Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ phần trăm mẫu dương tính và âm tính theo hai phương pháp truyền thống và PCR của Vibrio parahaemolyticus ...
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: các mẫu thuỷ sản hay sản phẩm từ thuỷ sản được khách hàng gửi đến trung tâm từ 01/03/2011 đến 01/06/2011
– Tủ ấm 37 o C, tủ cấy vô trùng
– Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di
– Bộ chụp ảnh gel sau khi điện di có gắn đèn soi UV
– Nồi hấp tiệt trùng – Kính hiển vi – Cân phân tích – Máy đo pH – Lò viba
– Micropipette (0.5-10 àl, 10-100 àl, 100-1000 àl) và đầu tip tương ứng
– Ống Eppendorf (1,5 ml) chuyên dùng cho PCR
– Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn
– Môi trường ASPW (Alkaline Salt Pepton Water)
– Môi trường TCBS (Thiosulfat Citrat Bile salt Sucrose agar)
– Môi trường NA muối(Nutrient Agar có bổ sung muối)
– Môi trường TSI muối ( Triple Sugar Iron agar)
– Môi trường LDC (Lysine decarboxylase broth ):
– Môi trường ODC (ornithine decarboxylase)
– Môi trường ADH (arginine decarboxylase)
– Môi trường muối trypton - tryptophan
– Môi trường nước pepton có bổ sung muối
Hồ Thị Kim Ngân 20 2.1.5 Thuốc thử - hóa chất
– Bộ nhuộm Gram: Crystal violet, Iodin, Safranin O, cồn 95%
– Nước được sử dụng ly trích mẫu là nước cất 2 lần hoặc dung dịch TE.
Hóa chất PCR được cung cấp dưới dạng bộ kit định tính từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương Bộ kit này bao gồm các ống eppendorf 0,2 ml chứa 20 µl Master Mix PCR với thành phần như sau:
• Master mix (MgCl2, Tris HCl, KCl, Taq polymerase, dNTP)
Vibrio parahaemolyticus: Vp_F: CGG ATT ATG CAG AAG CAC TG
Vp_R: ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC
Vibrio cholerae: Vc_F: TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG
Vc_R: GGT ATT CTG CAC ACA AAT CAG – Bộ chứng dương: Ống eppendorf 0.2 ml chứa 20 àl mix PCR và 5 àl amplicon đại diện cho Vibrio.
– Hóa chất điện di: được cung cấp bởi công ty TNHH công nghệ sinh học Khoa Thương
• Gel agarose (1,8%) có bổ sung thuốc nhuộm DNA (Ethidium bromide)
• Dung dịch nạp mẫu (loading dye)
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Theo quy trình phân tích thực nghiệm tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm và dựa trên TCVN 7905-1:2008
2.2.1 Chuẩn bị mẫu tăng sinh [6]
Mục tiêu của bước này là tăng số lượng vi khuẩn Vibrio trong mẫu Bước này cũng giúp phục hồi và phát triển các tế bào bị suy yếu hoặc tổn thương.
Các bước chuẩn bị mẫu: Cân 25 g (dạng rắn) hoặc rút 25 ml (dạng lỏng) mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) cho vào bao PE vô trùng Sau đó, bổ sung vào 225 ml môi trường tăng sinh ASPW Ủ mẫu ở nhiệt độ 37 o C ± 2 o C trong khoảng 18h ± 1h
2.2.2.1 Phân lập và nhận dạng:
Dùng que cấy vòng lấy mẫu tăng sinh trên và cấy lên môi trường TCBS sao cho thu được khuẩn lạc tách biệt tốt Ủ ở 37 O C trong 24h ± 3h
Sau khi ủ, ta kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn xuất hiện trên đĩa
– Vibrio parahaemolyticus: trơn nhẵn, màu xanh, đường kính 2 - 3 mm
– Vibrio cholerae: trơn nhẵn, màu vàng, tâm đục, có viền mờ xung quanh, đường kính 2 -3 mm
2.2.2.2 Tạo khuẩn lạc tinh khiết:
Chọn lọc khuẩn lạc điển hình để khẳng định và tạo khuẩn lạc tinh khiết: Từ mỗi môi trường nuôi cấy chọn ra ít nhất 5 khuẩn lạc được coi là điển hình hay gần giống với Vibrio cholerae hay Vibrio parahaemolyticus để cấy truyền Nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì cấy truyền tât cả các khuẩn lạc này
Cấy các khuẩn lạc đã chọn lên các bề mặt nghiêng của thạch NA muối Ủ các ống NA muối đã cấy ở 37 o C trong 24h ± 3h Sử dụng khuẩn lạc tinh khiết này để khẳng định sinh hóa
Phép thử phản ứng oxidase là kỹ thuật dùng vòng lấy mẫu hoặc đũa thủy tinh lấy một phần dịch cấy tinh khiết từ thạch muối dinh dưỡng và cấy vạch lên giấy lọc đã làm ẩm bằng thuốc thử oxidase Kết quả thử nghiệm được đánh giá là dương tính khi giấy lọc chuyển sang màu tím hoa cà hoặc tím sẫm trong vòng 10 giây.
