khoảng

120 hoạt chất đã được xác định, trong đó có 28 terpenoid – steroid, 36 flavonoids và 52 hợp chất bổ sung khác đã được xác định[14],[15]

Theo Lemberkovics E và các cộng sự của công, các thành phần chính

của tinh dầu chiết xuất từ hoa cúc La Mã là terpenoids như α-Bisabolol và azulenes ôxít của nó bao gồm chamazulene và các dẫn xuất axetylen Chamazulene và Bisabolol không ổn định và được bảo quản tốt nhất trong cồn rượu Tinh dầu hoa cúc La Mã có chứa ít chamazulene và chủ yếu được cấu thành từ các este của axit thiên nhiên và axit tiglic Nó cũng chứa farnesene và α-pinen Hoa cúc La Mã có chứa tới 0,6% sesquiterpene lactones loại germacranolide, chủ yếu là nobilin và 3-epinobilin Cả hai α-Bisabolol, Bisabolol oxit A và B và chamazulene hoặc azulenesse, farnesene và spiro-ether lactones quiterpene, glycosides, hydroxycoumarins, flavanoids (apigenin, luteolin, patuletin, và quercetin), coumarin (herniarin và umbelliferone), terpenoid, và chất nhầy được coi là thành phần sinh học hoạt động cao [16] [17] Thành phần chính khác của hoa bao gồm một số hợp chất phenolic, chủ yếu là các flavonoid apigenin, quercetin, patuletin như glucosides và các dẫn xuất acetyl hóa khác nhau Trong số các chất flavonoid, apigenin là hợp chất có triển vọng nhất Nó hiện diện với số lượng rất nhỏ như apigenin tự do, nhưng chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside [18][ 19]

1.2 Đặc điểm các hợp chất Terpenoid – Steroid

Terpenoid là một loại hợp chất thiên nhiên quan trọng có khả năng tạo mùi thơm và có hoạt tính sinh học mạnh Terpenoid phân bố rộng rãi trong thiên nhiên và có nhiều ở cây có tinh dầu Ngoài ra terpenoid cũng có mặt trong thực vật bậc thấp như tảo, nấm đến thực vật bậc cao, trong động vật và

vi khuẩn

Vào năm 1818 người ta đã tìm được một số hợp chất và xác định được rằng tỉ lệ nguyên tử C:H ở tinh dầu là 5:8 Tiếp thep đó là một số hợp chất hidrocacbon không no, không vòng hoặc có vòng đã được tách ra Chúng có công chung là (C5H8)n ,(n≥2) và được đặt tên là terpenoid

Terpenoid được Dumas đặt tên cho tinh dầu có trong dầu turpentine vào

năm 1866 Terpenoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là thành phần dễ bay hơi trong các loại dầu thực vật Cấu trúc của terpenoid bao gồm các monomer được gọi là isoprene Isoprenoid là tên gọi khác của terpenoid [1][2][3]

Tuỳ theo số đơn vị isoprene (n) mà người ta chia terpenoid ra thành nhiều loại khác nhau:

Bảng 1.1: Phân loại terpenoid

Số n Loại terpenoid Số carbon Nguồn gốc

Theo Ingold, trong các hợp chất terpenoid nói trên, các đơn vị isoprene nối với nhau theo nguyên tắc “đầu – đuôi”

Trong tinh dầu chủ yếu chỉ chứa hai loại terpenoid là monoterpen và sesquiterpen Các terpenoid này thường bất bão hoà và mang nhiều nhóm định chức khác nhau

Trong số những hợp chất này cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ:

− Không tuân theo nguyên tắc isoprene về số carbon

− Không nối nhau theo quy tắc “đầu – đuôi”

Lavandulol (C10H18O) Santenol (C9H16O)

