Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI---***--- NGÔ THỊ TUYẾT NHUNGỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-*** -
NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN
Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC :
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
HÀ NỘI 2017
-170833000884656a3c3bd-cbfa-4ac2-aca9-fab669d7aba7
170833000884611dad127-dc10-4c75-9f8a-500a7d2128b0
1708330008846d8ff2a33-ec97-4415-859c-9948e4019d3a
Trang 2L ỜI CAM ĐOAN
“Ứ ng d ng k thuật sinh học phân tử phát hiện ụ ỹ
độ t bi ến trên gen α globin gây bệ nh Hemoglobin H ” u ca
u t i khoa Di truy, B nh vi n Nhi
m Ngc s ct c u v vi
n i dung th c hi t qu t qu c
rung th
Ngô Thị Tuy t Nhung ế
Trang 3L Ờ I CẢM ƠN
c Phong,
m Proteomics- sinh h c- i h b o em trong su
m Ng c, ng khoa Di truy Sinh h- B nh vi n Nhi Trun u ki
Trang 4M Ụ C LỤ C
L ỜI CAM ĐOAN i
L Ờ I CẢM ƠN ii
M Ụ C LỤ C 1
DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ ẾT TẮT 4 VI DANH MỤC HÌNH 6
DANH M C B NG Ụ Ả 6
M Ở ĐẦ U 9
CHƯƠNG 1 TỔ NG QUAN 11
1.1.Lch s u b nh Alpha Thalassemia 11
1.1.1 Th gi i 11
1.1.2.Vi t Nam 13
1.2.C u tr Hemoglobin ng 14
1.2.1.C Hemoglobin 14
15
1.3.B nh Alpha Thalassemia 17
m chung v b nh Alpha Thalassemia 17
1.3.2.D ch t h c b 17
18
1.3.3.1 19
nh 19
1.3.3.3 B nh Hemoglobin H (HbH) 19
1.3.3.4 Hi ch 19
1.4.V 20
1.4.1 C 20
21
1.5 Chnh Alpha Thalassemia 22
m huy n 22
22
n di Hemoglobin 22
Trang 51.5.2.Ch b ng sinh h 23
1.5.2.1 K thuc hiu 24
1.5.2.2 K i a c hi u (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR) 24
1.5.2.3.K thu t x t gi i h n (restriction fragment length polymorphism analysis- RFLP PCR) 25
1.5.2.4 K thut GAP-PCR 25
1.5.2.5 K thu t gi gen 25
1.5.2.6 K thut khui nhithu c k t n i (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA) 26
CHƯƠNG 2 ĐỐ I TƯ ỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 28
u 28
t s d ng 28
2.3.Trang thit b 28
u 29
t ADN 29
t ADN t i vi[54] 29
t ADN t ch y 30
nh n ADN t ng s 30
t bing g 31
2.4.2.1.Ph n t bi 31
2.4.2.2.Ph n ng C- t bi n HbCS, HbQS 33
34
c 34
34
2.4.4 Ph n ng PCR khu gene HBA1, HBA2 36
2.4.5 Tinh sch sn ph m PCR 37
2.4.6 PCR m 37
2.4.7.Tinh sch bng BigDye X 39
2.4.8 gene 39
nh c hi u c a k thu t Multiplex Gap- 39
Trang 62.5.V c ngh nghi p 42
CHƯƠNG 3 KẾ T QU Ả VÀ BÀN LUẬ N 41
thu t s d t bi n gen globin 41
3.2 Kt qu t bin gen 44
3.2.1 K t qu t bi n mng g p b ng k thut Multiplex Gap- -ARMS PCR 44
3.2.2 K t qu t bim hi m g p d ng m n b ng k thu t gi i 47
3.2.2.t bi2 47
t bim c.92 G2 48
t bim c.426 A T(p.Ter142Tyr)- Hb Pa ks 2 50
t bim c.81G T Glu27Asp)- (p 1 51
3.2.3 T ng h p k t qu v t l t bia b 52
3.3 Kt qu ch c sinh 54
i chi u k t qu ch c sinh 56
K Ế T LUẬ N 58 KIẾ N NGH 59 Ị TÀI LIỆ U THAM KH O 60 Ả
Trang 7( thalassemia trait)
- /- ng h p t +-thal, i mang gen 0-thalassemia
(Trans)( thalassemia trait)
-3.7 t bi n m n 1 gen l ch ph i 3.7kb
-4.2 t bi n m n 1 gen l
SEA t bi n m n 2 gen d ng South East Asia
-c.2delT t bim ATG>A-G codon ATG gen 2
-c.92 G>A t bim AGG>AAG codon 31 gen 2
-c.426 A>T t bim TAA>TAT, Hb Pakse
-c.81G>T t bi n m GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan
Polymerase Chain Reaction
Trang 8ng c u (pg)
RBC (1012/L) Red Blood Cells, s ng h ng c u
quc t
WHO World Health Organization, T chc y t i th gi
Trang 9D ANH MỤC HÌNH
c u t Hemoglobin 14
n chuy n oxy c Hemoglobin 15
hu i globin 16
i ch 20
20
-R trong c 21
22
n di Hemoglobin b ng k thu t HPLC 23
t bi n globi nh Hemoblobin H 29
a k thu t GAP-PCR 31
a k thu t C- ARMS-PCR 33
n di s n ph m Multiplex GAP- n di s n ph m C- ARMS-PCR cho 20 mt bin gen globin 41
n di s n ph m PCR c a:(A) K thu t Mutiplex GAP-PCR, (B) K thu t C-ARMS PCR c- a 20 mt bi n gen globin 42
n di s n ph m PCR c t bi n m ng g globin cng k thu t Multiplex GAP PCR 44
n di s n ph m PCR c t bi n - HbCS - HbQS b ng k thu t C -ARMS- PCR 45
t qu gi gen t bi m c.2delT (p.Met1Argfs) 48
t qu gi gen t bi m c.92G>A (p.Arg31Lys) 49
t qu gi gen t bi m c.426A>T (p.Term142Tyr) 50
t qu gi gen t bi m c.81G>T (p.Glu27Asp) 52
Trang 10 n di ch c sinh b ng k thu t Multiplex GAP PCR 54
n di chc sinh bng k uth t C-ARMS PCR 55
ng r n thu th p t thai b c
57
Trang 11B ng 3.4: Ki u gen c a 47 b 53
B ng 3.5: T ng h p k t qu chc sinh b nh thalassemia 56
Trang 12s th gii mang gen b t ng quc gia, ch ng t [37] Trung Qu c m 5-[2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [13][5], Vit Nam 5% [63]
ng s
bng ( /
t biu hi nhi u m B nh Hemoglobin
t trong b nh c a b nh Alpha Thalassemia v n gen
α globin c b t bin
Tr mc b, phi ph thuc truyn
u qu N
u tr , tr m c HbH th n ng t vong s m, ho c mu n chng ca bnh
Ti b nh vi p nh n kho ng h p tr
b HbH m c m i Cn Hemoglobin
trong vi c h tr ch u , m
t bi chc sinh cho thai nhi nh lot binh HbH bthu
r ng trong vinh th b nh thi t y u cho n di truyc sinh bthalassemia
y
Ứ ng d ng k thu t sinh h c ụ ỹ ậ ọ phân tử phát hiệ n đ ộ t bi ến trên gen α globin gây bệ nh Hemoglo bin H”
Trang 13Mc c
- ng d thut sinh h t bi
nh Hemoglobin H chc sinh b
Trang 14 ng cthy b ng c u bi n d ng ki u thalassemia, nhi u h ng c
Trang 15 m vn
tnh HbH [32]
ng s
bc HbH t , k t qu cho th ng r n c a 30 tr c sinh ra t m c b ng h p
u ng t h t c
m c b [32] Nh ng tr
nh t g m 14 tr bing c u ngo i vi theo ki u thalassemia, h ng c u nh c s c,
to nh c b n th m th u h ng c cung r n chi m 5- n Hb cu hihuy t h - hai:
Trang 16 c n v c i v i nh ng b n ttrng c a bnh [26]
n mang thai Khi i v i chng t qu t m
nghi ng i mang gen b nh thalassemia, c th c hi m
di truy kh n di truyc sinh [1]
T m Ngng s u v m
h a ki gi a bn
u tr t i b nh vi n t i mang gen,
n di truyc sinh[6 7 ], [ ]
Trang 17 Tuyng s ng d thu
chng b nh nhi t i bnh vi [8]
1.2.C ấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thườ ng
1.2.1.C ấu trúc phân tử Hemog lobin
Trang 18Hình 1.2: Ch ức năng vậ n chuy n oxy c ể ủa phân tử Hemoglobin [ 33].
1.2.2 Các dạng Hemoglobin trong cơ thể
i chuchuyi, lo i chu chu i kia t n c a cu c s
chia chu i polypeptide
i delta
[12]
ng m p chu i polypeptide ph lon chung c u c22) chi m kho ng 97% trong
t ng s Hb c , hemoglobin A2 22) chi
) 22) chim ~ 1% [12]
B ả ng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triể ủa người bình thường n c
Trang 19ng hn ti p t c bi u hi n trong t ng cng
i ch ng t t s c t t di truy n (HPFH) [12]
Hình 1.3 : Các chuỗ i globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh [12 ].
Trang 20 ng,
Hai lo i chu 22
Trong t t c nh v r i lo n gen globin, b
r i s k t h p git bi
ca b a b o ra nhi u ki u
a b , b trung gian
y ch y u a Trung H i
Trang 21Bt hi t c n t ng t gii, rt ph bi n
ng 5% th gi i mang gen b
t ng qu c gia, ch ng t c [37] Trung Qui
m 5- [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 30% [13][5], Vi t Nam 5% [63]
15- mt v u Trong kho kho ng 900,000 tr sinh ra m c bnh T tr c v
1.3.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia.
