Phân tích sự biến đổi đa dạng di truyền của rong biển bằng kỹ thuật sinh học phân tử và bước đầu lựa chọn dòng có khả năng kháng bệnh và chịu nhiệt cao của ba chi rong sụn, rong nho và rong câu

VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội PHÂN TÍCH Sự BIẾN ĐĨI ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA RONG BIẾN BẢNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỦ VÀ BƯỚC ĐẦU LỤ A CHỌN DỊNG CĨ KHA NĂNG KHÁNG BỆNH VÀ CHỊU NHIỈỆT CAO CỦA BA CHI RONG SỤN, RONG NHO VÀ RONG CÂU Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Thân Lớp: KS CNSH 11-04 VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN TÍCH SỤ BIẾN ĐÓI ĐA DANG DI TRUYỀN CỦA RONG BIẾN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BƯỚC ĐẦU LỰA CHỌN DỊNG CĨ KHA NÀNG KHÁNG BỆNH VÀ CHỊU NHIẸT CAO CỦA BA CHI RONG SỤN, RONG NHO VÀ RONG CÂU Giáo viên hưởng dan: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Thân Lớp: KS CNSH 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học £í £3 ỉa LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phịng Cơng nghệ Táo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực tập phịng thí nghiệm Tơi vơ câm ơn TS Ngơ Thị Hồi Thu, phịng Cơng nghệ Tào, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ suốt thời gian thực đe tài tốt nghiệp Chị dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình chi dẫn cho nhiều kiến thức đề tài cho lồi sai, giúp không bị lệch hướng biến kiến thức mênh mông Đe có thê định hướng tốt làm luận văn cùa Tơi xin gừi lời cám ơn chân thành tới tập phịng Cơng nghệ Táo giúp đỡ tơi nhiệt tình chia sê khó khăn với tơi suốt q trình tơi thực tập phịng Những ngày làm thí nghiệm bữa ăn trưa anh chị phòng ki niệm đẻp đáng nhớ dời tôi: Tôi xin gứi lời cám ơn đến tất thầy, cô Viện Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mờ Hà Nội giúp đỡ dạy bão thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin bày tò lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình bạn bè tạo diều kiện tốt động viên tơi suốt q trình tơi học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thân Bùi Thị Thân Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC Trang LỜI CẦM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TÙ VIÉT TẨT iv DANH MỤC BẢNG .V MỞ ĐÀU PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu rong biển giói 1.1.1 Giói thiệu chung rong biển 1.1.2 Rong Sụn 1.1.2.1 Giới thiệu rong Sụn 1.1.2.2 Đặc điêm sinh học cùa rong Sụn 1.1.2.3 Nguồn gốc cùa rong Sụn.ớ Việt Nam 1.1.2.4 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác rong Sụn I hir vien Viên.-Rai hoe Jvlo Hà Noi Rong Nho 10 1.1.3 1.1.3.1 1.1.3.2 Đặc diêm sinh học 10 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác rong Nho 11 Rong Câu 13 1.1.4 1.1.4.1 Đặc diem sinh học 14 1.1.4.2 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trông khai thác rong Câu 15 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 Tình hình nghiên cứu rong biển việt nam 16 Da dạng rong biển sử dụng sinh khối rong biến Việt Nam 16 Hiện trạng khai thác nuôi trồng rong biển Việt Nam 17 Nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật 18 1.3.1 Kĩ thuật RAPD 18 1.3.2 Nghiên cứu đánh giá tính chống chịu với điều kiện nhiệt độ cao, hạn, độ mặn cao số gen đặc trung 19 Bùi Thị Thân ii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Hóa chất 24 2.3 Thiết bị 24 2.4 Phuong pháp nghiên cún 25 2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 25 2.4.2 Phản ứng RAPD-PCR vói mồi ngẫu nhiên 26 2.4.3 2.5 Điện di gel agarose 27 Xử lý số liệu 28 PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tách chiết AND tổng số 31 3.2 Phân tích tính đa hình ADN kỹ thuật RAPD-PCR 32 3.3 Bước đầu đánh giá sơ tính chống chịu 12 mẫu rong đưọc sử dụng nghiên cứu .42 KẾT LUẬN Thự vien Vien Dai.hoc Mở Hà Nôi 