Monoterpen chi phương (monoterpen mạch hở): có sườn cơ bản là

2,6-dimetiloctan, với nhánh iso nằm ở hai dạng khác nhau là Isopropennil (𝛼−)

và Isopropiliden (𝛽−).Trong thiên nhiên người ta thường gặp dạng 𝛽 hơn Cấu trúc khung sườn và các dạng dây nhánh Iso được trình bày trong hình 1.7

12

2,6-dimetiloctan Isopropiliden (𝛽−) Isopropennil (𝛼−)Hầu hết các monoterpen mạch hở đều bất bão hoà do đó các terpen này

dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, oxigen và ánh sáng để cho ra các phản ứng: Diels – Alder, polimer hoá, chuyển vị, quang hoá [2] Đa số các

monometerpen chi phương đều có mùi thơm dễ chịu, được sử dụng trong hương liệu Chúng còn là nguyên liệu đầu để tổng hợp các monoterpen oxigen

Một số monoterpen chi phương được tìm thấy trong thiên nhiên:Mircen

là cấu phần trong tinh dầu của hoa nguyệt quế, hoa bia và trong một số loại tinh dầu khác.Ocimen là đồng phân của mircen, có nhiều trong tinh dầu oải hương

𝛽-Mircen Cis-𝛽-Ocimen trans-𝛽-Ocimen

Monoterpen chi hoàn (monoterpen mạch vòng):được chia làm các dạng

khác nhau như: monoterpen đơn hoàn, monoterpen nhị hoàn và monoterpen tam hoàn

Monoterpen đơn hoàn (một vòng):được xem là dẫn chất của cyclohexane

với nhóm thế methyl và isopropyl, nó có sườn cơ bản là 𝜌-metan[3].Do ảnh hưởng của quá trình hydro hoá các monoterpen đơn vòng này có thể biến đổi qua lại với nhau Cấu trúc sườn và quá trình biến đổi được thể hiện như sau:

1 2 3 4 5 6 7

8

Phẳng Lập thể

Terpinolen 𝛼-terpinen

Một số monoterpen đơn vòng đã được tìm thấy trong thiên nhiên như: limone, Terpiolen có trong tinh dầu họ cam quýt, sả chanh, hạt tiêu, và có công thức cấu tạo được thể hiện như hình sau:

Limonen Isolimonen Terpinolen

Monoterpen nhị hoàn (hai vòng): có 4 loại sườn carbon cơ bản sau:

pinan, caran, tujan, camphan và 3 loại sườn đồng phân với camphan là: isocamphan, isoborilan, fenchan [1]

6 5

7

1 0

1 2 3

4 5 6

7

1 0

1 2 3 4 5

6 7

8 9 10

3 5

6 7

8

9

10 4

1 2 3 4 5

6 7

8 9

10

Fenchan Isocamphan Isoborilan

Một số terpenoid nhị hoàn đã được tìm thấy trong thiên nhiên

như:𝛼-Tujen được tìm thấy nhiều trong tinh dầu của cây Boswellia serrata Roxb Tujen là đồng phân vị trí của 𝛼-Tujen.Sabien được tìm thấy trong tinh dầu tùng (Theo Junipesis sabina L),  𝛿-3-Caren được tìm thấy trong tinh dầu nhựa dầu của cây Pinus longifodia

𝛽-𝛼-Tujen 𝛽-Tujen Sabinen 𝛿-3-Caren

Monoterpen tam hoàn (ba vòng): Một số monoterpen tam hoàn được tìm

thấy:Teresantalol có trong tinh dầu gỗ đàn hương.Nortricicloekasantala cũng

có trong tinh dầu gỗ đàn hương Ấn Độ

Teresantalol Nortricicloekasantala (11 C)

c) Sesquiterpen

Sesquiterpen có công thức phân tử là C15H24, được tạo thành bởi ba đơn

vị isoprene, nó là hợp chất không no Tinh dầu cũng chứa nhiều hợp chất loại sesquiterpen Sesquiterpen được chia làm hai dạng là chi phương và chi hoàn, trong đó chi hoàn gồm có sesquiterpen đơn hoàn, sesquiterpen nhị hoàn,

sesquiterpen tam hoàn

Sesquiterpen chi phương (mạch hở): Các sesquiterpen chi phương có

sườn cơ bản là famesan [3].Một số sesquiterpen chi phương thường gặp như: farnesol, neroliol, sesquicitronelen có trong tinh dầu sả Tích Lan và Java

