Luận văn tốt nghiệp sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vibrio anguillarum trên một số loài thuỷ sản nuôi ở việt nam

LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi Tất số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa ñược Mang l■i tr■ nghi■m m■i m■ cho ng■■i dùng, công ngh■ hi■n th■ hi■n ■■i, b■n online khơng khác so v■i b■n g■c B■n có th■ phóng to, thu nh■ tùy ý cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin, số liệu trích dẫn luận văn ñã ñược rõ nguồn gốc ñược ñồng ý tác giả Học viên 123doc Xu■t Sau Nhi■u h■n phát event s■ m■t t■ h■u thú ýn■m t■■ng m■t v■,raevent kho ■■i, t■oth■ c■ng ki■m 123doc vi■n ■■ng ti■n kh■ng ■ãthi■t t■ng ki■m l■ th■c b■■c v■i ti■nh■n 123doc online kh■ng 2.000.000 b■ng ■■nh ln tàitài v■ li■u t■o li■u tríhi■u c■ c■a ■ t■t h■i qu■ c■ gianh■t, l■nh t■nguy v■c: l■nh thu tínnh■p tài v■c cao nh■t tài online li■u tínMong cho d■ng, kinh t■t mu■n cơng c■ doanh mang ngh■ online thành l■i thông cho viên Tính tin, c■ng c■a ■■n ngo■i website ■■ng th■i ng■, Khách ■i■m xã h■itháng m■thàng ngu■n 5/2014; có th■ tài 123doc nguyên d■ dàng v■■t tri tra th■c m■c c■u quý 100.000 tàibáu, li■uphong m■t l■■t cách truy phú,c■p ■am■i d■ng, xác, ngày, nhanh giàus■ giá chóng h■u tr■ 2.000.000 ■■ng th■ithành mongviên mu■n ■■ng t■oký, ■i■u l■t ki■n vào top cho200 chocác cácwebsite users cóph■ thêm bi■n thunh■t nh■p t■iChính Vi■t Nam, v■yt■123doc.net l■ tìm ki■m thu■c ■■i nh■m top 3■áp Google ■ng Nh■n nhu c■u ■■■c chiadanh s■ tài hi■u li■udo ch■t c■ng l■■ng ■■ng vàbình ki■mch■n ti■n online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t Nhi■u 123doc Sau Th■a thu■n event s■ cam nh■n h■u k■t s■ thú xác m■t d■ng v■, s■ nh■n mang event kho t■ th■ l■i ki■m ■■ng CH■P vi■n nh■ng ti■n h■ kh■ng NH■N quy■n th■ng thi■tl■ CÁC th■c s■ l■i v■ichuy■n ■I■U t■t h■n 123doc nh■t 2.000.000 KHO■N sang cho ng■■i ph■n TH■A tàit■o li■u thông dùng THU■N c■ ■ tin t■t h■i Khixác c■ khách giaminh l■nh t■ng Chào hàng tài v■c: thu m■ng kho■n tr■ nh■p tài thành b■n email online ■■n thành tínb■n cho d■ng, v■i viên ■ã t■t 123doc 123doc.net! công ■■ng c■a c■ ngh■ 123doc kýthành v■i Chúng thông 123doc.netLink viên n■p tin, c■a cung ti■n ngo■i website vào c■p ng■, Khách xác tài D■ch kho■n th■c V■ s■ c■a (nh■ hàng ■■■c 123doc, ■■■c cóg■i th■v■ mơ b■n d■■■a t■ dàng s■ d■■i ■■■c ch■ tra■ây) email c■u h■■ng cho tài b■n li■u b■n, nh■ng ■ã m■t tùy ■■ng quy■n cách thu■c ky, l■i b■n vàosau xác, vuin■p lịng “■i■u nhanh ti■n ■■ng Kho■n chóng nh■p website Th■a email Thu■n c■a v■ S■vàD■ng click D■ch vào link V■” 123doc sau ■ây ■ã (sau g■i ■ây ■■■c g■i t■t T■i t■ng th■i ■i■m, chúng tơi có th■ c■p nh■t ■KTTSDDV theo quy■t Nhi■u Mang Luôn 123doc Th■a Xu■t Sau h■n h■■ng phát thu■n l■i event s■ cam nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, s■ nh■n website mang event kho m■i ■■i, t■o t■ th■ m■ l■i c■ng ki■m ■■ng d■n 123doc CH■P vi■n nh■ng cho ■■u ■■ng ti■n h■ kh■ng ng■■i NH■N ■ã quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c s■ l■i b■■c v■i ti■n vàchuy■n ■I■U t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t 2.000.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng cho tài ■■nh hi■n ng■■i li■u ph■n tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thơng dùng tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■u ■ tin t■t h■i Khi ■■i, qu■ Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh l■nh Nam t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p khơng tài phong v■c cao thành b■n email nh■t tài online khác chuyên ■■n li■u thành tínb■n Mong cho d■ng, v■i so nghi■p, viên kinh ■ã t■t 123doc 123doc.net! v■i mu■n công ■■ng c■a c■ doanh b■n hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c online thành v■i h■o, Chúng l■i thông B■n 123doc.netLink cho viên Tính ■■ n■p có tơi tin, c■ng c■a cao th■ ■■n cung ti■n ngo■i tính website phóng ■■ng th■i vào c■p ng■, Khách trách xác tài ■i■m D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a (nh■ ■■i hàng ■■■c tùy ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ■■■c ý cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mơ nguyên b■n d■ ng■■i ■■a t■ dàng s■ v■■t d■■i tri dùng ■■■c ch■ tra th■c m■c ■ây) email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u b■n, nh■ng ■ã hàng phong m■t l■■t tùy ■■ng ■■u quy■n cách truy thu■c phú, ky, c■a c■p ■a l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu ti■n s■ ■■ng tr■ giá Kho■n chóng h■u thành tr■ nh■p 2.000.000 website ■■ng Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u viên mu■n S■ online ■■ng D■ng click t■o l■n ký, D■ch ■i■u vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam, 200 ■ây cho ■ã cung các (sau g■iwebsite c■p users ■âynh■ng ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■i thu li■u t■t nh■t nh■p ■■c T■it■i khơng t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, v■y ■i■m, tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm ki■m tơi th■ racóthu■c ■■i tr■■ng th■nh■m c■p top ngo■i 3nh■t ■áp Google tr■ ■KTTSDDV ■ng 123doc.net Nh■n nhu c■u ■■■c theo chiaquy■t danh s■ tài hi■u li■udo ch■t c■ng l■■ng ■■ng vàbình ki■mch■n ti■n online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t Mangh■n Ln 123doc Th■a Xu■t Sau Nhi■u h■■ng phát thu■n l■i event s■ cam nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, s■ nh■n website mang event kho m■i ■■i, t■o t■ th■ m■ l■i c■ng ki■m ■■ng d■n 123doc CH■P vi■n nh■ng cho ■■u ■■ng ti■n h■ kh■ng ng■■i NH■N ■ã quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c s■ l■i b■■c v■i ti■n vàchuy■n ■I■U t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t 2.000.