Nghiên ứu xây dựng bộ phương pháp xét nghiệm sinh họ phân tử để phát hiện đột biến gen f8 gây bệnh hemophilia a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A NGÔ THU HẰNG Thuhangngo15@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Quang Hịa TS Dương Quốc Chính Viện: Chữ ký GVHD Chữ ký GVHD Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 10/2020 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132203471000000 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Ngô Thu Hằng Đề tài luận văn: Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190018 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày… .………… với nội dung sau: Bổ sung danh mục chữ viết tắt Sửa lỗi tả Bổ sung phương pháp hướng điều trị bệnh Hemophilia A Đưa hình ảnh minh họa phân tích kết giải trình tự gen F8 vào phần phụ lục Thêm trích dẫn tài liệu tham khảo Bàn luận kỹ mục tiêu Bổ sung danh sách mẫu bệnh nhân sử dụng số liệu thu thập có xác nhận Viện Huyết học - Truyền máu TW Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Giáo viên hướng dẫn Ký ghi rõ họ tên LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiêm cứu phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội TS Dương Quốc Chính, trưởng Khoa Di truyền – Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị đồng nghiệp Khoa Di truyền – Sinh học phân tử, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Bệnh Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X, dẫn đến giảm nồng độ hoạt tính yếu tố VIII máu Người mẹ mang gen bệnh có khả truyền bệnh cho 50% trai họ lần sinh Do vậy, thực tế gặp chủ yếu bệnh nhân nam Tỉ lệ mắc Hemophilia A 1: 5000 – 1: 10 000 bé trai [1] Việt Nam nước có tỉ lệ mắc Hemophilia A cao, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 25-60/1 000 000 người Triệu chứng lâm sàng thông thường tượng chảy máu kéo dài khớp cổ tay, cổ chân, chảy máu da, chảy máu nội tạng khó cầm máu Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (F8) nằm vị trí Xq28 NST giới tính X Gen F8 gen lớn hệ gen người, có kích thước 186 kb, gồm 25 intron 26 exon, mã hóa cho tiền protein 2351 axit amin [2] Theo thống kê đến năm 22/6/2020 CDC, có 3700 đột biến gây bệnh Hemophilia A công bố [3] Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A trải rộng bao gồm: đột biến đảo đoạn intron 22, đảo đoạn intron 1, đột biến điểm, đột biến đoạn, đột biến lặp đoạn… Việc phát xác dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A có ý nghĩa việc lựa chọn phương pháp điều trị việc chẩn đoán trước sinh để ngăn ngừa giảm tình trạng sinh mắc bệnh, hạn chế tỉ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng Do gen F8 gen dài hệ gen người đột biến gen F8 đa dạng phức tạp, vậy, để phát dạng đột biến gen F8 cần phải sử dụng kỹ thuật khác cho dạng đột biến cụ thể Đối với đột biến đảo đoạn, phương pháp sử dụng PCR Để phát đột biến điểm, phương pháp coi chìa khóa vàng sử dụng giải trình tự gen Sanger Bên cạnh đó, phương pháp MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn Vì lí nhu cầu thực tế trên, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A” Mục tiêu nghiên cứu nhằm: (1) phát triển phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử bao gồm: PCR, giải trình tự gen Sanger MLPA để phát đột biến gây bệnh Hemophilia (2) Đánh giá mối tương quan đặc điểm kiểu đột biến mức độ bệnh Nghiên cứu thực 100 mẫu máu ngoại vi bệnh nhân hemophilia A, với xét nghiệm ban đầu phát đột biến đảo đoạn intron 22, âm tính, thực xét nghiệm phát đột biến đảo đoạn intron Nếu mẫu bệnh nhân tiếp tục cho kết âm tính, thực giải trình tự gen Sanger để phát đột biến điểm đột biến đoạn nhỏ Nếu không phát đột biến, sử dụng kỹ thuật MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật bao gồm: quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 phương pháp RT-PCR; xây dựng quy trình giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger Ứng dụng quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật LD-PCR RT-PCR, quy trình phát đột biến đảo đoạn intron kỹ thuật Multiplex-PCR, quy trình phát đột biến điểm giải trình tự gen Sanger, quy trình phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn kỹ thuật MLPA để phát đột biến 100 mẫu bệnh nhân nghiên cứu