Famesan

Sesquicitronelen

Sesquiterpen chi hoàn (mạch vòng):

Sesquiterpen đơn hoàn: Các sesquiterpen đơn hoàn có 3 loại sườn cơ

bản là: bisabolol, germacran và humulan được trình bày ở hình 1.17

Một số sesquiterpen đơn hoàn:Zingiberen là cấu phần chính của tinh dầu gừng, rễ Curcuma zedoaria Rosc.Germacren B có trong tinh dầu hoa bia (hublon)

Zinggibereb Cumuren Germacren B

Sesquiterpen nhị hoàn: Sesquiterpen nhị hoàn có 3 loại sườn cơ bản:

naptalen vòng 6-6, azulen vòng 7-5 và caripphilen vòng 9-4 [23] Trong đó sườn naptalen có hai dạng cơ bản là: cadinan và eudesman (seliman), được

có trong tinh dầu phong lữ, vertiavazulen có trong tinh dầu hương bài, chammazulen có trong tinh dầu hoa cúc.Cariophilen có trong tinh dầu cuống

và nụ đinh hương, hoa bia

Guaiazulen Vertivazulen Chamazulen

𝛽- Cariophilen Isocariophiken

Sesquiterpen tam hoàn (ba vòng): 𝛼-Santalen có trong tinh dầu đàn hương Ấn Độ Gurjunen là thành phần chính của tinh dầu trích từ nhựa cây của vài loài Dipterocarpus Copaen là thành phần tương đối hiếm trong tinh dầu copaiba balsam Châu Phi

𝛼-Santalen Gurjunen Copaen

d) Diterpen

Diterpen có công thức phân tử là C20H32, được cấu tạo bởi 4 đơn vị isoprene, diterpen có chủ yếu trong nhựa cây và bao gồm bốn loại: Diterpen chi phương, diterpen chi hoàn

Diterpen chi phương: Trong tự nhiên diterpen chi phương là hợp chất

phytol Diterpen chi phương đã được tìm thấy nhiều trong thiên nhiên như: Trans-phytol có trong dầu cây Croton zambesicus và 3,7,11,15-tetrametil hexadeca-2,10,14-tetraen-1,7,12-diol được tìm thấy trong nhựa dầu Bifurcaria bifurcata Chúng được trình bày trong hình 1.22 như sau:

Trans-phytol

3,7,11,15-tetrametil hexadeca-2,10,14-tetraen-1,7,12-diol

Diterpen chi hoàn: được tìm thấy nhiều trong thiên nhiên như:

Hispanolone được cô lập từ nhựa dầu lá Leonurus japocicus, Marrubinon B

có trong tinh dầu cây Marrubium velutinum, Marrubiin có trong nhựa dầu cây Marrubium cylleneum

Hispanolone Marrubinan B Marrubiin

Các triterpen có hai nhóm hợp chất quan trọng là các saponin và sterol Gypsogenin được cô lập từ Climacoptera obtusifolia, Acid applanoxidic C và

F được cô lập từ Ganoderma annulare

Gypsogenin

Acid applanoxidic C Acid applanoxidic F

e) Tetraterpen

Tetraterpen có công thức phân tử là C40H64,nó còn có tên gọi khác là carotenoid Các chất này thường có cấu trúc hoá học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chất có màu từ vàng, cam đến đỏ Một số loại caroten

đã được tìm thấy như: Lycopen là một carotenoid chủ yếu có trong quả cà chua.Lycophyll là một dẫn xuất của lycopen, được điều chế nhằm làm tăng khả năng hoà tan trong nước [3] [4]