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng cho tài ■■nh hi■n ng■■i li■u ph■n tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thơng dùng tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■u ■ tin t■t h■i Khi ■■i, qu■ Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh l■nh Nam t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p khơng tài phong v■c cao thành b■n email nh■t tài online khác chuyên ■■n li■u thành tínb■n Mong cho d■ng, v■i so nghi■p, viên kinh ■ã t■t 123doc 123doc.net! v■i mu■n công ■■ng c■a c■ doanh b■n hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c online thành v■i h■o, Chúng l■i thông B■n 123doc.netLink cho viên Tính ■■ n■p có tơi tin, c■ng c■a cao th■ ■■n cung ti■n ngo■i tính website phóng ■■ng th■i vào c■p ng■, Khách trách xác tài ■i■m D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a (nh■ ■■i hàng ■■■c tùy ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ■■■c ý cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mơ ngun b■n d■ ng■■i ■■a t■ dàng s■ v■■t d■■i tri dùng ■■■c ch■ tra th■c m■c ■ây) email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u b■n, nh■ng ■ã hàng phong m■t l■■t tùy ■■ng ■■u quy■n cách truy thu■c phú, ky, c■a c■p ■a l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu ti■n s■ ■■ng tr■ giá Kho■n chóng h■u thành tr■ nh■p 2.000.000 website ■■ng Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u viên mu■n S■ online ■■ng D■ng click t■o l■n ký, D■ch ■i■u vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam, 200 ■ây cho ■ã cung các (sau g■iwebsite c■p users ■âynh■ng ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■i thu li■u t■t nh■t nh■p ■■c T■it■i khơng t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, v■y ■i■m, tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm ki■m tơi th■ racóthu■c ■■i tr■■ng th■nh■m c■p top ngo■i 3nh■t ■áp Google tr■ ■KTTSDDV ■ng 123doc.net Nh■n nhu c■u ■■■c theo chiaquy■t danh s■ tài hi■u li■udo ch■t c■ng l■■ng ■■ng vàbình ki■mch■n ti■n online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t Lnh■n 123doc Th■a Xu■t Sau h■■ng phát thu■n cam nh■n m■t t■k■t s■ t■i ýxác n■m t■■ng d■ng s■ nh■n website mang ■■i, t■o t■l■i c■ng ■■ng d■n 123doc CH■P nh■ng ■■u ■■ng h■ NH■N ■ã quy■n th■ng chia t■ng ki■m CÁC s■s■ l■i b■■c ti■n vàchuy■n ■I■U t■t mua online kh■ng nh■t bán KHO■N sang b■ng cho tài ■■nh ng■■i li■u ph■n tài TH■A v■ li■u hàng thơng dùng tríTHU■N hi■u c■a ■■u tin Khi qu■ Vi■t xác khách nh■t, minh Nam Chào hàng uy tài l■nh Tác m■ng tín kho■n tr■ phong v■c cao thành b■n email nh■t tàichuyên ■■n li■u thành b■n Mong v■i nghi■p, viên kinh ■ã 123doc 123doc.net! mu■n ■■ng c■a doanh hoàn mang 123doc kýonline v■i h■o, Chúng l■ivà 123doc.netLink cho Tính ■■ n■p tơi c■ng cao ■■n cung ti■n tính ■■ng th■i vào c■p trách xác tài ■i■m D■ch xãkho■n th■c nhi■m h■itháng V■ m■t s■ c■a (nh■ ■■i ■■■c ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ■■■c g■i t■ng tài 123doc v■ mô nguyên b■n ng■■i ■■a t■s■ v■■t d■■i tri dùng ■■■c ch■ th■c m■c ■ây) email M■c h■■ng quý 100.000 cho b■n tiêu báu, b■n, nh■ng ■ã hàng phong l■■t tùy ■■ng ■■u quy■n truy thu■c phú, ky, c■a c■p ■a l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau vuingày, n■p lòng “■i■u giàu ti■n s■ ■■ng tr■ giá Kho■n h■u thành tr■ nh■p 2.000.000 website ■■ng Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u viên mu■n S■ online ■■ng D■ng click t■o l■n ký, D■ch ■i■u vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam, 200 ■ây cho ■ã cung các (sau g■iwebsite c■p users ■âynh■ng ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■i thu li■u t■t nh■t nh■p ■■c T■it■i khơng t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, v■y ■i■m, tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm ki■m tơi th■ racóthu■c ■■i tr■■ng th■nh■m c■p top ngo■i 3nh■t ■áp Google tr■ ■KTTSDDV ■ng 123doc.net Nh■n nhu c■u ■■■c theo chiaquy■t danh s■ tài hi■u li■udo ch■t c■ng l■■ng ■■ng vàbình ki■mch■n ti■n online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t Lnh■n Th■a Xu■t Sau Nhi■u 123doc Mang h■■ng phát thu■n l■i event cam s■ nh■n m■t tr■ t■ h■u k■t s■ thú nghi■m t■i ýxác n■m t■■ng m■t d■ng v■, s■ nh■n website mang event kho m■i ■■i, t■o t■ th■ m■ l■i c■ng ki■m ■■ng d■n 123doc CH■P vi■n nh■ng cho ■■u ■■ng ti■n h■ kh■ng ng■■i NH■N ■ã quy■n th■ng thi■t chia t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c s■ l■i b■■c v■i ti■n vàchuy■n ■I■U t■t công h■n mua 123doc online kh■ng nh■t 2.000.000 ngh■ bán KHO■N sang b■ng cho tài ■■nh hi■n ng■■i li■u ph■n tài TH■A tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thơng dùng tríhi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■u ■ tin t■t h■i Khi ■■i, qu■ Vi■t xác c■ khách gia b■n nh■t, minh l■nh Nam t■ng Chào online hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác m■ng tín kho■n tr■ nh■p khơng tài phong v■c cao thành b■n email nh■t tài online khác chun ■■n li■u thành tínb■n Mong cho d■ng, v■i so nghi■p, viên kinh ■ã t■t 123doc 123doc.net! v■i mu■n cơng ■■ng c■a c■ doanh b■n hồn mang ngh■ 123doc ký g■c online thành v■i h■o, Chúng l■i thơng B■n 123doc.netLink cho viên Tính ■■ n■p có tơi tin, c■ng c■a cao th■ ■■n cung ti■n ngo■i tính website phóng ■■ng th■i vào c■p ng■, Khách trách xác tài ■i■m D■ch xã to,kho■n th■c nhi■m h■i thutháng V■ nh■ m■t s■ c■a (nh■ ■■i hàng ■■■c tùy ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ■■■c ý cóg■i t■ng th■ tài 123doc v■ mô nguyên b■n d■ ng■■i ■■a t■ dàng