Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI---***--- NGÔ THỊ TUYẾT NHUNGỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** - NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2017 1708330008846d8ff2a33-ec97-4415-859c-9948e4019d3a 170833000884611dad127-dc10-4c75-9f8a-500a7d2128b0 170833000884656a3c3bd-cbfa-4ac2-aca9-fab669d7aba7 LỜI CAM ĐOAN “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” u ca u ti khoa Di truy, Bnh vin Nhi m Ngc s ct c u v vi ni dung thc hit qu t qu c rung th Xác nhận trưởng nhóm nghiên cứu Học viên Ngô Thị Tuyết Nhung i LỜI CẢM ƠN c Phong, m Proteomics- sinh hc- i h bo em su m Ngc, ng khoa Di truy Sinh h- Bnh vin Nhi Trunu ki Em xin c Sinh h thc phi ht kin th c tn Trong thi gian hc tc s t y ca tp th t Cui li ci gia ng hc tu H Tuyt Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 11 1.1.Lch s u bnh Alpha Thalassemia 11 1.1.1 Th gii 11 1.1.2.Vit Nam 13 1.2.Cu tr Hemoglobin ng 14 1.2.1.C Hemoglobin 14 15 1.3.Bnh Alpha Thalassemia 17 m chung v bnh Alpha Thalassemia 17 1.3.2.Dch t hc b 17 18 1.3.3.1 19 nh 19 1.3.3.3 Bnh Hemoglobin H (HbH) 19 1.3.3.4 Hi ch 19 1.4.V 20 1.4.1 C 20 21 1.5 Chnh Alpha Thalassemia 22 m huy n 22 22 n di Hemoglobin 22 1.5.2.Chbng sinh h 23 1.5.2.1 K thuc hiu 24 1.5.2.2 K i ac hiu (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR) 24 1.5.2.3.K thut x t gii hn (restriction fragment length polymorphism analysis- RFLP PCR) 25 1.5.2.4 K thut GAP-PCR 25 1.5.2.5 K thut gi gen 25 1.5.2.6 K thut khui nhi thuc kt ni (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA) 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 u 28 t s dng 28 2.3.Trang thit b 28 u 29 t ADN 29 t ADN t i vi[54] 29 t ADN t ch y 30 nh n ADN tng s 30 t bing g 31 2.4.2.1.Phn t bi 31 2.4.2.2.Phn ng C-t bin HbCS, HbQS 33 34 c 34 34 2.4.4 Phn ng PCR khu gene HBA1, HBA2 36 2.4.5 Tinh sch sn phm PCR 37 2.4.6 PCR m 37 2.4.7.Tinh sch bng BigDye X 39 2.4.8 gene 39 nh c hiu ca k thut Multiplex Gap- 39 2.5.V c ngh nghip 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 thut s d t bin gen globin 41 3.2 Kt qu t bin gen 44 3.2.1 Kt qu t bin mng gp bng k thut Multiplex Gap- -ARMS PCR 44 3.2.2 Kt qu t bim him gp dng mn bng k thut gii 47 3.2.2.t bi2 47 t bim c.92 G2 48 t bim c.426 AT(p.Ter142Tyr)- Hb Paks2 50 t bim c.81GT(p.Glu27Asp)- 1 51 3.2.3 Tng hp kt qu v t l t bia b 52 3.3 Kt qu ch c sinh 54 i chiu kt qu chc sinh 56 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt / -/ Ý nghĩa gen hong D hp t +-thal, i mang gen +-thalassemia (Silent Carrier) / D hp t 0-thal, i mang gen 0-thalassemia (Cis) ( thalassemia trait) -/- ng hp t +-thal, i mang gen 0-thalassemia (Trans)( thalassemia trait) -3.7 t bin mn gen lch phi 3.7kb -4.2 t bin mn gen l SEA t bin mn gen dng South East Asia -HbCS t bim Hb Constant Spring (TAA>CAA) -HbQS t bim Hb Quong Sze (CTG>CCG) -c.2delT t bim ATG>A-G codon ATG gen 2 -c.92 G>A t bim AGG>AAG codon 31 gen 2 -c.426 A>T t bim TAA>TAT, Hb Pakse -c.81G>T t bin m GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan (22) Hemoglobin A (22) Hemoglobin A2 22) Hemoglobin Gower1 (22) Hemoglobin Gower2 22 ) Hemoglobin Porland (22) 4 Hemoglobin F Hemoglobin H 4 C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation SystemPolymerase Chain Reaction CO Carbon dioxide CO Carbon monoxide GAP-PCR GAP Polymerase Chain Reaction (PCR kho) Hb Hemoglobin HGB (g/dL) Khng hemoglobin (g/dL) HCT (%) Hematocrit (%) HPFH Hereditary persistence of fetal hemoglobin, Hi chng tn t sc t n HPLC High Performance Liquid Chromatography MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, th ng cu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, s ng hemoglobin trung ng cu (pg) O2 Oxygen PCR Polymerase Chain Reaction RBC (1012/L) Red Blood Cells, s ng hng cu TIF Thalassemia International Foundation, Hip hi Thalassemia quc t WHO World Health Organization, T chc y t th gii DANH MỤC HÌNH cu t Hemoglobin 14 n chuyn oxy c Hemoglobin 15 hui globin 16 i ch 20 20 -R c .21 22 n di Hemoglobin bng k thut HPLC 23 t bin globinh Hemoblobin H .29 a k thut GAP-PCR 31 a k thut C- ARMS-PCR 33 n di sn phm Multiplex GAP- n di sn phm CARMS-PCR cho 20 mt bin gen globin .41 n di sn phm PCR ca:(A) K thut Mutiplex GAP-PCR, (B) K thut C-ARMS-PCR ca 20 mt bin gen globin 42 n di sn phm PCR ct bin mng g globin cng k thut Multiplex GAP PCR .44 n di sn phm PCR ct bin -HbCS -HbQS bng k thut C-ARMS- PCR .45 t qu gi gen t bi m c.2delT (p.Met1Argfs) 48 t qu gi gen t bi m c.92G>A (p.Arg31Lys) .49 t qu gi gen t bi m c.426A>T (p.Term142Tyr) 50 t qu gi gen t bi m c.81G>T (p.Glu27Asp) .52 n di ch c sinh b ng k thut Multiplex GAP PCR 54 n di chc sinh bng k thut CARMS PCR .55 ng rn thu thp t thai b c 57