⮚ Kiểm tra bằng kính hiển vi: tiến hành kiểm tra từ dịch cấy thu được như sau:
• Làm tiêu bản nhuộm: tạo huyển phù vi khuẩn cần nhuộm, phết mỏng lên kính
• Phiến phết được làm khô tự nhiên trong không khí, có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Chú ý không hơ quá nóng vì sẽ làm tế bào vi khuẩn bị biến dạng
• Phủ dung dịch Crystal violet lên phiến phết, để 1 phút sau đó rửa nước và để ráo
• Phủ dung dịch Iodin lên, để yên trong 1 phút rồi rửa nước
• Tẩy màu bằng cồn 95%, nhỏ từng giọt cho đến khi màu không còn ra nữa
• Nhuộm lại với Safranin O trong 30 giây.Sau đó rửa nước, để khô và quan sát dưới kính hiển vi
Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím do thành tế bào dày đặc, trong khi vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng do thành tế bào mỏng hơn Để kiểm tra tính di động của vi khuẩn, mẫu khuẩn lạc được cấy vào dịch ASPW và ủ ở 37 độ C trong 1-6 giờ Sau đó, một giọt dịch được nhỏ lên phiến kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi.
❖ Thử nghiệm trên thạch muối TSI (khả năng sử dụng đường):
– Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và ria trên bề mặt nghiêng của thạch Ủ ở 37 o C trong 24 h ± 3h
• Quan sát thấy phần đáy cột thạch có màu vàng, phần mặt nghiêng của cột thạch có màu đỏ đồng thời thạch không bị nứt và không có màu đen Kết luận đó là Vibrio parahaemolyticus
• Nếu phần đáy cột thạch có màu vàng, phần mặt nghiêng cũng có màu vàng đồng thời thạch không có màu đen và không bị nứt, kết luận đó là Vibrio cholerae
❖ Phát hiện L-lysin tách nhóm carboxyl
– Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa môi trường LDC Sau đó thêm vào 1ml dầu khoáng vô trùng hay parafin lên bề mặt rồi ủ ở 37 o C trong
– Thử nghiệm dương tính là khi môi trường trở nên đục và có màu tím Còn màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính
❖ Phát hiện ornithine tách nhóm carboxyl
– Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa môi trường LDC Sau đó thêm vào 1ml dầu khoáng vô trùng hay parafin lên bề mặt rồi ủ ở 37 o C trong
– Thử nghiệm dương tính là khi môi trường trở nên đục và có màu tím Còn màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính
❖ Phát hiện arginine tách nhóm carboxyl
– Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa môi trường LDC Sau đó thêm vào 1ml dầu khoáng vô trùng hay parafin lên bề mặt rồi ủ ở 37 o C trong
– Thử nghiệm dương tính là khi môi trường trở nên đục và có màu tím Còn màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính
❖ Thử nghiệm ONPG (phát hiện β-galactosidase)
– Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 0,85%, cho đĩa giấy ONPG vào và ủ ở 37 o C trong 24 h ± 3h
– Thử nghiệm dương tính khi cả môi trường trong ống nghiệm chuyển sang màu vàng, còn môi trường không đổi màu là phản ứng âm tính
– Cấy sinh khối vi khuẩn vào các ống nghiệm chứ 5ml môi trường trypton – tryptophan muối Ủ ở 37oC trong 24 h ± 3h
– Sau khi ủ, thêm thuốc thử Kowac’s vào ống và quan sát Việc hình thành vòng màu đỏ, chứng tỏ phản ứng dương tính Còn màu vàng là phản ứng âm tính
Để xác định khả năng chịu mặn của vi khuẩn, người ta chuẩn bị một dãy nồng độ muối NaCl (0%, 3%, 6%, 8%, 10%) Sau đó, sinh khối vi khuẩn được cấy vào mỗi nồng độ muối và ủ ở 37oC trong 24 giờ Nếu môi trường đục sau khi ủ, điều đó chứng tỏ vi khuẩn có thể phát triển ở nồng độ muối tương ứng Ngược lại, môi trường trong cho thấy vi khuẩn không thể phát triển ở nồng độ muối đó.
Bàng 2.1:Các phép thử nhận dạng khuẩn lạc giả định của Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae
TCBS agar màu vàng màu xanh
– Giai đoạn này nhằm thu nhận DNA tinh không lẫn các tạp chất
– Cách xử lý như sau:
• Hút 1 ml dịch tăng sinh vào trong ống eppendorf
• Ly tâm lạnh với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch lỏng bên trên
• Huyền phù sinh khối trong ống với 1 ml nước cất vô trùng Ly tâm lạnh
6000 vòng/phút trong 05 phút Đổ bỏ dịch lỏng bên trên, giữ lại phần sinh khối ở đáy
• Thờm vào 0,5 ml (500 àl) nước cất vụ trựng Vortex mạnh để huyền phự đều sinh khối
• Ðun sôi cách thuỷ ở 97 o C trong 10 phút Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 -10 o C để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn DNA để tiến hành phản ứng PCR
– Nếu chưa tiến hành PCR ngay, ta có thể bảo quản DNA ở nhiệt độ 2 - 8 o C trong 2 - 3 ngày Trữ ở -20 o C trong 3 - 6 tháng
– Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn DNA đích trên máy luân nhiệt (thermocycler)
– Chuẩn bị ống khuếch đại:
• Hỳt 05 àl dịch nổi vào ống eppendorf cú chứa 20 àl mix PCR đặc hiệu cho vi sinh vật cần phát hiện
• Đậy nắp eppendorf thật kỹ, vortex nhẹ và đặt vào máy PCR cùng với 1 eppendorf chứng dương và chứng âm đi kèm
• Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng dịch DNA của
• Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng nước cất vô trùng – Chương trình khuếch đại
Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại như sau:
• Vibrio parahaemolyticus: 1 chu kỳ: 94 o C - 5 phút
• Vibrio cholerae: 1 chu kỳ: 94 o C - 5 phút
1 chu kỳ: 10 O C - ∞ – Giữ sản phẩm PCR trong máy ở 10 o C Trữ sp ở tủ -20 o C [1],[2]
– Nguyên tắc: các axit nucleic (DNA, RNA) do chứa gốc phosphate trong phân tử nên ở pH kiềm hay trung tính chúng sẽ là những polyanion tích điện rất âm Trong điện trường chúng sẽ chuyển động về phía cực dương không phụ thuộc vào điện tích của phân tử DNA, mà phụ thuộc vào kích thước phân tử DNA và tính chất của gel agarose Sau điện di DNA có thể được phát hiện và phân tách bằng cách nhuộm gel bởi ethium bromide (EtBr) EtBr là chất có khả năng liên kết đặc hiệu với DNA và chất huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng tử ngoại
– Bổ sung 10-15 àl dung dịch nạp mẫu vào mỗi eppendorf Hỳt và nhả bằng đầu tip để trộn đều
– Chuyển 10-15 àl hỗn hợp sau khi trộn vào giếng trờn gel agarose
– Một bản điện di xem kết quả gồm:
• Sản phẩm PCR chứng dương:
Vibrio cholerae kích thước tương đương 777bp
Vibrio parahaemolyticus kích thước tương đương 444bp
• Sản phẩm PCR chứng âm
• Sản phẩm PCR các mẫu DNA cần kiểm nghiệm
– Vận hành bộ nguồn điện di với hiệu điện thế 120V trong 30- 60 phút
– Sau khi quá trình điện di kết thúc Tắt nguồn điện và chuyển gel lên bàn đèn
UV để xem kết quả
2.2.5 Đọc và giải thích kết quả
– Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng cửa bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng của DNA xuất hiện trên bản gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả
– Mẫu dương tính với Vibrio parahaemolyticus:
• Sự hiện diện của vạch kích thước tương dương 444bp trong mẫu cho phép kết luận mẫu là dương tính với Vibrio parahaemolyticus Kích thước của vạch được xác định bằng cách so sánh với vạch có trong mẫu chứng dương và thang chuẩn Ba vạch này phải song song với nhau trong trường hợp mẫu xét nghiệm dương tính
• Sự vắng mặt của DNA kích thước tương đương trong mẫu cho phép kết luận mẫu: không phát hiện Vibrio parahaemolyticus[2]
Hình 2.1: ảnh điện di Vibrio parahaemolyticus dương tính
– Mẫu dương tính với Vibrio cholerae:
XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR
Tại thời điểm làm đề tài, do đặt mua không được chủng Vibrio cholerae và thời gian làm đề tài không nhiều nên chúng tôi chỉ tiến hành xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của kit định tính phát hiện Vibrio parahaemolyticus
Nhằm xác định mật độ Vibrio parahaemolyticus tối thiểu trong 1 ml dịch mẫu có thể phát hiện bằng phương pháp PCR Tiến hành thử nghiệm trên chủng Vibrio parahaemolyticus nuôi cấy qua đêm trên môi trường ASPW Sau đó pha loãng 10 lần huyền dịch vi khuẩn từ 10 0 , 10 -1 , , 10 -9 Xác định mật độ Vibrio parahaemolyticus
Hồ Thị Kim Ngân 29 trong 1 ml dịch pha loãng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Thực hiện song song phương pháp truyền thống và phương pháp PCR
Tiến hành gây nhiễm đồng thời Vibrio parahaemolyticus và các chủng vi sinh vật khác thường gặp trên sản phẩm thủy sản (bảng 2.2) vào 25g mẫu thực phẩm, thêm 225ml dung dịch ASPW và mang ủ ở 37 o C ± 2 o C trong khoảng 18h ± 1h
Bảng 2.2: Các chủng dùng kiểm tra độ đặc hiệu của kit định tính
Salmonella spp Phân lập từ mẫu thi thành thạo tại PVS TTDVPTTN
Vibrio parahaemolyticus Phân lập từ mẫu cá fillett tại PVS TTDVPTTN
PVS TTDVPTTN: Phòng Vi Sinh Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm
Do không có chủng Vibrio cholarae nên chúng tôi không đánh giá được độ đặc hiệu của kit PCR phát hiện Vibrio parahaemolyticus với chủng này
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
KẾT QUẢ
Trong khuôn khổ nghiên cứu, từ 215 mẫu thủy sản và sản phẩm từ thủy sản được khách hàng gửi đến trong giai đoạn từ 01/03/2011 đến 01/06/2011, nhóm nghiên cứu đã tiến hành song song hai phương pháp xét nghiệm truyền thống và phương pháp PCR để phát hiện kháng sinh Kết quả thu được cho thấy sự khác biệt đáng kể trong hiệu quả phát hiện kháng sinh giữa hai phương pháp, nêu bật vai trò quan trọng của phương pháp PCR trong việc đảm bảo an toàn cho sản phẩm thủy sản.
Bảng 3.1: Kết quả phân tích Vibrio parahaemolyticus trên thực phẩm
PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG PHƯƠNG PHÁP PCR
KẾT LUẬN Môi trường phân lập
Cá tra fillette đông lạnh
K2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K3 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K4 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K5 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K6 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K7 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
K8 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K9 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K10 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K11 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K12 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K13 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K14 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K15 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K16 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K17 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K18 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
K19 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K20 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K21 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K22 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K23 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
K24 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K25 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K26 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K27 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
K28 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K29 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K30 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K31 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K32 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K33 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K34 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K35 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K36 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K37 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K38 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K39 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K40 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K41 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
Cá tra tươi nguyên con
K42 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K43 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K44 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K45 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K46 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K47 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K48 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K49 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
K50 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K51 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
Cá ngừ K52 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
Cá ngân K53 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
K54 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K55 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
Cá cơm K56 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
K57 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K58 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K59 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
K61 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K62 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K63 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
(tôm sống, tôm lột vỏ… )
T1 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T3 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T4 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
T5 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T6 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T7 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
T8 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
T9 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
T11 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T12 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T13 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T14 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T15 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T16 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T17 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
T18 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T19 Không mọc - (-) Không có vạch (-) T20 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
T21 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T22 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T23 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) T24 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
M1 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M3 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M4 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M5 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
M6 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
M7 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M8 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
M9 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M10 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
M11 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
M12 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M13 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M14 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
M15 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
M16 Không mọc - (-) Không có vạch (-) M17 Không mọc - (-) Không có vạch (-) M18 Không mọc - (-) Không có vạch (-) M19 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) M20 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
B1 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
B2 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
B3 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
B4 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) B5 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) B6 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
B7 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
B8 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
B9 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
Các loại vắc-xin không điển hình B10, B11, B12, B13, B14, B15 và B16 đều không có vạch trên que thử nghiệm.