s■ v■■t d■■i tri dùng ■■■c ch■ tra th■c m■c ■ây) email c■u M■c h■■ng quý 100.000 cho tài b■n tiêu báu, li■u b■n, nh■ng ■ã hàng phong m■t l■■t tùy ■■ng ■■u quy■n cách truy thu■c phú, ky, c■a c■p ■a l■i b■n vào 123doc.net m■i d■ng, sau xác, vuingày, n■p lòng “■i■u nhanh giàu ti■n s■ ■■ng tr■ giá Kho■n chóng h■u thành tr■ nh■p 2.000.000 website ■■ng Th■a th■ email vi■n th■i Thu■n c■a thành mong tài v■ li■u viên mu■n S■ online ■■ng D■ng click t■o l■n ký, D■ch ■i■u vào nh■t l■t link ki■n V■” vào Vi■t 123doc top sau cho Nam, 200 ■ây cho ■ã cung các (sau g■iwebsite c■p users ■âynh■ng ■■■c cóph■ thêm tài bi■n g■i thu li■u t■t nh■t nh■p ■■c T■it■i không t■ng Chính Vi■tth■i th■ Nam, v■y ■i■m, tìm t■123doc.net th■y l■chúng tìm ki■m tơi th■ racóthu■c ■■i tr■■ng th■nh■m c■p top ngo■i 3nh■t ■áp Google tr■ ■KTTSDDV ■ng 123doc.net Nh■n nhu c■u ■■■c theo chiaquy■t danh s■ tài hi■u li■udo ch■t c■ng l■■ng ■■ng vàbình ki■mch■n ti■n online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t u■t phát Nhi■u Mang Luôn 123doc Th■a Xu■t Sau h■n h■■ng phát thu■n l■i event s■ cam nh■n t■ m■t tr■ t■ h■u ýk■t s■ thú nghi■m t■i ýt■■ng xác n■m t■■ng m■t d■ng v■, s■ nh■n website mang event t■o kho m■i ■■i, t■o t■ c■ng th■ m■ l■i c■ng ki■m ■■ng d■n 123doc CH■P vi■n nh■ng cho ■■ng ■■u ■■ng ti■n h■ kh■ng ng■■i NH■N ■ã quy■n th■ng thi■t chia ki■m t■ng ki■m dùng, l■ CÁC s■ th■c ti■n s■ l■i b■■c v■i ti■n vàchuy■n ■I■U t■t công online h■n mua 123doc online kh■ng nh■t 2.000.000 ngh■ bán KHO■N b■ng sang b■ng cho tài ■■nh hi■n tài ng■■i li■u ph■n tài TH■A li■u tài v■ th■ li■u hàng t■o li■u thông dùng trí hi■u hi■n THU■N hi■u c■ c■a ■■u ■ tin qu■ t■t h■i Khi ■■i, qu■ Vi■t xác c■ khách gia nh■t, b■n nh■t, minh l■nh Nam t■ng Chào online uy hàng uy tài v■c: l■nh thu Tác tín m■ng tín kho■n tr■ cao nh■p khơng tài phong v■c cao thành b■n nh■t email nh■t tài online khác chun ■■n li■u thành tín Mong b■n Mong cho d■ng, v■i so nghi■p, viên kinh ■ã mu■n t■t 123doc 123doc.net! v■i mu■n công ■■ng c■a c■ doanh b■n mang hoàn mang ngh■ 123doc ký g■c online thành v■i l■i h■o, Chúng l■i thông B■n cho 123doc.netLink cho viên Tính ■■ n■p có c■ng tơi tin, c■ng c■a cao th■ ■■n cung ti■n ngo■i ■■ng tính website phóng ■■ng th■i vào c■p ng■, Khách trách xác xã tài ■i■m D■ch xã to,h■i kho■n th■c nhi■m h■i thum■t tháng V■ nh■ m■t s■ c■a (nh■ ■■i hàng ngu■n ■■■c tùy ngu■n 5/2014; 123doc, v■i ■■■c ý cótài g■i t■ng th■ tài 123doc nguyên v■ mô nguyên b■n d■ ng■■i ■■a t■ dàng s■ v■■t tri d■■i tri dùng ■■■c ch■ th■c tra th■c m■c ■ây) email c■u quý M■c h■■ng quý 100.000 cho tài báu, b■n tiêu báu, li■u b■n, nh■ng phong ■ã hàng phong m■t l■■t tùy ■■ng ■■u phú, quy■n cách truy thu■c phú, ky, c■a c■p ■a ■a l■i b■n vào d■ng, 123doc.net m■i d■ng, sau xác, vuingày, n■p giàu lòng “■i■u nhanh giàu ti■n giá s■ ■■ng tr■ giá Kho■n chóng h■u tr■ thành tr■ nh■p ■■ng 2.000.000 website ■■ng Th■a th■ email th■i vi■n th■i Thu■n mong c■a thành mong tài v■ li■u mu■n viên mu■n S■ online ■■ng D■ng t■o click t■o l■n ■i■u ký, D■ch ■i■u vào nh■t l■t link ki■n ki■n V■” vào Vi■t 123doc cho top sau cho Nam, cho 200 ■ây cho ■ã cung các (sau g■i users website c■p users ■âynh■ng có ■■■c cóph■ thêm thêm tài bi■n g■i thu thu li■u t■t nh■p nh■t nh■p ■■c T■it■i Chính khơng t■ng Chính Vi■tth■i vìth■ Nam, vìv■y v■y ■i■m, tìm 123doc.net t■123doc.net th■y l■chúng tìm ki■m tơi th■ racó ■■i thu■c ■■i tr■■ng th■ nh■m nh■m c■p top ngo■i ■áp 3nh■t ■áp Google ■ng tr■ ■KTTSDDV ■ng 123doc.net nhu Nh■n nhuc■u c■u ■■■c chia theo chias■ quy■t danh s■tàitài hi■u li■u li■uch■t ch■t c■ng l■■ng l■■ng ■■ng vàvàki■m bình ki■mch■n ti■n ti■nonline online website ki■m ti■n online hi■u qu■ uy tín nh■t Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CẢM ƠN Trong suốt hai năm học tập khố Cao học ngành ni trồng thuỷ sản, tơi thu nhận nhiều kiến thức bổ ích lý thuyết thực hành từ Thầy giáo Nhân kiện đánh dấu kết học tập Luận văn này, xin gửi tới Thầy cô lời cảm ơn lời chúc tốt đẹp ðể hồn thành ñề tài tốt nghiệp nỗ lực thân, tơi cịn nhận hướng dẫn, giúp đỡ Thầy cô, nhà khoa học ủng hộ đồng nghiệp bạn bè Với lịng biết ơn chân thành nhất, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ Nguyễn Chí Thuận, người Thầy tận tình hướng dẫn tơi thực đề tài tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ Nguyễn Hồng Un tập thể nhà khoa học Phịng Cơng nghệ Enzym-Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành đợt thực tập tốt nghiệp Tơi bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Lãnh ñạo Vụ Khoa học Công nghệ- Bộ Thuỷ sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, ðại học Nông nghiệp I, Dự án FIBOZOPA ñã ủng hộ tạo điều kiện cho tơi tham gia khóa đào tạo Cao học Nhân tơi xin gửi lời cảm ơn ñến cán phòng Hợp tác quốc tế- ðào tạo, ñồng nghiệp, gia ñình bạn bè ñã giúp ñở, động viên tơi suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn ðức Cường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic APW Alkaline Pepton Water ATCC American Type Culture Colletion A, T, G, C Adenin, Thyamine, Guanine, Cytoxine bp base pair EDTA Disodium ethylenediamine tetraacetae EmpA Metalloprotease kb kilo base kDa kilo Dalton PCR Polymerase chain reaction TAE Tris acid EDTA TCBS Thiosulfate citrate bile salt sucrose VAM Vibrio anguillarum Medium V.anguillarum Vibrio anguillarum V.harveyi Vibrio harveyi Ncbi National Center of Biotechnology Information Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1-1 Tần số bắt gặp V anguillarum ốc hương, sò huyết Bảng 1-2 Kết xác ñịnh gen Va-toxR nhiều loài vi khuẩn Vibrio, E coli