Lycopen

Lycophyll

1.3 Quá trình sinh tổng hợp terpenoid

Terpenoid được tổng hợp từ các gốc acetyl-CoA hoạt hóa, trước hết tạo thành acid mevalonic, sau đó tạo thành isopentenyl pyrophosphate, isopentenyl pyrophosphate là tiền thân của terpenoid Các kết quả nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, một số dạng terpenoid của tinh dầu như các geraniol, linalool, farnesol…thường có mặt trong hầu hếtcác cơ thể sống ở tất

cả các mức độ tiến hóa khác nhau, từ các vi sinh vật, các loài thực vật bậc thấp, thực vật bậc cao, đến cả động vật và con người

Các terpenoid được hình thành từ hai hoặc ba hay nhiều phân tử isoprene, isoprene lại là một trong những hợp chất cơ sở để tạo thành các carotenoid, các steroid và cao su Quá trình sinh tổng hợp trong mọi cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ hợp chất ban đầu là acetic acid qua các sản phẩm trung gian là mevalonic acid, isopentenil pirophosphat đến geranil và farnesil phosphat Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được các chuỗi carbon trong các phân tử geraniol, linalool, farnesol và nerolidol là những sản phẩm trung gian chủ yếu trong quá trình sinh tổng hợp các terpenoid có hoạt tính sinh học như các phyton, hocmon steroid, các vitamin D, E, K và carotenoid Một số hợp chất thường gặp trong thành phần của tinh dầu như linalool, farnesol và nerolidol… luôn có mặt trong hầu hết các hoạt động sống của cây

Quá trình sinh tổng hợp terpenoid được thực hiện qua ba giai đoạn:

− Tạo isoprene hoạt hoá từ ba phân tử acetyl CoA

− Photphat hoá để tạo nên pyrophotphat isopentenyl và pyrophotphat dimethylallyl

− Sinh tổng hợp pyrophotphat geranul và neryl terpenoid hở dạng trans, dạng cis, pyrophotphat neryl terpenoid vòng, pyrophatphat geranyl

1.4 Tính chất tạo hương và hoạt tính sinh học

Hoa cúc La Mã đã được sử dụng qua nhiều thế kỷ, nó được dùng trong trà như một chất giúp thư giãn nhẹ, điều trị các bệnh sốt, cảm lạnh, đau dạ dày

và chống viêm [1]…Ngoài việc sử dụng làm dược liệu , chúng còn được dùng làm đồ uống giải khát cũng như là thành phần trong nhiều chế phẩm mỹ phẩm

1.5 Tính chất tạo hương của terpenoid

Terpenoid được cấu tạo bởi liên kết “đầu - đuôi” của các đơn vị isoprene được sinh ra từ mevalonic acid Terpenoid là những thành phần chủ yếu trong

tinh dầu thiên nhiên Terpenoid tạo nên một nhóm chất rất lớn của các sản phẩm thiên nhiên, chúng có đặc tính thơm và được sử dụng rộng rãi trong hương liệu và công nghiệp chất thơm Các cấu tử thuộc nhóm terpenoid thường dễ bay hơi, dễ hòa tan trong nước, trong ethanol, là những cấu tử có

độ phân cực trung bình và phân cực mạnh Đồng thời có tính chất tạo hương,

vì thế làm tăng mùi, vị hấp dẫn cho thực phẩm, cho nên thường được sử dụng làm hương liệu cho bánh, kẹo và sản xuất rượu mùi Các cấu tử của tinh dầu bao gồm terpene và dẫn xuất của terpene như aldehyde, ester, ketone, alcohol

và acid,… [6] [7]

Tác giả Newman A.A, cho rằng các dẫn xuất chứa oxy của của terpene như: alcohol, aldehyde, ketone, ester và acid có trong tinh dầu thường chủ yếu do các nhóm chức như: aldehyde, ester, ketone, alcohol và acid… quyết định