N2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N3 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N4 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N5 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N6 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N7 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N8 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
N9 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N10 Không mọc - (-) Không có vạch (-) N11 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N12 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N13 Không mọc - (-) Không có vạch (-) N14 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N15 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N16 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N17 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N18 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N19 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N20 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
N21 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N22 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) N23 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
C1 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
C3 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
C4 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
C5 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
C6 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
Theo biểu đồ trên, C12 có kiểu hình điển hình với kết quả biểu hiện (+) và trên đĩa có vạch xuất hiện Ngược lại, với các kiểu hình C7, C8, C9, C10 và C11 đều không điển hình, có kết quả biểu hiện (-) và không có vạch xuất hiện trên đĩa.
C13 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C14 Không mọc - (-) Không có vạch (-) C15 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C16 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
C17 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C18 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C19 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C20 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C21 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
C22 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C23 Không mọc - (-) Không có vạch (-) C24 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
C25 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) C26 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
Sản phẩm từ thủy sản, như: chả giò tôm ,cá viên, tôm viên, nước mắm, cá tẩm gia vị……
S1 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
S3 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
S4 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
S5 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S6 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
S7 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
S8 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
S9 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S10 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S11 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S12 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S13 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S14 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S15 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S16 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
S17 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S18 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S19 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S20 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S21 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S22 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
S24 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S25 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S26 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S27 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S28 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S29 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S30 Điển hình Điển hình (+) Có vạch (+)
S31 Không mọc - (-) Không có vạch (-)
S32 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S33 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S34 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S35 Không điển hình - (-) Có vạch (+)
S36 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S37 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S38 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S39 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S40 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S41 Không mọc - (-) Không có vạch (-) S42 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) S43 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
Bảng 3.2: Tỉ lệ phần trăm mẫu dương tính và âm tính theo hai phương pháp truyền thống và PCR đối với Vibrio parahaemolyticus
MẪU DƯƠNG TÍNH MẪU ÂM TÍNH
Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ phần trăm mẫu dương tính và âm tính theo hai phương pháp truyền thống và PCR của Vibrio parahaemolyticus
Từ biểu đồ 3.1, phương pháp PCR có tỉ lệ mẫu dương tính (25,6%) cao hơn phương pháp truyền thống (17,7%)
Dựa trên Bảng 3.1, các phương pháp kiểm tra đều cho kết quả nhất quán và tương đương nhau Tuy nhiên, có một số trường hợp cho kết quả trái ngược rõ rệt: phương pháp truyền thống cho kết quả âm tính trong khi phương pháp PCR lại cho kết quả dương tính rõ ràng Mối bất đồng này có khả năng được lý giải do phương pháp PCR phát hiện được cả vi sinh vật đã chết, dẫn đến hiện tượng dương tính giả Ngoài ra, cũng không thể loại trừ khả năng phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn so với phương pháp truyền thống, song điều này cần được đánh giá lại.
Hình 3.1: Ảnh điện di Vibrio parahaemolyticus trên các mẫu thủy sản
Từ 196 mẫu khách hàng hàng gửi tới trung tâm từ 01/03/2011 đến 01/06/2011 Chúng tôi thực hiện phân tích và thu được kết quả:
Bảng 3.3: Kết quả phân tích Vibrio cholerae trên 196 mẫu thực phẩm
PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG PHƯƠNG PHÁP PCR
LUẬN Môi trường phân lập
Cá tra fillette đông lạnh
K1 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K2 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K3 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K4 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K5 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K6 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K7 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K8 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K9 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
K10 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K11 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K12 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K13 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K14 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K15 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K16 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K17 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K18 Không điển hình - (-) Không có vạch (-)
K19 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K20 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K21 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K22 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K23 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K24 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K25 Không điển hình - (-) Không có vạch (-) K26 Không mọc - (-) Không có vạch (-) K27 Không mọc - (-) Không có vạch (-)