+ ội dung nghi n c u: -Thực hiện quy trình xác định HLA bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên các mẫu bệnh phẩm thực tế có tại Khoa Miễn Dịch -Thu thập số liệu các mẫu bệnh được xác định b
TỔNG QUAN Y VĂN 2.1 Hệ thống HLA
Định nghĩa
MHC là nhóm phức hợp chủ yếu tương hợp về mô học (the major histocompatibility complex) gồm nhiều vùng gen, họ gen mã hóa cho những phân tử MHC động vật Những phân tử MHC đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch và tự miễn dịch
Hệ thống kháng nguyên bạch cầu (HLA - Human Leukocyte antigen system) là tên gọi của nhóm MHC ở con người Được phát hiện bởi nhà miễn dịch học người Pháp- Jean Dausset vào 1958, tính đến nay HLA là một trong những hệ thống kháng nguyên phức tạp và đa dạng nhất, được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu chuyên sâu.[15,
Nhóm các gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 6 (hình 1A), bao gồm nhiều gen mã hóa cho các protein trình diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào bạch cầu và tất cả tế bào có nhân có vai trò quan trọng trong cấy ghép nội tạng và các gen khác Phức hợp gen HLA có kích thước khoảng 3.5 triệu nucleotide trong đó, lớp I và II chiếm đến 2/3 kích thước phức hợp Hình 1B mô tả vị trí tương đối của 3 lớp HLA trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, lần lượt từ trên xuống dưới là vị trí các locus HLA thuộc lớp I và lớp II và bản đồ gen của các gen thuộc lớp III [15, 3, 6]
Hình 1B : Sơ đồ vị trí tương đối và số lượng của các gen HLA trên cánh ngắn nhiễm
Vai trò
Hệ thống kháng nguyên HLA có nhiều vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch giúp con người chống lại bệnh tật Đồng thời chúng là tác nhân tiên quyết gây ra hiện tượng thải ghép HLA cũng có vai trò trong chống lại ung thư Tuy nhiên, ở một số trường hợp chúng cũng gây ra các loại bệnh tự miễn
Việc xác định type HLA có nhiều ứng dụng quan trọng như trong cấy ghép mô, cơ quan, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tiên lượng khả năng mắc và điều trị các bệnh tự miễn hay ung thư.[3]
❖ Vai trò trong các bệnh truyền nhiễm:
Khi các tác nhân gây độc ngoại lai xâm nhập vào cơ thể, nhóm các tế bào đặc biệt gọi là tế bào trình diện kháng nguyên (APCs –Antigen presenting cell ) sẽ phân cắt các kháng nguyên lạ này thông qua hiện tượng thực bào Sau quá trình này, các mảnh nhỏ của kháng nguyên sẽ được gắn lên vùng HLA thuộc lớp MHC II của tế bào APC Nhờ quá trình này đưa tín hiệu đến các tế bào T để chúng có thể trung hòa và ngăn ngừa các tác nhân ngoại lai Tương tự, các proteins bên trong tế bào bị nhiễm virus cũng sẽ được trình diện với vùng HLA thuộc lớp MHC lớp I, các tế bào nhiễm này sẽ bị nhận ra và tiêu diệt bởi nhóm tế bào T gây độc (CD8) [3, 15, 12]
❖ Vai trò trong quá trình thải ghép:
Các protein do nhóm gen HLA mã hóa sẽ biểu hiện ra bề mặt ngoài của tế bào, hệ miễn dịch của chúng ta dùng các protein HLA này để phân biệt tế bào của cơ thể và các tế bào ngoại lai theo cơ chế: bất cứ tế bào nào biểu hiện cùng kiểu type HLA của chính một người thì các tế bào đó được hệ thống tự miễn dịch nhận diện thuộc về cá thể đó Ngược lại, bất kì tế bào nào không mang đúng type HLA của cá thể đều bị các phản ứng loại thải [15, 4]
Sự đa hình của HLA trong cộng đồng người là một khía cạnh trong việc chống bệnh tật Kết quả của sự đa hình này là hai cá thể không có quan hệ huyết thống với nhau có tỷ lệ tương đồng trên tất cả các locus quy định HLA là rất thấp Như vậy, việc xác định kiểu type các gen HLA là rất có ý nghĩa, quyết định khả năng thành công của các ca ghép tạng giữa những cá thể có tương đồng HLA
Nói một cách khác, nếu giữa bệnh nhân cần ghép và người hiến tạng không có sự phù hợp type HLA, thì các tế bào gốc của người cho (trường hợp ghép tủy sống), hay cơ quan của người hiến có thể bị hủy hoại bởi hệ miễn dịch của người nhận Sự khác biệt về HLA giữa cá thể nhận tạng và hiến tạng dẫn đến bệnh nhân phải chịu các triệu chứng thải ghép, hậu quả nghiêm trọng có thể gây tử vong [15, 14, 3]
