Khảo Sát Quy Trình Giết Mổ Heo Và Kiểm Tra Chỉ Tiêu Vi Sinh Trên Sản Phẩm Pâté Sản Xuất Tại Công Ty Vissan.pdf

HCM và sự hướng dẫn của Thầy Phan Hữu Nghĩa, Cô Tô Minh Châu, và chú Lê Cẩm Tuấn, em đã thực hiện đề tài : “Khảo sát quy trình giết mổ heo và kiểm tra chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm pâté

TOÅNG QUAN

VEÀ PAÂPEÙ

Gan là bộ phận quan trọng nhất trong chuyển hóa vật chất cho hoạt động sống Toàn bộ chất dinh dưỡng mà cơ thể hấp thụ được qua hệ thống tiêu hóa đều thấm vào máu và đi đến gan Chất dinh dưỡng sẽ đi đến các tế bào cơ thể nhờ chức năng của gan trong việc điều hòa, phân phối Ngoài ra gan còn có chức naêng

• Khử độc các chất có hại trong chuyển hóa chất

• Dự trữ đường dưới dạng glucogen và điều hòa lượng đường trong máu

• Là cơ quan tổng hợp nhiều loại protid huyết tương fibrinogen, albumin…

• Nhũ tương hóa chất béo trước khi tham gia các quá trình trao đổi chất (nhờ dịch mật)

Bảng II.1 : HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ACID AMIN TRONG GAN

Acid amin Hàm lượng % tính theo protid

Acid amin Hàm lượng % tính theo protid

Qua bảng trên cho thấy protit gan là loại hoàn thiện Trong gan còn chứa mocopo lysaccarid – heparin Hợp chất trích ly chứa nitơ trong gan tương đối ít gồm có bazơ ourin, cholin, creatin, urê… gan chứa hệ thống nhiều men như: proteinaza, arginaza, nucleaza, amylaza, catala…

II.2 Giá trị dinh dưỡng của trứng :

Qua nghiên cứu dinh dưỡng người ta có thể đánh giá chất lượng trứng ngang với thịt và sữa So với thực phẩm nguồn gốc động vật khác thì trứng có giá trị năng lượng thấp hơn nhưng lại cho tỷ lệ protit cao hơn Ngoài ra, trứng còn cho khá đầy đủ các vitamin, các nguyên tố vi lượng

Protit của trứng là loại hoàn thiện chứa hầu hết các acid amin Trong tự nhiên và cân đối Trứng chứa hầu hết các khoáng chất cần cho cơ thể Trong trứng còn chứa chất diệt khuẩn như lyzozym trong lòng trắng có tác dụng tiêu diệt hay ức chế nhiều loại vi khuẩn thuộc giống Staphylycoccus , Streptococcus, Salmonella Trứng tươi mới đẻ không có vi khuẩn Vì thế, trong quá trình chế biến pate người ta cho thêm trứng vào để tăng giá trị dinh dưỡng như protit, vitamin và các yếu tố vi lượng Đối với hàm lượng vitamin, trứng chứa hầu hết các nhóm vitamn trừ vitamin C

Bảng II.2 : HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG TRỨNG(mg/100g)

Các nhóm vitamin Trứng Lòng đỏ Lòng trắng Axerofton 200 - 1400 470 – 3966 -

VỀ PHỤ GIA THỰC PHẨM DÙNG TRONG CÁC SẢN PHẨM CHẾ BIẾN TỪ THỊT

III.1 Khái niệm và phân loại :

Phụ gia thực phẩm là những chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, mà bản thân nó không được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm, việc chủ ý bổ sung chúng vào thực phẩm để giải quyết mục đích công nghệ sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó Phụ gia thực phẩm không bao gồm các chất nhiễm bẩn hoặc các chất bổ sung vào thực phẩm duy trì hay cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm

Phụ gia thực phẩm được chia làm 3 nhóm chính :

• Phụ gia để bảo tồn, bảo quản thực phẩm bao gồm: các chất bảo quản, các chất chống oxy hóa, các chất kháng sinh, sát khuẩn

• Phụ gia tăng sức hấp dẫn thực phẩm: các chất điều vị, các chất làm ngọt nhân tạo, các hương liệu, các phẩm màu

• Phụ gia sử dụng để chế biến đặc biệt: các chất enzym, các chất cho thêm vào chế biến đặc biệt, làm tăng khả năng tạo dạng mong muốn (làm rắn chắc, giòn dai, làm ẩm, nhũ hóa…)

III.2 Một số hóa chất thường dùng :

III.2.1 Hóa chất dùng nhằm tạo hương vị :

Acid glutamic không phải là một acid amin không thay thế, nhưng lại có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở con người và động vật

Trong cơ thể con người và động vật, acid glutamic tham gia vào việc tạo thành protein và các chất acid amin khác ( alanin, prolin…) Nó còn tham gia vào quá trình vận chuyển amin, còn tạo liên kết với amoniac ( NH3 ) để tạo glutamic, nó có ý nghĩa trong việc giảm lượng NH3 giải độc cho cơ thể Ở nhiệt độ 247 0 C–

249 0 C nó bị phân giải, tan tốt trong nước, hầu như không tan trong cồn, este và một số dung môi

Hiện nay, acid glutamic được sản xuất ngày càng nhiều, không chỉ vì mục đích y học mà chính là do yêu cầu thiết yếu trong lĩnh vực thực phẩm đã thúc đẩy ngành công nghệ sản xuất acid glutamic phát triển nhanh chóng

Tên thường dùng là Mì chính hay bột ngọt, được dùng trong thực phẩm ở dạng tinh thể, bột màu trắng, có vị mặn, hơi ngọt dễ tan trong nước được sử dụng phổ biến trong nấu nướng hàng ngày tại gia đình, trong các thức ăn đường phố

HOOC – CH2 – CH2 – CH – COOH

NH2 như phở, mì, hủ tiếu…hoặc trong các thực phẩm công nghiệp như mì gói, thịt hộp… để làm tăng hương vị của thực phẩm có chứa chất protein

Natri glutamate là một acid amin bình thường có mặt trong mọi chất đạm thực phẩm như protein của bột cá, thịt cá… nồng độ sử dụng trong chế biến:0,2 – 0,5 % sẽ có mùi vị của thịt cộng thêm sự hiện diện của NaCl hay muối ăn với nồng độ thích hợp sẽ cho vị ngon hấp dẫn

Sử dụng bột ngọt ngoài yếu tố ngon, hấp dẫn về vị, nó còn có những độc tính rất hại cho sức khỏe người tiêu dùng

Theo nghiên cứu của Olney J.W trên súc vật thấy hiện tượng tổn thương ở não do ăn thức ăn có nhiều bột ngọt

Nhiều công trình nghiên cứu ở Hoa Kỳ chứng minh rằng Natri glutamate khi đưa vào cơ thể thường tích tụ trong tế bào nhất là trong tế bào não bộ Khi não bộ thiếu Oxygen, tế bào não bộ phóng thích một số lượng lớn Natri glutamate mà nó chứa, dẫn đến sự chết của tế bào thần kinh, mặt khác ăn nhiều bột ngọt còn tạo nên nguy cơ teo não, gây thoái hóa não Đối với trẻ em ở lứa tuổi ăn, bổ sung sẽ tạo vị ngọt dẫn đến thói quen không tốt cho khẩu vị trẻ Đối với người lớn có thể có triệu chứng như nhức đầu, tức ngực, cảm giác bỏng rát ở cánh tay và sau gáy Do đó trẻ em dưới 12 tháng tuổi không nên sử dụng mì chính và đối với người lớn không nên ăn quá 2g/ ngày, không nên lạm dụng mì chính ngay cả đối với người lớn

Từ năm 1970, Cơ Quan Kiểm Soát Thực Dược Phẩm Hoa Kỳ (FAD) cấm dùng bột ngọt cho trẻ em Còn tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) và Hiệp Hội Lương Nông Thế Giới (FAO) khuyến cáo không nên sử dụng bột ngọt cho trẻ em

III.2.2 Hóa chất dùng nhằm tăng tính hấp dẫn :

Trong thực phẩm chế biến, việc tạo hương vị thơm ngon thì màu sắc đóng vai trò rất quan trọng nhằm tạo tính hấp dẫn, kích thích cảm giác ngon miệng cho người tiêu dùng Chất màu dùng trong thực phẩm gồm chất màu tự nhiên và chất màu nhân tạo

III.2.2.1Chất màu tự nhiên :

Màu của các sản phẩm thực phẩm lấy từ các nguyên liệu thực vật do các sắc tố Các sắc tố này được chia làm 3 nhóm chính:

• Antoxian có màu đỏ và xanh lam

• Clorolin có màu xanh lá cây

Chất màu tự nhiên không gây độc nhưng trong quá trình chế biến do tác dụng của nhiệt độ và độ chua của thực phẩm chúng thường bị lạt màu làm sản phẩm kém hấp dẫn hoặc bị phân giải làm cho sự tiêu hóa khó khăn hơn Như Antoxian của củ cải đỏ là một monoglucosid khi thủy phân tạo agluconbeanidin có màu nâu đậm hơn

III.2.2.2 Chất màu tổng hợp (chất màu nhân tạo ):

Chất màu nhân tạo là chất màu hóa học, nó có ưu điểm là không bị biến màu trong quá trình chế biến do đó màu của sản phẩm giữ bền và hấp dẫn Chất màu nhân tạo hiện có khoảng 160 loại trong đó chỉ có những chất cho phép sử duùng nhử amaran, tactrazin, indigo, 773 eritrzin, punsova…

Chất màu nhân tạo phải có sự kiểm soát chặt chẽ và có danh mục phẩm màu cho phép sử dụng vì nó có tính độc hại cho người tiêu dùng

Phần lớn các chất màu nhân tạo có tác độc khi được chuyển hóa thành các sản phẩm trung gian do có sẵn trong đường tiêu hóa Các sản phẩm này sẽ kích thích tế bào gây hiện tượng Methemoglobin trong máu với triệu chứng nhức đầu, đỏ ửng da, nôn ói, chóng mặt, suy sụp thần kinh, giảm huyết áp, rối loạn hô hấp…Nếu không điều trị kịp thời, bệnh nhân sẽ ngạt thở, hôn mê và đi đến tử vong

Bảng II.3 : QUY ĐỊNH VỀ PHẨM MÀU TỔNG HỢP TRONG THỰC PHẨM CỦA ỦY BAN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM STT Tên phẩm màu Liều lượng có thể chấp nhận (mg/kg/ngày/người)

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT

IV.1 Sự nhiễm vi sinh vật trên thịt:

Vi sinh vật nhiễm vào thịt bằng nhiều cách khác nhau nhưng có 2 con đường chính: nhiễm nội sinh và nhiễm ngoại sinh

Là do bản thân con vật bị bệnh trước khi giết mổ Đầu tiên mầm bệnh ở 1 vị trí hay 1 cơ quan nội tạng nào đó của con vật, sau đó tràn lan vào máu, vào thịt hoặc vào cơ quan nào khác Đôi khi do hậu quả của sự suy nhược cơ thể vì đói và lạnh cũng làm cho các vi sinh vật từ đường tiêu hóa tràn vào các cơ quan khác của gia súc theo đường mạch máu

Vi sinh vật luôn hiện diện ở môi trường xung quanh: đất, nước, không khí

Do đó, trong điều kiện giết mổ, bảo quản và phân phối thịt kém vệ sinh, vi sinh vật sẽ xâm nhập vào để tăng trưởng và phát triển Sự tăng trưởng của vi khuẩn là sự gia tăng toàn bộ các cấu tử tế bào, nhiều vi khuẩn có khả năng tiết ra enzym phân hủy protein tạo lớp chất có mùi khó chịu, làm chất lượng thịt thay đổi và trong quá trình đó chúng tiết ra độc tố gây ngộ độc thức ăn

Nguyeân nhaân gaây ra do:

− Thói quen ăn uống của người địa phương

− Giết mổ thịt không đảm bảo vệ sinh, để phần nội tạng dính với phần thịt bên ngoài làm cho thịt nhiễm vi khuẩn, ký sinh trùng…

Nơi chế biến không đủ điều kiện vệ sinh cũng là nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc

Số lượng vi sinh vật nhiễm vào thịt nhiều hay ít tùy theo điều kiện vệ sinh, tùy theo từng bộ phận và sẽ phát triển mạnh khi gặp nhiệt độ, ẩm độ thích hợp

Thịt bị nhiễm vi sinh vật nhiều hay ít, với các loại khác nhau gây tác hại khác nhau làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, thậm chí có thể gây tử vong Do đó, việc kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm là rất cần thiết nhằm mục đích phát hiện và khuyến cáo tình trạng vệ sinh tác động trực tiếp đến thịt

IV.2 Ngộ độc thức ăn có nguồn gốc vi khuẩn và độc tố vi khuẩn :

IV.2.1 Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn :

IV.2.1.1 Ngộ độc do Escherichia coli :

Thũt nhieóm khuaồn Naáu khoâng kyõ

Tận dụng công nghệ hay hủy bỏ

Hợp vệ sinh Thịt đạt yêu cầu Vệ sinh cá nhân không đúng quy định

Bảo quản không tốt Điều kiện VSV sống và phát triển

Người tiêu thụ Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn

Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli ) thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriaceac , chúng có nhiều trong tự nhiên , trong đường ruột người và các loại động vật máu nóng Trong đường ruột chúng có nhiều ở đại tràng nên gọi là vi khuẩn đại tràng

Các loại E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường Gần đây người ta chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ a Hình dạng :

Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn gram âm (G - ) bắt màu hồng, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại khụng độc lực khụng cú capsul Kớch thước trung bỡnh 0,5à x 1-3à hai đầu trũn, một số loài có lông bám hay còn gọi là pili

Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 37 o C nhưng có thể mọc trên 40 o C cho nên đây sẽ là nguyên nhân gây ngộ độc cho người tiêu dùng, trong nuôi cấy xác định chỉ số vệ sinh E.coli dùng 42 o C-44 o C pH 7,4 b Sức đề kháng :

E.coli có sức đề kháng kém, bị diệt ở nhiệt độ 55 o C/1 giờ và 60 o C/ 30 phút Các chất kháng khuẩn thông thường như nước Javel 1/ 200, Phenol 1/200 có thể diệt được vi khuẩn E.coli sau 2-4 phút c Tớnh gaõy beọnh :

E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Chúng được chia làm 4 loại :

O, H, K, và F trong đó có khoảng 150 kháng nguyên O, 100 kháng nguyên K, 50 kháng nguyên H, được chia thành nhiều type huyết thanh khác nhau Trong đó K là kháng nguyên gây bệnh nặng nhất, kháng nguyên K được chia thành K A , K B ,

K L Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì có tính gây bệnh khoâng gioáng nhau

Escherichia coli sinh nội độc tố gây bệnh thông qua sự sản sinh, có nội độc tố kém chịu nhiệt LT( Labile Toxins), nội tố chịu nhiệt ST (Stable Toxins) xâm thực tế bào và khuẩn lạc dày đặc trên niêm mạc ruột d Triệu chứng :

Thời gian ủ bệnh khoảng 2-20 giờ, nhưng thường là 4-6 giờ Bệnh phát một cách đột ngột, ở 3 dạng : viêm ruột , viêm độc tố và dạng nhiễm trùng máu Bệnh thường thể hiện triệu chứng đi tháo dạ, phân xanh mùi hôi thối dạng lỏng

1-12 lần/ ngày, sốt cao, người mệt mỏi ,chân tay co quắp Thời gian khỏi bệnh tương đối dài

E.coli gây tiêu chảy thường gặp các nhóm sau:

- Nhóm EPEC ( Enterophogenic E.coli ) là nguyên nhân gây bệnh trẻ em dưới 2 tháng tuổi, cơ chế gây bệnh chưa rõ

- Nhóm ETEC ( Enteroxigenic E.coli ) là nguyên nhân gây bệnh cho trẻ em và người lớn do tiết ra 2 độc tố ruột là LT và ST

+ Độc tố LT không bền với nhiệt, gây hoạt hóa men adenylcyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’monophotphat) Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl - và bicarbonat tách ra khỏi tế bào đồng thời ức chế Na + bên trong tế bào Hậu quả là gây tiêu chảy mất nước

+ Độc tố ST bền với nhiệt Cơ chế tác động của ST là hoạt hóa men guanylcyclase làm tăng yếu tố C.GMP (cyclic guanosin 5’ monophotphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước, gây tiêu chảy

- Nhóm EIEC (EnteroInvasine E.coli) những E.coli này bám lên niêm mạc và làm tróc niêm mạc gây loét niêm mạc, gây tiêu chảy có đàm lẫn máu Bệnh lý giống hội chứng lỵ do Shigella

KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRÊN SẢN PHẨM PÂTÉ

II.1 Nội dung kiểm tra vi sinh vật :

- Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí

- Định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN

II.2 Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ :

Pate gan hộp của VISSAN loại 170 gam được mua tại siêu thị Coop Mart Hà Nội (10 mẫu) và Pate tại các điểm bán lẻ dọc đường trên địa bàn quận 2 và quận 9 (10 mẫu)

- Các môi trường nuôi cấy vi sinh (phụ chương)

- Các hóa chất dùng trong kiểm tra vi sinh (phụ chương)

-Đĩa petri - Bếp cách thủy

-Oáng nghiệm - Cân điện tử

-Pipette đủ các loại dung tích - Kẹp

-Oáng đong - Phòng cấy vô trùng

-Kớnh hieồn vi - Tuỷ saỏy

II.3 Tiến hành thí nghiệm :

25 gam pate pha trong 225 ml photphat đệm Độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 Độ pha loãng 10 -1

TSVKHK Coliforms E.C Sta.aureus Sal Cl sinh H 2 S

Tra bảng MPN và tính số lượng

Thử sinh hóa Kết luận Thử sinh hóa

- Mẫu lấy là pate gan hộp VISSAN (10 mẫu) và pate đường phố (10 mẫu)

- Mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên, đồng đều và đại diện cho mẫu tại nơi khảo sát

- Khối lượng mỗi lần lấy mẫu là 200 gam

- Mẫu được kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu đề ra, trọng lượng dư được giữ lại để lưu mẫu đối chiếu khi cần thiết

II.3.2 Phương pháp kiểm tra vi sinh :

II.3.2.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí : a Nguyeân taéc :

Vi khuẩn hiếu khí là những vi sinh vật sống trong điều kiện có oxy tự do Số lượng vi sinh vật hiếu khí trên 1 gam mẫu được xác định theo phương pháp đếm tổng số vi khuẩn trên đĩa dựa trên qui ước mỗi khuẩn lạc phát triển từ một vi khuẩn Thực chất, đây là phương pháp xác định số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí treân 1 gam maãu b Môi trường nuôi cấy :

- Môi truờng NA (Nutrient agar )

- Dung dịch pha loãng mẫu : dung dịch photphat đệm c Tiến hành thí nghiệm :

Dùng phương pháp đếm trên thạch đĩa : Plate Count Agar

- Mọi thao tác nuôi cấy đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng Tất cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu đều phải vô trùng

- Cân 25g mẫu được lấy từ 200g mẫu ban đầu, cho vào bình erlen có chứa 225ml dung dịch photphat đệm Sau đó đưa lên máy lắc, lắc đều trong 20 phút

- Duứng oỏng huựt pipette, huựt 1ml dung dũch maóu trong bỡnh erlen (dung dũch này có độ pha loãng 10 -1 ) cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml photphat đệm

Lắc đều ống nghiệm để có độ pha loãng 10 -2 , pha tiếp tương tự để có dung dịch có độ pha loãng 10 -3 , 10 -4 ,10 -5 …

- Tùy thuộc mức độ nhiễm khuẩn của từng loại mẫu mà ta chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp Thông thường, thực phẩm như pate hộp phải pha loãng ở nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 ; đối với pate đường phố phải pha loãng ở nồng độ 10 -3 ,10 -

- Dùng pipette 1ml hút 0,1ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri có đổ sẵn 15-20ml môi trường NA đã thanh trùng ở t o 121 o C/15 phút Sau đó, dùng que cấy trang trải đều mẫu, mỗi nồng độ pha loãng cấy trang vào 2 đĩa petri có sẵn môi trường NA (tất cả thực hiện trong phòng cấy vô trùng)

- Kế tiếp đem đĩa petri để vào tủ ấm ở t o 37 o C/24 giờ, đọc kết quả d Cách đếm khuẩn lạc : Đếm khuẩn lạc bằng cách chia từng ô hay chấm dấu mực ở đáy đĩa petri Lượng vi sinh vật có trong 1ml mẫu nguyên chất là tỉ số giữa tổng số vi khuẩn trong các đĩa trên số khuẩn lạc ở mỗi đĩa nhân với hệ số pha loãng tương ứng Công thức tính:

Trong đó : ΣC : tổng số vi khuẩn trong các đĩa n1 :số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 1 n2 : số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 2 n3 : số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 3 d : mẫu có độ pha loãng thấp nhất

Vớ duù: Đĩa 1 có 70 khuẩn lạc Đĩa 2 có 60 khuẩn lạc

- Ở nồng độ pha loãng 1/10 3 (10 -3 ) Đĩa 1 có 55 khuẩn lạc Đĩa 2 có 50 khuẩn lạc

- Ở nồng độ pha loãng 1/10 4 (10 -4 ) Đĩa 1 có 40 khuẩn lạc Đĩa 2 có 32 khuẩn lạc

Vậy tổng số khuẩn lạc trong các đĩa là : ΣC= 70+60+55+50+40+32 = 307 khuẩn lạc Vậy số khuẩn lạc có trong 1g mẫu hay 1ml mẫu :

X C (khuẩn lạc/1g hay ml maãu) Đọc kết quả : tất cả các khóm trên đĩa TCVN : 15 –300 khóm

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

(A) Khuẩn lạc (B) Khuẩn lạc (C) Khuẩn lạc

SƠ ĐỒ XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Hỡnh 3.1 5: Vi khuaồn hieỏu khớ

II.3.2.2 Đếm chỉ số Coliforms và định lượng Escherichia coli bằng phương pháp MPN : a Nguyeân taéc :

Coliforms là những trực khuẩn đường ruột, gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, có khả năng lên men sinh hơi đường lactose ở

Escherichia coli là dạng Coliforms phân có nguồn gốc từ phân, phát triển trong điều kiện 44 – 46 o C , có khả năng sinh Indol, lên men sinh hơi đường lactose, sinh acid (phản ứng MR+), không sinh axeton (phản ứng VP-) và không sử dụng citrat làm nguồn cacbon duy nhất (phản ứng citrat -) b Môi trường nuôi cấy :

- Môi trường tăng sinh chọn lọc BGBL (Brilliant Green Bile Lactose)

- Môi trường chuyên biệt EC (Enricherment Coli)

- Môi trường phân lập EMB Agar (Eozin Methyl Blue) hay Macconkey

- Môi trường phản ứng sinh hóa Indol, MR – VP, Simon Citrat Agar

- Thuốc thử : dung dịch Methyred 2%, dung dịch NaOH 40%, dung dịch thuốc thư û α- naphtol, thuốc thử Kowacs c Tiến hành thí nghiệm :

Mẫu được lấy và pha loãng ở 3 nồng độ liên tiếp

Dùng 9 ống nghiệm có chứa sẵn môi trường BGBL có ống Durham úp ngược, mỗi ống cho vào 1ml mẫu pha loãng Dùng 3 ống nghiệm có chứa môi trường cho mỗi nồng độ pha loãng, để tủ ấm 37 o C/24 giờ Sau đó chọn ống sinh hơi lên men đường lactose (ống (+), đục đều) Ta có từng chỉ số ở mỗi nồng độ pha loãng, dựa theo bảng Mac.Crady suy ra chỉ số MPN, tính được tổng số Coliforms trong 1ml dung dịch mẫu hay 1g thực phẩm

Hình 3.16 : Coliforms taêng sinh trong mt BGBL Oáng (+) : Sinh hơi có bọt khí, môi trường đục

Oáng (-) : Không sinh hơi, môi trường trong

Ví dụ : Trong 9 ống nghiệm có

- Ở nồng độ 10 -3 có 2 ống sinh hơi, lên men đường lactose

- Ở nồng độ 10 -4 có 1 ống sinh hơi, lên men đường lactose

- Ở nồng độ 10 -5 không có ống sinh hơi

Tra bảng Mac.Crady ta có số ống dương là 210 suy ra chỉ số là 1,5 Vậy số vi sinh vật trong 1ml mẫu là chỉ số có được 15 x hệ số pha loãng thấp nhất là

1000 = 1,5.10 3 Coliforms /1ml maãu hay 1g maãu nguyeân Định lượng Escherichia coli bằng phương pháp MPN

Chọn ống sinh hơi, lên men đường lactose ở môi trường tăng sinh BGBL

Hút 0,1 ml dung dịch mẫu cấy sang môi trường chuyên biệt EC, ủ 44 o C/24 giờ Đọc kết quả, chọn ống (+), sinh hơi cấy sang môi trường phân lập EMB Agar hay Macconkey

Hình 3.17 : VK E.Coli taêng sinh trong mt EC Oáng (+): Sinh hơi có bọt khí, môi trường đục Oáng (-) : Không sinh hơi, môi trường trong

Nếu trên môi trường phân lập EMB Agar có Escherichia coli (E.coli) sẽ tạo khuẩn lạc tím ánh kim, dẹt, tròn, đường kính từ 1-3mm hay môi trường

Macconkey có E.coli tạo khuẩn lạc màu đỏ, ướt, hơi lồi

Hình 3.18 : VK E.Coli tạo khuẩn lạc tím ánh kim trên mt EMB

Bảng 3.1 :PHẢN ỨNG IMVIC Môi trường Dung dịch thử

Phản ứng traộc nghieọm AÂm tớnh (-) Dửụng tớnh (+)

INDOL Kowacs Không tạo vòng đỏ Có vòng đỏ tím xuất hiện trên môi trường

MR Methyl red Môi trường có màu vàng

Môi trường có màu đỏ

Môi trường có màu vàng

Môi trường chuyển sang màu hồng lợt

CITRAT Không dùng Không có sự chuyển màu Đổi màu môi trường từ xanh lá cây sang xanh dửụng

Hình 3.19 : MT thử phản ứng sinh hóa vi khuẩn E.Coli

Nếu các môi trường trên có kết quả phản ứng E.coli ở nồng độ pha loãng 10 -

3 có 1 ống, 10 -4 không có, 10 -5 không có Tra bảng MNP ở chỉ số 100 ta có 0,4 x1000 = 400 Có thể kết luận số lượng E.coli trong 1ml mẫu nguyên là 400 vi khuẩn (1000 là độ pha loãng thấp nhất)

SƠ ĐỒ KIỂM TRA COLIFORMS VÀ E.COLI

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Chọn khuẩn lạc đặc trưng và thử sinh hóa Kết luận

II.3.2.3 Kieồm nghieọm Salmonella : a Nguyeân taéc :

Vi khuẩn Salmonella là vi khuẩn trực khuẩn, gram âm, vừa hiếu khí vừa hiếu khí tùy nghi, có khả năng di động, không sinh bào tử, không lên men đường lactose, saccharose, lên men glucose, và nhiều loại đường khác, sinh hơi, sinh acid b Môi trường nuôi cấy :

- Môi trường tiền tăng sinh hay gọi là pepton đệm

- Môi trường tăng sinh Tetrathionat broth hay Rappaport

- Môi trường phân lập BSA (Bis Muthsulfile Agar)

Môi trường thử phản ứng sinh hóa, thuốc thử giống xác định E.coli c Tiến hành thí nghiệm :

- Mẫu được pha loãng ở nồng độ 10 -1 (cân 25g mẫu pate hòa vào 225ml môi trường tiền tăng sinh hay gọi là pepton đệm),ủ 37 o C trong 24 giờ Sau đó dùng pippet hút 1ml từ môi trường pepton đệm đã cấy mẫu cho vào môi trường tăng sinh Rappaport, ủ 44 o C /24 giờ Đọc kết quả, Salmonella làm đục môi trường tăng sinh, tạo váng mỏng

- Tiến hành phân lập trên môi trường BSA

- Nếu có Salmonella thì xuất hiện khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bóng, màu đen, đường kính từ 2-4mm

- Chọn khuẩn lạc nghi ngờ, nhuộm gram soi kính và thử phản ứng sinh hóa Trên môi trường KIA (Kigler Iron Agar) sau 24 giờ nuôi cấy, Salmonella giữ nguyên phần màu đỏ của môi trường thạch nghiêng (lactose (-)), đáy ống nghiệm chuyển sang màu vàng (glucose (+)), ở giữa ống nghiệm có màu đen sinh hôi

Thử phản ứng sinh hóa IMVIC có phản ứng Indol-, MR+, VP-,citrat+

Hình 3.20 : MT thử phản ứng sinh hóa VK Salmonella

Hình 3.21 : VK Salmonella tạo khuẩn lạc màu đen trên mt BSA

Uû 37 0 C /24h, đọc kết quả : chọn khóm màu đen, hơi lồi, tròn

Thử phản ứng sinh hóa

KIA đỏ/vàng I(-),MR(+),VP(-),C(+)

SƠ ĐỒ XÁC ĐỊNH SALMONELLA

II.3.2.4 Kieồm nghieọm Staphylococcus aureus baống phửụng pháp MPN a Nguyeân taéc :

Staphylococcus aureus là loại cầu khuẩn gram dương, thường tụ thành đám dạng chùm nho , không sinh bào tử, không di động Có khả năng lên men mannitol, đông huyết tương , hiếu khí không bắt buộc và chịu được nồng độ muoái cao 7,5% b Môi trường nuôi cấy :

- Môi trường tăng sinh MSB (mannitol Salt Broth)

- Môi trường phân lập MSA (mannitol Salt Agar)

- Môi trường canh BHI (Brain Heat Infusion broth)

- Test ủoõng huyeỏt tửụng Coagulase c Tiến hành thí nghiệm :

PHUẽ LUẽC

MÔI TRƯỜNG DÙNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

1.1 Môi trường dùng xác định tổng số vi khuẩn hiến khí :

Nutrient Agar (NA hay thạch dinh dưỡng)

Nước cất :1000ml Agar :15-20g pH :7,4-7,6

1.2 Môi trường dùng kiểm tra coliforms và E.Coli:

Brilliant green bile lactose broth (BGBL)

Eozin methyl blue agar (EMB):

Agar :15g Nước cất :1000ml pH :7,1±0,2

Nutrient broth ( NB:canh dinh dưỡng) dùng thử phản ứng Indol

Nước cất :1000ml pH :6,8±0,2 Hấp khử trùng 121 0 C/15-20phút

Nuôi cấy vi khuẩn sau 24h, lấy ra nhỏ vài giọt thuốc thử Kowacc

Clark lub medium (hay MR-VP meidum)

Hấp khử trùng 121 0 C/15-20phút Nuôi cấy vi khuẩn sau 24h, lấy ra nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red

Simon citrat medium (hay Kosers citrat medium)

Nước cất :1000ml Hấp khử trùng 121 0 C/15-20phút

1.3 Môi trường dùng kiểm tra Salmonella:

Môi trường tiền tăng sinh:

Môi trường tăng sinh Rappaport:

Môi trường Bimuth Sunfite Agar(BSA):

Môi trường này không khử trùng chỉ đun sôi rồi đổ đĩa

Môi trường Brilliant Green Agar ( BGA):

NaCl :5g Brilliant :12.5g Agar :15g Nước cất :1000ml pH :6,9 ± 0,2

Giống môi trường dùng kiểm tra Coliforms và E Coli

Giống môi trường dùng kiểm tra Coliforms và E Coli

Clark lub medium (hay MR_VP medium)

Giống môi trường dùng kiểm tra Coliforms và E Coli

Giống môi trường dùng kiểm tra Coliforms và E Coli

1.4 Môi trường dùng kiểm tra Staphylococcus aureus:

Mannitol Salt broth và Mannitol Salt agar (MSB và MSA)

P Mannitol :2,5g Phenol red :0,025g Nước cất :1000ml pH :7,4 ± 0,2

Môi trường Brain heat infusion broth (BHI):

Thử nghiệm các phản ứng:

Lên men glucose và mannitol kỵ khí

Dung huyết trên môi trường thạch máu

1.5 Môi trường dùng kiểm tra vi khuẩn sinh H 2 S:

Môi trường Tryptose Sulfite Cycloseric Agar(TSC):

II CÔNG THỨC PHA HÓA CHẤT:

Dung dòch goác : KH2SO4 :34g

Dung dịch pha mẫu : lấy 12.5ml dung dịch gốc trên cho vào một lít nước cất Phân vào chai 90ml và ống nghiệm 9 ml Khử trùng 121 0 C/15-20phút

Coàn Ethanol (hay amylic ) :75ml

Hòa D dimetyminobenzaldehyte vào cồn, từ từ cho HCl vào giữ 4 0 C

Hòa Methyl red vào ethanol, bổ sung đủ 50ml nước cất

NaOH :45g pha vào 50ml nước cất lắc đều để 24 giờ gạn lấy trong bên trên rồi pha loãng với nước sôi để nguội đủ một lít

Các dung dịch 0,1N và 0,5N pha từ dung dịch 1N

2.6 Thuốc thử và Naphotol 5% trong cồn :

Bảo quản lạnh trong chai màu trước khi dùng

Coàn 70 o :100ml Đựng trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh

2.8 Thuốc nhuộm: Crystal violet (C 25 H 30 N 3 Cl.9H 2 0W0.11)

III BẢNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM 7049 (2002) CỦA CÁC SẢN PHẨM CHẾ

BIẾN TỪ THỊT QUA XỬ LÝ NHIỆT:

Teõn chổ tieõu Yeõu caàu Toồng soỏ vi khuaồn hieỏu khớ

Salmonella Staphylococcus aureus Clotridium perfrigens

IV NHỮNG PHỤ GIA ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM :

Axit benzoic :(benzoic acid) Được dùng trong nước giải khát, giới hạn tối đa cho phép (GHTĐCP) là 600mg/kg; trong dưa chuột dầm đóng lọ 1g/kg dùng một mình hoặc kết hợp với natri, cali benzoat, cali sorbat, margarin, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và các muối sorbat; nước dứa ép đậm đặc, GHTĐCP là 1g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và các muối sorbat với các sunphit nhưng sunphit không quá 500mg/kg; tương cà chua, các thực phẩm khác, GHTĐCP là 1g/kg

Axit propionic (propionic acid) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là 3g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và sorbat, bánh mì, GHTĐCP là 2g/kg

Axit sorbic (sorbic acid) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là 3g/kg, dùng một mình hay kết hợp với các sorbat, axit propionic và các propionat; margarin, mức, thạch quả, nước dứa ép đậm đặc có chất bảo quản, GHTĐCP là 1g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit benzoic và các benzoat; quả mơ khô, GHTĐCP là 500mg/kg dùng một mình hay kết hợp với acid sorbic và natri sorbat

Canxi benzoat (calcium benzoate) Được dùng trong tương cà chua, nước hoa quả ép đậm đặc, GHTĐCP là 1g/kg, dùng một mình hay kết hợp với natri, kali bezoat, với axit sorbic và với các sunphit nhưng sunphit không quáù 500g/kg; rượu vang, các đồ uống có rượu, GHTĐCP là 200mg/kg

Canxi sorbat (calcium sorbate) Được dùng trong margarine,GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hoặc kết hợp với axit sorbic, axit benzoic và các benzoat, sorbat, nước ép dứa đậm đặc, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit benzic và các benzoat, sorbat và với các sunphit nhưng sunphit không quá 500mg/kg

Kali bisunphit (potassium bisulphit) Được dùng trong khoai tây rán đông lạnh, GHTĐCP là 50mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác; nước dứa ép đậm đặc, GHTĐCP là 500mg/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit benzoic và các bezoat, với sunphit khác; tôm tươi, tôm đông lạnh, GHTĐCP là 100mg/kg trong sản phẩm chế biến Dùng một mình hay kết hợp với các sunphit khác

Kali nitrat (potassium nitrat) Được dùng trong thịt hộp, thịt muối, lạp xường, jămban, GHTĐCP là 500mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với natri nitrat; phomat, GHTĐCP là 50mg/kg dùng một mình hay kết hợp với natri nitrat

Kali propionat (potassium propionat) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là 3g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit propionic, sorbic và các sorbat

Kali sorbat (potassium sorbat) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là 3g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit propionic và propionat; phomat, margarin, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit benzoic và các benzoat; mơ khô, mức cam, GHTĐCP là 500mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic; dưa chuột dầm đóng lọ, mức, thạch quả, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit benzoic và natri, kali benzoat; nước dứa ép đậm đặc, HGTĐCP là 1g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit benzoic và các benzoat với sunphit nhưng sunphit không quáù 500mg/kg

Natri benzoat (sodium benzoate) Được dùng trong dưa chuột dầm, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit benzoic, natri và kali sorbat; mức thạch quả, GHTĐCP là 1g/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, kali sorbat và este của para- hydroxybenzoat; nước giải khác, GHTĐCP là 600mg/kg; xốt cà chua và thực phẩm khác, GHTĐCP là 1g/kg

Natri hydro sunphit (sodium hydrogen sulphite) Được dùng trong khoai tây rán đông lạnh, GHTĐCP là 50mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác; nước dứa ép đậm đặc, GHTĐCP là 500mg/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic, axit benzoic và các benzoat, với sunphit khác; tôm tươi, tôm đông lạnh, GHTĐCP là 100mg/kg trong sản phẩm thô, 30 mg/kg trong sản phẩm chế biến Dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác

Natri meta bisunphit (sodium meta bisulphate) Được dùng trong khoai tây rán đông lạnh, GHTĐCP là 50 mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác; tôm tươi, tôm đông lạnh, GHTĐCP là

100 mg/kg trong sản phẩm chế biến, dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác

Natri nitrat (sodium nitrate) Được dùng trong thịt hộp, thịt muối, lạp xường, jămbon, GHTĐCP là 500 mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với natri nitrat; phomat, GHTĐCP là 50mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với kali nitrat

Natri propionat (sodium propionate) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là 3g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và sorbat; bánh mì, GHTĐCP là 2g/kg

Natri sorbat (sodium sorbate) Được dùng trong mơ khô, mức chanh, GHTĐCP là 500mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và các benzoat; dưa chuột dầm, margarin, mức thạch quả, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit benzoic và các benzoat; nước ép dưa đậm đặc, GHTĐCP là 1g/kg dùng một mình hay kết hợp với axit benzoic và các benzoat với sunphit nhưng sunphit không quá 500mg/kg

Natri sunphit (sodium sulphite) Được dùng trong khoai tây rán đông lạnh, GHTĐCP là 50mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác; nước dứa ép đậm đặc, GHTĐCP là 500mg/kg, dùng một mình hay kết hợp với axit sorbic và các benzoat, với sunphit khác; tôm tươi, tôm đông lạnh, GHTĐCP là 100mg/kg trong sản phẩm thô, 30mg/kg trong sản phẩm chế biến Dùng một mình hay kết hợp với sunphit khác

Nisin (nisin) Được dùng trong sản xuất phomat, GHTĐCP là12,5mg/kg

Sunphua dioxyt (sulphur dioxide) Được dùng trong dưa chuột dầm đóng lọ, GHTĐCP là 50mg/kg; mức thạch quả là 100mg/kg; nước hoa quả ép đậm đặc, tương cà chua, 350mg/kg; đường bột, đextro bột: 20mg/kg; đường trắng, dấm, xirô, bia, nước giải khát: 70 mg/kg; rượu vang: 200mg/kg, xúc xích: 150mg/kg; cà phê tan 150mg/kg; gelatin: 1g/kg; thực phẩm khác: 500mg/kg

1 Tô Minh Châu, “Giáo trình kiểm tra chất lượng thực phẩm”, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM

2 Tô Minh Châu – Phan Hữu Nghĩa, “Giáo trình thực tập vi sinh cơ sở”, Khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM

3 Tô Minh Châu – Phan Hữu Nghĩa – Nguyễn Minh Hoàng – Nguyễn Văn Minh, “Giáo trình thực hành kiểm tra chất lượng thực phẩm”, Khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM

4 Bộ nội thương (1981), “Thương phẩm học, gia súc, gia cầm, thịt, trứng, Hà Nội

5 Phạm Văn Sổ – Bùi Thị Như Thuận, “Kiểm nghiệm lương thực thưc phẩm”, Nxb khoa học và kỹ thuật

6 Leõ Vaờn Vieón – Leõ Khaộc Huy – Nguyeón Thũ Lieõn (1997), “Coõng ngheọ sau thu hoạch đối với các sản phẩm chăn nuôi”, Nxb nông nghiệp Hà Nội

7 Trần Linh Thước, “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm”, Ncb giáo dục

8 Phan Hoành Thi – Đoàn Thị Ngọt (1984), “Bảo quản và chế biến sản phẩm động vật”, Nxb nông nghiệp Hà Nội