Nhóm alcohol: Các cấu tử có nhóm chức alcohol cũng có nhiều trong

tinh dầu vỏ quả có múi, có thể ở dạng mạch thẳng hay mạch vòng Chúng cũng góp phần tạo hương thơm cho tinh dầu vỏ quả có múi, chẳng hạn trans-p-mentha-2,8-dien-1-ol là cấu tử tạo hương thơm đặc trưng cho tinh dầu bưởi, nerol cũng góp phần tạo cho tinh dầu chanh có hương thơm Một số kết quả nghiên cứu cho thấy các cấu tử như: Geraniol, linalool, farnesol cũng có tác dụng quan trọng trong việc tạo hương thơm cho loại tinh dầu này [7] Theo Nguyễn Mạnh Pha và cộng sự, cho thấy sự có mặt của các cấu tử

có nhóm chức alcohol góp phần làm cho tinh dầu hoa bưởi có hương thơm hấp dẫn, rất đặc trưng và có tác dụng như một chất định hương

Nhóm aldehyde: Các cấu tử có nhóm chức aldehyde thường chỉ chiếm

một hàm lượng rất nhỏ trong tinh dầu vỏ quả có múi, nhưng lại là những cấu

tử tạo hương thơm đặc trưng cho tinh dầu này Trong đó phải kể đến các cấu

tử octanal, citronellal, decanal, dodecanal, geranial là những cấu tử tạo hương thơm đặc trưng cho tinh dầu vỏ bưởi, cam, chanh

Nhóm ketone: Người ta thường gặp nootkatone là cấu tử tạo mùi thơm

đặc trưng cho tinh dầu bưởi

Nhóm ester: Trong tinh dầu cũng có chứa một số cấu tử tham gia tạo mùi thơm thuộc nhóm ester như octyl acetate, geranyl acetate, neryl acetate, perillyl acetate Những cấu tử này cũng thường chiếm tỷ lệ nhỏ trong tinh dầu

và rất dễ bay hơi

Nhóm acid: Trong tinh dầu một số loại quả người ta cũng xác định được

một số cấu tử có nhóm chức acid tham gia tạo mùi thơm cho tinh dầu, chẳng hạn như nonanoic acid có trong tinh dầu chanh

Nhóm oxide: Người ta cũng xác định được cis-linalool oxide, linalool oxide góp phần tạo mùi thơm cho tinh dầu [17] Những cấu tử này cũng thường chiếm tỷ lệ nhỏ và là những cấu tử dễ bay hơi Ngoài tinh dầu hoa quả thì terpenoid cũng tham gia tạo hương thơm cho tinh dầu bạch đàn, tinh dầu đinh hương và tinh dầu gừng Với những vai trò tạo hương thơm như vậy terpenoid được sử dụng rộng rãi trong sản xuất chất thơm cho thực phẩm

trans-và mỹ phẩm

Vậy tính chất tạo hương của terpenoid chủ yếu là do các cấu tử có nhóm chức aldehyde, ester, ketone, alcohol và acid quyết định

1.6 Hoạt tính sinh học của terpenoid – Steroid

Nhờ có những biến đổi rộng lớn về độ phân bố các cấu tử, trọng lượng phân tử, điểm sôi và độ phân cực mà nhiều tinh dầu đã thể hiện hoạt tính kháng côn trùng, kháng khuẩn và kháng nấm rất tốt Về mặt tác dụng, terpenoid được dùng trong diệt khuẩn, phòng chống tim mạch và phòng chống khối u Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy tinh dầu vỏ bưởi và

vỏ cam còn có tác dụng chống ung thư Trong tinh dầu bưởi, cam, có các cấu

tử limonene, octanal, citronellal và decanal đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh khả năng phòng chống một số loại ung thư [3] [4]

[5]