Ngược lại, nếu có sự tương đồng HLA giữa hai cá thể cho và nhận thì tỷ lệ thành công của ca ghép tạng là rất khả quan
❖ Vai trò trong các bệnh tự miễn:
Một số kiểu gen của HLA đôi khi có liên kết với các căn nguyên bệnh tự miễn (như đái tháo đường type I, lupus đỏ hệ thống, hội chứng Bekhterev, hội chứng Celiac ) [3, 15]
❖ Vai trò trong ung thư:
Một số kiểu gen của HLA có sự liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý ung thư đặc biệt là hội chứng EATL (Enteropathy-Associated T- cell Lymphoma)
Sự phân lớp hệ thống HLA
HLA được chia làm ba lớp với các tính năng khác nhau:
- Lớp I: có vai trò quan trọng, bao gồm các gen chính: HLA A, HLA B, HLA C và các gen thuộc locus E, F, G Nhóm HLA này mã hóa cho các đoạn glycopeptides có nguồn gốc nội bào của chính cá thể và trình diện các peptide của virus nhiễm vào tế bào Các glycopeptide được biểu hiện ở hầu hết các tế bào có nhân, ngoài ra chúng có dạng hòa tan trong bào tương, đôi khi xuất hiện ở tiểu cầu … Có khoảng 500 đến 1 triệu phân tử protein lớp một trên bề mặt tế bào [4] Kháng nguyên HLA lớp I bao gồm : một chuỗi glycopolypeptide α có khối lượng khoảng 45 kilo-dalton với ba vùng
( Vùng ngoại bào, vùng xuyên màng và đuôi nội bào); một chuỗi polypeptide β2 microglobulin có tác dụng hỗ trợ cấu trúc không gian của chuỗi α [4, 3] Quan sát bằng phương pháp chiếu xạ tinh thể học cho thấy vùng ngoại bào của kháng nguyên HLA nhóm I có ba domains (α 1 , α 2 , α 3 ) Hai domains α 1 và α 2 chứa các trình tự acid amin rất đa dạng nhờ đó chúng quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên của phân tử HLA lớp
I, hai domains này tạo thành một tiểu cấu trúc đặc biệt là PBS (Peptide binding site- Vùng gắn peptide) , vùng này sẽ có nhiệm vụ gắn với các đoạn peptide lạ [12]
Các đoạn polypeptid này được tạo ra từ quá trình phân cắt các protein lạ bởi proteasomes Sau đó chúng được chuyển vào mạng lưới nội chất nhờ TAP (Transporter associated protein-Protein đồng vận chuyển) để gắn vào các phân tử thuộc HLA lớp I và được biểu hiện ra ngoài bề mặt tế bào Các peptide này có kích thước rất nhỏ khoảng 9 acid amin Các đoạn peptide ngoại lai sẽ thu hút các tế bào T giết (tế bào T có CD8 hay tế bào T gây độc) tới để phá hủy tế bào nhiễm [12, 3 ]
Hình 2A: Mô hình mô tả cấu trúc phân tử HLA lớp I ; Hình 2B : Mô hình do máy tính mô phỏng cấu trúc bậc 4 (3D) của HLA lớp I với tiểu cấu trúc PBS
Hình 2C: Sơ đồ biểu diễn quá trình trình diện kháng nguyên của phân tử HLA lớp I
- Lớp II: bao gồm các HLA DP, DM, DOA, DOB, DQ & DR Có nhiệm vụ trình diện kháng nguyên ở bề mặt tế bào lympho B, đại thực bào và các tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen-presenting cells- APCs) [6, 4] HLA thuộc lớp này đóng vai trò trình diện các kháng nguyên có nguồn gốc ngoại lai bị phân cắt bởi lysozyme, kích
(2B) 2A thích sự sinh sản các tế bào lympho T hỗ trợ có thụ quan CD4 (T-help), từ đó dẫn đến sự kích thích các tương bào B tạo ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên biểu hiện Cấu trúc của phân tử HLA lớp II gồm hai chuỗi glycoprotein: Chuỗi α có kích thước khoảng 34 kilo-dalton và chuỗi β có kích thước khoảng 28 kilo-dalton, gen mã hóa cho hai chuỗi glycopolypeptide này đều nằm trên nhiễm sắc thể 6 Mỗi chuỗi đều gồm ba vùng (Vùng ngoại bào, vùng xuyên màng và đuôi nội bào) Vùng ngoại bào của cả hai chuỗi gồm hai domain (α 1 , α 2 và β 1 , β 2 ) chúng hợp thành tiểu cấu trúc PSB tương tự như ở HLA lớp I [12, 6]
Hình 3A: Mô hình mô tả cấu trúc phân tử HLA lớp II ; Hình 3B : Mô hình do máy tính mô phỏng cấu trúc bậc 4 (3D) của HLA lớp II với tiểu cấu trúc PBS đã liên kết với peptide lạ
Hình 3C : Sơ đồ biểu diễn quá trình trình diện kháng nguyên của phân tử HLA lớp II
- Lớp III: Mã hóa cho các cấu phần của hệ thống bổ thể, tham gia phản ứng kết hợp bổ thể [15].
Danh pháp HLA
Với sự chính xác và phổ biến của kĩ thuật xác định HLA bằng sinh học phân tử Danh pháp HLA viết theo kiểu định danh phân tử được sử dụng khá rộng rãi Cấu trúc tên gọi của một kháng nguyên HLA bao gồm: Phần I * Phần II
• Phần I (trước dấu *): tiếp đầu ngữ “HLA” và tên các locus (A, B, DR…)
• Phần II (sau dấu *): dãy số Ả rập mã hóa cho allele tồn tại trong locus:
Hai số đầu ghi rõ nhóm allele (thường trùng với kháng nguyên huyết thanh) Hai số kế tiếp chỉ rõ thứ tự phát hiện allele trong nhóm allele
Hai số kế tiếp chỉ các đột biến đồng nghĩa trong vùng mã hóa của gen
Hai số kế tiếp chỉ các đột biến nằm ngoài vùng mã hóa, thuộc các introns hoặc vùng không phiên mã
• Trong một số trường hợp, danh pháp HLA có thêm các tiếp vĩ ngữ là các chữ cái phản ánh mức độ biểu hiện của allele như N (Null-vô hiệu), L (Low-có mức độ biểu hiện trên bề mặt tế bào thấp hơn mức bình thường), S (Secreted-có dạng hòa tan trong túi tiết nhưng không biểu hiện ra ngoài), C (Cytoplasm-dạng hòa tan trong bào tương nhưng không biểu hiện ra ngoài bề mặt tế bào), A (Aberrant- biểu hiện trên bề mặt tế bào ở dạng bất thường), Q (Questionable- có xảy ra đột biến trong trình tự Nu gây ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện) Đến tháng 4 năm 2011 đã không còn allele nào mang tiếp vĩ ngữ C và A [6, 13, 3]
Hình 4: Biểu đồ mô tả số lượng gene HLA được phát hiện và định danh từ năm 1968 đến tháng 4 năm 2011.
Di truyền học HLA
Thông thường việc định type HLA mô chủ yếu dựa trên ba locus qui định HLA lớp I (A, B, C) và ba locus qui định HLA lớp II (DR, DP, DQ) Do các nhiễm sắc thể tồn tại ở dạng cặp đôi (diploid) ở mỗi cá thể nên type HLA bình thường ở mỗi cá thể có liên quan đến 12 kháng nguyên HLA Tất cả 12 kháng nguyên này có thể được nhận dạng bằng cùng một kĩ thuật và sự xuât hiện của kháng nguyên này không ảnh hưởng đến khả năng xác định các kháng nguyên khác Một số đặc tính di truyền của kháng nguyên HLA là: Tính đa hình, Tính di truyền, Di truyền liên kết không đồng đẳng và Phản ứng chéo
Tính đa hình của các locus HLA được ghi nhận là rất lớn Các phân tử HLA có sự khác biệt nhỏ ở các chuỗi amino acids cấu thành nên chúng, điều này khiến các phân tử HLA cũng khác biệt ở cấu trúc bậc ba (khe gắn các peptide mà HLA có vai trò giới thiệu) Loài người có 1 dãy rất nhiều các HLA khác nhau, mỗi kháng nguyên có hình dạng và vùng khe gắn peptid khác nhau để đối phó với các dạng chuỗi peptid khác nhau Tuy nhiên vì tính đa hình của HLA là một đặc trưng của cộng đồng nên tần suất kháng nguyên HLA ở các cộng đồng khác nhau có sự khá nhau rõ rệt Ví dụ: HLA- A*34 chiếm tỷ lệ 78% ở thổ dân Châu Úc, nhưng tần số này lại ít hơn 1% ở cả dân Úc gốc Âu và gốc Trung Hoa Đã có nhiều nghiên cứu về tần suất HLA ở các cộng đồng trên thế giới Vì vậy, HLA là một yếu tố đáng chú ý trong nghiên cứu nhân chủng học Những cộng đồng có tần suất kháng nguyên HLA rất tương đồng thì rõ ràng những cộng đồng đó có chung một tổ tiên Đây chính là cơ sở của việc ứng dụng xác định HLA trong nghiên cứu nhân chủng học.[4, 12, 3]
Hình 5: Bảng thống kê số lượng allele HLA đã được phát hiện tính đến năm 2010
Kiểu hình HLA của 1 cá thể có được từ sự di truyền từ cha và mẹ, nếu có được các thông tin HLA của gia đình cũng có thể suy đoán được HLA của cá thể đó
Trong trường hợp không có sự trao đổi chéo của nhiễm sắc thể 6 (trong quá trình tiếp hợp), hai anh chị em ruột cùng thừa hưởng kiểu gen HLA từ bố mẹ sẽ có kiểu HLA đồng nhất Cơ hội cho điều này xảy ra là ẳ Vỡ vậy trong bất cứ gia đỡnh nào cú hơn 4 con thì ít nhất 2 trong số chúng sẽ có sự tương đồng về kiểu gen HLA [4, 3]
❖ Di truyền liên kết không đồng đẳng:
Theo quy luật di truyền của Mendel thì tần suất xuất hiện của các allele trên cùng một locus sẽ không ảnh hưởng đến tần suất xuất hiện của các allele trên locus khác Tuy nhiên, di truyền HLA có điểm khác biệt Có nhiều nghiên cứu cho thấy trong hệ thống HLA, các allele liên kết thuộc các locus khác nhau có tần suất xuất hiện cao hơn rất nhiều so với tần số xuất hiện của allele nằm trên gen riêng lẻ, đây chính là đặc điểm của liên kết không đồng đẳng Một ví dụ khá rõ ràng là kiểu gen HLA của nhóm thổ dân Úc là HLA-A1, B8, DR3 (DRBI*0301), DQ2 (DRB1*0201) có tính bảo tồn cao cho phép có thể dự đoán được các allele thuộc gen bổ thể (lớp III) với độ chính xác khá cao Ở các allele HLA lớp II cũng xảy ra hiện tượng này, nếu có sự hiện diện của một allele xác định thuộc locus DR người ta có thể suy đoán được allele của locus DQ với độ chính xác cao trước khi thực hiện test Chính vì kiểu di truyền này mà tổ hợp các HLA lớp I, lớp II, và sản phẩm lớp III có thể di truyền cùng nhau ở một tần suất cao hơn so với sự di truyền riêng lẻ của từng loại Các “bộ” allele này có thể có lợi về mặt miễn dịch học [3]
Phản ứng chéo là hiện tượng mà một kháng thể có thể phản ứng với nhiều kháng nguyên, thường là trên cùng một locus Điều này được giải thích là do các kháng nguyên HLA khác nhau có cùng một vùng trình tự amino acid trong cấu trúc phân tử của chúng - vùng này là vùng gắn đặc hiệu (epitop) đối với kháng thể Tính chất này rất quan trọng trong xác định HLA bằng phương pháp miễn dịch, nó ảnh hưởng đến việc lựa chọn huyết thanh thử nghiệm và việc đọc kết quả thử nghiệm [4, 12, 3]
Một số kĩ thuật xác định HLA
2.4.1.Phương pháp Huyết thanh học:
Là phương pháp cổ điển, được sử dụng từ lâu, dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhằm xác định kiểu hình HLA của người hiến tạng và người nhận tạng Phương pháp được sử dụng là : “Phương pháp gây vi độc tế bào kết hợp bổ thể-Complement-dependent microlymphocytoxicity”
Huyết thanh mang kháng thể thử được ly trích từ máu của những người nhạy cảm với HLA ngoại lai (phụ nữ mang thai, hay người có tiền sử ghép tạng)
Trong thực nghiệm, người ta thường thực hiện phương pháp này trên các dãy từ 60-72
“giếng” Kháng huyết thanh đã xác định trước được cho vào các giếng Sau đó huyền phù tế bào cần xác định HLA sẽ được phân phối vào mỗi giếng Ủ 30 phút, cho thêm vào các giếng này huyết thanh chứa thành phần bổ thể ly trích từ thỏ Nếu các kháng thể kết hợp được với kháng nguyên HLA trên bề mặt tế bào, chúng sẽ hoạt hóa bổ thể làm màng tế bào bị vỡ, tế bào chết Kết quả được quan sát trên kính hiển vi ngược pha với các thuốc nhuộm tế bào như Eosin Y và Trypan blue Các tế bào chết sẽ to và bắt màu đậm hơn so với tế bào còn sống Nếu các tế bào chết, có nghĩa là tế bào đó mang type HLA đang thử nghiệm [10, 4]
Hình 6: Sơ đồ mô tả cơ chế của phương pháp gây vi độc tế bào
2.4.2.Sử dụng kỹ thuật tế bào học (MLC-Mixed lymphocyte culture):
Phương pháp này có độ nhạy cao hơn so với định type huyết thanh, nó có thể phát hiện sự khác biệt chỉ ở 1 chuỗi amino acid đơn thông qua việc kích thích các loại bạch cầu Tuy nhiên, do khó khăn trong việc nuôi cấy tế bào, chuẩn bị hỗn hợp MLC và khó khăn trong đọc kết quả nên phương pháp này ít được sử dụng
Lymphocyte từ máu ngoại vi của người hiến tạng và bệnh nhân được nuôi cấy cùng nhau Nếu chúng có cùng kiểu HLA, thì sẽ không có hiện tượng xảy ra Ngược lai, nếu chúng không đồng nhất về kiểu HLA sẽ có hiện tượng kích thích lẫn nhau, hai loại lymphocyte sẽ có hiện tượng tăng sinh (phát hiện bằng phương pháp đo lượng thymidine)
Một cải tiến của phương pháp này là việc xử lý tế bào cần xác định HLA bằng phóng xạ hay mitocycin c nhằm làm bất hoạt tế bào, nuôi cấy chung với các lymphocyte đã biết trước kiểu hình, quan sát xem có hiện tượng kích thích và tăng sinh không Nếu không có hiện tượng, có thể kết luận, tế bào cần xác định HLA có kiểu HLA giống với tế bào thử [4, 16]
2.4.3.Xác định HLA thông qua DNA (HLA DNA typing):
Là kĩ thuật có nhiều ưu điểm và được sử dụng rộng rãi trong xác định HLA ngày nay.Có 3 phương pháp chính :
+ Kết hợp PCR và lai phân tử: Đầu tiên, người ta sử dụng PCR để khuếch đại các đoạn trong locus HLA quan tâm, sau đó cho chạy điện di sản phẩm PCR rồi chuyển nó sang màng nitrocellulose hay màng nilon, thực hiện lai phân tử với các đoạn dò đặc hiệu đã được đánh dấu (phóng xa, dioxigenin, Enzyme đặc hiệu, ) Sau đó người ta sẽ cho phản ứng hiện hình bằng các phương pháp tương ứng Phương pháp này có thể sử dụng bằng cách gắn DNA của nhiều người lên màng lai, cho lai với 1 đoạn dò duy nhất, cứ như vậy lặp lại nhiều lần sẽ giúp ta xác định được độ tương đồng HLA của 1 nhóm người
Kĩ thuật này cho độ chính xác cao, tuy nhiên đòi hỏi những kĩ thuật viên phải thuần thục trong thao tác trong kỹ thuật lai và đọc kết quả [4, 3]
Phương pháp này được dùng để xác định tính đa hình của gen HLA, các đoạn mồi sử dụng phải được thiết kế đặc biệt cho các allele đa hình của locus HLA quan tâm Nếu có mặt của allele tương ứng trong mẫu thì phản ứng khuếch đại xảy ra và ngược lại Sau đó sản phẩm được phát hiện bằng kĩ thuật chạy điện di trên gel agarose Kĩ thuật này khó khăn ở chỗ phải thiết kế phản ứng PCR với nhiều cặp mồi, phải biết trước kích thước và thông tin của các allele thuộc hệ thống HLA
Với nhiều ưu điểm vượt trội, phương pháp xác định HLA bằng PCR và các cải tiến của nó được sử dụng tại khá nhiều phòng thí nghiệm cận lâm sàng [4, 3]
+ Giải trình tự gen HLA:
Phương pháp này có độ chính xác cao nhất, ít chịu nguy cơ ngoại nhiễm Tuy nhiên giá thành phương pháp khá cao và khá mất thời gian.[3]
PCR (Polymerase chain reaction)-Phản ứng khuếch đại chuỗi
Sự ra đời của PCR vào năm 1985 bởi Karl Mullis và cộng sự đã giải quyết thành công việc nhân bản vật chất di truyền ở mức độ in vitro PCR và các cải tiến của nó đã nhanh chóng được sử dụng cho các mục đích nghiên cứu di truyền, vi sinh, hay y sinh học.[1,2]
- Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Sự sao chép DNA xảy ra khi có sự tham gia của DNA polymerase giúp tổng hợp mạch DNA mới khi đoạn mồi bắt cặp với mạch DNA khuôn mẫu với vật liệu là các dNTP trong điều kiện phù hợp Một phản ứng PCR cơ bản là một chuỗi chu kì luân nhiệt nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm ba bước:
*Bước 1: Trong hỗn hợp phản ứng với đầy đủ thành phần (dNTP, Mg 2+ ,
Taq polymease, DNA khuôn mẫu) DNA khuôn mẫu sẽ bị biến tính bởi tác nhân nhiệt độ thành dạng mạch đơn Nhiệt độ này phải cao hơn Tm ( melting temperature-nhiệt độ nóng chảy phân tử DNA) của phân tử DNA khuôn mẫu Thông thường, nhiệt độ bước này vào khoảng 95-96 o C trong 30 giây-1 phút Đây được gọi là giai đoạn biến tính (denaturation)
*Bước 2: Là giai đoạn các mồi bắt cặp với khuôn mẫu do nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mổi) Nhiệt độ của phản ứng ở giai đoạn này phụ thuộc vào
Tm mồi, thường dao động khoảng 40-70 o C Đây là giai đoạn lai (hybridization)
*Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 o C, là khoảng nhiệt độ thích hợp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp, thời gian này phụ thuộc độ dài trình tự khuôn mẫu, đôi khi kéo dài nhiều phút Đây là giai đoạn kéo dài (elongation)
Việc lặp lại các chu kì nhiều lần sẽ khiến số lượng bản sao DNA trong mẫu tăng gấp nhiều lần ban đầu [1, 2]
Hình 7:Hình ảnh minh họa các bước trong một chu kỳ của PCR và số lượng bản sao sau mỗi chu kì
- Ứng dụng của PCR trong xác định mức độ đa hình của HLA:
Có thể chia được thành các nhóm phương pháp PCR chính [3]:
• PCR được dùng nhằm khuếch đại các vùng đa hình của HLA Sau đó, sử dụng một kĩ thuật thứ hai để phát hiện :lai mồi (PCR-SSO), cắt đoạn đa hình (PCR-RFLP), giải trình tự (PCR-SBT)
• Allele HLA được xác định trực tiếp trong quá trình PCR, đọc kết quả bằng phương pháp điện di (PCR-SSP)
• Sử dụng phân tích sai khác hình dạng trên mạch đôi DNA sai khác xảy ra trong quá trình PCR để xác định kháng nguyên HLA (Phân tích sợi đôi khác nhau- heteroduplex, điện di trên thang nhiệt độ, điện di trên thang biến tính)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả tiến cứu trong khoảng thời gian là
4 tháng (từ 14/02/2011 đến 30/6/2011) với 86 mẫu bệnh phẩm thu nhận được tại Khoa Miễn Dịch-Bệnh viện Truyền Máu và Huyết Học Tp.Hồ Chí Minh.
Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu máu từ các Khoa Lâm Sàng, phòng khám, bệnh viện khác gửi đến ngay trong ngày với chỉ định xác định HLA
Các mẫu máu được gửi đến nhưng với các chỉ định khác
Khảo sát đặc điểm mẫu
Các bệnh phẩm được lấy bởi các kỹ thuật viên, điều dưỡng được chuyển tới ngay đến Khoa Miễn Dịch trong ngày
Thông tin về bệnh nhân và chẩn đoán lâm sàng, tên bác sĩ chỉ định được ghi trên phiếu xét nghiệm
Trong một số trường hợp đặc biệt, cần có thêm kết quả sàng lọc máu trước khi thực hiện xác định HLA
Vật liệu
Tất cả các DNA Stock sử dụng trong đề tài này được ly trích từ tất cả các mẫu bệnh phẩm (máu) tại các Khoa Lâm Sàng, phòng khám và các bệnh viện khác gửi đến
Bộ phận “HLA-NAT-Điện di kháng thể miễn dịch”- Khoa Miễn Dịch với chỉ định xác định HLA
Tất cả các mẫu máu đều được ly trích DNA với kit QIAamp Blood Mini (250), Qiagen Co-Catalog No 51104 với phương pháp ly trích cột DNA sau khi ly trích có kích thước khoảng 50kb, không chứa các Protein và thành phần tạp nhiễm, có thể thực hiện PCR ngay
3.2.3: Kit PCR-SSP xác định HLA:
-Kit Micro SSP HLA Class I and II ABDR DNA Typing Tray, Lot No 008, sản phẩm của One Lambda, Inc
-Kit Micro SSP HLA Class I HLAC DNA Typing Tray, Lot No 005, sản phẩm của One Lambda, Inc
-Kit Micro SSP HLA Class II DQB1 DNA Typing Tray, Lot No 001, sản phẩm của One Lambda, Inc
-Một số Kit Micro SSP HLA Allele Specific DNA Typing Tray, sản phẩm của One Lambda, Inc
-Các kit test gồm hai thành phần chính là các tray có sẵn primer đặc hiệu và D- mix với các thành phần có sẵn cho phản ứng PCR (Ngoại trừ Taq polymerase)
-Taq polymerase sử dụng trong phản ứng PCR được cung cấp bởi BioRad với nhãn hiệu iTaq
3.2.4: Agarose và Stock TBE 10X, Ethidium Bromide:
-Agarose dạng bột tinh chế dùng cho sinh học phân tử của Bio-rad quy cách 125gr
-Stock TBE 10X của Bio rad, pha loãng với nồng độ 0.5X khi dùng
-Ethidium Bromide 10 ml của invitrogen
-Buồng thao tác vô trùng
-Micropipet: Bio-Rad 1000 àl, Bio-Rad
200 àl, Bio-Rad 20 àl, Bio-Rad 10 àl, Biohit 0, 1 - 2, 5 àl
-Đầu tip vô trùng có lọc và không lọc -Plat Capstrips, Bio-Rad Co
-Eppendorf vô trùng thể tích 1,5 ml
-Máy đo OD và cuvette thạch anh
-Máy PCR, Bio Rad Co
-Khuôn và lược đổ gel điện di
-Buồng điện di báo giờ -Máy chụp hình gel, Bio Rad Co
-Máy tính có cài đặt phần mềm Swift II (Dùng đo nồng độ), Quantity One (Chụp hình gel điện di), HLA Fusion 2.0 (Đọc và phân tích kết quả HLA) -Máy in
-Găng tay và khẩu trang, áo thao tác vô trùng
Phương pháp
3.3.1 Quy trình ly trích DNA từ mẫu máu bệnh nhân:
-Bước 1: Hỳt 20 àl proteinase K cho vào đỏy eppendorf 1,5 ml sạch,
-Bước 2: Thờm 200 àl mỏu và 200 àl dung dịch AL Vortex 15giõy, spin- down
-Bước 4: Sau khi ủ 10 phỳt thờm vào 200 àl ethanol (96 - 100%) Vortex 15 giây Spin-down
-Bước 5: Chuyển dung dịch từ eppendorf sang cột lọc vô trùng, tránh làm bẩn nắp cột Ly tâm cột với tốc độ 8000 rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi ly tâm, chuyển cột lọc sang tube sạch khác, bỏ tube cũ và dịch lọc
-Bước 6: Thờm vào 500 àl dung dịch AW1, trỏnh làm bẩn nắp cột Ly tõm cột với tốc độ 8000 rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi ly tâm, chuyển cột lọc sang tube sạch khác, bỏ tube cũ và dịch lọc
-Bước 7: Thờm vào 500 àl dung dịch AW2, trỏnh làm bẩn nắp cột Ly tõm cột với tốc độ 14000 rpm trong 3 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi ly tâm, chuyển cột lọc sang eppendorf 1,5 ml sạch, bỏ tube cũ và dịch lọc
-Bước 8: Chuyển cột vào eppendorf 1,5 ml sạch, thờm vào 200 àl dung dịch
AE, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm cột với tốc độ 8000 rpm trong 1 phút ở 20 o C
Bỏ cột lọc, dịch chứa DNA có thể tiến hành đo nồng độ ngay hoặc trữ lạnh ở -20 o C
3.3.2 Phương pháp đo nồng độ Stock DNA ly trích:
Nồng độ DNA Stock ly trích được xác định bằng phương pháp đo OD với hai bước sóng 260nm và 280nm
-Hỳt 72 àl nước cất cho vào 1 eppendorf sạch, vortex eppendorf chứa DNA stock cần đo, hỳt 8 àl DNA stock vào eppendorf đó cú nước cất, vortex 15 giõy
-Hỳt 80 àl nước cất vào cuvette tham chiếu Hỳt toàn bộ 80 àl dung dịch DNA đã chuẩn bị vào cuvette còn lại Đặt cuvette tham chiếu chứa nước cất vào Cell 1 của máy đo, cuvette chứa DNA vào Cell 2, đóng nắp máy
-Sử dụng chương trình SWIFT II với chương trình đo dna 1-10
-Máy sẽ tự động đo và trả kết quả giá trị OD 260 /OD 280 và nồng độ DNA trong mẫu đo
Hình 9: Giao diện trả kết quả chương trình Multi Wavelengh
Giá trị chấp nhận được của mẫu đo DNA là độ tinh sạch dao động từ 1.6-1.8 Nồng độ từ 30 ng/ml đến 50 ng/ml
Sau khi đo nồng độ tiến hành pha loãng để thực hiện PCR, DNA stock được pha loãng với nước cất, nồng độ từ 23 ng/ml đến 25 ng/ml
3.3.3 Phương pháp chuẩn bị tray kit và PCR:
Mỗi một trường hợp xác định HLA sẽ được tiến hành xác định trên 6 locus là
Tất cả các trường hợp HLA đều bắt đầu bằng 3 kit test loại Generic là ABDR,
C và DQB1, dựa vào kết quả phân tích (locus A, B, DRB1, DRB3/4/5, C, DQB1) từ các kit test Generic, sau đó mới tiếp tục triển khai trên nhóm các kit Allele Specific để xác định chính xác kiểu hình của đối tượng
-Bước 1: Rã đông Stock DNA và D-mix ở 37 o C, lấy tray kit ra ngoài đặt trên rack lạnh
-Bước 2: Cho Taq polymerase vào D-mix Vortex 15 giõy Hỳt 9 àl D-mix và 1 àl nước cất vào giếng đối chứng õm của cỏc kit (Giếng H hàng 1)
-Bước 3: Cho Stock DNA vào eppendorf có D-mix và Taq polymerase
Vortex 15 giây Tỷ lệ Taq polymerase và DNA Stock sẽ thay đổi tùy vào số lượng giếng của các kit test theo bảng sau:
Số hàng giếng của mỗi test
Số lượng phản ứng PCR của mỗi test
Thể tích hỗn hợp phản ứng D-Mix (àl) cho mỗi test
Thể tích DNA (àl) cho mỗi test
Thể tích Taq polymerase (àl) cho mỗi test
Bảng 1: Tỷ lệ Taq polymease và DNA Stock cần cho các phản ứng
Loại tray kit Thể tích Taq polymerase
Thể tích DNA Stock (23-25 ng/ml) Micro SSP HLA Class I and II ABDR DNA
Tray, Lot No 005-3 hàng, 24 giếng
Micro SSP HLA Class II
Tray, Lot No 001-2 hàng, 16 giếng
Thực hiện tương tự đối với các kit Micro SSP HLA Allele Specific DNA Typing Tray
Lần lượt phõn phối 10 àl hỗn hợp PCR vào tất cả cỏc giếng Đúng nắp kit bằng Plat Captrips
-Bước 4: Trên máy PCR, chạy protocol HLA như sau:
Số chu kỳ Bước Nhiệt độ Thời gian (s)
Bảng 2: Protocol chu trình PCR của kit test HLA Thời gian chạy PCR là 1 giờ Sau 1 giờ tiến hành điện di sản phẩm PCR
3.3.4 Phương pháp điện di sản phẩm PCR:
-Bước 1: Cân 6 gr Agarose cho vào 300 ml TBE 0,5X đã chuẩn bị trước (Gel agarose 2 %) Đun tan gel, để gel nguội tự nhiờn đến khoảng 60 o C, cho 15àl Ethidium Bromide vào, lắc đều Đổ vào khuôn gel đã gắn lược, để nguội
-Bước 2: Đặt gel vào buồng điện di, châm dung dịch TBE 0,5X vào đến vạch đánh dấu Lần lượt nạp mẫu vào các giếng điện di theo thứ tự Thực hiện điên di trong 15 phút với hiệu điện thế 100 V
-Bước 3: Mở chương trình Quantity One, chọn Select Scanner, chọn GelDoc
EQ, bấm nút UV trên máy Tùy chỉnh và chụp hình lưu lại với đầy đủ thông tin (mã bệnh nhân, tên bệnh nhân, tên test thực hiện, số giếng, ngày và giờ chụp ảnh gel)
Sau khi chụp hình gel ta sẽ thu được hình ảnh gel với các vạch sáng nằm tại các vị trí khác nhau Mỗi một giếng sẽ gồm 3 vạch chính: chứng nội tại, vạch dương (có hoặc không) và vạch primer dimer nằm cuối cùng
3.3.5.Phương pháp đọc kết quả HLA bằng phần mềm HLA Fusion 2.0:
Kết quả HLA được xác định bằng phần mềm HLA Fusion 2.0 thông qua bốn bước:
-Bước 1: Từ kết quả hình ảnh điện di, gel được chia ra thành các hàng giếng Mỗi hàng giếng gồm 8 giếng, được đánh dấu theo tứ tự từ H đến A (Giếng đầu tiên là giếng H, giếng thứ 8 là giếng A từ trái sang phải) Hàng giếng đầu tiên sẽ được đánh số 1, lần lượt cho đến hết Ghi lại tên các giếng có vạch dương tính, các giếng còn lại là âm tính
Hình 10: Ví dụ phân tích kết quả điện di : Kết quả điện di này sẽ được đọc như sau: (1): A, B ; (2): - ; (3): F ; (4): H, ; (5) - ; (6) -
Internal Control (chứng nội tại)
-Bước 2: Mở phần mềm HLA Fusion 2.0 trên máy tính Chọn thẻ “Micro SSP”, tiếp tục chọn thẻ “Manual Entry” Chọn Code và tray lots của kit test, nhập mã số, tên họ bệnh nhân Chọn “Next”
-Bước 3: Nhập kết quả điện di sản phẩm vào bằng cách nhấp chuột vảo giếng có lên band dương Kiểm tra lại vị trí các giếng dương cũng như vị trí tương đối giữa các band dương xem có hợp lý hay không Nhấp “Analyze”
Bước 4: Phần mềm sẽ tự động tính toán các kiểu hình HLA có thể xảy ra trên các locus dựa trên kết quả nhập vào Kết quả sẽ được thể hiện theo dạng cặp đôi (diploid) ở từng locus Sẽ có hai kiểu kết quả HLA:
Kết quả kiểu hình HLA trên các locus là kết quả xác định, không cần thực hiện thêm các kit Micro SSP HLA Allele Specific DNA Typing Tray để xác đinh rõ kiểu hình
Phần mềm đưa ra các kiểu hình HLA có khả năng xuất hiện, cần thực hiện thêm các test Micro SSP HLA Allele Specific DNA Typing Tray để tìm được kiểu HLA chính xác
Hình 11 : Kết quả điện di ở trên được thể hiện với phần mềm HLA Fusion 2.0 (Các vạch điện di được thể hiện bằng band đỏ)
Ví dụ: Kết quả phân tích HLA của bệnh nhân A được máy tính tính toán như sau:
Hình 12: Kết quả HLA được phần mềm tính toán dựa trên kết quả của kit Micro SSP HLA Class I and II ABDR DNA Typing Tray, Lot No 008
Hình 13: Kết quả sau khi thực hiện các kit test Micro SSP HLA Allele Specific DNA Typing Tray kết hợp với kết quả ban đầu
Dựa trên kết quả mô tả ở hình 12, bệnh nhân A có kết quả HLA được phần mềm phân tích như sau:
Kết quả xác định HLA tại locus A
Trong tổng số 177 locus A được xác định kiểu hình thì các nhóm allele có tần suất xuất hiện cao là A*11 (26,6 %), A*02 (24,3 %), nhóm allele A*30 và A*74 có tần suất xuất hiện thấp nhất (0,6 %)
STT HLA-A Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 3 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm allele tại locus A
Tần suất các nhóm allenle tại locus A
Biểu đồ 1: Tần suất các nhóm allele tại locus A
Trong quá trình thực hiện xác định kiểu hình HLA tại locus A chúng tôi gặp khó khăn khi phần mềm phân tích kết quả DNALTM không thể phân định được rõ ràng kiểu hình A*02 và A*92 trong một vài trường hợp Tuy nhiên, đối với chương trình phân tích kết quả HLA Fusion 2.0, hiện tượng này không còn xảy ra Chúng tôi sẽ phải cần thêm các kit Allele Specific của A*23 để xác định kiểu hình tại locus
A một cách rõ ràng hơn.
Kết quả xác định HLA tại locus B
Các nhóm allele chúng tôi thường gặp với tần suất cao là: B*15 (26,8 %), B*07 (14,8 %)
STT HLA-B Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 4 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm allelele tại locus B
Tần suất các nhóm allenle tai locus B
Biểu đồ 2: Tần suất các nhóm allele tại locus B.
Kết quả xác định HLA tại locus C
Các nhóm allele chúng tôi thường gặp với tần suất cao là C*07 (20,5 %,), C*08 (18,8 %)
STT HLA-C Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 5 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm allele tại locus C
Tần suất các nhóm allenle tại locus C
Biểu đồ 3: Tần suất các nhóm allele tại locus C
Việc thiếu các kit Allele Specific C*05, C*08 khiến chúng tôi gặp trở ngại trong việc xác định rõ ràng kiểu hình tại locus C trong một vài trường hợp.
Kết quả xác định HLA tại locus DRB1
Các nhóm allele chúng tôi thường gặp với tần xuất cao là DRB1*12 (31,0 %), DRB1*10 (10,5 %), DRB1*09 (16,4 %)
STT HLA-DRB1 Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 6 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm allele tại locus DRB1
Tần suất các nhóm allenle tại locus DRB1
DRB1*12 DRB1*10 DRB1*15 DRB1*09 DRB1*03 DRB1*11 DRB1*14 DRB1*07 DRB1*04 DRB1*08 DRB1*16 DRB1*13 DRB1*06
Biểu đồ 4: Tần suất các nhóm allele tại locus DRB1.
Kết quả xác định HLA tại locus DRB3/4/5
Tại locus DRB3/4/5 chúng tôi nhận thấy DRB3* chiếm tỷ lệ cao nhất (56,3 %), tiếp đó là nhóm allele DRB4* (33,9 %) và ít gặp nhất là DRB5* (9,8 %)
STT HLA-DRB1 Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 7 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm tại locus DRB 3/4/5
Tần suất các nhóm DRB3*, DRB4*, DRB5*
Biểu đồ 5: Tần suất các nhóm DRB3*/DRB4*/DRB5*
4.5.1.Tần suất các nhóm allele thuộc nhóm DRB3*:
STT HLA-DRB3 Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 8: Số lượng và tỷ lệ các nhóm allele thuộc nhóm DRB3*
Tần suất của các nhóm allenle thuộc nhóm DRB3*
Biểu đồ 6: Tần suất các nhóm allele thuộc nhóm DRB3*
4.5.2.Tần suất các nhóm allele thuộc nhóm DRB4*:
STT HLA-DRB4 Số lượng Tỷ lệ %
Bảng 9 : Số lượng và tỷ lệ các nhóm allele thuộc nhóm DRB4*
Tần suất của các nhóm allenle thuộc nhóm DRB4*
Biểu đồ 7: Tần suất các nhóm allele thuộc nhóm DRB4*
4.5.3.Tần suất các nhóm allele thuộc nhóm DRB5*: Đối với nhóm DRB5*, trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi nhận thấy chỉ có hai nhóm kiểu hình là nhóm allele DRB5*01 với 15 trường hợp xuất hiện và DRB5*02 với 2 trường hợp xuất hiện.