nhằm đưa mối tương quan đột biến mức độ bệnh đặc điểm đột biến gen F8 Trong 100 bệnh nhân nghiên cứu, có 82 bệnh nhân mức độ nặng gồm 48.78% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4.88% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 1, đột biến điểm chiếm 34,15%, đột biến đoạn chiếm 10,98%, đột biến lặp đoạn lớn chiếm 1.22% Trong 11 bệnh nhân mức độ trung bình, 90.91% bệnh nhân măng đột biến điểm, 9.09% bệnh nhân mang đột biến đoạn nhỏ Còn lại 100% bệnh nhân mức độ nhẹ mang đột biến điểm Nghiên cứu phát 16 đột biến chưa công bố sở liệu EAHAD (Châu Âu) CHAMPS (CDC, Mỹ), phát 14/100 bệnh nhân có xuất kháng thể ức chế yếu tố VIII HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Hemophilia A 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Lịch sử bệnh Hemophilia A 1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng phân loại mức độ bệnh 1.1.5 Điều trị 1.2 Cơ sở di truyền yếu tố VIII 1.2.1 Con đường đông máu vai trò yếu tố VIII 1.2.2 Đặc điểm sinh học yếu tố VIII 1.2.3 Cấu trúc gen F8 1.2.4 Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh Hemophilia A 11 1.3.1 Chẩn đoán xác định 11 1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố 13 1.3.3 Chẩn đoán phân biệt 13 1.3.4 Phát đột biến gen F8 kỹ thuật sinh học phân tử 14 1.4 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A 20 1.2.5 Nghiên cứu Thế giới 20 1.2.6 Nghiên cứu Việt Nam 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng: 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 i 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 Tối ưu quy trình kỹ thuật phát đột biến 44 3.1.1 Tối ưu quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT-PCR 44 3.1.2 Tối ưu quy trình khuếch đại 26 exon gen F8 nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger 46 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng kỹ thuật tinh sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự 49 3.2 Đánh giá hiệu phát đột biến kỹ thuật PCR, giải trình tự gen Sanger MLPA 51 3.2.1 Phát đột biến đảo đoạn intron 22 51 3.2.2 Phát đột biến đảo đoạn intron 51 3.2.3 Phát đột biến phương pháp giải trình tự gen Sanger 52 3.2.4 Phát đột biến sử dụng kỹ thuật MLPA 54 3.2.5 Hiệu phát đột biến phương pháp PCR, Sanger sequencing MLPA 57 3.3 Đánh giá mối tương quan dạng đột biến gen F8 với mức độ bệnh hemophilia A đặc điểm đột biến gen F8 58 3.3.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu (giới tính) 58 3.3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo mức bệnh (Nặng, Trung bình, Nhẹ) 59 3.3.3 Tương quan kiểu đột biến mức độ bệnh 59 3.3.4 Thống kê đột biến chưa công bố sở liệu (EAHAD CHAMP) 61 3.3.5 Phân bố đột biến điểm đoạn nhỏ exon/ intron 62 3.3.6 Tỷ lệ bệnh nhân xuất kháng thể kháng yếu tố VIII loại đột biến 63 ii CHƯƠNG KẾT LUẬN 65 1.1 Kết luận 65 1.2 Hướng phát triển đồ án tương lai 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 70 iii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Các giai đoạn q trình đơng máu Hình 1.2 Sơ đồ đơng máu theo đường nội sinh ngoại sinh Hình 1.3 Cấu trúc gen yếu tố đơng máu FVIII [2][8][12] Hình 1.4 Cấu trúc gen F8A F8B Hình 1.5 Đột biến đảo đoạn intron 22 [2] Hình 1.6 Đột biến đảo đoạn intron [2] 10 Hình 1.7 Sơ đồ di truyền bệnh Hemophilia A 11 Hình 1.8 Phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật Southern Blot 15 Hình 1.9 Sơ đồ vị trí mồi chiều dài sản phẩm LD-PCR 16 Hình 1.10 Sơ đồ vị trí mồi chiều dài sản phẩm phản ứng PCR phát đột biến đảo đoạn intron 17 Hình 1.11 Nguyên lý kĩ thuật I-PCR 18 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 27 Hình 2.2 Phác đồ chẩn đốn phân tử bệnh hemophilia A 28 Hình 2.3 Nguyên lý tinh ExoSap-IT 36 Hình 2.4 Nguyên lý tinh hạt từ 37 Hình 2.5 Cấu trúc ddNTPs gắn huỳnh quang 38 Hình 2.6 Các bước phương pháp MLPA 41 Hình 3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 44 Hình 3.2 Tối ưu số chu kỳ nhiệt 45 Hình 3.3 Giới hạn phát phản ứng RT-PCR 45 Hình 3.4 So sánh kết phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT-PCR (mẫu RNA) kỹ thuật LD-PCR (mẫu DNA) 46 Hình 3.5 Kết sản phẩm khuếch đại 26 exon với điều kiện Bảng 3.1 47 Hình 3.6 Kết phản ứng PCR khuếch đại 26 exon với điều kiện ta=58oC, 35 chu kỳ 48 iv