loài khác phân lập từ cá gây bệnh [48] 18 Bảng 1-3 Thành phần phản ứng PCR 24 Hình 1-4 Các bước thực phản ứng PCR chu kỳ 25 Bảng 3-1 Danh mục vi khuẩn, nguồn ñịa ñiểm thu nhận 38 Bảng 3-2 Kết phân lập vi khuẩn môi trường TCBS ,VAM 40 Bảng 3-3: Thành phần phản ứng PCR 43 Bảng 3-4 Kết ñịnh danh phương pháp PCR 52 Bảng 3-5 Kết kiểm tra API 20E Vibrio sp 54 Bảng 3-6 Kết so sánh phương pháp PCR API 20E xác ñịnh V.anguillarum 54 Bảng 3-7 Thành phần phản ứng PCR (25 µl.) 56 Bảng 3-8 Hoạt tính enzym chủng V anguillarum, V harveyi…… 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1-1 Hình thái V anguillarum chụp qua kính hiển vi điện tử 12 Hình1-2 Bản đồ Gen homolysin V.anguillarum V cholerae 19 Hình 1-3- Phản ứng khuếch ñại PCR 24 Hình 1-4- Các bước thực phản ứng PCR chu kỳ………………… 25 Hình 3-1 Bệnh phẩm số lồi hải sản thu 39 Hình 3-2: Khuẩn lạc V.anguillarum mơi trường TCBS 41 Hình 3-3 Khuẩn lạc HW 72 môi trường VAM 41 Hình 3-4 Khuẩn lạc chủng (Va5) mơi trường VAM 41 Hình 3-5 : Khuẩn lạc V.anguillarum VAM 41 Hình 3-6: Khuẩn lạc chủng V.anguillarum TCBS 41 Hình 3-7: Khuẩn lạc chủng (Va7) mơi trường VAM 41 Hình 3-8: ADN tổng số chủng chuẩn 43 Hình 3-9 Sản phẩm PCR gen empA chủng chuẩn 45 Hình 3-10 Sản phẩm PCR gen empA chủng phân lập từ mẫu tơm 46 Hình 3-11 Sản phẩm PCR gen empA chủng phân lập từ mẫu cá 46 Hình 3-12 Sản phẩm PCR gen empA làm 47 Hình 3-13 Sản phẩm PCR gen luxA chủng V.harveyi chuẩn 50 Hình 3-14 Sản phẩm PCR gen luxA chủng V.harveyi 51 Hình 3-15 Sản phẩm PCR gen luxA chủng V.harveyi 51 Hình 3-16 Kết kiểm tra API 20E chủng Va3 (2), HW72 (3) VIB 395(1) 53 Hình 3-17 Sản phẩm khuếch đại gel agarose 1,5% đệm TAE 1X.57 Hình 3-18 Hoạt hoạt tính enzym V.anguillarum…………………………58 Hình 3-19 Hoạt hoạt tính enzym V.harveyi……….………………………59 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỤC LỤC MỞ ðẦU .3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1.1 Trong nước .6 1.1.2 Ngoài nước .9 1.2 Tổng quan chung Vibrionaceae 10 1.3 Tổng quan Vibrio anguillarum 11 1.3.1 Bệnh lý tôm, cá V.anguillarum gây 11 1.3.2 ðặc điểm, hình thái, phân loại 12 1.3.3 ðặc điểm sinh lí, sinh hố, sinh trưởng 13 1.3.4 Hoạt tính enzym độc tố 14 1.3.5 Gen mã hoá protein Vibrio anguillarum 16 1.4 Phương pháp phát Vibrio anguillarum 20 1.4.1 Phương pháp vi sinh vật học 20 1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử 21 1.5 Kỹ thuật PCR khuếch ñại gen ứng dụng 23 1.5.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 23 1.5.2 Ý nghĩa ứng dụng phương pháp PCR 26 1.5.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotit: 27 CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 ðối tượng, thời gian ñịa ñiểm tiến hành nghiên cứu 28 2.1.1 ðịa ñiểm nghiên cứu: 28 2.1.2 ðối tượng nghiên cứu 28 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: 28 2.2 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2.1 Chủng giống vi khuẩn dùng nghiên cứu 28 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 29 2.2.3 Mơi trường xác định hoạt tính enzym 30 2.2.4 Hoá chất phân tích 31 2.2.5 Thiết bị sử dụng: 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 31 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 2.3.1 Phương pháp phân lập V.anguillarum mơi trường đặc trưng 31 2.3.2 Phương pháp ñịnh danh Vibrio anguillarum kit API 20E (bioMérieus) 32 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym vi khuẩn 32 2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 33 2.3.5 Phương pháp PCR khuếch ñại gen 34 2.3.6 Phương pháp ñiện di ADN gel agrose 34 2.3.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotit 35 2.3.8 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết thu mẫu, phân lập Vibrio anguillarum số loại hải sản nuôi 37 3.1.1 Kết thu mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn 37 3.1.2 Kết phân lập vi khuẩn mơi trường đặc trưng 40 3.2 Kết nghiên cứu xác ñịnh V.anguillarum phương pháp sinh học phân tử 42 3.2.1 Kết nghiên cứu khuếch ñại ñoạn gen empA Vibrio anguillarum 42 3.2.2 Kết nghiên cứu giải trình tự phân tích gen empA V anguillarum 46 3.2.3 Kết PCR khuếch ñại gen luxA 49 3.2.4 Kết so sánh phương pháp PCR kit API-20E xác ñịnh V.anguillarum V harveyi 53 3.2.5 Quy trình xác định vi khuẩn V anguillarum kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) 55 3.3 Kết khảo sát hoạt tính enzym chủng Vibrio.sp 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 MỞ ðẦU Trong năm gần đây, hoạt động ni trồng thuỷ sản ngày phát triển mạnh mẽ tạo công ăn việc làm thu ñược ngoại tệ cao cho ñất nước Kim ngạch xuất năm 2006 ñạt 3,31 tỷ USD, mặt hàng thuỷ sản ni nước lợ nước mặn chiếm > 55% (Báo cáo tổng kết năm 2005 2006 Bộ Thuỷ sản) Nuôi thuỷ sản nước mặn, lợ vấn ñề bệnh chúng ñược nhiều người quan tâm ñây nội dung hàng ñầu chiến lược phát triển ngành thuỷ sản ði với phát triển nghề nuôi trồng thuỷ sản, dịch bệnh đối tượng ni đặc biệt ñối tượng nuôi lợ, mặn ñã ñang gây thiệt hại nghiêm trọng Trên đối tượng ni thủy sản nước lợ nước mặn, bệnh vi khuẩn chủ yếu gây nhóm vi khuẩn Vibrio Trong đó, vi khuẩn Vibrio anguillarum tác nhân gây nên bệnh nguy hiểm: nhiễm khuẩn máu cá biển, bệnh ấu trùng nhuyễn thể, ăn mòn vỏ giáp xác, Ở Việt Nam ñã phát ñược V.anguillarum nhiều đối tượng ni trồng thủy sản tơm sú, ốc hương, cá song, cá giị số loài cá biển khác [6], [7], [3], [13] Do cần có phương pháp chẩn đốn phát sớm tác nhân gây bệnh để có biện pháp khắc phục kịp thời nhằm hạn chế thấp thiệt hại cho thuỷ sản dịch bệnh gây Các phương pháp chẩn đốn truyền thống quan sát dấu hiệu bệnh lý, phân lập vi sinh kinh ñiển, mơ bệnh học, soi kính hiển vi thường cho kết giai đoạn phát bệnh nên có hiệu để phịng bệnh Trong lĩnh vực chẩn ñoán bệnh nhà nghiên cứu thường hướng tới việc xác ñịnh gen ñặc hiệu (gen ñộc tố, gen mã hóa protein cấu trúc ) để thiết kế mẫu dò (gen probe) phát chủng gây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 bệnh kỹ thuật lai ADN, PCR [9], [11], [4], [8], [12] Với ưu ñiểm có độ nhạy cao, xác đặc hiệu, có khả phân tích mẫu với thời gian phân tích ngắn Các phương pháp chẩn đốn bệnh dựa kỹ thuật sinh học phân tử ñã ñược sử dụng rộng rãi ñể chẩn ñoán, xét nghiệm nhiều loại vi khuẩn, virút gây bệnh người nhiều loại vật nuôi Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, kỹ thuật lai ADN, PCR, RT-PCR ñã ñược sử dụng ñể phát nhiều loại virút, vi khuẩn (Ligthner 1999) Nghiên cứu phát triển thị phân tử để chẩn đốn bệnh Việt Nam vấn ñề song cần thiết, phương pháp có ý nghĩa thiết thực nghề nuôi thuỷ sản Việt Nam trước mắt lâu dài Trên giới nghiên cứu V.anguillarum ñược tiến hành ñối tượng thuỷ sản, số nghiên cứu chủ yếu cá hồi nhằm phát gen gây bệnh, ñộc tố gây bệnh [19], ñể nhận dạng chủng gây bệnh sản xuất vắcxin Ở Việt Nam phương pháp phân loại truyền thống [1] ñã phát ñược V.anguillarum số đối tượng thủy sản ni: tơm [6], cá song [13], ốc hương [3] Tuy nhiên theo nghiên cứu cho thấy số lồi Vibrio có hình thái, mầu sắc khuẩn lạc gần giống nhau; ñặc biệt môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) VAM (Vibrio anguillarum Medium) V.anguillarum V.harveyi ñều cho khuẩn lạc màu vàng có hình thái giống [15], [50] Do việc ñịnh tên phương pháp phân loại truyền thống gặp số khó khăn Mặt khác, nghiên cứu lựa chọn chủng Vibrio anguillarum mang gen gây bệnh để ứng dụng sản xuất chế phẩm phịng bệnh vắcxin vấn ñề ñang ñược người quan tâm “Sử dụng kỹ thuật PCR ñể phát vi khuẩn Vibrio anguillarum số loài thủy sản ni Việt Nam” hướng nghiên cứu góp phần tìm hiểu chế gây bệnh phương pháp phát V.anguillarum giúp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 cho việc chẩn đốn nhanh, xác để ñưa biện pháp phòng ngừa trị bệnh kịp thời, hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho ngành nuôi trồng thuỷ sản cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: ðưa phương pháp xác định nhanh, xác vi khuẩn Vibrio anguillarum gây bệnh ñối tượng hải sản ni & có chủng Vibrio anguillarum có đặc tính điển hình định hướng ứng dụng cho sản xuất chế phẩm phòng bệnh & vắcxin Nội dung nghiên cứu ñề tài: Phân lập, nhận dạng sơ vi khuẩn V anguillarum tôm he (P.monodon, P.vannamei), cá song (E.coioides) số loài cá biển nuôi Việt Nam so sánh với chủng chuẩn, thu nhận chủng Ứng dụng phương pháp PCR ñể phát nhanh, xác vi khuẩn Vibrio anguillarum Khảo sát so sánh trình tự đoạn gen đặc trưng, gen độc tố gây bệnh Khảo sát hoạt tính enzym (Amylase, Caseinase, Lipase, Gelatinase Lecithinase) chủng V anguillarum phân lập Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 kỳ); Chu kỳ cuối nhiệt ñộ 72oC 10 phút; ñể nhiệt độ 4oC phân tích g ðiện di sản phẩm nhận định kết Lấy µl sản phẩm PCR trộn với 1µl dung dịch 6X Loading Dye cho vào giếng thạch Ðiện di gel agarose 1,5 % ñệm TAE 1X, thời gian 30 phút ñiện 100V cường ñộ 50mA − Nhuộm gel Ethidium bromide (5-15phút); soi gel ñèn UV (312nm) xem kết − Căn vào thang ADN mẫu chuẩn ñể nhận ñịnh kết Nếu ảnh ñiện di sản phẩm PCR, ADN mẫu nghiên cứu xuất băng đặc trưng kích thước 249 bp kết luận chủng thu nhận V.anguillarum 250bp → M Hình 3-17 Sản phẩm khuếch ñại gel agarose 1,5% ñệm TAE 1X Chú thích - Giếng M thang ADN chuẩn 1.000 bp; Giếng 1-2: sản phẩm khuếch ñại 250 bp; Giếng 3-4: mẫu ñối chứng dương; Giếng : mẫu ñối chứng âm 3.3 Kết khảo sát hoạt tính enzym chủng Vibrio.sp Tiến hành thử hoạt tính số enzyme Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase Hemolysin chủng V.anguillarum, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………57 V harveyi ñã ñược ñịnh danh PCR Trên bảng 3-8 cho thấy, hầu hết chủng vi khuẩn có hoạt tính Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase Hemolysis (17-24/30 chủng), hoạt tính Gelatinase, Lipase, Lecithinase Hemolysis biểu cao ða phần chủng vi khuẩn nghiên cứu biểu hoạt tính enzym ngoại bào ðặc biệt, chủng V.anguillarum phân lập ñược ñều thể hoạt tính β-hemolysis (++) tương ñương chủng chuẩn Với biểu hoạt tính β-hemolysis hoạt tính có khả gây độc tố cao (hơn hoạt tính α γ) chủng có khả ứng dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học vắcxin B A C Hình 3-18 Hoạt hoạt tính enzym V.anguillarum, A Hoạt tính Caseinasse B Gelatinase C- Hoạt tính Hemolysis Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………58 A B C D E G Hình 3-19 Kết xác ñịnh hoạt tính enzym V harveyi A - Gelatinase; B -Caseinase; C – Leucethinase; D - Lipase; E - Amylase; G -Hemolysis Tại hình 3-18, ba chủng Vibrio anguillarum: HW72, Va4, Va6 ñều tiết enzym phân huỷ chất Gelatinase, Caseinase thạch máu Vòng chất bị tác động đổi màu vịng quanh chủng Chúng ta thấy, vịng chất bị tác động chủng HW72 lớn Hai vòng chủng lại bé nhiên ñã thể ñược hoạt tính enzym chủng Duy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………59 nhất, chủng Va1 hoạt tính enzym tác động nên chất xung quanh chủng khơng bị biến đổi mầu Tại hình 3-19, chúng tơi thử nghiệm hoạt tính enzym V harveyi chất trình bầy Cũng giống chủng chuẩn HW72, số chất chủng chuẩn ATCC14126, VIB 395 nhỉnh đường kính vịng chất bị tác động Các chủng chúng tơi phân lập ñược thể tốt khả tiết enzym phân huỷ chất Tên, kí hiệu Amylase Caseinase Gelatinase Lipase Lecithinase Hemolyysis