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Bùi Thị Thân iii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẤT Tù' viết tắt bp Viết đầy đủ Số cặp base PCR Polymerase Chain Reaction ADN Axít Deoxyribonucleic RAPD Random amplified polymorphic DNA dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid kb Kilobase HSĐDDT Hệ số đồng dạng di truyền Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Bùi Thị Thân iv Lớp 11-04 ÍH ỉa Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Trang Bàng 2.1 Danh sách 10 mẫu rong Sụn rong Nho rong Câu sử dụng 24 nghiên cứu Bàng 2.2 Trình tự mồi ngầu nhiên sử dụng nghiên cứu 26 Bàng 3.1 Các đoạn ADN nhân phản ứng RAPD-PCR với 35 mồi ngầu nhiên cặp moi DREB2 Báng 3.2 Hệ số đồng dạng di truyền 10 mẫu rong thuộc loài K alvarezii, K 40 striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata, G hailinae c lentillifera dựa vào kết RAPD-PCR với mồi ngầu nhiên cặp mồi DERB2F-R Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Bùi Thị Thân Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ành cùa hai lồi Rong Sụn A: K alvarezii', B: K striatum Hình 1.2 Sơ đồ vịng đời cùa rong Sụn Hình 1.3 Hình thái rong Sụn Hình 1.4 Hình thái rong Nho (Caulerpa lentillifera J Agracilarh, 1873) 11 Hình 1.5 Hình thái rong Câu (Gracilaria) 15 Hình 3.1 Anh hình thái cùa 10 mẫu rong Sụn, rong Nho rong Câu 32 Hình 3.2 ADN tổng số cùa 10 mẫu rong nghiên cứu 32 Hình 3.3 Kết quà điện di sán phẩm RAPD-PCR với mồi OPH08, 34 Hình 3.4 OPR08, RA 143, OPN15, OPN04 OPE14 OPC19, OPV11 Sán phẩirỉ^ÕEỈ^ỈỈa àẫJt^ẳỊg tíRÉtì2 38 Cây phát sinh chúng loại cùa 10 mẫu rong biền thuộc lồi K 40 Hình 3.5 alvarezii, K striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata, G bailinae c lentillifera Bùi Thị Thân vi Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU Một số lồi rong biển có tầm quan trọng kinh tế Việt Nam Rong biển sử dụng làm thực phấm cho người động vật nuôi; nguyên liệu cho ngành công nghiệp, ngành Y-học, sản xuất phân bón gần dùng để sàn xuất nhiên liệu sinh học Chính quốc gia có biến trọng phát triển việc nuôi trồng- khai thác chế biến rong biển Việt Nam đất nước nhiệt đới gió mùa, với 3260 km đường bờ biển nhiều đáo quần đảo Đây điều kiện thuận lợi để hệ rong biến phát triển đa dạng Tống số loài rong biển dọc theo bờ biển Việt Nam bao gồm hài đảo, ước tính gần (X)0 loài Theo truyền thống, ngư dân Việt biết nuôi trồng, thu hoạch sử dụng rong biến trăm năm nay, nhóm rong kinh tế phố biến Việt Nam gồm rong Sụn (Kappaphycus), rong Câu (Gracilaria), rong Nho (Cauìerpa), rong Mơ (Sargassum) Tuy nhiên, việc nuôi trồng - khai thác rong biển nhiều hạn chế, chưa mang lại hiệu quâ kinh tế cao Do đặc điếm khi' hậú nhiệt 'đới gió mùà có ảnh hướng nhiều đến phân bố da dạng, sinh trường phát triển, chất lượng rong biển Các yếu tố sâu bệnh, nhiệt độ, lượng mưa độ mặn vùng ven biển có ảnh hướng lớn tới phát triển cùa rong biến Vì yêu cầu đặt cần phải nghiên cứu tìm dịng có khả chống chịu tốt với thay đối điều kiện ngoại cảnh Từ giúp nâng cao sàn lượng chất lượng cùa lồi Đề ni trồng rong biền trờ thành ngành cơng nghiệp mang lại nguồn thu nhập cho người dân góp phần ổn định kinh tế nước nhà Chính u cầu cấp thiết nêu mà chúng lôi tiến hành thực đề tài nghiên cứu "Phân tích biến đổi đa dạng di truyền rong biển bàng kỹ thuật sinh học phân tử bước đầu lựa chọn dịng có khả kháng bệnh chịu nhiệt cao ba chi rong Sụn, rong Nho rong Câu” với mục tiêu nghiên cứu sau: • Phân tích biến đối di truyền loài rong biển Việt Nam kỳ thuật sinh học phân từ nhờ sử dụng mồi đa hình ngẫu nhiên (RAPD-PCR) Bùi Thị Thân Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp • ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học Bước đầu lựa chọn dịng có khả kháng bệnh, chịu nhiệt, chịu hạn cao loài thuộc ba chi rong Sụn, rong Nho rong Câu Cơng việc nghiên cứu dược thực