B globin b t bi n, v u hi m i th
Trang 23Biu hia tr m u
n thai trong t u hi
n, h tim m n bTr m u h ng t n thai (23-38 tu n)
ho c ngay sau khi sinh Ch ng h u tr [20]
Hình 1.4: H i ch ộ ứng phù thai do Hb Bart’s [20]
A: Máu ngoại vi có hồng c u non, nhầ ỏ, nhược sắc B: Phù thai do Hb Bart’s
1.4.V ị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin
1.4.1 C ụm gen α globin
Cao g
c ch p x t -
- - - [42]
Hình 1.5: C ấu trúc cụm gen α globin [21]
Trang 24ng cho s bi u hi n c [15]
Hình 1.6 C : ấu trúc vùng MCS -R trong c ụm gen α globin [15]
HS- ADN ng 40kb nm u ngu n c a c y c n vu
t d S n c - u t c n thi t cho s
bi u hi n c u b ng ch ra r ng m HS- u hi n c a c ngu n,
Trang 25Hình 1.7 C : ấu trúc gen α globin [71]
y, m ng s globin mang ch t ng s , s n ph m chu c s n xu t t 4 gen
i s n ph m chu c s n xu t t
n 11, t chui globin
1.5 Chẩn đoán bệ nh Alpha Thalassemia
1.5.1 Xét nghiệ m huy ế ồ t đ cơ bả n
1.5.1.1 Xét nghiệm công thức máu
Trang 26hong i mng gi m thy xu t hi n HbH [17]
i huy t s c t bn v b b c biu b nh ph
l nh ho c s d t s c t t
s c t b ng khc phc nhi d ng
i mang gen trong cc
[34, 35] Trong th i k n b ng
n thc h p c a chu o
mng th
n m n ng nh ca b-thalassemia N u n
t ch m cho b nghi m di truy c c ch nh thc hi kh nh ch
Hình 1.8 : Phân tích Hemoglobin b ng k thu t HPLC ằ ỹ ậ
1.5.2 Chẩn đoán bằ ng sinh h ọc phân tử
Tu nh thu c d t, tu c
m c a t a ch n k thu t t bi n gen m t s k thu t sinh h
c s d ng
Trang 271.5.2.1 K ỹ thuật lai đặ c hi ệu
K thut dot blot (DB) ho c reserve dot blot (RDB) l
[55], s d ng m t m ADN c
lai vADN th hai ch c
b sung (target) v i m p base tham
n ng C u c n khu ch
c hi u m n ADNn cc lai vc c nh s c c d
i v i DB, m i m t probe trong m t ph n ng c a trong m t
u ki n m t lo t bi n c a nhi u m
mc l i v i RDB s d
t bi c a t u kin nhit bi n c t m
1.5.2.2 K ỹ thuât khuếch đạ i a en đặ l c hi ệ u ( Amplificat ion refractory mutation system- ARMS PCR)
K thut ARMS-PCR s d n s t ca at bin
s n ph m ADN khu i v t
n g , s d c nhi u
t bi t b u
s d ng k thu -thalassemia [43, 16 21] ,
Trang 28k thun ph i bi m i thi t k c c p mng [37] Hip m n ng GAP-PCR cho b nh -thalassemia
Trang 29d i ADN i ADN , t s
t ng h p c a m i s i ADN m c d ng l i t i m m d c theo chui Chu k t h p ngtheo s t ca ADN ng
c thi t k c b sung vADN
t bi n m n d h p t s u gi m t 35-50% so vi m c
m t c hi n gich th u m
Trang 302720-25% so vu bn b n sao HbA
ng [50]
Trang 31- Ethidium Bromide (Invitrogen), Agarose (Biorad), TBE10X (Invitrogen)
- Kit tinh sch s n ph m PCR (QIAquick PCR purification kit- c)
- Sequencing kit v3.1 (ABI)
Trang 32- c
- Khay l nh
- H thi gen ( PCR Eppendoff, Bior ad)
- H ng soi gel Biorad th
- gene 3130 Genetic Analyser (ABI- M )
Trang 33- Tách chiế t ADN t t ừ ế bào dị ch i: ch ố
v d ADN t ng s QIAamp DNA mini kit (Qiagen- ADN t ng s
2.4.1.3 Xác đị nh n ồng độ ADN ổng số t
- Vinh n ADN s n ph n ng PCR
t hi u qu t t N ADN nh b cThermo
- Ti 2 l n v i m i m
Trang 342.4.2 Phương pháp PCR sàng lọ c 5 đ ộ t biến thường gặp trên gene HBA
2.4.2.1 Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọ c đ ộ t biế SEA, α3.7, α4.2 n
Gap-PCR (PCR khoc thi t l
m n l ph n n v i c p m i
c thi t k b sung v c t bi n m n,
ph n c th c hi t ct bic th hi n b ng s n ph m ADN khu i v t Ny ra m n ng
c hic do c p m b t c n
ph m PCR
Multiplex Gap- - c s d ng thi nhi u c p m c hi ng th i nhi t bi n m n
l t c t bic biu hi n qua s t c n
phm ADN khu i v t
Hình 2.2: Ngu yên lý củ a k thu t GAP-PCR [21] ỹ ậ