Bảng 3-8 Hoạt tính enzym chủng V anguillarum, V harveyi HW 72 ++ + - ++ ++ β++ Va1 - - - + - - Va2 ++ +++ ++ +++ +++ ++ Va3 - - - - - Va4 - - ++ - - Va5 - - ++ - + Va6 - - ++ + + β++ Va7 ++ ++ ++ ++ +++ β++ Va8 - - ++ + +++ β++ 10 Va9 + + ++ ++ + 11 Va10 - - ++ ++ ++ - 12 Va11 + ++ + ++ ++ β++ 13 Va12 - - ++ ++ +++ β++ 14 Va13 - - ++ + +++ β++ 15 Va14 ++ ++ ++ ++ +++ β+ 16 Vh15 - + - - - β++ 17 Vh16 - + - + α++ 18 Vh19 + + - - β++ TT β++ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………60 19 Vh 20 ++ + - ++ ++ α+ 20 Vh21 + + + + - α++ 21 Vh22 - - - - - - 22 Vh23 ++ + +++ +++ +++ α+++ 23 Vh25 +++ +++ +++ +++ +++ α+++ 24 Vh26 + + - - - β++ 25 Vh27 + + + + - β++ 26 Vh28 + - - + β+++ 27 Vh29 + + - + - β++ 28 Vh30 + + - - - β++ 29 ATCC14126 + ++ ++ ++ ++ α++ 30 VIB 395 ++ ++ +++ +++ +++ α+++ Ghi chú:( -) âm tính; (+) hoạt tính thấp; (++) hoạt tính trung bình;(+++) hoạt tính cao Trong chủng Vibrio anguillarum đa dạng có chủng (Va2 -Tơm sú; Va7- Tơm chân trắng; Va11- Cá song) có hoạt tính enzym cao (Amylase, Caseinase Gelatinase) hoạt tính β+ hemolysis có khả gây độc tính vật chủ Các chủng V harveyi ña dạng: số chủng V harveyi có hoạt tính α-hemolysis: tạo màu xanh lục bao quanh khuẩn lạc môi trường thạch máu (Vh21; Vh25) số khác + β-hemolysis: tạo vùng suốt (Vh28-Vh29) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN - Tại thời ñiểm tiến hành nghiên cứu ñã phân lập tôm sú, tôm thẻ chân trắng, cá song, cá tráp, cá bơn, cá hồng ñỏ, cá chim vây vàng, ốc hương, cá cảnh biển thu ñược số chủng vi khuẩn có đặc tính điển hình, kết PCR xác ñược 15 chủng Vibrio anguillarum - Gen empA gen đặc trưng vi khuẩn V anguillarum sử dụng gen empA làm gen thị ñể nhận dạng V anguillarum phương pháp PCR ðã xây dựng ñược quy trình kỹ thuật phương pháp PCR phát xác vi khuẩn Vibrio anguillarum - Hầu hết chủng Vibrio anguillarum phân lập ñược thuỷ sản ñều có hoạt tính enzym (Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase Lecithinase) ngồi chúng biểu hoạt tính β-hemolysis môi trường thạch máu, chủng mang β-hemolysis chủng có độc tính cao sử dụng cho sản xuất chế phẩm phòng bệnh & vắcxin II KIẾN NGHỊ - ðề nghị tiếp tục phổ biến áp dụng phương pháp PCR phát Vibrio anguillarum thêm ñối tượng thủy sản khác ñể khẳng ñịnh kết - ðầu tư nghiên cứu sâu dịch tễ học phân tử tính chất gây bệnh V.anguillarum ñể ñưa giải pháp phòng trị bệnh V anguillarum hiệu quả, định hướng nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh V.anguillarum gây cần thiết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………62 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng (bản dịch) (1993), Thực tập vi sinh vật học, NXB ðại học Trung học chuyên nghiệp Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2001), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Lan Hương (2005), ðiều tra nghiên cứu ký sinh trùng bệnh vi khuẩn ốc hương, sò huyết Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật ñề tài cấp Bộ Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Hồng Un, Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Văn Hảo (2003) Phát gen tdh (thermostable direct haemolysin) chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam Hội nghị CNSH toàn quốc 2003 tr: 1111-1115 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác ñịnh hoạt ñộ Emzym, NXB Khoa học Kỹ thuật Bùi Quang Tề (2002), Nghiên cứu lựa chọn bước ñầu chất thay số hoá chất kháng sinh cấm sử dụng nuôi trồng thuỷ sản Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật ñề tài cấp Bộ Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tôm nuôi biện pháp phịng trừ, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Hồng Un, Nguyễn Thị Thanh Lợi (2004) Xác ñịnh gen ñộc tố Thermostable direct hemolysin (tdh) V.parahaemolyticus kỹ thuật lai ADN (2004) Những vấn ñề NCCB khoa học sống- ñịnh hướng Y Dược học; Hà Nội -28/10/2004: tr 475-478 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………63 Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Hồng Un, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Lê Trần Bình 2002 Phương pháp lai ADN probe gắn alkaline -Phosphatase (AP) ñể xác định Vibrio parahaemolyticus BCKH Hội nghị tồn quốc lần thứ hai, NCCB 1037-1039 10 Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hồng Un (2005) ðặc điểm hóa sinh, hoạt tính enzym số chủng vi khuẩn phân lập từ ống tiêu hóa tơm sú (P.monodon) khả ứng dụng TT BCKH toàn quốc Hà Nội 12/2005 tr.312-314 11 Nguyễn Hồng Un, Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2003 Phát gen mã hố hemolysin bền nhiệt khơng bền nhiệt (tlh) Vibrio parahaemolyticus phương pháp PCR TC Sinh vật học 25(4):42-46 12 Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Chí Thuận, Lê Thanh Hồ (2004): Tách dịng gen thermostable direct hemolysin (tdh) mã hóa protein dung huyết chịu nhiệt chủng Vibrio parahaemolyticus ATCC17803 PM1 phân lập từ tơm sú (Penaeus monodon) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (1) 43-48-2004 13 Phan Thị Vân (2006), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến ñối với cá mú, cá giị ni đề xuất giải pháp phòng trị bệnh Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật ñề tài cấp Bộ 14 Lê Xân (2007), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kỹ thuật ni thương phẩm tạo ñàn cá bố mẹ hậu bị năm loài cá biển kinh tế: cá song vằn (Epinephelus fuscoguttatuss), cá song vang (Epinephelus lanceolatus), cá song chuột (Cromileptis altivelis), cá hồng vân bạc (Lutjanus argentimaculatus) cá chim vây vàng (Trachinotus blochi) Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật ñề tài cấp Bộ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………64 B TIẾNG ANH 15 Anicet R Black (1994), “A medium for presumptive identification of Vibrio anguillarum.”, Applied and Enviromental Microbiology, May 1994, p 1681÷1683 16 Arias, C.R., Garay, E and Aznar, R (1995) Nested PCR method for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in fish, sediments, and water In Appl Environ Microbiol Vol 61, pp 3476-3478 17 Austin, B., A C Pride, and G A Rhodie (2003) Association of a bacteriophage with virulence in Vibrio harveyi In J Fish Dis Vol 26, pp 55-58 18 Austin, B., and D A Austin (1999) Bacterial fish pathogens: disease of farmed and wild fish Berlin, Germany: Springer-Verlag KG 19 Austin, M Alsina, D.A Austin, F Grimont, P.D.A.Grimont, T.Jofre, S.Koblavi, J.K.Larsen, K Pedersen, T Tiainen, L.Verdonock, and J.Swings (1995), “Identification and Typing of Vibrio anguillarum: a comparasion of different methods”, System Applied Microbiol.18, p258÷302 20 Barbieri, E., Falzano, L., Fiorentini, C., Pianetti, A., Baffone, W., Fabbri, A., Matarrese, P., Casiere, A., Katouli, M., Kuhn, I., Mollby, R., Bruscolini, F and Donelli, G (1999) Occurrence, diversity, and pathogenicity of halophilic Vibrio spp and non-O1 Vibrio cholerae from estuarine waters along the Italian Adriatic coast In Appl Environ Microbiol Vol 65, pp 27482753 21 Bassler, B.L., Wright, M and Silverman, M.R (1994) Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………65 sequence and function of genes encoding a second sensory pathway Mol Microbiol 13: 273-286 22 Bassler, B.L., Wright, M., Showalter, R.E and Silverman, M.R (1993) Intercellular signalling in Vibrio harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence Mol Microbiol 9: 773-786 23 Ben-Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J and Rosenberg, E (2003) Vibrio coralliilyticus sp nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocillopora damicornis In Int J Syst Evol Microbiol Vol 53, pp 309-315 24 Bose, N and Taylor, R.K (2005) Identification of a TcpC-TcpQ outer membrane complex involved in the biogenesis of the toxin-coregulated pilus of Vibrio cholerae J Bacteriol 187: 2225-2232 25 Buchmann, K., J L Larsen, and B Therkildsen (2001) Improved recapture rate of vaccinated sea-ranched Atlantic salmon, Salmo salar L In J Fish Dis Vol 24, pp 245-248 26 Chai, S., Welch, T.J and Crosa, J.H (1998) Characterization of the interaction between Fur and the iron transport promoter of the virulence plasmid in Vibrio anguillarum In J Biol Chem Vol 273, pp 33841-33847 27 Chatterjee, J., Miyamoto, C.M and Meighen, E.A (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor Mol Microbiol 20: 415-425 28 Chatterjee, J., Miyamoto, C.M and Meighen, E.A (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor Mol Microbiol 20: 415-425 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………66 29 Chopp, D.L., Kirisits, M.J., Moran, B and Parsek, M.R (2003) The dependence of quorum sensing on the depth of a growing biofilm Bull Math Biol 65: 1053-1079 30 Colwell, R.R., P R Brayton, D J Grimes, D B Roszak, S A Huq & L M Palmer (1985) Viable but Non-Culturable Vibrio cholerae and Related Pathogens in the Environment: Implications for Release of Genetically Engineered Microorganisms In Nature biotechnology Vol 3, pp 817-820 31 Connell, T.D., Metzger, D.J., Lynch, J and Folster, J.P (1998) Endochitinase is transported to the extracellular milieu by the eps-encoded general secretory pathway of Vibrio cholerae In J Bacteriol Vol 180, pp 5591-5600 32 DeLisa, M.P., Valdes, J.J and Bentley, W.E (2001) Quorum signaling via AI-2 communicates the "Metabolic Burden" associated with heterologous protein production in Escherichia coli Biotechnol Bioeng 75: 439-450 33 Denner, E.B., Vybiral, D., Fischer, U.R., Velimirov, B and Busse, H.J (2002) Vibrio 34 Denner, E.B., Vybiral, D., Fischer, U.R., Velimirov, B and Busse, H.J (2002) Vibrio calviensis sp nov., a halophilic, facultatively oligotrophic 0.2 microm-fiIterabIe marine bacterium In Int J Syst Evol Microbiol Vol 52, pp 549-553 35 Duan, K., Dammel, C., Stein, J., Rabin, H and Surette, M.G (2003) Modulation of Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication Mol Microbiol 50: 1477-1491 36 Dufour, P., Jarraud, S., Vandenesch, F., Greenland, T., Novick, R.P., Bes, M., Etienne, J and Lina, G (2002) High genetic variability of the agr Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………67 locus in Staphylococcus species In J Bacteriol Vol 184, pp 1180-1186 Chatterjee, J., Miyamoto, C.M and Meighen, E.A (1996) Autoregulation of luxR: the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor Mol Microbiol 20: 415-425 37 Eberhard, A., Burlingame, A.L., Eberhard, C., Kenyon, G.L., Nealson, K.H and Oppenheimer, N.J (1981) Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase Biochemistry 20: 2444-2449 38 Gomez-Gil, B., A Roque, J F Turnbull, and L Tron-Mayen (1998) Species of Vibrioisolated from hepatopancreas, haemolymph and digestive tract of a population of healthy juvenile Penaeus vannamei In Aquaculture Vol 163, pp 1-9 39 Grisez, L., Reyniers J.; Verdonck L.; Swings J.; Ollevier F (1997) Dominant intestinal microflora of sea bream and sea bass larvae, from two hatcheries, during larval development In Aquaculture Vol 155, pp 387-399 40 Heidelberg, J.F., Heidelberg, K.B and Colwell, R.R (2002) Bacteria of the gammasubclass Proteobacteria associated with zooplankton in Chesapeake Bay In Appl Environ Microbiol Vol 68, pp 5498-5507 41 Heidelberg, J.F., Heidelberg, K.B and Colwell, R.R (2002) Seasonality of Chesapeake Bay bacterioplankton species In Appl Environ Microbiol Vol 68, pp 5488-5497 42 Hirono, I., Masuda, T and Aoki, T (1996) Cloning and detection of the hemolysin gene of Vibrio anguillarum In Microb Pathog Vol 21, pp 173182 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………68 43 Hjeltnes, B., and R J Roberts (1993) Vibriosis In Bacterial diseases of fish R J Roberts, N.R.B., and V Inglis (ed.) Oxford, United Kingdom: Blackwell Scientific, pp 109-121 44 Huys, G., Gevers, D., Temmerman, R., Cnockaert, M., Denys, R., Rhodes, G., Pickup,R., McGann, P., Hiney, M., Smith, P and Swings, J (2001) Comparison of the antimicrobial tolerance of oxytetracycline-resistant heterotrophic bacteria isolated from hospital sewage and freshwater fishfarm water in Belgium Syst Appl Microbiol 24: 122-130 45 Javier Martiner –Picardo (1995), “Species- Specific detection of Vibrio anguillarum in marine aquaculture enviroment by selective culture and DNA hybridization”, Applied and Emviromental Microbiology, Feb.1996, p 443÷449 46 Jessica L Rock† and David R Nelson (2006) Identification and Characterization of a Hemolysin Gene Cluster in Vibrio anguillarum Infec.ImmunMay 2006, p 2777–2786 47 Jun Okuda, Tshihiro Nakai, Park Se Chang, Takainori Oh, Takeshi Ninishino, Tsumotu Koitabashi and Mitsuaki Nishibuchi (2001), “The tox R gene of Vibrio (Listonella) anguillarum controls expression of the major outer membrane proteins but not virulence in a natural host model”, Infection and Immunity, Oct.2001, pp 609÷611 48 Jun Okuda,Toshhiro Nakai and Mitsuaki Nishbuchi, 2001 The toxR Gene of Vibrio (Listonella) anguillarum Controls Expression of the Major Outer Membrane Proteins but Not Virulence in a Natural Host Model Infec.Immun,69; 6091–6101 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………69 49 Liu PC, Lee KK (1997), “Purivication and characterization of a cysteine protease produced by pothogenic luninous Vibrio harveyi”, Curr microbio, Jul 2997, pp 32-39 50 Mercedes Alsina 1994 A medium for Presumptive Identification of Vibrio anguillarum App.Environ.Microbiol 60:1681-1683 51 Norqvist A, B Norrman and Wolf-Watz 1990 Identification and characterization of a zine metalloprotease associated with invastion by the fish pathology Vibrio anguillarum Infec.Immun,58; 3731-3736 52 Norqvist, A.; B Norman and Hwolf-Watz (1990), “Identification and characterization of zinc metalloprotease associated with invasion by the first pathogen Vibrio anguillarum”, Infect Immum, Nov.1990, p 1737÷1990 53 Ortigosa, M., C Esteve, and M J Pujalte (1989) Vibrio species in seawater and mussels: abundance and numerical taxonomy In Syst Appl Microbiol Vol 12, pp 316-325 54 Ortigosa, M., E Garay, and M J Pujalte (1994) Numerical taxonomy of Vibrionaceae isolated from oysters and seawater along an annual cycle In Syst Appl Microbiol.Vol 17, pp 216-225 55 Ringo, E and Olsen, R.E (1999) The effect of diet on aerobic bacterial flora associated with intestine of Arctic charr (Salvelinus alpinus L.) In J Appl Microbiol.Vol 86, pp 22-28 56 Rodkhum, C., Hirono, I., Crosa, J.H and Aoki, T (2005) Four novel hemolysin genes of Vibrio anguillarum and their virulence to rainbow trout In Microb Pathog Vol 39, pp 109-119 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………70 57 Staeoscik A.M, Denkin SM, Nelson DR,2005 Regulation of the Vibrio anguillarum metalloprotease EmpA by posttranslational modification J Bacteriol 2005 ; 187:2257-60 58 Steven M Denkin and David R Nelson.2004 Regulation of Vibrio anguillarum empA Metalloprotease Expression and Its Role in Virulence.App.Environ.Microbiol 70:4193-4204 59 Steven M Denkin and David R.Nelson.1999 Introduction of protease activity in Vibrio anguillarum by Gastrointestinal Mucus App.Environ.Microbiol 65:3555-3560 60 Steven M Denkin, Pedja Sekaric and David R Nelson (2004), “Gel shift analysis of the empA promoter region in Vibrio anguillarum”, BMC Microbiology, Oct.2004, p.1÷11 61 Steven M Denkin† and David R Nelson.2004 Regulation of Vibrio anguillarum empA Metalloprotease Expression and Its Role in Virulence.App.Environ.Microbiol 70:4193-4204 62 Toranzo, A., Barja, JL (1990) A review of the taxonomy and seroepizootiology of Vibrio anguillarum , with special reference to aquaculture in the Northwest of Spain In Diseases of Aquatic Organisms Vol 9, pp 73-82 63 X H Wang, H L Oon, (1998), “Internalization and cytotoxicity are important virulence mechanisms in vibrio–fish epithelial cell interactions”, Microbiology (1998), 144, pp 2987–3002 64 Zorrilla, I., Chabrillon, M.,Arijo,S., Daz-Rosales, Balebona, M.C., Morinigo, M.A (2003) Bacteria recovered from diseased cultured gilthead sea bream (Sparus aurata L.) in southwestern Spain In Aquaculture Vol.218, pp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………71 ... virút sử dụng kỹ thuật PCR (RT -PCR) cho hiệu cao xác đặc hiệu Trong tương lai việc kết hợp kỹ thuật PCR lai ADN thay cho phương pháp phát sản phẩm PCR kỹ thuật ñiện di nâng cao ñộ nhậy phát 1.5 Kỹ. .. Kary Mullis - người phát minh nó, PCR ứng dụng Việt Nam Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) kỹ thuật sử dụng chuỗi phản ứng nối tiếp dùng ñể khuếch ñại số lượng trình tự ADN đích thơng qua... Javiermarti (1996) sử dụng probe VaV3 phát V anguillarum Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 1.2 Tổng quan chung Vibrionaceae Vibrio vi khuẩn sống mơi trường