phịng Công nghệ Táo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Bùi Thị Thân Lớp 11-04 ÍH ỉa Luận văn tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 200 0 0 0 0 10 100 1 0 1 0 OPN15 2000 1 1 1 1 1 1300 0 1 0 850 1 1 1 1 500 0 0 0 1 200 0 0 0 0 OPN04 2000 0 0 0 1 1300 1 1 1 1000 1 1 1 1 870 0 0 1 1 600 0 1 0 0 400 1 0 0 0 0 — * _ _ _ — - - - liu V1ICI loviẹ 11 uạ 01 ực ỴlU I l(jl INI OPE14 1500 1300 1 1 0 1000 1 0 1 0 0 870 1 1 1 1 600 1 1 1 1 400 1 1 0 OPC19 4000 0 0 0 0 2000 0 0 0 1300 0 0 1 1 1000 1 1 1 1 850 1 1 1 1 700 1 1 1 1 550 0 0 0 0 400 0 0 0 OPV11 Bùi Thị Thân 36 Lớp 11-04 ÍH ỉa Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 4000 1 1 0 0 1500 0 0 0 1 1300 1 1 1 1 1 1000 1 1 1 1 1 870 1 1 1 1 1 700 0 0 0 1 0 500 0 1 0 1 400 1 0 0 0 350 0 0 1 10 300 0 0 0 0 DERB2 1500 0 0 0 1 1350 0 0 0 0 1000 0 0 1 0 700 0 0 0 0 500 1 1 400 0 1 1 1 Ạ lệ 11 Đạ Ị1ỢC ỴIỜ Iị.1 N( 1 Kct điện di sàn phấm PCR chúng tơi trình bày hình 3.3 Các băng ADN nhân phản ứng RAPD - PCR với mồi ngẫu nhiên tống kết bàng 3.1 Kết quà nghiên cứu thu cho thấy có 69 băng ADN nhân rõ nét, có kích thước khác nhau, có băng chung cho cá 10 mẫu rong (chiếm 8,6%) băng cịn lại 63 đa hình (chiếm 91,4%) Các băng chung cho cà 10 mẫu sau: mồi OPR08-1000bp, mồi OPN15-2000 mồi OPV111300, 1000 870bp mồi DREB2- 500pb Trong đó, mồi OPH08 RA 143, OPV11 nhân 10 băng; mồi OPR08, OPC19 nhân băng; mồi OPN04, OPE14, DREB2 nhân 6; moi OPN15 nhân băng Kích thước băng thay đối từ lOObp (OPA4) đến 4000bp (OPC19) Điều chứng tỏ 10 mầu rong nghiên cứu có sai khác di truyền rat lớn Khi phân tích tính đa hình mẫu dịng với chúng tơi nhận thấy rằng: Bùi Thị Thân 37 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp ÍH ỉa Khoa Cơng nghệ sinh học Đối với mẫu K alvarezii có màu xanh nâu (mẫu 2): có tổng số 33 băng với kích thước từ 100 bp 4000 bp Trong đó, 26 băng chung cho hai dòng chiếm 78,78% băng đa hình chì chiếm ti lệ 21,21% mầu c lentillifera: có tống số 43 băng với kích thước dao động từ 100 bp đến khoáng 4000bp Trong có 14 băng chung cho cá mẫu, chiếm 32,55% 29 băng đa hình chiếm ti lệ 67,44% Có 14 maker chung cho mẫu thuộc chi Caulerpa bao gồm mồi OPH08- 1300 870 600bp; mồi OPR08- lOOObp; mồi RA143-500bp; mồi OPNI5- 2000, 850bp; mồi OPN04- 870; mồi OPE14- 870, 600bp; mồi OPV111300 1000, 870bp mồi DREB2 - 500 bp mầu Gracilaria tenuistipitata, G hailinae G bailinae Cam Ranh: có tổng số 52 băng với kích thước dao động từ 100 bp đến khoảng 4000bp nhân Trong dó có 17 băng chung cho cá mẫu chiếm 32,69% 35 băng da hình chiếm 67,31% 17 maker chung gồm mồi OPR08-1300, lOOObp; RA143- 1500, 850, 600, 500; GPN15-2000bp, OPN04 - 1300 lOOObp; OPC19 - 850, 700bp; OPV11- 1300, 1000, 870bp; DREB2 - 1000, 500 ,400 bp Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội DREB2 Hình 3.4 Săn phấin PCR cùa 10 mẫu rong vói mồi DREB2 Giếng c+: Mầu Đối chứng (với mồi DREB2) 5(H) h|^ Giếng 2-11: Sản phẩm PCR với mồi DREB2 10 mẫu rong tương ứng với mầu có thứ tự từ 1-10 bảng Giếng M2: Thang chuẩn ỘX174 RF DNA/Hae III Fragment Dựa xuất không xuất băng ADN nhân ngầu nhiên với mồi ngẫu nhiên RAPD cặp moi DREB2 mối liên quan di truyền học 10 mẫu rong sử dụng nghiên cứu bao gồm K alvarezii Bùi Thị Thân 38 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học £í £3 ỉa K striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata G bailinae, c lentillifera mức độ phân tứ thiết lập Các số liệu phân tích theo chương trình NTS 2.0 Sự khác mức độ phân tử biểu hệ số đồng dạng di truyền mẫu loài hay loài khác Hệ số đồng dạng di truyền cao mối quan hệ di truyền loài hay dịng gần Chúng ta có thẻ phân chia mức độ giống (hay mức độ gần mặt di truyền) mẫu sau: - Neu hệ số đồng dạng di truyền mẫu hay lồi > 0,92 chúng coi gần mặt di truyền coi một; khó phân biệt chúng mặt di truyền - Ncu hệ số đồng dạng di truyền