Trong dân gian còn dùng tinh dầu bưởi để giải rượu và bôi lên các vùng tóc rụng để kích thích mọc tóc Xông mặt với tinh dầu vỏ cam và quýt với nước có tác dụng giảm thiểu những cơn đau đầu khó chịu Trong hợp chất lactone terpenoid có vòng lactone không no dễ dàng kết hợp với các nhóm -

SH, -OH, -NH của amino acid và protein trong vi sinh vật, biến thành chất độc và làm rối loạn quá trình sống của chúng [3]

Terpenoid còn có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, chúng tham gia vào những quá trình trao đổi chất như các vitamin, tác dụng như các tác nhân điều tiết, phòng chống ung thư và đóng vai trò bảo vệ như những chất chống oxy hóa Đặc biệt trong terpenoid có các hợp chất vòng lactone chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp vì tác dụng độc tế bào, kháng khuẩn, diệt côn trùng, diệt nấm và kháng ung thư [3]

Các nghiên cứu về dược lý cho thấy các hợp chất terpenoid thể hiện hoạt tính sinh học rất đa dạng như các hoạt tính chống ung thư, khối u, chống oxy hóa, kháng virus, kháng viêm nhiễm, bảo vệ gan, phòng chống tiểu đường, phòng chống bệnh thấp khớp, trị các chứng bệnh về đường hô hấp và hạn chế sinh tổng hợp cholesterol từ đó làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch

Hoạt tính sinh học của một số tecpenoid :

a) Liomnene

Limonene là một terpen quan trọng được phát ra bởi những cây giả

xanh (cây ô rô), và hoạt động như allelochemical trong việc ức chế sự nảy mầm của các loài thực vật khác (Singh HP et al., Ann Bot năm 2006, 98,

1261) Có khoảng 30.000 tấn/năm limonene được chiết xuất từ các nguồn tự

nhiên (dầu thông) và được sử dụng trong quá trình tổng hợp các sản phẩm quang học khác (Schwal Wet al., Eur J Lipid Sci Technol năm 2013, 115, 3)

b) Thuyone

Thuyone được biết đến như một hóa chất độc hại trong absinthe, một sản phẩm chiết xuất từ Artemisia absinthium Thuyone gây ra hiệu ứng ảo giác Thujone hoạt động chủ yếu trên các thụ thể GABA trong não và thể hiện phản ứng thần kinh Ở nhiều quốc gia, số lượng Thujone cho phép trong thực phẩm hoặc các sản phẩm nước uống được điều chỉnh (ở châu Âu, mức độ dung nạp tối đa là 25 mg / l)

c) Menthol

Menthol có trong tinh dầu bạc hà (Mentha arvensis L., thuộc họ Hoa môi

- Lamiaceae) Trong y học dùng làm thuốc giảm đau, chữa chứng đau nửa

đầu; chữa cảm lạnh, nóng sốt; chống buồn nôn do say tàu xe Kháng viêm, khử trùng mạnh Thanh lọc không khí, khử mùi Xua đuổi muỗi và côn trùng.Trong công nghiệp tinh dầu bạc hà dùng vào thành phần của các mỹ phẩm giúp da mịn màng, làm se lỗ chân lông

d) Borneol, Tecpinhidrat, lupeol

Borneol trong cây Đại bi (Blumea balsamifera) dùng làm thuốc cảm

cúm, chữa cảm mạo, ho, sốt nóng làm ra mồ hôi dưới dạng thuốc xông Tecpinhidrat (từ các nguồn như dầu nhựa Thông, oregano, Húng tây và Bạch đàn) dùng làm thuốc ho Dược phẩm tecpin-codein chữa ho long đờm trong điều trị viêm phế quản cấp hay mãn tính Lupeol có tính kháng khuẩn, chống viêm chống viêm khớp chủ yếu được tìm thấy trong cây ăn quả phổ biến như Ô liu, Xoài, Dâu tây, Nho,… có tác dụng có lợi như một tác nhân

