Nghiên ứu xây dựng bộ phương pháp xét nghiệm sinh họ phân tử để phát hiện đột biến gen f8 gây bệnh hemophilia a

Bên cạnh đó, phương pháp MLPA đểphát hiện các đột biến mất đoạn và lặp đoạn.. Vì nh ng lí do và nhu c u thữ ầ ực tế trên, chúng tôi th c hiự ện đề tài “Nghiên cứu xây dựng bộ phương pháp

HÀ N I, 10/2020 Ộ

Chữ ký c a GVHD ủ

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132203471000000

C NG HÒA XÃ HỘ ỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độ ậ c l p – T – H ự do ạ nh phúc

B N XÁC NH N CH NH S A LU Ả Ậ Ỉ Ử ẬN VĂN THẠC SĨ

H và tên tác gi lu ọ ả ận văn : Ngô Thu H ằ ng

Đề tài luận văn: Nghiên cứu xây d ng b ự ộ phương pháp xét nghi m sinh h c phân t phát hiệ ọ ử để ện đột bi n gen F8 gây b nh Hemophilia A ế ệ

Chuyên ngành: Công ngh sinh h cệ ọ

Mã s ố SV: CA190018

Tác giả, Người hướng d n khoa h c và Hẫ ọ ội đồng ch m luấ ận văn xác nh n tác giậ ả đã sửa chữa, b sung luổ ận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày… ………… với các nội dung sau:

1 B sung danh m ổ ục chữ ế ắ vi t t t

2 S ửa lỗi chính t ả

3 B ổ sung phương pháp và hướng điề ị ệu tr b nh Hemophilia A

4 Đưa hình ảnh minh họa phân tích kết quả ải trình tự gi gen F8 vào phần

ph l c ụ ụ

5 Thêm trích d n tài li u tham kh o ẫ ệ ả

6 Bàn lu n k ậ ỹ hơn về ụ m c tiêu 2

7 B ổ sung danh sách mẫu bệnh nhân được sử ụng số ệu thu thậ có xác d li p

nh n c a Vi n Huy t h c - Truy n máu TW ậ ủ ệ ế ọ ề

Ngày tháng năm

CH T CH H Ủ Ị ỘI ĐỒ NG

L I C Ờ ẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn sâu sắ ới TS Lê Quang Hòa, trưởc t ng phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiêm c và phát tri n Công nghứu ể ệSinh h c, vi n Công ngh Sinh h c và Côngọ ệ ệ ọ ngh Thệ ực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội và TS Dương Quốc Chính, trưởng Khoa Di truy n – ề Sinh học phân t , Vi n Huyử ệ ết học – Truyền máu Trung ương đã tận tình chỉ ảo và hướ b ng

d n tôi trong su t quá trình nghiên c u và hoàn thành luẫ ố ứ ận văn

Tôi cũng xin chân thành c m ơn các th y, cô trong viả ầ ện đã nhiệt tình gi ng ả

dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên c u ứ

Qua đây, tôi cũng xin ử ờ ảg i l i c m ơn chân thành nhấ ớt t i các anh ch ng ị đồnghiệp tại Khoa Di truyền – Sinh học phân tử, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương đã tạo điều ki n và ệ giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên c u và h c t p ứ ọ ậ

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên giúp đỡ ạo điề, t u kiện để tôi hoàn thành luận văn

TÓM T T N I DUNG LU Ắ Ộ ẬN VĂN

Bệnh Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên ế ới tính, gen bệnh nằk t gi m trên nhiễm sắc thể X, dẫn đến gi m nả ồng độ hoạt tính yếu tố VIII trong máu Người m mang gen b nh có kh ẹ ệ ả năng truyền b nh cho 50% con trai c a h ệ ủ ọ ở

mỗi lần sinh o vậ , trên thực tế chúng ta gặ chủ ếu bệnh nhân là nam Tỉ ệ D y p y l

mắc Hemophilia A là 1: 5000 – 1: 10 000 bé trai [1] Việt Nam là một nước có tỉ

l mệ ắc Hemophilia A cao, tỷ ệ ắc bệnh khoảng 25 l m -60/1 000 000 người Triệu chứng lâm sàng thông thường là hiện tượng ch y máu kéo dài các khớ ổả ở p c tay,

c chân, chổ ảy máu dưới da, ch y máu n i t ng và khó c m máu ả ộ ạ ầ

Gen quy định t ng h p y u t VIII ( ) nổ ợ ế ố F8 ằ ở ịm v trí Xq28 trên NST gi i ớtính X Gen F8 là m t trong nh ng gen l n nh trong hộ ữ ớ ất ệ gen người, có kích thước 186 kb, g m 25 intron và 26 exon, mã hóa cho tiồ ền protein 2351 axit amin [2] Theo thống kê đến năm 22/6/2020 ủa CDC, có hơn 3700 đột biến gây bệ c nh Hemophilia A được công b [3] Các dố ạng đột bi n gây b nh Hemophilia A tr i ế ệ ả

rộng bao gồ : đột biế ảo đoạm n đ n intron 22, đảo đoạn intron 1, đột biến điểm, đột

biến mất đoạ , đột biến lặp đoạ … Việc phát hiện chính xác các dạng đột biến n ngây bệnh Hemophilia A có ý nghĩa trong việc lựa chọn phương pháp điều trịcũng như trong việc chẩn đoán trước sinh để ngăn ngừa và gi m tình tr ng sinh ả ạcon mắc bệnh, h n ch t l mạ ế ỉ ệ ắc bệnh chung cho cộng đồng

Do gen F8 là m t trong nh ng gen r t dài trong hộ ữ ấ ệ gen người và đột biến gen F8 rất đa dạng và ph c t p, chính vì vứ ạ ậy, để phát hi n các dệ ạng đột bi n gen ếF8 cần phải sử ụng các kỹ d thuật khác nhau cho từng dạng đột biến cụ ể Đố th i

với đột biế ảo đoạn, phương pháp đượn đ c sử ụng là PCR Để phát hiện đột biến dđiểm, phương pháp được coi là chìa khóa vàng được s d ng là gi i trình t gen ử ụ ả ựSanger Bên cạnh đó, phương pháp MLPA đểphát hiện các đột biến mất đoạn và

lặp đoạn

Vì nh ng lí do và nhu c u thữ ầ ực tế trên, chúng tôi th c hiự ện đề tài

“Nghiên cứu xây dựng bộ phương pháp xét nghiệ m sinh học phân tử để phát hiện đột bi n gen F8 gây b nh Hemophilia A”ế ệ

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằ : (1)m phát tri n ể các phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử bao gồm: PCR, giải trình tự gen Sanger và MLPA để

phát hiện đột bi n gây b nh Hemophilia.ế ệ (2) Đánh giá mối tương quan giữ ặa đ c điểm kiểu đột bi n và mế ức độ ệ b nh

Nghiên cứu được th c hi n trên 100 m u máu ự ệ ẫ ngoại vi của bệnh nhân hemophilia A, i xét nghivớ ệm ban đầu là phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22,

nếu âm tính, thực hiện xét nghiệm phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1 Nếu ẫm u

bệnh nhân tiếp tục cho kết quả âm tính, thực hiện giải trình tự gen Sanger để phát

hiện đột biến điểm và đột biến mất đoạn nhỏ ếu không phát hiện đột biến, sử N

d ng k thuụ ỹ ật MLPA để phát hiện các đột bi n mế ất đoạn và lặp đoạn lớn

Nghiên cứu đã xây dựng được các quy trình k thuỹ ật bao gồm: quy trìnhphát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng phương pháp RT-PCR; đã xây dựng được quy trình gi i trình t gen F8 b ng k thu t Sanger ng dả ự ằ ỹ ậ Ứ ụng được quy trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ thuật LD PCR và RT- -PCR, quy trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1 ng k bằ ỹ thu t Multiplex-ậ PCR, quy trình phát hiện đột biến điểm bằng gi i trình t gen Sanger, quy trình phát hiả ự ện

đột bi n mế ất đoạn và lặp đoạn l n b ng k thuớ ằ ỹ ật MLPA để phát hiện đột bi n ếtrên 100 m u b nh nhân nghiên cẫ ệ ứu nh m đưa ra mối tương quan giữ ộ ếằ a đ t bi n

và mức độ bệnh cũng như đặc điểm đột biến gen F8 Trong 100 bệnh nhân nghiên c u, có 82 b nh nhân mứ ệ ức độ ặ n ng gồm 48.78% bệnh nhân mang đột

biến đảo đoạn intron 22, 4.88% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 1, đột

biến điểm chiếm 34,15%, đột bi n mế ất đoạn chiếm 10,98%, đột biến lặp đoạn lớn chiếm 1.22% Trong 11 bệnh nhân mứ ộc đ trung bình, 90.91% bệnh nhân măng

đột biến điểm, 9.09% bệnh nhân mang đột bi n mế ất đoạn nh Còn l i 100% ỏ ạ

bệnh nhân mứ ộc đ nh ẹ mang đột biến điểm Nghiên cứu phát hiện được 1 độ6 t

biến chưa được công bố trên cơ sở ữ ệu EAHAD (Châu Âu) và CHAMPS d li(CDC, Mỹ), phát hiện 14/100 bệnh nhân có xuất hiện kháng thể ức chế ếu tố yVIII

H C VIÊN Ọ

Ký và ghi rõ họ tên

M C L C Ụ Ụ

CHƯƠNG 1 TỔ NG QUAN 1

1.1 B nh Hemophilia A 1 ệ 1.1.1 Định nghĩa 1

1.1.2 L ch s b nh Hemophilia A 1ị ử ệ 1.1.3 D ch t hị ễ ọc bệnh Hemophilia A 2

1.1.4 Tri u ch ng lâm sàng và phân loệ ứ ại mức độ ệ b nh 2

1.1.5 Điều tr 3ị 1.2 Cơ sở di truy ề n yếu tố VIII 3

1.2.1 Con đường đông máu và vai trò của yế ốu t VIII 3

1.2.2 Đặc điểm sinh học yếu tố VIII 5

1.2.3 C u trúc gen F8 6ấ 1.2.4 Các dạng độ ến gây bệt bi nh Hemophilia A 8

1.3 Các phương pháp chẩ n đoán b ệ nh Hemophilia A 11

1.3.1 Chẩn đoán xác định 11

1.3.2 Chẩn đoán mức độ ệ b nh Hemophilia A theo nồng độ ế y u tố 13

1.3.3 Chẩn đoán phân biệt 13

1.3.4 Phát hiện đột biến gen F8 bằng k thu t sinh h c phân t 14ỹ ậ ọ ử 1.4 Tình hình nghiên cứu các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiệ n đ ộ t biế n gen F8 gây b nh Hemophilia A 20 ệ 1.2.5 Nghiên c u trên Th gi i 20ứ ế ớ 1.2.6 Nghiên c u tứ ại Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 25

2.1 Đối tượ ng: 25

2.2 Phương pháp nghiên cứ u 25

2.1.1 V t li u nghiên c u 25ậ ệ ứ2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3 KẾ T QU VÀ BÀN LU N 44 Ả Ậ 3.1 T ối ưu quy trình kỹ thuậ t phát hi ệ n đ ộ t biế n 44

3.1.1 Tối ưu quy trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹthu t RT-PCR 44ậ

3.1.2 Tối ưu quy trình khuếch đại 26 exon của gen F8 nhằm mục đích

gi i trình t gen Sanger 46ả ự3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của các kỹ thuật tinh sạch sản phẩ PCR m

nh m mằ ục đích giải trình t 49ự

3.2 Đánh giá hiệ u quả phát hiệ ộ n đ t biến bằng kỹ thuật PCR, giải trình

t gen Sanger và MLPA 51 ự

3.2.1 Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 513.2.2 Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1 513.2.3 Phát hiện đột biến bằng phương pháp gi i trình t gen Sanger 52ả ự3.2.4 Phát hiện đột biến sử ụ d ng k thu t MLPA 54ỹ ậ3.2.5 Hiệu quả phát hiện đột biến của phương pháp PCR, Sanger sequencing và MLPA 57

3.3 Đánh giá mối tương quan giữ a các dạ ng đ ộ t biến gen F8 với mứ ộ c đ

b ệnh hemophilia A và đặ c đi ểm độ t biế n gen F8 58

3.3.1 Đặc điểm nhóm b nh nhân nghiên c u (gi i tính) 58ệ ứ ớ3.3.2 T l bỷ ệ ệnh nhân theo mức bệnh (N ng, Trung bình, Nh ) 59ặ ẹ3.3.3 Tương quan giữa kiểu đột bi n và mế ức độ ệ b nh 593.3.4 Thống kê đột biến chưa được công bố trên cơ sở ữ ệu d li(EAHAD và CHAMP) 61 3.3.5 Phân b t biố độ ến điểm và mất đoạn nh trên các exon/ intron 62ỏ3.3.6 T l bỷ ệ ệnh nhân xuất hiện kháng thể kháng yếu tố VIII trong

m i loỗ ại đột bi n 63ế

CHƯƠNG 4 KẾ T LU N 65 Ậ 1.1 K t lu n 65 ế ậ 1.2 Hướ ng phát tri ể n của đồ án trong tương lai 65 TÀI LI U THAM KH O 66 Ệ Ả

PH L C 70 Ụ Ụ

DANH M C HÌNH V Ụ Ẽ

Hình 1.1 Các giai đoạn chính của quá trình đông máu 4Hình 1.2 Sơ đồ đông máu theo con đường nội sinh và ngo i sinh 5ạHình 1.3 C u trúc gen và y u t ấ ế ố đông máu FVIII [2][8][12] 7Hình 1.4 C u trúc gen F8A và F8B 8ấHình 1.5 Độ ến đảo đoạt bi n intron 22 [2] 9Hình 1.6 Độ ến đảo đoạt bi n intron 1 [2] 10Hình 1.7 Sơ đồ di truy n b nh Hemophilia A 11ề ệHình 1.8 Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 b ng k thu t Southern Blot 15ằ ỹ ậHình 1.9 Sơ đồ ị trí mồ v i và chi u dài s n ph m LD-PCR 16ề ả ẩHình 1.10 Sơ đồ ị v trí m i và chi u dài s n ph m ph n ng PCR phát hiồ ề ả ẩ ả ứ ện đột

biến đảo đoạn intron 1 17Hình 1.11 Nguyên lý kĩ thuật I-PCR 18 Hình 2.1 Sơ đồ thi t k nghiên c u 27 ế ế ứHình 2.2 Phác đồ chẩn đoán phân tử ệ b nh hemophilia A 28 Hình 2.3 Nguyên lý tinh s ch b ng ExoSap- 36ạ ằ ITHình 2.4 Nguyên lý tinh s ch b ng h t t 37ạ ằ ạ ừHình 2.5 C u trúc ddNTPs g n hu nh quang 38ấ ắ ỳHình 2.6 Các bước của phương pháp MLPA 41 Hình 3.1 T ối ưu nhiệt độ ắ g n m 44ồi.Hình 3.2 Tối ưu số chu k nhi t 45ỳ ệHình 3.3 Gi i h n phát hi n c ớ ạ ệ ủa phả ứn ng RT-PCR 45Hình 3.4 So sánh kết quả phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 b ng kằ ỹ thu t ậRT-PCR (m u RNA) và k thu t LD-PCR (m u DNA) 46ẫ ỹ ậ ẫHình 3.5 K t qu sế ả ản phẩm khuếch đại 26 exon với điều ki n troệ ng Bảng 3.1 47Hình 3.6 K t quế ả ph n ả ứng PCR khuếch đại 26 exon với điều ki n ta=58ệ oC, 35 chu k 48ỳ

Hình 3.7 K t quế ả khắc ph c hiụ ện tượng băng phụ trong ph n ả ứng PCR khuếch

đại 26 exon c a gen F8 48 ủHình 3.8 Hình ảnh điện di s n ph m PCR sau khi tả ẩ ối ưu hóa 49Hình 3.9 Kết quả ả gi i trình tự ả s n phẩm PCR được tinh s ch bạ ằng phương pháp ExoSAP- 50ITHình 3.10 K t quế ả ả gi i trình tự ả s n phẩm PCR được tinh s ch bạ ằng phương pháp

h t t (Pronex) 50ạ ừHình 3.11 Kết quả điện di s n ph m Multiplex PCR phát hiả ẩ ện đột biến đảo đoạn intron 1 51 Hình 3.12 Hình nh phân tích khả ả năng gây bệnh c a đủ ột biến sử ụ d ng công cụpolyphen-2 vớ ẫ ệi m u b nh nhân H37 53Hình 3.13 Hình nh phân tích khả ả năng gây bệnh của đột biến sử ụ d ng công cụpolyphen-2 vớ ẫ ệi m u b nh nhân H83 53Hình 3.14 K t qu ế ả MLPA đố ới v i mẫu người bình thường giới tính nam 54Hình 3.15 K t qu phát hiế ả ện đột bi n lế ặp đoạn từ exon 4 đến exon 8 của bệnh nhân H10 54 Hình 3.22 S n phả ẩm điện di khuếch đại 26 exon của bệnh nhân H13 55Hình 3.17 K t qu phát hiế ả ện đột bi n gen mế ất đoạ ớ ừn l n t exon 7 -9 trên gen F8

của bệnh nhân H13 55Hình 3.18 K t qu phát hiế ả ện đột bi n gen mế ất đoạ ớ ừn l n t exon 26 trên gen F8

của bệnh nhân H22 56Hình 3.19 K t qu phát hiế ả ện đột bi n gen mế ất đoạ ừn t exon 23 25 trên gen F8 -

của bệnh nhân H55 56Hình 3.26 Hi u quệ ả phối hợp các phương pháp phát hiện đột bi n gen F8 bế ằng

k thu t PCR, Sanger sequencing và MLPA 57ỹ ậ

B ng 2.7 Trình t m i trong ph n ng PCR khuả ự ồ ả ứ ếch đại 26 exon trên gen F8 34

B ng 2.8 Chu trình nhi t c a ph n ng PCR khuả ệ ủ ả ứ ếch đại 26 exon trên gen F8 35

B ng 2.9 Thành ph n ph n ng PCR v i mả ầ ả ứ ớ ồi giải trình t 38ự

B nả g 2.10 Chương trình PCR với mồi giải trình t 39ự

B ng 2.11 Chu trình nhi t c a ph n ng PCR trong phuwogn pháp MLPA 42ả ệ ủ ả ứ

Bảng 2.12 Giá ị tr cut-off của tỷ ệ DQ trong phân tích kết quả đối với mẫu giớ l i tính nam trong phương pháp MLPA 43

Bảng 2.13 Giá trị cut-off của tỷ ệ DQ trong phân tích kết quả đối với mẫu giớ l i tính n tronữ g phương pháp MLPA 43

Bảng 3.1 Điều kiện ban đầu của phả ứn ng PCR khuếch đại 26 exon c a gen F8 47ủ

Bảng 3.2 Đặc điểm nhóm b nh nhân nghiên c u 58ệ ứ

B ng 3.3 T l b nh nhân theo mả ỷ ệ ệ ức độ ệ b nh 59

Bảng 3.4 Tương quan giữa kiểu đột bi n và mế ức độ độ t bi n 59ế

Bảng 3.5 Thống kê đột biến chưa được công bố trên cơ sở ữ ệu (EAHAD và d liCHAMP) 61

Bảng 3.7 Bảng phân bố đột biến điểm và mất đoạn nhỏ trên các exon/intron (theo

t l xu t hi n) 62ỷ ệ ấ ệ

B ng 3.8 T l b nh nhân xu t hiả ỷ ệ ệ ấ ện chấ ức chết 63

Haemophilia and Allied Disorders

Amplification

1

CHƯƠNG 1 Ổ T NG QUAN 1.1 B nh Hemophilia A ệ

1.1.1 Định nghĩa

Bệnh Hemophilia (hay bệnh rối loạn đông máu) là bệnh di truyền do thiếu

hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương, bao

gồm: yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, yếu

t ốXI gây bệnh hemophilia C Trong đó, bệnh hemophilia A phổ ến nhất chiế bi m khoảng 80 85%, Hemophilia B chiếm từ- 15-20%, còn Hemophilia C chiếm tỉ ệ l

r t ít, ch y u ph biấ ủ ế ổ ến ở người Do Thái [4]

Bệnh Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên ết vớ ới tính, gen bệk i gi nh

n m trên nhi m sằ ễ ắc thể X, dẫn đến gi m nả ồng độ ho t tính y u t VIII trong máu ạ ế ố

1.1.2 Lịch sử bệnh Hemophili a A

Bệnh máu khó đông được biết ngay từ ời kì cổ đại, trong các văn tự ổ th c

của người Do Thái, từ ế ỷ ứ II trước công nguyên, Tamud đã miêu tả đứa trẻ th k th chết do ch y máu quá nhi u sau khi cả ề ắt bao quy đầu Tuy nhiên, báo cáo y t u ế đầtiên v phát hiề ện đột bi n gây b nh Hemophilia A ế ệ ở Nam Phi vào năm 1803 bởi Otto, trong đó ông mô tả ột gia đình có cùng triệ m u ch ng kéo dài ba th h ứ ế ệ

Mặc dù chưa được biết đến cụ ể, nhưng bệnh rối loạn đông máu cũng thđược ghi chép là căn bệnh Hoàng gia vì n ữ hoàng Anh Victoria (1837-1901) mang gen b nh này, ệ ảnh hưởng đến các gia đình hoàng gia Anh, Đức, Nga và Tây Ban Nha trong th k XIX và XX [5] ế ỷ

nh Đến năm 1872, William Leg mô tả chi tiết về đặc điểm lâm sàng bệHemophilia Ngay sau đó, là hàng loạt các nghiên c u có ứ ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị như xác định thi u hế ụt yế ố VIII là nguyên nhân u tgây b nh Hemophilia ệ năm 1937 Đến năm 1944, Pavlosky nghiên cứ ởu Buenos Aires cho th y máu cấ ủa mộ ệt b nh nhân Hemophillia A có thể điều trị triệu chứng

rối loạn đông máu của bệnh nhân Hemophillia khác và ngược lại, khi tình cờ ông

gặp hai bệnh nhân bị ếu hụt hai protein khác nhau ếu tố VIII và yếu tố thi - y IX Năm 1952, ếY u t ố IX được xác định, phân bi t 2 lo i Hemophillia A và B Sau ệ ạ

đó, bệnh Hemophilia được phân bi t v i bệ ớ ệnh von Willebrand năm 1971 Từ

2

năm 1982-1984, gen mã hóa y u t ế ố VIII được xác định và gi i trình tả ự, đóng vai trò vô cùng quan trọng cho các phương pháp phát hiện đột bi n bế ằng kĩ thuật sinh h c phân t hiọ ử ện nay

1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A

Theo ước tính của Liên đoàn Hemophilia Thế gi i, s ớ ố người m c b nh ắ ệHemophilia trên thế giới khoảng 400,000 người năm 2010 Trong đó, còn tới 75% chưa được chẩn đoán và điều tr ị đầy đủ [4] T i Vi t Nam, có kho ng 6000 ạ ệ ảngườ ịi b Hemophilia [6]

Hemophilia A là b nh di truy n lệ ề ặn do đó gặp chủ ế ở y u nam giới, còn

ph n ụ ữ là người mang gen Người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do v y chậ ủ ế y u b nh nhân là nam Tệ ỉ ệ l m c ắHemophilia A là 1:5000 – 1:10000 bé trai [1] Vi t Nam là ệ một nước có tỉ ệ ắ l m c Hemophilia A cao, t l mỷ ệ ắc bệnh khoảng 25 60/1,000,000 ngườ- i

Hiện nay, trên toàn quốc mới có khoảng 2200 người bệnh được phát hiện, chăm sóc thường xuyên và qu n lý, chi m gả ế ần 40% Như vậy, t l ỉ ệ người b nh ệchưa được chẩn đoán và đ ềi u tr v n m c cao T i Trung tâm Hemophillia, ị ẫ ở ứ ạ

Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đang quản lý và điều trị khoảng 1.200 người bệnh, trong đó bệnh Hemophillia A chi m 85%, b nh Hemophillia B ế ệchiếm 13,16% và còn lại là những người bệnh bị các bệnh rối loạn đông máu khác Trung bình m i ngày có tỗ ừ 80 đến 100 người b nh tệ ới điều trị ộ n i và ngoại trú [7]

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng và phân loại mức độ bệnh

Triệu chứng lâm sàng thông thường là hiện tượng chảy máu kéo dài ở các

khớp cổ tay, cổ chân, chảy máu dướ da, chảy máu nội tạng và khó cầm máu.i

Nếu được chẩn đoán sớm và điều trị đầy đủ, người bệnh hoàn toàn có thể có được cu c sộ ống bình thường, ngượ ạc l i, nếu được chẩn đoán muộn h s b các ọ ẽ ị

biến chứng do chảy máu tái phát nhiều lần gây ra, trở thành người tàn tật, thậm chí m t sấ ớm Đối với người phụ ữ n mang gen bệnh, ước tính có kho ng 50% ảtrong s này có nố ồng độ ế y u t VIII thố ấp, có nguy cơ bị chảy máu khó c m sau ầchấn thương, phẫu thu t hoậ ặc sinh đẻ và đặc bi t quan tr ng là có th truy n gen ệ ọ ể ề

b nh cho th h sau [8] ệ ế ệ

3

Nồng độ ế y u tố VIII ở người bình thường là 200 ng/mL ứ ộM c đ bệnh

nặng hay nhẹ ụ ph thuộc vào ồng độ ếu tốn y VIII trong máu Căn cứ vào nồng độ

y u tế ố, người ta chia thành 3 mức độ:

(1) M ứ ộc đ nặng: nồng độ ếu tố VIII < 1% (<1 IU/dl, <0.01 IU/ml), y

bệnh nhân thường có xuất huyết tự nhiên, không liên quan đến chấn thương và thường được phát hi n s m khi tr tệ ớ ẻ ập đi

(2) M ứ ộc đ trung bình: nồng độ ếu tố VIII từ y 1-5%(1-5 IU/dl, 0.01-0.05 IU/ml), bệnh nhân thường bị chảy máu một cách tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ ể, bi u hi n bệ ệnh cũng xuất hi n muệ ộn hơn

(3) M ứ ộc đ nhẹ: nồng độ ếu tố VIII từ y 5-40% (5-40 IU/dl, 0.05-0.40 IU/ml), chảy máu thường ch xu hi n ỉ ất ệ sau chấn thương nặng hoặc sau

ph u thu t [4] [8] ẫ ậ

1.1.5 Điều trị

Mục tiêu chính của việc điều trị ệnh hemophilia A là dự phòng chảy máu b

Nếu bệnh nhân có chảy máu cấp thì cần bổ sung yếu tố đông máu để có thể đạ t được nồng độ để ầ c m ch y máu Tùy thu c vào v trí ch y máu, m c đ ch y ả ộ ị ả ứ ộ ảmáu, mục đích điều trị mà người ta tính toán được liề ế ố đông máu cầu y u t n dùng

1.2 Cơ sở di truy ề n yếu tố VIII

1.2.1 Con đường đông máu và vai trò của yếu tố VIII

Đông máu là một quá trình máu chuy n t th l ng thành th c do s ể ừ ể ỏ ể đặ ựchuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan Các sợi fibrin sẽ trùng hợp với nhau t o ra mạ ạng lưới fibrin giam gi các thành ph n c a máu và máu sữ ầ ủ ẽ đông

l i Cạ ục máu đông hình thành sẽcó tác dụng b t kín ch tị ỗ ổn thương [9]

Quá trình đông máu gồm 5 giai đoạn chính: giai đoạn cầm máu kì đầu, giai đoạn co m ch t i ch , ạ ạ ỗ giai đoạ ạn t o nút ti u cể ầu, giai đoạn đông máu huy t ếtương và tiêu s i huy t v i s tham gia c a 12 y u t ợ ế ớ ự ủ ế ố đông máu:

- Y u t I: Fibrinogen ế ố

- Y u t IIế ố : Prothrombin

- Y u t III: Prothrombin c a mô hoế ố ủ ặc các yếu tố mô

Hình 1.1 Các giai đoạn chính của quá trình đông máu

Giai đoạn cầm máu kì đầu di n ra s co m ch t i ch nh các sễ ự ạ ạ ỗ ờ ợi cơ trơn theo cơ chế ph n x thả ạ ần kinh và cơ chế ể ị th d ch

Sau khi co m ch t i ch , t i v trí thành mạ ạ ỗ ạ ị ạch bị ổn thương, tiể t u cầu dính vào lớp dưới nội mạc qua yếu tố von Willebrand Tại đây, tiểu cầu được hoạt hóa, gi i phóng các chả ất như ADP, serotonin, thromboxan A2… thúc đẩy tiểu

cầu ngưng tập, hình thành các nút tiểu cầu tại vị trí tổn thương, giúp cầm máu

t m th i ạ ờ

Sau khi o nút ti u c tạ ể ầu, quá trình đông máu huyết tương diễn ra, bao gồm

3 giai đoạn nhỏ: Giai đoạn hình thành thromboplastin ho t hóa (ph c h p ạ ứ ợprothrombinase), giai đoạn hình thành thrombin, giai đoạn hình thành fibrin Giai

5

đoạn hình thành thromboplastin ho t hóa (ph c hạ ứ ợp prothrombinase) là giai đoạn

phức tạp, gồm 2 con đường nội sinh và ngoại sinh, sử ụng các yếu tố đông máu dXII, XI, IX, VIII, X, VII, V để ổ t ng hợp prothrombinase Sau đó, prothrombinase chuyển prothrombin thành thrombin với sự tham gia của ion canxi Dưới tác

dụng của thrombin, xảy ra quá tình cắt chọn lọc các fibrinopeptide A và B hình thành các fibrin mon mer Các monomer s trùng h p thành fibrin polymero ẽ ợ Sơ

đồ thác đông máu được mô t ả như trong Hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ đông máu theo con đường n i sinh và ngo i sinhộ ạ

1.2.2 Đặc điểm sinh học yếu tố VIII

Yếu tố VIII là một glycoprotein bao gồm một chuỗi nhẹ có trọng lượng phân t 80 KDa và m t chu i n ng trử ộ ỗ ặ ọng lượng phân tử ừ t 90-200 KDa, được liên kết với nhau bằng cầ ốu n i ion Cu2+ Trình t các axit amin t o ra cự ạ ấu trúc

g m 6 vùng s p x p theo th t A1:A2:B:A3:C1:C2 [8] ồ ắ ế ứ ự

Yếu tố VIII được tổng hợp chủ ế ở gan, một lượng rất nhỏ được tổ y u ng

h p thợ ở ận, tụy, Bình thường, nồng độ ếu tố VIII là 50 200%, thời gian bán y

-hủy từ 12 giờ Đầu tiên, yếu tố VIII được tổng hợp như một chuỗi đơn gồ 8- m

2351 axit amin ở lướ i nội bào, sau đó được chuy n vàoể thể golgi và ở đấ ảy x y ra

m t s ph n ộ ố ả ứng để hình thành phân t dử ạng heterodimer như đã mô tả ở trên

6

Ngay sau khi đượ ổc t ng h p, y u t VIII g n v i y u t von Willebrand ợ ế ố ắ ớ ế ố(vWF), vWF bảo vệ ế ố VIII khỏ ự ạ y u t i s ho t hóa b i y u t ở ế ốXa và sự ấ b t ho t bạ ởi protein C hoạt hóa Bên cạnh đó, yếu tố von Willebrand cũng ngăn cản yếu tốVIII trong việc gắn với phospholipid và ti u c u hoể ầ ạt hóa [2] Thông thường, th i ờgian bán hủy của yếu tố VIII là 8 12 gi- ờ, tuy nhiên, trong trường h p không có ợvWF, th i gian bán hờ ủy c a yế ốủ u t VIII giảm còn ít hơn 2 giờ.[8] [10] Yếu tốVIII tương tác với nhi u lo i protein trong t bào, s ề ạ ế ự tương tác này ảnh hưởng

đến s bi u hi n, ho t tính, tính ự ể ệ ạ ổn định và chức năng của nó Ví d liên quan v ụ ềtính ch t này là sấ ự tương tác của yếu tố VIII v i LMAN1 (lectin, mannoseớ -binding 1) và MCFD2 Cả hai protein này đều có chức năng làm ổn định phức chất trong t bào gan [2] ế

Yếu tố VIII được lưu thông dưới dạng tiền yếu tố không hoạt động và được ho t hóa nh quá trình xúc tác phân gi i b i thrombin ho c y u t Xa b ng ạ ờ ả ở ặ ế ố ằcách cắ ế ốt y u t VIII v trí Arg372 (ch n i A1-A2), Arg 740 (ch n i A2 B) và ở ị ỗ ố ỗ ố -Arg 1689 (chỗ ố n i B-A3) Khi vùng A2 tương tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì y u t VIII thế ố ực sự được ho t hóa Y u t VIIIa và y u t IXa liên k t trên bạ ế ố ế ố ế ề

mặt tiểu cầu hoạt hóa để ạo phức hợp hoạt hóa yếu tố X chức năng Với sự t có

mặt của yếu tố VIIIa, tố ộc đ hoạt hóa yếu tố X bởi yếu tố IXa tăng lên nhiều lần

Nếu yếu tố VIII bị ếu hụt hay bất thường, sự ạo thành cục đông chậm lại bở thi t i thrombin bị ả gi m s n xu t mả ấ ột cách đáng kể, cục máu đông kém bền vững và dễ

b tan [8] [11] ị

1.2.3 Cấu trúc gen F8

Gen quy định t ng h p y u t VIII n m v trí locus 28 thu c ổ ợ ế ố ằ ở ị ộ cánh dàitrên NST gi i tính Xớ (Xq28) Gen F8 là m t trong nh ng gen lộ ữ ớn nhất cơ thể, được tách dòng năm 1982 – 1984, có kích thước 186 kb, g m 25 intron và 26 ồexon, mã hóa cho ti n protein 2,351 axit amin [3] ề Trong đó, 24 exon có kích thướ ừc t 62-262 bp và 2 exon l n nh t là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 ớ ấbp) Hình 1.3

7

Hình 1.3 C u trúc gen và y u t ấ ế ố đông máu FVIII [2][8][12]

a) Gen F8 có kích thước 186 kb, bao gồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thướ ừc t -69 262 bp, exon 14 và exon 26 có kích thướ ần lược l t là 3,106

bp và 1,958 bp; exon 26 ch a trình t 3’UTR, intron 22 ch a 2 gen F8A và ứ ự ứ

F8B b) F8 mRNA có chi u dài kho ng 9kb c) F8 ề ả mRNA được dịch mã

thành tiền protein gồm 2,351 axit amin (267 kDa), sau đó được xử lý bằng thrombin t o protein FVIII d ng kích ho t d) Protein FVIII d ng kích ho t ạ ạ ạ ạ ạ

g m chuồ ỗi nặng (90-210kDa), chu i nh (73kDa) t o phỗ ẹ ạ ức với ion Cu2+ Gen F8 mã hóa protein y u t VIII g m hai chu i n ng và nhế ố ồ ỗ ặ ẹ ố n i với nhau b i ion kim loở ại đồng Cấu trúc của phức hợp này được giữ ổn định nhờ ự s tương tác giữa các liên kết ưa nước và k ị nước v i y u t von Willebrand và ớ ế ố

Ca2+ Chuỗi nặng có đầu N t n, g m các vùng A1ậ ồ - -A2 B, chuỗi nặng có vùng C

tận, gồm các vùng A3-C1-C2 Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và không

có sự tương đồng với bất kì gen nào đã biết Vùng B không cần cho chức năng

của yếu tố VIII nên sau quá trình dịch mã, vùng B bị ắt khỏi chuỗi nặng của yế c u

t VIII ố

Các intron có kích thước đa dạng, t ừ 200 bp đến 325 bp, trong đó 6 intron

có kích thướ ớc l n nh t là intron 1, 6, 13, 14, 22 và 25 Intron 22 là intron có kích ấ

t gen ả F8A có kích thước khoảng 2 kb, F8B có kích thước 2 5 kb Vị trí bắ ầ t đ u

của gen F8A và F8B nằm cách nhau 122 pb Tại vị trí đầu 5’ exon gen F8B của intron 22 có khả năng mã hóa cho 8 axit amin và được nố ới exon 23 đếi v n exon

26 của gen F8 Năm 2001, gen F8A được xác định là bi u hi n mã hóa cho ể ệprotein huntingin có kích thước 40 kDa trong b nh Huntington Tuy nhiên, chệ ức năng của F8B chưa được xác định M c dù quá trình d ch mã c ặ ị ả 2 gen được phát

hiện trong nhiều tế bào nhưng chức năng của 2 gen chưa được hiểu hết Điều đặc

biệt là vị trí của 2 gen tạo nên vùng hot spot – d xễ ảy ra đột biến, cụ ể là độ th t

biến đảo đoạn intron 22 Hình 1.4 [13]

1.2.4 Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A

Khi gen F8 bị đột bi n, t bào gi m hoế ế ả ặc mất khả năng tổng h , tợp ạ ếo y u

t ố VIII không có hoặc giảm hoạt tính, ảnh hưởng đến sự tương tác với yếu tốVon Willerbrand và tương tác vớ ế ố IX cũng như việi y u t c bài ti t y u t VIII ra ế ế ốngo i bào [28] ạ

9

Có r nhiất ề ộu đ t biến gen F8 đã được xác định, phổ ến là đột biến đả bi o đoạn intron 22 gây ra 40-50% ca b nh hemophilia A m c đ nệ ứ ộ ặng và đột bi n ếđảo đoạn intron 1 gây ra 5 7% ca b- ệnh m c đ n ng[14] Nhứ ộ ặ ững trường h p còn ợ

lại mắc bệnh do đột biế điểm (thay thế nucleotide gây đột biến sai nghĩa hoặc n

vô nghĩa), đột bi n mế ất đoạ chèn đoạn, n l n, t bi n lớ độ ế ặp đoạn Tùy thu c vào ộ

kiểu gen và vị trí đột biến trên gen F8 mà gậy ra bệnh với mứ ộc đ nặng nhẹ khác nhau

• Độ ế ảo đoạt bi n đ n

Đảo đoạn intron 22 x y ra do s tái t h p gi a vùng int22h1 (vùng l p l i ả ự ổ ợ ữ ặ ạ

gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao vùng đồng nhất nằm ởtelomere vùng int22h2 int22h3 , (tương đồng đến 99,9%); v trí 400 kb ị ở đầu 5’ ngoài gen F8 dẫn đến tách gen thành hai ph n riêng bi t (exon 1 22 và 23 ầ ệ – – 26) cách nhau 400 kb [2], [12], [15] Đột biến đảo đoạn này dẫn đến đứt gãy gen F8

và h u qu gây bậ ả ệnh m c đ nứ ộ ặng cho bệnh nhân Đột biến này chiếm 40-50%

bệnh nhân hemophilia A ức độ ặm n ng [2], [12]

Hình 1.5 Đột biến đảo đoạn intron 22 [2]

Đảo đoạn intron 1 xảy ra tương tự, do s tái t h p vùng int1h1 thu c ự ổ ợ ộintron 1 (kích thước 900 bp) n m v trí 140 kb u 5’ c a gen F8 v i b n sao ằ ở ị ở đầ ủ ớ ảint1h2 nằm ngoài gen F8 [2], [15] Đột biến này hiếm gặp hơn so với đảo đoạn intron 22

10

Hình 1.6 Đột biến đảo đoạn intron 1 [2]

M c dù không có vai trò quan tr ng trong vi c mã hóa hay tham gia vào ặ ọ ệquá trình ho t hóa yạ ếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây ra các dạng đột biến đảo đoạ ởn các bệnh nhân hemophilia A mức độ

n ng ặ

• Độ ết bi n đi m: ể

Đột biến sai nghĩa là một trong những đột bi n hay g p cho b nh ế ặ ệhemophilia A, có th gây mã hóa t ng h p các protein m ho không chể ổ ợ giả ặc ức năng M c đ b nh ph thu c loứ ộ ệ ụ ộ ại đột bi n và v ế ị trí đột bi n t biế Độ ến vô nghĩa

là k t quế ả ủ c a sự thay th các axit amin thành codon k t thúc, dế ế ẫn đến không

tổng hợp yếu tố VIII Điều đáng chú ý là đột biến điểm gây bệnh Hemophilia A

nằm rải rác trên 26 exon mà không tập trung một vùng hotspot Theo thống kê, khoảng gần 42.5% các đột biến điể ảnh hưởng tới acid amin Arginin, phần lớm n các bệnh mang độ ến này đề ở ức độ ặt bi u m n ng[15]

Trong đó, không chỉ độ t bi n t i exon có vai trò quan tr ng ế ạ ọ mà đột bi n ếđiểm t i v trí c t nạ ị ắ ối intron và exon đã được nhi u tác gi công b ề ả ố liên quan đến

những ca bệnh nặng và trung bình Bên cạnh đó, nhiều đột biến thay thế ả nh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hi n m t s b nh nhân[15] ệ ở ộ ố ệ

• Độ ết bi n m ất đoạ n

Đột bi n mế ất đoạ ớn l n chi m t 2-5% b nh nhân hemophilia A m c đ ế ừ ệ ứ ộ

nặng Cơ chế phân tử ủa dạng đột biế này đã được kết luận là do quá trình tái c n

11

t hổ ợp dẫ ến đ n hiện tượng lặp lại Alu ó khoảng 105 đột biến mất đoạn lớn có Ckích thước lớn hơn 200 bp được liệt kê trong cơ sở ữ ệ d li u HAMSTeRS (Hemophilia A Mutation, Search, Test and Resource Site)

• Các dạng độ ết bi n khác Cũng theo cơ sở ữ ệ d li u trên, có khoảng 59 đột biến chèn đoạn nh Các ỏđoạn nh ỏ có kích thước dưới 200 bp [15] Bên cạnh đó, đột bi n lế ặp đoạ cũng n được nhi u tác gi công b [30] ề ả ố

1.3 Các phương pháp chẩ n đoán b ệ nh Hemophilia A

1.3.1 Chẩn đoán xác định

 Ti n s ề ử gia đình có người mắc bệnh

Chẩn đoán xác định dựa trên tiền sử gia đình có người mắc bệnh thông qua phân tích ph hả ệ Phả ệ là đạ ệ h i di n di truy n cề ủa một gia đình trong đó sơ đồhóa s di truy n cự ề ủa một tính tr ng hoạ ặc một bệnh qua các thế ệ h Hemophilia A

là ví dụ đặc trưng cho bệnh lí di truy n lề ặn, gen quy định y u t VIII n m trên ế ố ằnhiễm sắc thể X và không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y Vì vậy, căn

c ứvào quy luật di truyền của Mendel, dựa vào phả ệ có thể xác định được nam h

giới có khả năng bị ệnh, nam giới bình thường, người phụ ữ chắc chắn mang b n gen và người ph n có kh ụ ữ ả năng mang gen

Hình 1.7 Sơ đồ di truy n b nh Hemophilia A ề ệ

12

Nếu một người đàn ông bị ệnh, lấy một người phụ ữ bình thường thì tấ b n t

c con gái cả ủa họ là người mang gen, còn con trai thì bình thường (Hình 1.7 A)

Nếu một người phụ ữ mang gen lấy một người đàn ông bình thường thì n xác su t cho mấ ỗi lần sinh con của họ là: 25% con trai bình thường, 25% con trai

b b nh, 25% cị ệ on gái bình thường, 25% con gái mang gen b nh (Hình 1.7 B) ệ

Nếu một người phụ ữ mang gen kết hôn với một người đàn ông bị ệ n b nh thì xác suất cho mỗ ầi l n sinh con của họ là: 25% con trai bị ệ b nh, 25% con trai bình thường, 25% con gái b b nh, 25% con gái mang gen b nh (Hình 1.7 C) ị ệ ệ

Người ph n ch c ch n mang gen khi ụ ữ ắ ắ có 1 trong 4 điều ki n sau: ệ

- Có ít nh t hai con trai b b nh ấ ị ệ

- Là con của bệnh nhân hemophilia

- Có 1 con trai bị ệnh và có ít nhấ 1 người đàn ông trong họ ẹ ị b t m b

b nh ệ

- Có 1 con trai bị ệnh và trong gia đình họ ẹ có ít nhất 1 người được b m chẩn đoán là mang gen

Người ph n có kh ụ ữ ả năng mang gen khi có 1 trong 3 điều ki n sau: ệ

- Có 1 con trai bị ệnh và trong gia đình không có ai bị ệnh cũng như b bmang gen b nh ệ

- Có ít nhất 1 người đàn ông trong họ ẹ ị ệ m b b nh và không có con trai b ị

xuất hiện các nốt hoặc các điểm tụ máu Bên cạnh đó, trong các thể ất huyết xu

nhẹ, xuất huyết xảy ra khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng Bệnh Hemophilia A ức m

độ ặng đặc trưng bở n i b m tím và chầ ảy máu thường xuyên tái phát khở ớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay Tuy nhiên, nguy hiểm và khó khăn nhất là ch u máu trong n i t ng, dả ộ ạ ẫn đến các bi n ch ng nghiêm tr ng ế ứ ọ

13

Các xét nghi m c n lâm sàng cệ ậ ần thực hi n: ệ

- Thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1 giờ, chất lượng cục máu đông kém, thời gian Howel kéo dài…

- Định lượng y u t VIII gi m ho c không có ế ố ả ặ

- Y u t ế ố von Willerbrand bình thường

- S ng ti u c ố lượ ể ầu bình thường

1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố

Nồng độ ếu tố y VIII ở người bình thường là 200 ng/mL ứ ộM c đ bệnh

nặng hay nhẹ ụ ph thuộc vào nồng độ ếu tố VIII trong máu Căn cứ vào nồng độ y

y u tế ố, người ta chia thành 3 mức độ:

(4) M ứ ộc đ nặng: nồng độ ếu tố VIII < 1% (<1 IU/dl, <0.01 IU/ml), y

bệnh nhân thường có xuất huyết tự nhiên, không liên quan đến chấn thương và thường được phát hi n s m khi tr tệ ớ ẻ ập đi

(5) M ứ ộc đ trung bình: nồng độ ếu tố VIII từ y 1-5%(1-5 IU/dl, 0.01-0.05 IU/ml), bệnh nhân thường bị chảy máu một cách tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ ể, bi u hi n bệ ệnh cũng xuất hi n muệ ộn hơn

(6) M ứ ộc đ nhẹ: nồng độ ếu tố VIII từ 40% (5 40 IU/dl, 0.05 y 5- - -0.40 IU/ml), chảy máu thường ch xu t hi n ỉ ấ ệ sau chấn thương nặng hoặc sau

ph u thu t [4] [8] ẫ ậ

1.3.3 Chẩn đoán phân biệt

Trong quá trình chẩn đoán, cần phân bi t b nh Hemophilia v i m t sệ ệ ớ ộ ố

bệnh khác như:

Bệnh von Willerbrand: là bệnh di truyền nhiễm sắc thể thường gặ ở ảp c nam và nữ Biểu hiện của bệnh chủ ế y u chảy máu niêm m c, th i gian máu ở ạ ờchảy kéo dài, nồng độ ế ố y u t VIII thấp hơn 30%, nồng độ ế ố y u t von Willerbrand

14

xuất huyết hậu sản kéo dài, ít gặp xuất huyết ở ớp Xét nghiệm APTT kéo dà kh i,

nồng độ ế y u tố VIII thấp hơn 30%, có chấ ức chế ếu tố VIII theo thời gian, sốt ylượng ti u cể ầu bình thường

Những rối loạn di truyền khác gây kéo dài thời gian APTT: bao gồm giảm

yếu tố XI, XII, prekallikrein và kininogen trọng lượng phân tử cao, phân b ệt dựa ivào định lượng y u t VIII, IX ế ố

Bệnh lý lưu hành kháng yếu tố VIII và yếu tố IX: trong một số ệnh tự b

miễn APTT kéo dài, nồng độ ếu tố VIII, IX giảm Phân biệt bằng cách trộ y n huyết tương bệnh nhân với huyết tương người bình thường, APTT không được

c i thiả ện trong trường hợp có kháng đông lưu hành

Rối loạn đông máu do tăng tiêu thụ yêu tố đông máu: gặ ở ả nam và nữp c , thường là bi u hi n r i loể ệ ố ạn đông máu do mộ ố ệnh khác như nhiễt s b m trùng, chấn thương nặng, ngoài gi m y u tốả ế VIII, các y u t khác c ng gi m [12] ế ố ũ ả

1.3.4 Phát hiện đột biến gen F8 bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Lựa chọn phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia A phụthuộc vào dạng đột biến và loại mẫu bệnh phẩm Do tính chất không đồng nhất

của đột biến và sự ức tạp về các đột biến trên gen F8 cũng như bản chất khác phnhau của các mẫu bệnh ph m, có thẩ ể chia các phương pháp phát hiện đột biến gen F8 thành 2 nhóm chính: phương pháp phát hiện đột biến trực tiếp và phương pháp phân tích gián tiếp Phương pháp phân tích gián tiếp d a trênự các yế ố di u ttruyền liên kết với gen F8 để ết luận về tình trạng đột biến gen Phương pháp kphân tích tr c ti p rự ế ất đa dạng, bao g m PCR, MLPA, gi i trình t gen (Sanger ồ ả ự

và Next generation sequencing) Vi- ệc lựa chọn các phương pháp này tùy thuộc điều ki n phòng xét nghiệ ệm và đối tượng xét nghiệm (người bệnh, người mang gen, t bào i, t bào phôi sinh thi t) ế ố ế ế

 Phân tích tr c ti p ự ế

Phương pháp phân tích trực ti p s d ng các k thuế ử ụ ỹ ật để phát hi n tr c ệ ự

tiếp và chính xác các đột biến như kỹ thuật PCR, giải trình tự gen, MLPA Kỹthuật PCR được sử ụng để d phát hiện các đột biến đảo đoạn; k thu t gi i trình t ỹ ậ ả ựgen đượ ức ng d ng trong phát hi n chính xác các đ t biụ ệ ộ ến điể , độm t bi n m t ế ấ

15

đoạn và chèn đoạn nh ; còn lỏ ại, để phát hiện đột bi n mế ất đoạn và lặp đoạ ớn l n

c n s d ng k thuầ ử ụ ỹ ật MLPA

Do gen F8 có kích thướ ớn, đã gây khó khăn trong việc l c nghiên c u phát ứ

hiện đột biến gây bệnh Hemophilia A trong nhiều năm Đến năm 1991, hệ ố th ng phân tích đầu tiên được Higuchi và c ng s công b , s d ng k thuộ ự ố ử ụ ỹ ật điện di

biến tính trên gel (DGCE) để sàng lọ ộc đ t biến Tuy nhiên, kỹ thuật này không phát hiện được nhiều đột bi n gây bế ệnh Sau đó, đến năm 1993, một loại đột bi n ế

có t n su t x y ra lầ ấ ả ớn (đến 50% ca bệnh Hemophilia A) được công bố là đột biến đảo đoạn intron 22 Đảo đoạn intron 22 x y ra do s tái t h p gi a vùng int22h1 ả ự ổ ợ ữ(vùng lặp lạ ồi g m 9,5 kb) thu c intron 22 v i m t trong hai bộ ớ ộ ản sao vùng đồng

nhất nằ ở telomere vùng int22h2 int22h3 (tương đồng đến 99,9%); vị trí 400 m ,

kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 dẫn đến tách gen thành hai phần riêng biệt (exon 1 – 22

và 23 26) cách nhau 400 kb Tro– ng giai đoạn đó, kỹ thuật Sout ern blotting hđược công b ố

- K thu t Southern blot ỹ ậ

Phương pháp Southern Blot ứng d ng trong chụ ẩn đoán đột biến đảo đoạn intron 22 được miêu t b i Lakich và cả ở ộng s ự năm 1993[32] X lý (ho c c t) ử ặ ắDNA b ng enzym ằ BclI, sử ụ d ng u đầ dò đánh dấu phóng xạ P32 để xác định đột

bi n ế Ở người bình thường, enzym sẽ ắt DNA làm 3 đoạn có kích thước 21,5kb; c16kb và 14kb Nếu kết quả có kích thước 20kb; 17,5kb; 14kb hay 20kb; 16kb; 15,5kb tương ứng v i đ t biớ ộ ến đảo đoạn intron 22 typ 1 (int22h2) và type e 2 (int22h3)

Hình 1.8 Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 b ng k thu t Southern Blot ằ ỹ ậ Trong đó, (1): Người bình thường, (2) N mang gen, (3) Nam b b nh ữ ị ệ

16

- K thu t PCR ỹ ậ

+ Kỹ thu t Long Distance - ậ PCR

Sau đó, năm 1998, Liu và c ng s ộ ự đã công bố ỹ k thu t phát hi n nhanh ậ ệ

đột biến đảo đoạn intron 22, giúp kh c ph c các nhưắ ụ ợc điểm c a k thu t ủ ỹ ậSouthern blot Kỹ thuật LD-PCR được thiế ế đểt k khuếch đại các đoạn gen dài đểphát hiện được người mắc bệnh, người lành mang gen, trong đó sử ụ d ng 4 m i P, ồ

Q, A và B Cặp mồi P và Q được thiết kế ở ị v trí có thể khu ch đế ại vùng gen int22h1 Cặp mồi A và B được thi t k v ế ế ở ị trí đặc hi u cho 2 vùng int22h2 và ệint22h3 Hình ảnh điện di trên gel Agarose 0.5% trong 6 8 gi- ờ ả, s n ph m khu ch ẩ ế

đại LD-PCR v i mớ ẫu DNA người bình thường cho 2 băng có kích thước 10 kb

và 12 kb, với người bị đột biến đảo đoạn intron 22 cho 2 băng kích thước 10 kb

và 11 kb, với người lành mang gen cho 3 băng kích thước 10, 11, 12 kb [18] [19]

Hình 1.9 Sơ đồ ị v trí m i và chi u dài s n ph m LD-PCRồ ề ả ẩ

+ Kỹ thu t Multiplex PCR ậ

Cho đến năm 2001, kỹ thu t phát hiậ ện đột biến đảo đoạn intron 1 được Bagnall, Richard D và cộng s ựbáo cáo [20] Thiế ết k 2 ph n ứng Multiplex PCR, ảtrong đó phả ứn ng 1 ch a c p mứ ặ ồi đặc hi u cho ệ vùng int1h1(9F và 9cR) và mồi inth1h-2F đặc hiệu cho vùng int1h2, phả ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu cho n int1h2 (int1h-2F và int1h2 R) và mồi 9F đặc hiệu cho - int1h1 Trường h p không ợ

có đột biến đảo đoạn intron 1, ph n ng 1 ch có m i inth1 b t c p cho kích ả ứ ỉ ồ ắ ặthước 1908 pb, ph n ng 2 ch có m i int1h2 b t cả ứ ỉ ồ ắ ặp cho kích thước 1191 bp

17

Nếu đột biến xảy ra, phả ứng 1 và 2 cho sản n phẩm có kích thước tương ứng là

1323 bp và 1776 bp [20]

Hình 1.10Sơ đồ ị trí mồ v i và chi u dài s n ph m ph n ng PCR phát hi n ề ả ẩ ả ứ ệ

đột biến đảo đoạn intron 1+ Kỹ thu t Inversion PCR (I-ậ PCR)

Năm 2005, để kh c ph c nhắ ụ ững nhược điểm c a k thu t LD PCR phát ủ ỹ ậ hiện đột biến đảo đoạn intron 22, nhóm nghiên cứu Rossetti, Liliana Carmen và công sự đã công bố ỹ k thu t I-PCR [33]ậ Các mồi IU, ID, ED được thiết kế có chứa trình t enzyme c t gi i h n BclI n m ự ắ ớ ạ ằ ở hai đầu c a int22h1 và mủ ột đầu c a ủint22h2/3 Sau khi cắt sản ph m DNA b ng enzyme c t gi i hẩ ằ ắ ớ ạn BclI, 2 đầu DNA được n i l i b ng enzyme T4 ligase s cho 2 s n ph m DNA vòng có kích ố ạ ằ ẽ ả ẩthước 21,5 và 20 kb Ở người bình thường, m i IU b t c p v i m i ED t o ra ồ ắ ặ ớ ồ ạDNA đóng vòng kích thước là 21 5 kb; ch ứa đoạn int22h1 (BX842559, GeneBank), có vị trí của enzyme cắt giới hạ BclI: base 36204 trên mồi IU và n base 14595 trên mồi ID Khi khuếch đại b ng phằ ản ứng multiplex PCR s cho ẽđoạn DNA có kích thước 487 bp Khi hiện tượng đảo đoạn xảy ra, đoạn int22h1

-nằm trong gen F8 được thay thế ằng đoạn int22h2 hoặc int22h3 nằm ngoài gen bF8 cách đầu telomere 500kb, do đó DNA vòng có kích thước là 20 kb Lúc này

mồi IU sẽ ắt cặp với mồi ED (mồi ED được thiết kế ằm cạnh int22h2 và intron b n22h3 có ch a trình t enzym c t gi i h n BclI) So sánh trình tứ ự ắ ớ ạ ự mồi ED trên GenBank (BX 276110) thấ ị y v trí BclI trên int22h3 là nucleotide 14703 vùng BX

Giải trình tự gen là phương pháp hiện đại, là tiêu chuẩn vàng cho phát

hiện đột biến gen F8 trên cả người bệnh nam và người nữ mang gen hương Ppháp gi i trình tả ự gen phân tích trình tự ắ s p x p các nucleotit cế ủa gen F8, qua đóphát hi n ệ chính xác các độ ết bi n trên gen F8

Đối với phương pháp giải trình t gen Sanger, m u DNA sau tách chi t ự ẫ ếđược khuếch đại các vùng exon mong mu n c trình t b ng ph n ng PCR ố đọ ự ằ ả ứ

S n phả ẩm PCR được tinh sạch để i b loạ ỏ các oligonucleotide và dNTP dư, sau đó được th c hiự ện bước PCR ti p theo v i các c p m i gi i trình tế ớ ặ ồ ả ự Trong đó, phản

ứng s d ng h n h p deoxynucleotide và dideoxynucleotdie v i t l thích h p ử ụ ỗ ợ ớ ỉ ệ ợ

S g n cự ắ ủa các dideoxynucleotide sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA đượ ổc t ng h p, k t qu s t o ra h n h p các sợ ế ả ẽ ạ ỗ ợ ợi DNA có kích thước khác nhau Sau đó, hỗn h p các s i DNA t ng h p t m t sợ ợ ổ ợ ừ ộ ợi khuôn được tinh s ch và ạphân tách bằng điện di mao quản trên máy AB3500 Trình tự các exon sau đó đượ ắp ráp và đốc l i chi u v i trình t gen tham chiế ớ ự ếu để tìm ra các v ị trí đột bi n ế

và sai khác

Đối với phương pháp giải trình t gen th h m i (NGS), vùng gen F8 ự ế ệ ớđược khuếch đại và phân mảnh đến kích thướ ố ưu cho giảc t i i trình t gen (trong ựkhoảng 150 600bp) Thư viện ADN sau đó được gắn mồi giải trình tự gen, gắn -

19

mã phân bi t, tinh s ch và ệ ạ thực hiện giải trình tự gen trong m t chip g i là ộ ọFlowcell, g m hồ ệ thống mao qu n và l p cả ớ ố định s i ADN Tợ ại đây, thư viện ADN được khuếch đại m t l n nộ ầ ữa theo phương pháp tổng h p b c c u (brigde ợ ắ ầamplification) để làm giàu gen đích và quá trình đọc trình tự các đoạn thư viện ADN được tiến hành theo phương pháp đọc trình t trong quá trình t ng h p và ự ổ ợkéo dài chu i ADN bỗ ổ sung Các nucleotide được đọc và phân biệt dựa trên tín

hiệu huỳnh quang khác nhau của các nucleotide ATGC đưa vào trong phả ứn ng kéo dài chuỗi Cuối cùng, trình tự các đo n đạ ọc được phân lo i, l p ráp và g i ra ạ ắ ọcác sai khác dựa trên gen tham chi u (Ref.Gen.) b ng ph n m m tinh sinh h c ế ằ ầ ề ọchuyên d ng ụ

- K thu t MLPA ỹ ậ

Phương pháp MLPA đượ ử ục s d ng đ phát hi n các đ t bi n mể ệ ộ ế ất đoạ ớn l n

và lặp đoạ , đặn c bi t là nhệ ững đôt biến mớ trên gen F8 Phương pháp này sửi

dụng 43 đầ dò có trình tự đặc hiệu với gen F8, được lai với các trình tựu khác nhau trên các exon c a gen F8 và 10 m u dò tham chi u g n trên nhi m sủ ẫ ế ắ ễ ắc thể

X Mỗi mẫu dò bao g m 2 oligonucleotidồ e liề ề, được nố ạ ớn k i l i v i nhau sau khi lai chúng v i trình tớ ự gen đích Các mẫu dò sau khi n i số ẽ được khuếch đạ ằi b ng

ph n ả ứng PCR với một cặp mồi duy nhất Kết quả là một tập hợp các exon đặc

hiệu được khuếch đại tạo sản phẩm có chiều dài từ 136-477 bp Sản phẩm PCR MLPA được phân tách bằng điện di mao qu n V i đ t bi n mả ớ ộ ế ất đoạn, các đỉnh tương ứng v i t ng exon s b m t [21] [22] Bên cớ ừ ẽ ị ấ ạnh đó, Phương pháp này còn

có thể định lượng được số probe lai qua đó đánh giá được mứ ộ ất đoạc đ m n trên

m i alen, t ỗ ừ đó kết luận được trạng thái đồng hoặc dị ợ ử độ ế h p t t bi n

 Phân tích gián ti p ế

Phân tích liên kết là phương thức theo dõi di truy n cề ủa nhi m s c thễ ắ ể X

b ịđột biến trong gia đình Phương thức này dựa trên 2 loại marker là: đa hình nucleotide và các đoạn lặp ng n, ng u nhiên (STRs) liên k t trên nhi m s c th X ắ ẫ ế ễ ắ ể

- Phân tích đa hình

Đa hình đơn nucleotide là những thay đổi trên trình t nucleotide c a gen ự ủ

dẫn đến tính đa dạng, tạo ra sự khác biệt giữa người này và người kia mà không

của đoạn cắt cũng sẽ thay đổi theo giữa các cá thể khác nhau cũng như giữa 2 nhi m sễ ắc thể X của người ph n ụ ữ được phân tích [8]

1.4 Tình hình nghiên cứu các ỹ thuật sinh học phân tử phát hiệ k n đ ộ t

bi n ế gen F8 gây bệnh Hemophilia A

1.2.5 Nghiên cứu trên Thế giới

Trên Thế giới, nghiên c u vứ ề Hemophilia A có ph m vi rạ ộng và đa dạng, bao gồm các nghiên cứ ều v cơ s ởdi truy n b nh, các kề ệ ỹ thuật phát hiện đột biến, nghiên c u th ng kê tứ ố ỉ ệ độ l t bi n, nghiên c u vế ứ ề hướng điều tr và li u pháp ị ệgen…

Trong đó, các nghiên cứu v phát tri n k thu t sinh h c phân t trong phát ề ể ỹ ậ ọ ử

hiện đột bi n gen F8 gây b nh Hemophilia A n i b t phế ệ ổ ậ ải kể đến, bao gồm:

- Các nghiên c u t ng quan v Hemophilia A và sinh h c phân t : ứ ổ ề ọ ử

+ “The molec ar Basis of Hemophilia A: Genotype Phenotype relationships ul – and inhibitor developer” được vi t b i Goodeve AC và c ng sế ở ộ ự năm 2003 [15] Nghiên c u t p trung vào mô tứ ậ ả ối tương quan giữ m a kiểu đột bi n và ki u hình ế ể

21

bệnh nhân hemophilia A Bên cạnh đó còn đánh giá sự hình thành yếu tố ức chế

dựa trên đặc điểm kiểu đột bi n ế

+ “Historical review on genetic analysis in hemophilia A.” được nghiên c u bởi ứnhóm Oldenburg, Johannes và c ng sộ ự năm 2014 [13] Nghiên cứu đã nêu lên

b c tranh t ng quan v ứ ổ ềcác kỹ thuật phân tích đột bi n gây b nh hemophilia A ế ệ

- Các nghiên cứu về ỹ k thuật sinh học phân tử trong xây dựng các phương pháp phát hiện đột biến điển hình g m: ồ

+ “Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A” một trong nh ng nghiên cữ ứu đầu tiên về đột biến đảo đoạn intron

22 c a nhóm nghiên c u Lakich, D và củ ứ ộng s ự năm 1993 [32] Nghiên c u nêu ứlên đặc điểm đột biến đảo đoạn intron 22 và đưa ra quy trình phát hiện đột bi n ế

b ng k thu t Southern Blot nh m phát hiằ ỹ ậ ằ ện đột biến đảo đoạn intron 22

+ “Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A.”, nghiên cứu đầu tiên về phương pháp phát

hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ thu t LD-ậ PCR ủa nhóm tác giả Liu, Q c

và c ng sộ ự năm 1998[19] Nghiên c u thứ ực hiện trên 40 mẫu trong đó 13 mẫu

b nh nhân, 6 m u nệ ẫ gười mang gen và 21 mẫu người bình thường

+ Năm 2001, nhóm tác giả Bagnall, Richard D và cộng s ự đã công bố nghiên c u ứ

“Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause

of severe hemophilia A.” v i n i dung chính là kớ ộ ỹ thu t Multiplex ậ PCR để phát

hiện đột biến đảo đoạn intron 1 [20]

+ “Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR.”, thuộc nhóm nghiên c u Rossetti, Liliana Carmen và c ng sứ ộ ự năm 2004, đây là một nghiên cứu v k thu t I-ề ỹ ậ PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22, một kĩ thuật

có th khể ắc phục được những nhược điểm của kỹ thu t -ậ LD PCR [33]

+ Đến năm 2008, cùng nhóm nghiên cứu Rossetti, Liliana Carmen và c ng s ộ ự đã công b nghiên c u: “ố ứ Developing a new generation of tests for genotyping hemophilia-causative rearrangements involving int22h and int1h hotspots in the factor VIII gene.”, đây là kỹ thu t phát tri n d a trên n n tậ ể ự ề ảng công trình được công bố năm 2004 [34] Tính m i cớ ủa kỹ thuật inversion shifting PCR này giúp

h n ch cạ ế ủa các phương pháp đã công bố trước đó [35]

+ Tháng 1/ 2020, nhóm nghiên c u Wang, Xiong và cứ ộng sự đã công bố nghiên cứu “Rapid genotyping of F8 intron 22 inversion by nested PCR based on long-distance PCR.”, đưa ra kỹ thu t phát hiậ ện đột biến đảo đoạn intron 22 b ng kằ ỹthuật Nested PCR dựa trên nền tảng của nghiên cứu năm 1998 của nhóm tác giảLiu, Q và c ng s [36] ộ ự

1.2.6 Nghiên cứu tại Việt Nam

Ở nước ta chưa có nhi u công trình nghiên c u v b nh Hemophillia A và ề ứ ề ệ

chủ ế y u là các nghiên c u v ứ ề đặc điểm lâm sàng, đánh giá tỉ ệ ắ l m c bệnh, hay các nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều tr Các công trình nghiên cị ứu v ề ứng d ng kụ ỹthu t sinh h c phân t trong chậ ọ ử ẩn đoán bệnh Hemophilia A có th k ể ể đến như:

- Nghiên cứu “Ứng dụng phương pháp PCR-RFLP v i v trí c t c a ớ ị ắ ủ

enzyme BclI chẩn đoán người mang gen bệnh trong gia đình bệnh

nhân Hemophilia A t i Vi t Namạ ệ ” được công bố ở b i nhóm tác giảPhạm Quang Vinh và c ng s ộ ự năm 2007 Nghiên c u s d ng k thu t ứ ử ụ ỹ ậPCR - RFLP với enzym BclI xác định tần suất dị ợp tử đoạn ADN đa hhình cho 22 b nh nhân hemophilia A, 40 phệ ụ ữ n liên quan, 31 phụ ữ n bình thường Xét nghi m PCR - ệ RFLP cho 9 gia đình (bệnh nhân hemophilia, b , m ố ẹvà chị em bệnh nhân) để tìm người mang gen

- Năm 2013, nhóm nghiên cứu Trần Vân Khánh và cộng sự đã công bốnghiên c u “ứ Xác định đột bi ến đảo đoạn intron 22 trên b nh nhân ệ

Hemophillia A bằng kĩ thuật Inversion PCR” Nghiên cứu đưa ra phương pháp phát hiện đột bi n đế ảo đoạn intron 22 b ng k thu t ằ ỹ ậinversion PCR d a trên nghiên c u c a Bagnall và c ng s ự ứ ủ ộ ự năm 2001

23

- Nghiên cứu “Xây dựng quy trình chẩn đoán đột bi n gen y u t VIII ế ế ố

gây b nh Hemophilia Aệ ” của nhóm nghiên c u Nguy n Thứ ễ ị Băng Sương và cộng s ự năm 2013 [14] Nghiên c u ứ Phân tích đột bi n gen ếF8 ở hai b nh nhân nam m c bệệ ắ nh Hemophilia A th nở ể ặng đã được chẩn đoán trên lâm sàng DNA từ máu ngo i vi c a bệnh nhân sau khi ạ ủtách chiết được dùng làm khuôn cho phả ứn ng PCR v i 33 cớ ặp mồi

nhằm khuếch đại toàn bộ 26 exon và vùng nối intron exon của gen– F8 S n phả ẩm PCR sau đó được gi i trình t và phân tích kả ự ết quả ằ b ng

ph n m m chuyên d ng nhầ ề ụ ằm xác định các đột bi n gây b nh ế ệ

- Năm 2014, nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật inverse shifting PCR xác

-định đột biến đảo đoạn intron 22 gây b nh Hemophilia A th n ngệ ể ặ ” được công b b i nhóm nghiên c u Nguy n H u Huy và c ng s ố ở ứ ễ ữ ộ ựNghiên cứu được th c hi n v i m c tiêu ự ệ ớ ụ xác định đột biến đảo đoạn intron 22 ở ệ b nh nhân Hemophilia A thể ặng và ngườ n i nữ ị ợ d h p tửtrong gia đình bệnh nhân Nghiên cứu này được th c hi n trên 2 gia ự ệđình với 2 bệnh nhân nam được chẩn đoán Hemophilia A thể ặ n ng và

5 thành viên nữ Phả ứn ng Inverse PCR gồm 3 bước: (a) c t bắ ằng enzyme BclI; (b) n i l i s n ph m c t t o DNA vòng; (c) th c hiố ạ ả ẩ ắ ạ ự ện

ph n ả ứng multiplex PCR và đọc kết qu ả

- Nhóm nghiên cứu Lưu Vũ Dũng và cộng sự nghiên cứ xác đị đột u nh

biến gen F8 gây bệnh Hemophillia A là cơ sở xây dựng được bản đồ

đột biến gen F8 đối với 92 người b nh Hemophillia A t i Vi t Nam ệ ạ ệnăm 2014 [12]

- Nghiên cứu “Xác định người lành mang gen b nh Hemophilia A b ng ệ ằ

k thuỹ ật Microsatellite DNA” của nhóm nhiên cứu Đỗ Th Hi n và ị ế

cộng sự năm 2016 [31] Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xây

dựng quy trình xác định người lành mang gen bằng kỹ thuật microsatellite DNA được th c hiự ện trên 10 gia đình người b nh ệhemophilia A

Có thể ấ th y rằng, ở nước ta một số công trình nghiên cứu về đột bi n gen ếF8 gây b nh Hemophilia A Tuy nhiên, v i tính chệ ớ ất đa dạng và phức tạ ủ ộp c a đ t

biến gen F8, cùng với sự phát triển nhanh chóng của các nghiên cứu trên Thế

24

giới, thì cần nhiều hơn ữa các nghiên cứu về các kỹn thuật mới để ập nhật và c

ứng d ng hi u qu trong chụ ệ ả ẩn đoán phục v ụ điều tr và ki m soát b nh ị ể ệHemophilia A

25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2.1 Đối tượ ng:

100 b nh nhân không cùng huy t thệ ế ống được chẩn đoán bệnh hemophilia A tại

Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương Trong đó, dựa nên nồng độ ếu tố yVIII, có 82 b nh nhân mệ ức độ ặ n ng, 11 b nh nhân mệ ức độ trung bình, 7 bệnh nhân mức độ nhẹ

3 mẫu người lành mang gen F8 đột biến được qu n lý t i Viả ạ ện Huyế ọc – t hTruy n máu Trung ề Ương

Thông tin bệnh nhân và người mang gen được bảo m t và tuân thậ ủ quy định yêu

cầu đạo đức nghiên c u y sinh h ứ ọc

- Ống l y máu chấ ống đông EDTA

- Đầu côn các lo i, pipet pasteur ạ

- H th ng tách chiệ ố ết DNA/ RNA KingfisherTM (Thermo)

- Máy quang ph Nanodrop (Thermo) ổ

- Máy PCR eppendorf MasterCycler Nexus GX2

- Máy vortex (IKA)

26

- Máy spindown (Eppendorf)

- H thệ ống điện di ngang (Clever scientific)

- Cân k thu t (Satorius) ỹ ậ

- Máy gi i trình t ả ựgen AB3500

- Máy ly tâm đĩa PCR

- B micropipet ộ

• Hóa ch t, sinh ph m nghiên c u ấ ẩ ứ

 Hóa ch t tách chiấ ết DNA

- Sinh ph m Mag-Bind® Blood & Tissue DNA HDQ 96 kit (Omega) ẩ

 Hóa ch t tách chiấ ết RNA

- Hóa ch t tách b ch c u Red Blood Cell Lysis Buffer (Bio-world) ấ ạ ầ

- PBS buffer

- Sinh ph m Mag-Bind® Total RNA 96 kit (Omega) ẩ

 Hóa ch t PCR ấ

- Sinh ph m Longrange PCR kit (Qiagen) ẩ

- Gotaq Master Mix (Promega)

- PCR Super Mix (ThermoFisher Scientific)

- SuperScriptTM III One-Step RT PCR Mix (ThermoFisher Scientific)

 Hóa chất điện di

- Đệm TBE

- Agarose

- Red safe (intron biotechnology)

 Hóa ch t tinh sấ ạch sau điện di

- Sinh ph m ExoSap-IT PCR product Cleanup Reagent (ThermoFisher) ẩ

- Sinh ph m ProNex® Size Selective Purification System (Promega) ẩ

27

 Hóa ch t ch y MLPA ấ ạ

- SALSA MLPA probe mix P178 F8 (MRC Holland)

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.3. Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên c u ứ

2.1.2.4. Các bước tiến hành:

 Xây dựng b ộ phương pháp xét nghiệm k thu t sinh h c phân t phát hi n ỹ ậ ọ ử ệ

đột bi n gen F8 gây b nh hemophilia A ế ệ

- T ối ưu hóa kỹ thu t: ậ

+ Tối ưu hóa và xây dựng quy trình phát hi n đệ ột đảo đoạn intron 22 b ng ằ

k thu t RT-ỹ ậ PCR để kh c phắ ục nhược điểm của kỹ thu t -PCR ậ LD

+ Hoàn thi n quy trình gi i trình t gen Sanger: ệ ả ự

• Tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại 26 exon ủa gen F8 nhằm mục đích c

gi i trình t Sanger Sequencing ả ự

• Khảo sát ảnh hưởng của các ỹk thuật tinh sạch sản phẩm PCR n ằm mục hđích giải trình t gen Sanger Sequencing ự

+ Áp dụng kỹ thu t MLPA (s d ng kit SALSA MLPA) ậ ử ụ

- Đánh giá hiệu quả phát hiện đột biến của từng phương pháp để xây

dựng phác đồ nh phù h p chỉ đị ợ