điều trị và phòng ngừa cho một loạt các rối loạn Hợp chất lupeol trong trái

cây tìm thấy có tác dụng tiêu diệt các khối u ung thư ở đầu và cổ

e) Linalool

Linalool là một loại chất dẫn xuất có thể tìm thấy trong Cam, Quýt, Xoài, các loài thảo mộc khác như là Húng quế, Rau mùi, cây Bu lô hay hoa Oải hương Ngửi chất linalool có thể mang đến những hiệu quả về mặt sinh

lý hóa, từ đó có thể làm cho mức độ căng thẳng giảm xuống một cách đáng

kể Linalool ức chế các tế bào ung thư gan tái tạo: Một nồng độ 0,4 micromol

ức chế 50% của các tế bào tái tạo, nồng độ của 2 micromol ức chế 100% của các tế bào từ sao chép, do đó phá hủy các ung thư.Linalool còn dùng để diệt

Bọ chét, Gián…

f) Sequitecpen lacton

Các hợp chất sesquitecpen lacton trong tinh dầu chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu do tác dụng độc tế bào, kháng ung thư, kháng trùng, diệt côn trùng và diệt nấm của chúng Đa số có vị đắng và có mùi khó chịu nên động vật ăn cỏ và sâu bọ không ưa thích Ví dụ về tác dụng của vài sesquitecpen lacton:

Helenalin được tìm thấy trong Arnica Montana và Arnica chamissonis foliosa hoạt tính chống viêm và chống ung thư Helenalin đã được chứng minh để chọn lọc ức chế yếu tố phiên mã NF-kB, mà đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa đáp ứng miễn dịch[3]

Vernolepin được phân lập từ trái cây sấy khô của Vernonia amygdalina Del Nó cho thấy tính chất chống kết tụ tiểu cầuvà cũng là mộtchất ức chế polymerase DNA không thể đảo ngược, do đó có thể có khả năng kháng u

Artemisinin trong cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua)đã được sử dụng để điều trị nhiễm ký sinh trùng đường ruột, trĩ chống viêm và làm thuốc chống sốt rét

1.7 Các phương pháp chiết tách Terpenoid-steroid

Hầu hết các terpenoid, steroidlà các hydrocarbon có mang một số nhóm chức như hydroxyl (-OH), acetyl (-OAc), eter (-O-), carbonyl (C=O ester hoặc acid carboxylic), nối đôi (-C=C-),…nên nói chung là những hợp chất có tính ít phân cực, có tính thân dầu nên tan tốt trong eter dầu hoả Hexan, eter dietyl, clorofrom…ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với các phân

tử đường để tạo thành glycoside

Không có phương pháp đặc trưng nào để chỉ tách riêng terpenoid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên chiết tách chúng ra khỏi dược liệu và tiếp theo sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất [9] [10]

1.8 Phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi (chưng ninh)

Dung môi dùng trong phương pháp này cần đạt được những yêu cầu sau:

− Hoà tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu tử có trong nguyên liệu

− Tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu

− Không có tác dụng hoá học với tinh dầu

− Không biến chất khi sử dụng nhiều lần

− Hoà toàn tinh khiết, không có mùi lã, không độc, không ăn mòn thiết

bị, không tạo hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

− Điểm sôi của dung môi thấp hơn so vời điểm sôi của các cấu tử dễ bay hơi nhất trong tinh dầu

Thông thường không có loại dung môi nào phù hợp với tất cả các yêu cầu trên, người ta sử dụng dung môi không tan trong nước như eter dầu hoả, dimetyl eter, hay dung môi tan trong nước như ethanol, aceton,

Nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình phản ứng, được gia nhiệt và xáo trộn đều trong suốt thời gian trích ly Giữ cho hoa chìm trong dung môi Sau khi quá trình tẩm trích kết thúc, dung dịch trích ly sẽ được tách nước bằng cách là khan bằng Na2SO4, lọc Loại bỏ dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phương pháp chưng cất dưới áp suất thấp (cô quay) Sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sản phẩm thu được gồm có terpenoid - steroid và một số chất khác như nhựa, sáp, chất béo nên cần phải tách riêng terpenoid - steroid ra Cho eter dầu hoả vào hỗn hợp sản phẩm và chiết nhiều lần để chiết kiệt thành phần terpenoid – steroid sau đó cô quay thu hồi dung môi

1.8.1 Phương pháp chưng lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn

Chưng lôi cuốn hơi nước trực tiếp:

Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo thành phần sterpenoid – steroid, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được phân đoạn sterpenoid – steroid sau khi phân ly tách nước ra

Ưu điểm:

Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền phù hợp với quy mô sản xuất nhỏ

Nhược điểm:

− Chất lượng sản phẩm không cao

− Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết

bị

− Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài

− Tiêu tốn nhiều năng lượng

Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp:

Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau

Do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục được tình trạng nguyên liệu khê khét, màu sắc và phẩm chất của sản phẩm thu được tốt hơn

Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế vào điều chỉnh các hông số như lưu lượng, áp suất cho hù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp

nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm thu được

1.8.2 Phương pháp ngâm kiệt

Nguyên tắc của phương pháp ngâm kiệt là dược liệu luôn tiếp xúc với dung môi mới, luôn tạo sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao do đó có thể chiết kiệt hoạt chất

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thuỷ tinh, hình trụ đứng dưới đáy bình là một van khoá để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, bột bình hướng đặt bên dưới để hừng dịch chiết, Phía trên cao của bình ngấm kiệt

là bình lóng để chứa dung môi

Phương pháp tiến hành: Bột cây được xay thô, cho vào bình ngấm kiệt phía đáy bình được lót bằng bông thuỷ tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được cho vào bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng

những viên bi thuỷ tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột

Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên

bề mặt Có thế sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12 -24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khoá bình lóng cho dung môi chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi

chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình

Ưu điềm:

− Hiệu quả chiết cao

− Dễ dàng thực hiện

Nhược điểm:

− Đòi hỏi tiết bị phức tạp hơn

− Thời gian chiết kiệt lâu

1.8.3 Phương pháp chiết bằng soxhlet

Bột dược liệu được đặt trong một túi vải sau đó được cho vào ống chứa nguyên liệu Rót dung môi vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút

mài, như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống sinh hàn Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Dung môi khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, sau đó bị làm lạnh tại sinh hàn, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thằng xuống ồng đựng nguyên liệu Dung môi ngấm qua bột cây và chiết những chất hữu cơ có thể hoà tan trong dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi với vào ống chứa nguyên liệu càng nhiều, đến một mức cao nhất, dung môi sẽ bị hút về bình

cầu Tiếp tục chiết đến khi chiết kiệt chất trong bột cây

Sau khi hoàn tất, lấy dung môi ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi thu được

cao chiết

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quá trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm tại đó, chỉ

có dung môi tinh khiết là được bốc hơi lên để tiếp tục quá trình chiết

Ưu điểm:

− Tiết kiệm dung môi

− Không cần các thao tác lọc và châm dung môi mới

− Chiết kiệt hợp chất trong nguyên liệu

Nhược điểm:

− Kích thước máy soxhlet làm giới hạn khối lượng nguyên liệu cần chiết

− Do trong quá trình chiết các hợp chất chiết ra từ nguyên liệu được trữ lại trong bình cầu, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi, vì

thế nếu các hợp chất nào kém bền nhiệt có thể bị hư hại

− Hệ thống máy đắt tiền và dễ vỡ

1.8.4 Các phương pháp chiết hiện đại

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn, chiết dưới áp suất cao, đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng

như chất lượng chiết xuất

1.8.5 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm

Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết Sóng siêu âm với tần số 20 kHz thường được sử dụng Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hoà tan các chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể

phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết

Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng trong chuẩn

bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng