Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật vật liệu: Nghiên cứu quá trình nhả thuốc Insulin của hệ - hạt Micro Chitosab-Insulin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Đại Phú

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét:

1: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét:

2: PGS.TS Nguyễn Đại Hải

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày 12 tháng 09 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đắc Thành

2 Thư ký: TS Nguyễn Thị Lê Thanh

3 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong 4 Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Đại Hải

5 Ủy viên: TS La Thị Thái Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAĐộc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 31/01/1995 Nơi sinh: Bến Tre

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHẢ THUỐC INSULIN CỦA HỆ - HẠT MICRO CHITOSAN – INSULIN/ OS-PLA-PEG-PLA-OS

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tổng hợp oligomer serine (OS) nhạy pH, triblock PLA-PEG-PLA nhạy nhiệt độ, pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS và vi hạt chitosan mang thuốc insulin (CINs)

- Đánh giá khả năng chuyển trạng thái sol-gel trong môi trường in vitro của

pentablock copolymer, độ nhớt của pentablock copolymer và hệ vận chuyển thuốc CINs-pentablock ở pH 7,4 và 8,9

- Đánh giá khả năng tương thích sinh học của pentablock, CINs trong môi trường

in vitro và thế zeta của hệ vật liệu mang thuốc

- Khảo sát khả năng gel hóa trong môi trườn in vivo và khả năng phân hủy sinh

học theo thời gian của pentablock copolymer và hệ chitosan-pentablock copolymer

- Đánh giá hình dạng, sự phân bố hạt chitosan và sự sinh trưởng tế bào bên trong

khối gel của hệ chitosan-pentablock copolymer in vivo

- Khảo sát khả năng điều trị bệnh tiểu đường loại 1 bằng hệ vận chuyển thuốc insulin CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS ở các tỷ lệ khác nhau

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 24/02/2020 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/12/2020 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Huỳnh Đại Phú

i

tôi thực hiện luận văn này Thầy luôn theo dõi chi tiết các hướng thí nghiệm, Thầy tận tình chỉ bảo, chia sẻ rất nhiều kiến thức quý báu trong suốt chương trình học tập của tôi Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Doo Sung Lee và tập thể các anh chị của phòng thí nghiệm Polymer Nano Structure and Properties, Theranostic Macromolecules Research Center, South Korea đã hỗ trợ về cơ sở vật chất, tinh thần, quy trình thủ tục thí nghiệm trong quá trình thực tập ngắn hạn của tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh/chị/em: Phạm Ngọc Sinh, Lê Thái Minh Duy, Hồ Hoàng Gia Vinh, Tô Thị Cẩm Thạch….tại Phòng thí nghiệm tại Trung Tâm Nghiên Cứu Vật Liệu Polymer đã cùng giúp đỡ, cùng thảo luận và góp ý cho nhiều ý tưởng đa dạng trong suốt quá trình nghiên cứu

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn yêu thương nhất đến gia đình tôi, nơi có cha, mẹ, chị và em gái tôi luôn tạo nguồn động lực cho tôi cố gắng mỗi ngày, để tôi vượt lên giới hạn của bản thân

Trong quá trình thực hiện luận văn không tránh khỏi những sai sót nhất định, rất mong quý thầy cô, anh chị cũng như các bạn đọc thông cảm và đóng góp ý kiến để tôi điều chỉnh hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

ii

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Luận văn này phát triển theo hướng nghiên cứu chế tạo hệ vận chuyển thuốc hạt micro-chitosan mang thuốc insulin (CINs) và hydrogel nhạy pH/nhiệt độ, đã thực hiện các nội dung chính như sau:

Thừa hưởng kết quả tốt nhất của nhóm nghiên cứu trước và tổng hợp thành công pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymer (PEG/LA/OS = 1:2:6) có Mn = 4130 g/mol (627-2877-627), với độ phân tán là PDI = 1,203; hạt CINs có thông số tạo hạt Cchitosan = 3,25wt%; U = 12,5kV; Q = 0,2mL/h; L = 13 cm và đầu kim tiêm 18G tạo

được hạt cầu rời rạc có Dtb = 268,2 ± 138,5nm (số hạt n = 505)

Đánh giá sản phẩm in vitro: pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS nhạy pH/nhiệt

độ, CINs được kiểm tra sự tương thích sinh học với dòng tế bào 293T, RAW 264.7; độ nhớt dung dịch pentablock và hệ mang thuốc, thế zeta và đường kính trung bình của các micelle ở điều kiện pH 7,4 và 8,9

Đánh giá sản phẩm in vivo: hạt micro-chitosan phân tán trong pentablock

copolymer OS-PLA-PEG-PLA-OS nhạy pH/nhiệt độ được đánh giá khả năng phân hủy

sinh học tại pH 8,9; tất cả các mẫu thử nghiệm trong môi trường in vivo được mổ tách

lấy mẫu để quan sát kích thước, hình dạng mẫu gel, tất cả mẫu được sấy đông khô và cân lấy khối lượng, chụp SEM tại mặt cắt ngang để đánh giá lỗ xốp và phân bố hạt

Gây bệnh tiểu đường loại 1 bằng thuốc STZ trên cơ thể chuột có trọng lượng 20g, chia thành 5 nhóm (n=4) và điều trị bệnh bằng các tỷ lệ insulin khác nhau, cụ thể:

18-Nhóm 1: 100L dung dịch 30wt% pentablock copolymer

Nhóm 2: 100L dung dịch CINs trong PBS tại pH 7,4 (0,375 mg/mL CINs) Nhóm 3: 100L dung dịch insulin trong PBS (insulin 0,075mg/mL)

Nhóm 4: 100L với 2,5wt% CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS (0,25mg/mL CINs) Nhóm 5:100L với 3,75wt% CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS (0,375mg/mL CINs) với lượng thuốc insulin được “đóng gói” trong hạt chitosan là không đổi 20wt%

Tại thời điểm 1h, 2h, 4h…72h… xác định chỉ số nồng độ đường huyết bằng bộ thử đường huyết và hàm lượng thuốc insulin nhả ra trong huyết tương của chuột bằng bộ insulin ELISA Đồng thời, quan sát hành vi chuột và theo dõi trọng lượng cơ thể trong suốt quá trình điều trị

iii

ABSTRACT

A novel insulin composite delivery system was prepared and characterized The composite consisted of a pH-and temperature-sensitive hydrogel which is oligomer serin-b-poly (lactide)-b-poly (ethylene glycol)-b-poly (lactide)-b- oligomer serin (OS-PLA-PEG-PLA-OS) pentablock copolymer as matrix and chitosan-insulin electrosprayed nanosphere (CINs) as constituent materials The OS-PLA-PEG-PLA-OS pentablock copolymer and the chitosan-insulin nanoparticles’ properties were investigated The chitosan-insulin nanospheres uniformly distributed in the matrix showed the reinforcing effect on the mechanical property and prolonged the degradation time of the hydrogel depot in body condition The composite solutions accommodating different concentrations of the chitosan-insulin nanospheres were

subcutaneously injected into induced diabetic BALB/c mice to study the in vivo insulin-release

profile The result showed that insulin concentrations in blood plasma were maintained at a steady-state level

Furthermore, the bio-property of the insulin was reserved and showed blood glucose level reducing effect for more than 60 hours after injection to streptozotocin (STZ)-induced diabetic mouse model The results suggested that this injectable pH-temperature sensitive hydrogel contained chitosan-insulin electrosprayed nanospheres composites have promising potential applications for diabetes type 1 treatment

iv

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Tôi xin can đoan toàn bộ số liệu trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Huỳnh Đại Phú

Tp.HCM, ngày 20 tháng 08 năm 2020 Người thực hiện

Trịnh Thúy An

1.1.4 Hydrogel có khả năng nhạy cảm pH và nhiệt độ 9

1.2 Tổng quan về hạt chitosan mang thuốc 11

1.2.1 Nguyên lý tạo hạt bằng phương pháp electrospraying 11

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình dạng và kích thước của hạt cầu 12

1.3 Các quá trình phân hủy sinh học và quá trình giải phóng thuốc từ hệ vận chuyển thuốc 15

1.3.1 Quá trình phân hủy sinh học của hydrogel, hạt mang thuốc trong môi trường in vitro 15

1.3.2 Quá trình phân hủy sinh học của hydrogel trong môi trường in vivo 20

1.4 Ứng dụng hệ vận chuyển thuốc trong điều trị bệnh 23

1.4.1 Tổng quan bệnh tiểu đường loại 1 23

1.4.2 Ứng dụng điều trị bệnh tiểu đường loại 1 bằng hệ vận chuyển thuốc 25

1.4.3 Cơ chế phân rã, quá trình đào thải các polymer trong môi trường in vivo 27

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 31

2.1 Nguyên liệu 31

2.2 Thiết bị - Dụng cụ 34

2.3 Phương pháp phân tích 34

vi

2.3.1 Quan sát hình thái hạt bằng kính hiển vi điện tử quét – SEM 34

2.3.2 Phương pháp sắc kí gel GPC 35

2.3.3 Phân tích cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR 35

2.3.4 Phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển 35

2.3.5 Phương pháp thử nghiệm khả năng tương thích sinh học của copolymer trong môi trường in vitro 36

2.5.3 Quy trình tổng hợp pentablock nhạy nhiệt/pH OS-PLA-PEG-PLA-OS 46

2.5.4 Quy trình tổng hợp hạt chitosan mang thuốc insulin 48

2.5.5 Quy trình chế tạo hệ vận chuyển thuốc từ pentablock nhạy pH/nhiệt độ và hạt Chitosan mang Insulin 49

2.5.6 Quy trình gây bệnh tiểu đường cho chuột 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52

3.1 Tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt độ/pH OS-PLA-PEG-PLA-OS và hạt Chitosan mang thuốc insulin 52

3.1.2 Tổng hợp hạt micro Chitosan-Insulin bằng phương pháp electrosprayed 55

3.2 Đánh giá độ nhớt, thế zeta và khả năng tương thích sinh học pentablock copolymer và hệ CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS 57

3.2.1 Khảo sát độ nhớt của pentablock copolymer và CINs-pentablock tại các điểm pH khác nhau 57

3.2.2 Thế zeta của hệ CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS 58

3.2.3 Khả năng tương thích sinh học của CINs và pentablock trên dòng tế bào 293T, RAW 264.7 60

3.3 Nghiên cứu chế tạo hệ vận chuyển thuốc insulin CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS trong môi trường in vivo 61

3.3.1 Khảo sát khả năng sol-gel, phân hủy sinh học của pentablock copolymer và hệ CS-pentablock copolymer trong môi trường in vivo 61

vii

3.3.2 Khảo sát thời gian phân hủy sinh học và cấu trúc bên trong hệ hydrogel và

CS-hydrogel in vivo 64

3.3.3 Đánh giá quá trình sinh học của tế bào lên cấu trúc của mẫu gel in vivo 66

3.4 Đánh giá khả năng giải phóng thuốc insulin của hệ CINs/OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymer trên cơ thể chuột bị bệnh tiểu đường loại 1 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 79

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 103

Hình 1.12 A/ 20wt% PEG – PSMEU copolymer ở trạng thái gel dưới da trên lưng chuột SD B/ Hình ảnh thể hiện sự phân hủy sinh học của hydrogel trong môi trường in vivo

ở các điểm thời gian xác định; C/ Nhuộm H&E mẫu da xung quanh khối gel và quan sát dưới kính hiển vi quang học [27,29] 18

Hình 1.13 Ảnh SEM thể hiện A/ Hạt chitosan chứa 10wt% insulin được tạo bởi phương

pháp electrosprayed, B/ Sự thay đổi hình dạng hạt mang thuốc sau 9 ngày được ngâm trong dung dịch PBS (Phosphate-Buffered Saline Solution) [36] 19

ix

Hình 1.14 Sự phân hủy sinh học của pentablock nhạy pH/ nhiệt độ ở môi trường in vivo 300L dung dịch copolymer (30wt%, Mn = 1750g/mol; PCL/PEG =1,8/1; OS = 1,34kDa) được tiêm dưới lớp da của lưng chuột SD tại (A) 3h; (B) 1 tuần; (C) 2 tuần;

(D) 3 tuần (E) Khả năng phân hủy sinh học của hydrogel in vivo được xác định bằng

phương pháp giảm khối lượng [36] 21

Hình 1.15 Sự phân phối thuốc từ một hệ thống phức hợp hydrogel [46] 22

Hình 1.16 Vị trí tuyến tụy, tế bào beta bình thường và bị phá hủy thu hẹp diện tích [43] 24

Hình 1.17 Nồng độ insulin trong huyết tương của chuột SD 25

Hình 1.18 Sơ đồ giải thích cách nạp và giải phóng insulin trên nền hydrogel [9] 27

Hình 1.19 Các quá trình phân hủy PEG nội bào 29

Hình 1.20 Mô tả các phân tử sau các giai đoạn bị phân cắt bởi enzym 30

Hình 2 1 Các trạng thái sol – gel của phương pháp nghịch chuyển 36

Hình 2.2 Mẫu CINs và pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymerr trong thử nghiệm khả năng tương thích sinh học với tế bào in vitro 37

Hình 2.3 Mô phỏng quy trình thử nghiệm phân hủy sinh học trong môi in vivo 38

Hình 2.4 Mô hình khảo sát khả năng trị bệnh của hệ mang thuốc CINs 39

Hình 2.5 Giai đoạn 1 tổng hợp pentablock, CINs của đề tài 40

Hình 2.6 Giai đoạn 2 - Pentablock copolymer và CINs được đánh giá độ nhớt hệ ở các tỷ lệ pH khác nhau, khả năng tương thích sinh học, phân hủy sinh học 41

Hình 2.7 Giai đoạn 3 – thử nghiệm hệ complex gel trong môi trường in vivo và tìm ra thông số thử nghiệm phù hợp nhất 42

Hình 2.8 A) Cơ chế phản ứng tạo nhóm sulfonamide; B) Các cơ chế tạo triblock và cơ chế gắn nhóm OS lên triblock để tạo thành pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymer 43

Hình 2.9 Quy trình tổng hợp Triblock PLA-PEG-PLA 44

Hình 2.10 Quy trình tổng hợp mSerine 45

Hình 2.11 Phương trình tổng hợp pentablock nhạy nhiệt/pH 46

Hình 2.12 Sơ đồ khối quy trình tổng hợp OS-PLA-PEG-PLA-OS Copolymer 47

Hình 2.13 Quy trình chế tạo micro chitosan mang thuốc insulin (CINs) 48

Hình 2.14 Sơ đồ khối thể hiện quy trình gây bệnh tiểu đường 50

x

Hình 3.1 Quá trình chuyển pha sol-gel của pentablock trong môi trường in vitro tại 30wt% OS-PLA-PEG-PLA-OS; a) trạng thái sol; b) trạng thái gel; c) trạng thái vữa-sol.

52 Hình 3.2 Giản đồ chuyển pha sol-gel của pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymerr 53 Hình 3.3 Sự phân bố kích thước trung bình của pentablock copolymer micelles trong dung dịch PBS có pH 7,4 55 Hình 3.4 Chế tạo hạt chitosan, CINs bằng phương pháp electrosprayed và biểu đồ phân

bố kích thước hạt CINs với 20wt% insulin 56

Hình 3.5 Độ nhớt của hydrogel và hệ CINs-hydrogel copolymer ở pH 8,9 và pH 7,4 57 Hình 3.6 Thế zeta của copolymer, insulin, chitosan và dung dịch CINs (hạt chitosan mang thuốc insulin) tại nồng độ là 1mg/mL 58 Hình 3.7 Thể hiện hạt CINs trong hệ hydrogel (A) Dung dịch ở trạng thái sol có độ nhớt thấp, (B) Dung dịch ở trạng thái gel trong môi trường có pH 7,4 nhiệt độ 37oC trong cơ thể chuột 59 Hình 3.8 (A, B) Khả năng tương thích sinh học của tế bào 293T và RAW 264,7 trên

OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymer ở các nồng độ được chỉ định (in vitro), với độ lệch chuẩn n = 6; (C) Sự gel hóa và kích thước của CINs-hydrogel trong môi trường in vivo.

60 Hình 3.9 A-Khối gel sau 3h tiêm vào da chuột, B-Ngoại quan về khối gel sau 4 tuần

tiêm, C-Khối lượng cơ thể chuột trong suốt quá trình thử nghiệm in vivo 62 Hình 3.10 Hình ảnh ngoại quan về sự phân hủy sinh học in vivo của A/ Khối gel có 30wt% OS-PLA-PEG-PLA-OS copolymer; B/ CS-pentablock copolymer (20wt% CS

(chitosan) so với khối lượng hydrogel) tại pH 8,9 và 15-20oC được tiêm dưới da và thu thập lấy mẫu da tại thời điểm chỉ định 63 Hình 3.11 A-B Ảnh chụp ngoại quan các mẫu gel sau khi được xử lý sấy tách nước, 65 Hình 3.12 Ảnh SEM mặt cắt ngang của pentablock và CINs-pentablock sau khi tách nước ra khỏi khối gel ở 1 ngày, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần 66

Hình 3.13 Các hình ảnh quang học về sự phân hủy sinh học in vivo của khối gel sau

khi nhuộm HE các mô xung quanh của CINs-hydrogel 67

xi

Hình 3.14 (A) Nồng độ đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều trị bằng insulin tự do, hạt CINs, chỉ dung dịch pentablock và 2,5wt% CINs-pentablock và 3,75wt% CINs-pentablock (A') trình bày vùng giá trị 0 đến 12h của (A) (B) Nồng độ insulin được giải phóng ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều trị bằng

insulin tự do, CINs, pentablock và 2,5wt% pentablock và 3,75wt%

CINs-pentablock (C) Thay đổi trọng lượng cơ thể trong các nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ 69 Hình 3.15 (A) Nồng độ đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều

trị bằng insulin tự do, hạt CINs, chỉ dung dịch pentablock và 2,5wt% CINs-pentablock và 3,75wt% CINs-pentablock (A') trình bày vùng giá trị 0 đến 12h của (A) (B) Nồng

độ insulin được giải phóng ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều trị bằng

insulin tự do, CINs, pentablock và 2,5wt% pentablock và 3,75wt%

CINs-pentablock (C) Thay đổi trọng lượng cơ thể trong các nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ 69 Hình 3.16 (A) Nồng độ đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều trị bằng insulin tự do, hạt CINs, chỉ dung dịch pentablock và 2,5wt% CINs-pentablock và 3,75wt% CINs-pentablock (A') trình bày vùng giá trị 0 đến 12h của (A) (B) Nồng độ insulin được giải phóng ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 1 sau khi điều trị bằng

insulin tự do, CINs, pentablock và 2,5wt% pentablock và 3,75wt%

CINs-pentablock (C) Thay đổi trọng lượng cơ thể trong các nhóm chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ 69

xiii

DANH MỤC VIẾT TẮT

PEG Poly(ethyleneglycol) PLA Poly lactide

PAA Poly amido amine PAE Poly β-amino ester PAEU Poly amino(ester)urethane

PCLA Poly(ε-capronlactone-co-lactide) PLGA Poly D,L-lactide acid-co-glycolic acid

OSM Oligomer Sulfamethazine

sulfamethazine-Polyurethane

HVCH: TRỊNH THÚY AN 1

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Ngày nay, bên cạnh sự phát triển vượt bậc của khoa học – công nghệ thì tỷ lệ người mắc bệnh hiểm nghèo như ung thư, HIV/AIDS, đặc biệt là bệnh đái tháo đường ngày càng tăng cao gây nên mối nguy hiểm lớn đối với con người cũng như các tổ chức y tế thế giới [1] Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp truyền thống như: tiêm, bơm trực tiếp dược phẩm/thuốc/protein qua da để điều trị các loại bệnh này có những nhược điểm lớn như: liều lượng dược phẩm/thuốc/protein tập trung bùng phát dược tính đột ngột tại thời điểm đầu Dược tính tăng cao vượt ngưỡng điều trị sẽ gây tác dụng phụ cho người bệnh như kích ứng thuốc, nôn mửa tiêu chảy, ngứa, đau, tê cứng vùng tiêm, rồi loạn chuyển hóa mỡ, suy nhược hoặc hôn mê Các hiện tượng trên làm sức khỏe suy giảm nhanh chóng đối với người già hoặc người mắc nhiều bệnh lý khác nhau và cũng rất khó điều trị cho phụ nữ mang thai Hàm lượng dược phẩm/thuốc/protein ở thời điểm giảm xuống thấp hơn ngưỡng điều trị gây lãng phí thuốc Thời gian tác dụng của thuốc đối với cơ thể trong một lần tiêm sẽ ngắn, vì vậy việc tiêm thuốc/dược phẩm/protein sẽ lặp đi lặp lại nhiều lần cho một phác đồ điều trị và bệnh nhân cần phải đến bệnh viện nhiều lần để được tiêm thuốc/dược phẩm/protein cần thiết, điều này làm cho bệnh nhân mệt mỏi và mất nhiều kinh phí điều trị [2-3]

Trong thập kỷ qua, nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đã nhận thấy những nhược điểm của việc sử dụng dược phẩm bằng phương pháp điều trị truyền thống như đã nói trên [4-7] Và họ đã không ngừng nghiên cứu để tìm ra những phương pháp mới để đưa dược phẩm vào cơ thể mang lại hiệu quả chữa trị tốt hơn, kinh tế hơn cho nước nhà cũng như thuận tiện cho bệnh nhân Trong đó, phương pháp vận chuyển thuốc bằng hydrogel tiêm được qua da (injectable hydrogel, hydrogel kích thích phản ứng với pH và nhạy cảm với nhiệt độ môi trường) và các hạt micro-nano mang các tác nhân điều trị đang được quan tâm nghiên cứu rộng rãi Với mục tiêu chính là hạn chế sự bùng nổ thuốc tại thời điểm đầu và duy trì được nồng độ dược phẩm/thuốc/protein trong ngưỡng điều trị ở khoảng thời gian điều trị như mong muốn, thể hiện ở hình 0-A

Trong nhiều thập kỷ qua, có nhiều nhà nghiên cứu đang nghiên cứu theo hướng trên và đạt được nhiều thành quả đáng ngạt nhiên như sau:

Loại hydrogel

Copolymer Tác nhân điều trị

Phương pháp trị liệu

Tình hình nghiên cứu thế giới

Nhạy nhiệt độ/pH

OSM–PCLA–PEG–PCLA–OSM

Paclitaxel, nồng độ thuốc 5mg/mL

Điều trị khối u dưới da chuột; nhả 4% lượng thuốc/ngày và duy trì trong suốt 30 ngày điều trị [12] HTCC–PEG–GP Insulin giảm bùng nổ thuốc tại thời điểm

ban đầu 40–50%; duy trì khả năng nhả thuốc trong vòng 4-5h [13] Hạt

chitosan mang thuốc

hạt CS-g-PCL PXT; hạt trung bình 200-400nm

mức độ nhả thuốc 30%; 50%; 80% thuốc được giải phóng ra trong 3 ngày đầu [14]

Chitosan Ampicillin; hạt trung bình 0,5-1μm

120h lượng thuốc giải phóng ra môi trường dung dịch đệm đạt 90%lượng thuốc [15]

Tình hình nghiên cứu trong nước

HVCH: TRỊNH THÚY AN 3

Ý tưởng khoa học

Phối hợp hai loại vật liệu hydrogel OS-PLA-PEG-PLA-OS và hạt chitosan mang thuốc insulin để tận dụng ưu thế nhả thuốc trong thời gian dài Hệ vật liệu này được ứng dụng làm hệ vận chuyển và nhả thuốc bằng phương pháp tiêm theo nguyên lý sau: hạt mang thuốc insulin dễ dàng được phân tán trong nền dung dịch hydrogel nhạy nhiệt độ/pH Dung dịch này sẽ chuyển trạng thái sol-to-gel ngay khi tiêm qua da và được định hình tại vị trí tiêm Thông qua khả năng phân hủy sinh học của hệ-hạt sẽ giúp insulin được giải phóng vào máu một cách chậm rãi và đưa nồng độ đường huyết của người bị tiểu đường về mức bình thường Tính toán thời gian phân hủy sinh học, nồng độ thuốc được giải phóng vào cơ thể; từ đó chế tạo hệ vận chuyển thuốc phù hợp

Tính cấp thiết và tính mới

Việc nghiên cứu thành công đề tài góp phần giải quyết vấn đề: tận dụng các ưu thế của từng loại vật liệu y sinh để tạo ra hệ vật liệu mới có khả năng mang thuốc và nhả thuốc theo phát đồ điều trị bệnh Góp phần cho sự phát triển của ngành dược phẩm nước nhà; hạn chế sự lãng phí thuốc tối thiểu, đặc biệt là một số loại dược phẩm đặc hiệu Giải quyết bài toán giá dược phẩm đặc hiệu nhập ngoại quá cao, gây khó khăn cho người Việt Nam trong tình trạng kinh tế có hạn khi phải điều trị những căn bệnh hiểm nghèo

Mục tiêu thực hiện

Kết hợp 2 loại vật liệu gồm hydrogel nhạy pH/nhiệt độ OS-PLA-PEG-PLA-OS và hạt chitosan “đóng gói” insulin (CINs) với mục tiêu chế tạo hệ vận chuyển insulin có khả năng: Tiêm dưới dạng dung dịch và định hình khối gel dưới da; Hạn chế được hiện tượng bùng phát thuốc vào thời điểm đầu; Duy trì được nồng độ thuốc ở ngưỡng điều trị trong thời gian dài, phù hợp với phác đồ điều trị cho bệnh nhân

Hydrogel mang hạt chitosan

NPC-PEG-TA mang hạt chitosan

Dán vết thương trên cơ thể thỏ Cường độ kết dính với vết thương hở trên da tốt, vết thương đóng kín miệng, tốc độ hồi phục nhanh [16] Hydrogel

mang sợi, hạt chứa thuốc

PCL-OSM

OSM-PCL-PEG-Cucurmin, insulin

Điều trị kháng khuẩn, điều trị tiểu đường loại 1, hạn chế được sự bùng nổ thuốc ban đầu và duy trì nhả thuốc trong 3 ngày [17-20]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hydrogel nhạy pH/nhiệt độ

1.1.1 Hydrogel và các tính chất

Hydrogel là mạng lưới không gian của các chuỗi vướng rối polymer ưa nước ở trạng thái trương lên khi chúng hấp thụ một lượng lớn nước hoặc chất lỏng sinh học Do đặc tính hấp thụ nước cao của hydrogel, chúng có thể mô phỏng các thuộc tính tương tự như mô sinh học, dẫn đến khả năng tương thích sinh học tuyệt vời [33-36] Đối với việc hydrogel vận chuyển thuốc có kiểm soát, ngoài khả năng tương thích sinh học cao, hydrogel đòi hỏi khả năng “đóng gói” các tác nhân trị liệu (thuốc/protein/dược phẩm) với hàm lượng tải cao, giải phóng các tác nhân trị liệu trong cách kiểm soát, điều chỉnh được sự ổn định và khả năng phân hủy sinh học [37-39] Hydrogel có khả năng chuyển hóa sol-gel tốt, có lợi thế để tiêm vào cơ thể mà không cần phẫu thuật cấy ghép và tốc độ nhả thuốc/protein/dược phẩm được đóng gói sẽ được quy định bởi tốc độ giảm cấp của hydrogel, cũng như quá trình khuếch tán của thuốc vào cơ thể [40-42]

Hydrogel có thể được phân thành 2 nhóm tùy theo tính chất của phản ứng liên kết ngang Nếu phản ứng liên kết ngang liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hóa trị, thì hydrogel đó được coi là hydrogel bền (permanent hydrogel), điển hình pMMA và pHEMA Nếu hydrogel đó được hình thành do các tương tác vật lý như là: sự vướng rối của các phân tử, tương tác ion và liên kết hydro, giữa các chuỗi polymer thì được coi là hydrogel vật lý, điển hình như: poly(vinyl alcohol)/glycine hydrogels, gelatin gels … Hydrogel cũng có thể được phân loại thành hydrogel đáp ứng thông thường và kích thích Hydrogel thông thường là chuỗi polymer liên kết ngang hấp thụ nước khi cho vào dung dịch nước, không có sự thay đổi trong trạng thái cân bằng khi tiếp xúc với sự thay đổi độ pH, nhiệt độ hoặc điện trường của môi trường xung quanh Trong khi hydrogel đáp ứng kích thích là mạng lưới polymer thay đổi trạng thái cân bằng của chúng với sự thay đổi của môi trường xung quanh Hydrogel trải qua quá trình chuyển đổi thể tích hoặc chuyển trạng thái pha sol-gel đáng kể trong đáp ứng với các kích thích vật lý và hóa học Các kích thích vật lý bao gồm nhiệt độ, điện trường và từ trường, thành phần dung môi, cường độ ánh sáng và áp suất, trong khi các kích thích hóa học

HVCH: TRỊNH THÚY AN 5

hoặc sinh hóa bao gồm pH, ion và các thành phần hóa học cụ thể Tuy nhiên, hydrogel có khả năng trở lại trạng thái ban đầu ngay sau khi gỡ bỏ các kích hoạt trước đó Phản ứng của hydrogel với các kích thích bên ngoài chủ yếu được xác định bởi bản chất của monome, mật độ điện tích, chuỗi mạch dây chuyền và mức độ liên kết chéo Độ lớn của đáp ứng trên các chuỗi mạch phân tử của hydrogel cũng tỷ lệ thuận với kích thích bên ngoài được áp dụng

Luận văn này tập trung nghiên cứu tổng hợp một loại hydrogel nhạy cảm pH/nhiệt độ mới ứng dụng trong vật liệu y sinh Với lý do đó, những phần tiếp theo sẽ tiến hành phân tích sâu rộng cấu tạo, tính chất của từng block trong khối pentablock (triblock nhạy nhiệt và oligomer nhạy pH) và ứng dụng của loại vật liệu này

1.1.2 Hydrogel nhạy nhiệt độ

Hydrogel nhạy nhiệt độ cho thấy khả năng chuyển đổi trạng thái pha sol-gel khi nhiệt độ thay đổi nhờ vào những cấu trúc kị nước Hydrogel trải qua biến đổi ưa nước – kị nước như vậy là do sự cạnh tranh/chiếm ưu thế hơn giữa các liên kết hydro dọc theo mạch phân tử (hay giữa nước và cấu trúc ưa nước trên mạch phân tử - tương tác ưa nước) và tương tác kỵ nước trong hydrogel Tương tác ưa nước chiếm ưu thế khi nhiệt độ thấp dẫn đến khả năng hòa tan cao hơn hay sự trương lên của polymer cao Ngược lại, khi nhiệt độ tăng thì tương tác kị nước chiếm ưu thế hơn và làm cho hydrogel bị co lại, đẩy phân tử nước ra ngoài được mô phỏng như hình 1.1

Hình 1.1 Biến đổi ưa nước (trương lên) – kỵ nước (co lại) của hydrogel nhạy nhiệt Copolymer khối dạng B-A-B (ví dụ: PCL-PEG-PCL; PLA-PEG-PLA; PAE-PEG-PAE) là một trong những hydrogel nhạy nhiệt độ đặc trưng, trên mạch của chúng chứa các khối (block) ưa nước ở tâm (core) và các khối kị nước ở cuối cấu trúc mạch

HVCH: TRỊNH THÚY AN 6

Khối kị nước này đóng vai trò là thành phần nhạy nhiệt, tính kị nước của chúng tỷ lệ

thuận với độ tăng nhiệt độ, khi nhiệt độ cao hơn giá trị nhiệt độ dung dịch tới hạn dưới

(LCST- lower critical solution temperature) của nó Sự chuyển đổi đại phân tử của cấu trúc ưa nước sang cấu trúc kỵ nước xảy ra khá đột ngột ở nhiệt độ dung dịch tới hạn dưới Khi có sự cân bằng giữa các nhóm ưa nước và kỵ nước trong polymer phù hợp dẫn đến sự co mạch và sau cùng là tách pha Do đó, chúng thể hiện được tính tan-không tan của khối copolymer khi nhiệt độ thay đổi [21]

Điều này cũng tương tự đối với triblock PLA-PEG-PLA được chọn cho nghiên cứu trong đề tài này Mạch phân tử PLA đóng vai trò khối kị nước do trong cấu trúc của nó vừa có mạch dài, vừa có liên kết ester nên ở nhiệt độ thường nó đã thể hiện một phần tính kị nước (do có mạch dài) và tính ưa nước (do có liên kết ester) Nhưng khi nhiệt độ tăng thì enthalpy (ΔH) của nước tăng dẫn đến làm đứt các tương tác giữa nước và nhóm ester này (liên kết hydrogen) nên làm cho tính kị nước của nó tăng và mạch co cụm lại hay sự giảm thể tích đáng kể

Hình 1.2 Cấu trúc triblock poly(lactide)-poly (ethylene glycol)-poly (lactide) (PLA-PEG-PLA)

Hydrogel nhạy cảm với nhiệt độ có thể chia thành:

− Các polymer nhạy nhiệt “âm”: chúng có nhiệt độ dung dịch tới hạn dưới LCST, khi nhiệt độ thấp hơn LCST thì trương đáng kể, còn khi gia nhiệt trên LCST thì chúng co lại, điển hình như:poly(N-isopropylacrylamide) có LCST (32°C) gần nhiệt độ cơ thể, poly(N,N’-diethylacrylamide), poly(dimethylaminoethyl methacrylate), poly(2-carboxy-isopropylacrylamide)…[23]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 7

− Các polymer nhạy nhiệt “dương”: chúng có nhiệt độ dung dịch tới hạn trên UCST, ở nhiệt độ cao hơn UCST thì trương đáng kể, khi làm lạnh dưới UCST thì chúng co lại, điển hình như: poly(acrylic acid), polyacryamide, agarose… [24]

− Các polymer có hiệu ứng cân bằng phân tử lưỡng tính Các block copolymer có thành phần cấu tạo phân tử lưỡng tính, gồm các nhóm ưa nước và kị nước Chúng cảm ứng nhiệt độ tạo hạt micelle trong môi trường nước và hình thành gel Như vậy, nhiệt độ hóa gel là nhiệt độ tới hạn, khi nhiệt độ tăng dung dịch polymer tạo thành gel, như: PEO – PPO - PEO [25]

Sự cân bằng tính kị nước/ưa nước được điều chỉnh bằng cách đưa vào 2 đầu mạch bên các nhóm ưa nước và kị nước, như các block copolymer poly(ethylene glycol –D–L–axit lactic – coglycolide –b– ethylene glycol) (PEG – PLGA – PEG)

1.1.3 Hydrogel nhạy pH

Polymer nhạy pH là loại polymer có khả năng phản ứng lại sự thay đổi pH môi trường xung quanh nó, làm thay đổi cấu trúc mạng của chúng Biểu hiện của quá trình này là sự co lại hay giãn ra của mạch polymer do tạo nên tương tác cùng cực khi có sự thay đổi pH môi trường Những polymer nhạy pH có chứa những nhóm chức có khả năng ion hóa, chúng có thể cho hay nhận proton tùy theo pH của môi trường Khi pH môi trường thay đổi, mức độ ion hóa của polymer phụ thuộc vào bản chất nhóm chức, là nhóm chức thể hiện khả năng ion hóa tại những điểm pH riêng biệt, hình 1.3 [26]

Hình 1.3 Sự thay đổi mức độ trương, co của polymer nhạy pH khi [26] Ta có thể chia polymer nhạy pH thành hai nhóm chính sau:

HVCH: TRỊNH THÚY AN 8

− Polymer nhạy pH loại nhạy “anion”: trong mạch polymer có chứa các nhóm chức acid ( –COOH, -SO3H, -SH,…), những polymer này có khả năng ion hóa trong môi trường pH có tính base Các nhóm chức acid sẽ hình thành ion âm trong môi trường pH lớn hơn giá trị pKa của nó, do sự phân ly proton tạo nên các ion mang điện tích cùng dấu trên mạch polymer

− Polymer nhạy pH loại “cation”: trên mạch có nhóm chức amin như -NH2, ,….Những polymer có khả năng ion hóa trong môi trường pH có tính acid Các nhóm chức amin sẽ hình thành ion dương trong môi trường pH bé hơn pKb của nó, do nhận proton tạo nên các ion mang điện tích cùng dấu trên mạch [26] Sự hình thành các điện tích cùng dấu trên mạch polymer làm lực đẩy tĩnh điện trên mạch polymer giãn ra (hiện tượng trương) Khi pH thay đổi đến giá trị các nhóm chức không còn bị ion hóa (đề ion hóa), mạch polymer không còn tồn tại lực đẩy tĩnh điện chúng sẽ co lại Polymer nhạy cảm pH có cấu trúc chứa axit như: axit cacboxylic và axit sunfonic hoặc các nhóm base như muối amoni, phản ứng với sự thay đổi pH trong môi trường của chúng bằng cách tăng hoặc giảm proton Polyelectrolytes là các polymer có số lượng lớn các nhóm ion hóa Các polyelectrolytes anion như poly (axit acrylic) (PAA) bị khử proton trong điều kiện môi trường base và sau đó lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi tăng mạnh, cho phép các phân tử nước xâm nhập gây ra sự trương lên mạnh mẽ của hydrogel Tuy nhiên, trong môi trường axit, các proton polymer có tính axit dẫn đến giảm mật độ điện tích và giảm thể tích polymer

Hình 1.4 Sự ion hóa phụ thuộc pH của polyelectrolytes (a) Poly (axit acrylic) và (b) poly (N, N’ -diethylaminoethyl metacryit) [26]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 9

 Oligomer nhạy cảm pH trong hệ thống phân phối thuốc bằng phương pháp

“tiêm” dưới da (Injectable temperature pH-sensitive Polymer)

Polymer nhạy pH ứng dụng trong hệ thống phân phối thuốc bằng phương pháp tiêm vào cơ thể sống phải có khả năng chuyển hóa trạng thái sol-gel (các monome được tổng hợp phải chứa đựng các nhóm chức sau khi hình thành nên polymer có khả năng ion hóa và đề ion hóa khi pH môi trường thay đổi như –COOH, -SH, -NH2,…) khi thay đổi môi trường (nhiệt độ, pH, nồng độ ion,….), nhằm mục đích khối gel được định hình và trở thành nơi lưu trữ tác nhân điều trị bệnh trong thời gian dài [8,27]

Polymer nhạy pH được tổng hợp nên phải có khối lượng phân tử không quá lớn để có thể phân hủy nhanh chóng (sau 7 đến 21 ngày), nên polymer nhạy pH thường được tổng hợp thành các oligomer (với số mắc xích hình thành nhỏ hơn 100 đơn vị) Do vậy, loại oligomer được tổng hợp để khảo sát phải có khả năng đề ion hóa ở giá trị pH của máu (7,15-7,35) để có thể bao bọc phần thuốc bên trong khi được tiêm vào cơ thể, và bị ion hóa ở pH cao hơn 7,4 hay thấp hơn 7 nhằm hòa tan được trong dung dịch hydrogel trước khi sử dụng Để thỏa mãn điều này, đề tài chọn oligomer có chứa nhóm sulfuamide để thỏa mãn điều kiện ion hóa và đề ion hóa như trên

1.1.4 Hydrogel có khả năng nhạy cảm pH và nhiệt độ

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu phát triển copolymer có nhiều hơn một độ nhạy với kích thích ngoài nhạy với nhiệt độ Yếu tố pH đáp ứng kích thích thường được dùng để kết hợp với copolymer nhạy nhiệt độ để chế tạo ra vật liệu mới có tính chất ứng dụng rộng hơn và tốt hơn (như hình 1.5)

Hình 1.5 Kết hợp giữa copolymer nhạy nhiệt độ và nhạy pH

Sản phẩm được tổng hợp sẽ có tính chất nhạy cảm pH và nhiệt độ có sự phù hợp (tương tác) với mỗi loại tác nhân điều trị bệnh khác nhau [28]

Trong đề tài này, lựa chọn tổng hợp nên nhóm nhạy pH trên cơ sở nhóm chức sulfonamide của oligomer Serine (OS) và nhóm nhạy nhiệt độ (PLA-PEG-PLA) tạo nên

HVCH: TRỊNH THÚY AN 10

sự chuyển pha sol – gel cho hydrogel này cũng tương tự như cơ chế chuyển pha sol-gel của copolymers sulfamethazine – polyurethane (PUSMA) (là phản ứng kết hợp giữa Poly(ethylene glycol), ε-caprolactone-sulfamethazine và 1 nhóm diisocyanate: (PEG : CL-SMA : HDI)) thể hiện ở hình 1.6

Độ pH thấp hơn và nhiệt độ cao hơn dẫn đến tính kỵ nước cao hơn của các khối copolymer PUSMA, do đó làm cho sự gel hóa xảy ra Tuy nhiên, nhiệt độ tăng lên hydrogel dẫn đến mất tính cân bằng, bị kết tụ và không còn tính chất chuyển đổi trạng thái pha sol-gel Nhiệt độ chuyển pha sol-gel được xếp theo PUSMA1> PUSMA2> PUSMA3, là thứ tự ngược với chiều dài của mạch kỵ nước trên polymer, hay nói cách khác chiều dài mạch càng cao sẽ làm tăng khả năng kỵ nước (thể hiện ở hình 1.6-A)

Điều đáng chú ý là cả ba dung dịch copolymer đều có thể tạo thành hydrogel trong điều kiện cơ thể (37°C và pH 7,4) Sự chuyển đổi trạng thái pha sol-gel như vậy của các dung dịch polymer từ pH cao và nhiệt độ phòng sang điều kiện cơ thể có thể cho phép các copolymer này được sử dụng làm hydrogel tiêm cho kỹ thuật tiêm ở dưới da

Sự chuyển đổi trạng thái pha sol-gel của PUSMA copolymer có thể được giải thích dựa trên cấu trúc hóa học của chúng Trong điều kiện pH cao (pH> 8,0), trong các nhóm sulfonamide, các nguyên tử oxy của các nhóm sulfonyl hút các electron của nguyên tử lưu huỳnh Hơn nữa, nguyên tử hydro có tính axit của -SO2-, NH- thu được

Hình 1.6 A/ Sơ đồ chuyển pha của các dung dịch PUSMA copolymer khác nhau về trọng lượng phân tử (Mw g/mol), B/ Độ nhớt hệ gel của các PUSMA copolymer khác

nhau tại pH 8,9 và pH 7,4 [29]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 11

một electron, hai tác dụng này gây ra sự ion hóa các nhóm sulfonamide Do đó, các khối PUSMA là ưa nước và tĩnh điện đẩy nhau, các phân tử copolymer tương tác yếu tạo ra dung dịch copolymer chảy dễ dàng Trong điều kiện sinh lý, các nhóm sulfonamid bị khử ion và các khối sulfamethazine trở thành kỵ nước Sau đó, tính kỵ nước tự nhiên của các khối sulfamethazine tăng đáng kể ở nhiệt độ cơ thể và gây ra sự chuyển đổi dung dịch copolymer sang trạng thái gel thông qua tương tác kỵ nước

1.2 Tổng quan về hạt chitosan mang thuốc

1.2.1 Nguyên lý tạo hạt bằng phương pháp electrospraying

Electrospraying là phương pháp phân tán giọt chất lỏng của dung dịch polymer thành hạt có kích thước nano–micromet dưới tác dụng của dòng điện áp cao Nguyên tắc dựa trên lý thuyết những hạt tích điện cho thấy: một điện thế cao được áp vào một chất lỏng được đẩy nhỏ giọt ra khỏi đầu kim tiêm có thể làm biến dạng mặt tiếp xúc của giọt Điện tích tạo ra lực tĩnh điện bên trong giọt, cạnh tranh với sức căng bề mặt của giọt và tạo thành hình nón Taylor Cone-Jet (Taylor Cone-Jet là chế độ phun đặc trưng của phương pháp Electrospraying) Cuối cùng, lực tĩnh điện (được tạo ra bởi việc sử dụng điện áp cao) đủ lớn để vượt qua được sức căng bề mặt của giọt Lưu lượng dung dịch vừa xuất hiện tại đầu kim tiêm sẽ được tích điện, liên tiếp bị phân chia thành những hạt có kích thước nano-micro và tiến về cực âm ở bản thu mẫu, trong quá trình giọt bị phân tách liên tục sẽ làm dung môi bay hơi nhanh chóng Trong giọt dung dịch thì dung môi là tác nhân dẫn điện, nên trong quá trình giọt dung dịch bị phân tách liên tục bởi điện thế cao tương ứng với lượng dung môi bị bay hơi ra môi trường (nguyên lý tách hạt electrospray được thể hiện như mô hình 1.7) Để lại những chuỗi vướng rối mạch polymer sắp xếp tạo thành hình dạng khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ polymer, dung môi hòa tan polymer, hiệu điện thế áp vào, lưu lượng đầu ra của pơm vi lượng, yếu tố môi trường [30]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 12

Hình 1.7 Mô hình mô phỏng quá trình tạo hạt bằng phương pháp electrospraying

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình dạng và kích thước của hạt cầu

 Nồng độ phần trăm của polymer

Các chuỗi vướng rối mạch phân tử polymer trong vi hạt được hình thành trong quá trình electrospraying dung dịch polymer, sự sắp xếp các chuỗi vướng rối mạch polymer này quyết định đến hình thái cuối cùng của hạt Số lượng chuỗi rối trên một chuỗi trong dung dịch, (ne)sol, được tính toán thông qua nồng độ dung môi:

w( )e sol

Quá trình tạo vi hạt chỉ xảy ra đối với trường hợp 1 chuỗi rối trên mạch ((ne)sol= 2) trong khi 2,5 chuỗi rối trên một mạch ((ne)sol= 3,5) sẽ dẫn đến sự hình thành các sợi –

quá trình này gọi là quá trình Electrospinning Nồng độ polymer trong dung dịch quyết

định mật độ chuỗi rối và là thông số dẫn đến sự hình thành các hạt hay sợi Đây là thông số quan trọng để kiểm soát và tối ưu hóa quá trình thực hiện

Nồng độ chuỗi rối che phủ hạt cầu tới hạn Cov là điểm mà nồng độ dung dịch bằng với nồng độ bên trong bán kính tròn của một mạch dài polymer và tỷ lệ với độ nhớt thực của polymer () [31]: C 1

[ ]



HVCH: TRỊNH THÚY AN 13

Khi nồng độ polymer trong dung dịch bé hơn nồng độ chuỗi vướng rối che phủ

hạt cầu tới hạn (C < Cov) thì: trong dung dịch không xuất hiện sự rối chuỗi và thu được các hình bán cầu Khi Cov < C < Cent (Cent: nồng độ chuỗi vướng rối phù hợp): nồng độ polymer trong dung dịch đủ lớn để các mạch polymer có thể sắp xếp đan xen lên nhau nhưng chưa đủ để có thể hình thành mức độ rối lớn, tạo hạt có hình thái móp mép trên bề mặt ngoài Khi Cent < C < 3Cov: mức độ chuỗi rối phù hợp để tạo vi hạt có hình thái trơn nhẵn, đầy đặn Nhưng khi nồng độ dung dịch polymer vượt qua 3Cov thì vi hạt sẽ bắt đầu xuất hiện vi sợi và lớn dần hình thành chuỗi hạt và sợi, như hình ảnh 1.8

Hình 1.8 Ảnh hưởng của nồng độ đến kết quả hạt thu được bằng phương pháp electrospraying tương ứng với các chế độ khác nhau [30]

 Ảnh hưởng của dung môi

Dung môi hữu cơ được dùng để hòa tan polymer được sắp xếp nhiệt độ sôi tăng dần: acetone< chloroform< ethanol< acetonitrile< 1,2-dichloroethane< axit axetic< N,N-dimetylformamit (DMF), có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc phối trộn với các tỉ lệ khác nhau Nhiệt độ sôi của dung môi là nhiệt độ mà áp suất hơi bằng áp suất không khí xung quanh và nó là đại diện cho tính không ổn định của dung môi Các dung môi có áp suất hơi cao (nhiệt độ sôi thấp) làm dung môi bay hơi dễ dàng hơn, các dung môi có áp suất hơi thấp (nhiệt độ sôi cao) làm dung môi bay hơi khó hơn Sự khuếch tán polymer được giảm xuống bên trong các giọt khi dùng dung môi có áp suất hơi thấp, ảnh hưởng đến kích thước và hình thái học của các hạt và nó tương ứng với sự giảm bớt sự biến động

HVCH: TRỊNH THÚY AN 14

Khi dung môi bay hơi nhanh, thời gian đủ để chuỗi rối khuếch tán và sắp xếp lại trong các giọt dung dịch khi bay tiếp xúc với điện trường Dung môi bay hơi nhanh hơn dẫn đến sự hình thành của lỗ hõm sâu và thậm chí các hạt rỗng Các polymer khác nhau có các tương tác khác nhau với dung môi, ảnh hưởng đến những chuỗi vướng rối mạch polymer và hình thái cuối cùng của các hạt [32]

 Ảnh hưởng của hiệu điện thế áp hai đầu

Chế độ phun hình nón (Taylor-cone) được tạo bởi dòng điện và lưu lượng dung dịch tại đầu kim tiêm được coi là chế độ ổn định nhất của quá trình tạo hạt bằng phương pháp electrospraying Với chế độ phun hình nón, cho thấy hiệu điện thế ảnh hưởng không nhiều đến sự biến đổi kích thước hạt thu được Khi tăng hiệu điện thế giữa hai cực thu, kích thước hạt thu được có xu hướng giảm, nhưng sự giảm là rất nhỏ không đáng kể, thể hiện ở hình 1.9 [38] Tuy nhiên, khi tăng hiệu điện thế hình thái hạt thu được lại ảnh hưởng nhiều, hạt thay đổi từ dạng hình cầu sang dạng hình cầu có kích thước bé hơn nhưng xuất hiện rất nhiều vi sợi (vi sợi vệ tinh) xen kẽ nhau Điều này có thể giải thích là do khi tăng hiệu điện thế trên cùng một lưu lượng, giọt dung dịch sẽ được tích điện nhiều hơn do đó các điện tích dương trong giọt bị đẩy nhau và tách ra liên tục gây ra sự bất ổn định và xuất hiện nhiều hình thái bất thường trên bản thu Nếu tiếp tục tăng hiệu điện thế thì chế độ phun sẽ chuyển sang nhiều tia (mutil-cone) rất khó để thu hạt vì sự bất ổn định của dòng chuyển động cao Do đó, để có thể duy trì hình dạng hình cầu của các hạt thu được, cần phải sử dụng hiệu điện thế phù hợp với độ nhớt của dung dịch trong quá trình electrospraying [33]

Hình 1.9 Ảnh hưởng của hiệu điện thế đến kích thước hạt thu được bằng phương pháp electrospraying [33]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 15

 Khoảng cách bay hơi dung môi

Khoảng cách bay hơi dung môi là khoảng cách được tính từ đầu kim tiêm (nơi nhỏ giọt dung dịch có kiểm soát nhờ bơm vi lượng) đến bảng thu mẫu Khoảng cách này là yếu tố ảnh hưởng đến sự bay hơi dung môi và phù hợp để hạt được tách nhỏ Khoảng cách khảo sát phụ thuộc vào hiệu điện thế sử dụng và lưu lượng phun Tại điện áp không đổi, giới hạn nhỏ nhất của khoảng cách được xác định khi có điện trường giữa bảng thu mẫu và cực dương (đầu kim tiêm tích điện dương của nguồn điện áp vào) Khi khoảng cách quá nhỏ sẽ làm giảm sự bay hơi của dung môi, tăng kích thước hạt, những vi hạt còn chưa kịp bay hơi hoàn toàn lượng dung môi bên trong hạt nên làm ảnh hưởng đến hình thái hạt trên lá nhôm, dẫn điện sự suy giảm điện trường tại vị trí bị che khuất bởi các lớp hạt polymer trước đó Khi tăng khoảng cách dẫn đến các hình thái hạt cầu từ các chuỗi polymer có đủ thời gian để khuếch tán trong giọt và giảm sức căng bề mặt tùy thuộc vào loại dung môi được sử dụng Nhưng đến khi tăng khoảng cách vượt ngoài lực tác dụng điện trường giữa cực âm và cực dương, dẫn đến đường kính hạt tăng đáng kể tỷ lệ với sự giảm của lực tác dụng của điện trường Ngoài những yếu tố chủ yếu trên, hệ electrospraying còn bị ảnh hưởng như: nhiệt độ môi trường, độ ẩm không khí, ánh sáng môi trường ngoài, mức độ bão hòa dung môi xung quanh hệ…[33]

1.3 Các quá trình phân hủy sinh học và quá trình giải phóng thuốc từ hệ vận chuyển thuốc

1.3.1 Quá trình phân hủy sinh học của hydrogel, hạt mang thuốc trong môi

trường in vitro

 Sự tương thích sinh học và thế zeta của vật liệu

Trước khi thực hiện các thí nghiệm phân hủy sinh học trong môi trường in vitro và in vivo, cần kiểm chứng giữa các phân tử trên mạch của hydrogel nhạy pH/nhiệt độ

và hạt mang tác nhân điều trị bệnh (thuốc/protein/hormon) có sự tương tác tĩnh điện với nhau nhờ các phần tử mang điện tích trái dấu bằng phép đo tán xạ ánh sáng động (phép đo xuất kết quả - potential – hay gọi là điện thế zeta; tích hợp trong phương pháp tán xạ ánh sáng động Dynamic light scattering (DLS)) Phép đo này được giải thích cụ thể ở nhiều công bố quốc tế trước đó, điển hình là công bố của tác giả Huỳnh Công Trực

HVCH: TRỊNH THÚY AN 16

(năm 2011), phép đo điện thế zeta của phức hợp copolymer “đóng gói” hormon PAEU–PEG–PAEU/hGH (human growth hormon) trong dung dịch đệm PBS tại giá trị pH 7,4 với nồng độ thuốc hGH không đổi (1mg/mL) Thế zeta của dung dịch hGH có giá trị là -14,5mV nhưng giá trị thế zeta đã tăng nhanh chóng khi copolymer được thêm vào dung dịch được đo Với sự tăng dần tỷ lệ copolymer/hGH, thế zeta của dung dịch tăng từ giá trị âm (-2,2mV tại tỷ lệ của 0,1/1 lên giá trị dương và đạt +3,8 mV ở tỷ lệ trọng lượng 20/1 Điều này chứng minh rằng giữa copolymer PAEU–PEG–PAEU và thuốc hGH (dạng rắn) có thể tạo thành một phức hợp tốt với nhau trên cùng một hệ dẫn truyền thuốc, thể hiện kết quả ở hình 1.10 [34]

Hình 1.10 Thế điện zeta với các tỷ lệ khác nhau của hệ mang thuốc copolymer PAEU–PEG–PAEU/hGH tại pH 7,4 [34]

Bên cạnh đó, cần thử nghiệm đến tính tương thích sinh học của vật liệu, hay khả năng của vật liệu hydrogel hỗ trợ sự phát triển và tăng sinh tế bào mà không gây ra độc tính lên tế bào Hay nói cách khác, tính tương thích sinh học của vật liệu y sinh nói chung là khả năng có thể thực hiện những đáp ứng thích hợp với cơ thể vật chủ trong những ứng dụng cụ thể Khả năng tương thích sinh học đáp ứng hai yếu tố cơ bản là an toàn sinh học và chức năng sinh học Vật liệu polymer dùng trong y học phải có khả năng tương thích với tế bào nơi vật liệu tiếp xúc, phải thực hiện được chức năng của nó trong môi trường cơ thể Đối với vật liệu polymer có tính tương thích sinh học cao, khi tiêm/cấy ghép vào cơ thể sẽ không gây viêm sưng kéo dài, cơ thể sẽ không có những phản ứng tự vệ đào thải vật liệu Hầu hết các polymer sử dụng cho mục đích y sinh phải được kiểm tra trước khả năng tương thích sinh học với tế bào của cơ thể [35] Hydrogel

HVCH: TRỊNH THÚY AN 17

có khả năng tương thích sinh với cơ thể được thể hiện chi tiết ở công trình nghiên cứu của tác giả Lê Thái Minh Duy ( năm 2018) giải thích cụ thể cho thí nghiệm kiểm tra độc tính của PEG−PSMEU copolymer đối với dòng tế bào kháng viêm RAW 264.7 (đại thực bào) và dòng tế bào phôi thận 293T (hình 1.11) trong môi trường ống nghiệm Các kết quả tương thích tế bào cho thấy ngay cả ở mức nồng độ cao 1000 g/mL PEG − PSMEU copolymer không gây độc cho hai dòng tế bào trên Ở các nồng độ khác nhau, kết quả thử nghiệm cho thấy tỷ lệ sống sót của hai dòng tế bào trong vật liệu là lớn hơn 85% so với nhóm đối chứng, kết quả này rất khả thi cho vật liệu y sinh của công trình nghiên cứu của tác giả Do đó, PEG − PSMEU copolymer có thể được sử dụng trong ứng dụng vận chuyển tác nhân điều trị (thuốc/protein) có kiểm soát [29].

Hình 1.11 Khả năng tồn tại của dòng tế bào 293T và RAW 264.7 trên hydrogel PEG-PSMEU copolymer tại các nồng độ khác nhau trong môi trường ống

nghiệm, với độ lệch chuẩn (n = 6) [29]

Ngoài ra, khi PEU-PSMEU copolymer được tiêm dưới da chuột SD, hình thành khối gel trong thời gian thí nghiệm là 10 phút, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần… mẫu da tại vị trí copolymer tiếp xúc với da trên cơ thể được tác giả thu thập và xử lý qua nhuộm

H&E (H&E stain (từ "haematoxylin and eosin stain" - nhuộm hêmatôxylin và êôzin))

sau đó các mẫu da được quan sát dưới kính hiển vi quang học, cho thấy xung quanh vị trí khối gel xuất hiện rất nhiều tế bào sống tập trung dày đặc ở xung quanh biên của khối gel tiếp xúc với da tại vị trí tiêm vào cơ thể Sau thời gian 1 tuần, 2 tuần các tế bào có

HVCH: TRỊNH THÚY AN 18

biểu hiện len lõi, xâm lấn vào bên trong cấu trúc của copolymer theo vị trí mà các phân tử nước còn bị vướng lại bởi mạng lưới không gian của hydrogel (ở trạng thái gel) co cụm khi thay đổi nhiệt độ, pH thể hiện ở hình 1.12 Thời gian phân hủy một khối gel phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: cấu trúc khối gel có chứa liên kết bền vững, hay liên kết kém bền… mạch phân tử của vật liệu tổng hợp chứa nhiều hay ít nhóm chức ester, vòng thơm; chiều dài mạch phân tử, sinh lý của cơ thể sống….[29]

Hình 1.12 A/ 20wt% PEG – PSMEU copolymer ở trạng thái gel dưới da trên

lưng chuột SD B/ Hình ảnh thể hiện sự phân hủy sinh học của hydrogel trong môi

trường in vivo ở các điểm thời gian xác định; C/ Nhuộm H&E mẫu da xung quanh

khối gel và quan sát dưới kính hiển vi quang học [27,29]

 Sự phân hủy sinh học của hạt mang thuốc

Phân hủy sinh học của vật liệu là một trong những tính chất quan trọng trong ứng dụng vận chuyển thuốc của hydrogel cũng như hạt mang tác nhân điều trị nói chung Từ việc tính toán được khả năng phân hủy sinh học của hydrogel/hạt mang tác nhân điều trị, ta có thể dễ dàng tìm được thời gian phân hủy sinh học chung của hệ complex gel

HVCH: TRỊNH THÚY AN 19

khi phối hợp hai loại vật liệu trên, nhằm mục tiêu đạt được thời gian điều trị bệnh thích

hợp với bệnh nhân Trước hết, sự phân hủy sinh học của hạt chitosan mang 10wt% insulin được tạo bởi phương pháp electrosprayed trong môi trường in vitro sau 9 ngày

thể hiện ở hình 1.13 của tác giả Nguyễn Trí Đăng (2019), cho thấy:

Hình 1.13 Ảnh SEM thể hiện A/ Hạt chitosan chứa 10wt% insulin được tạo bởi

phương pháp electrosprayed, B/ Sự thay đổi hình dạng hạt mang thuốc sau 9 ngày được ngâm trong dung dịch PBS (Phosphate-Buffered Saline Solution) [36]

Sự phân hủy sinh học xảy ra đáng kể, lượng insulin được giải phóng ra được đo bởi phép đo HPLC sau 9 ngày đạt 60-90% lượng insulin ban đầu được “đóng gói” vào hạt Về hình thái hạt cho thấy rõ biên hạt cầu bị biến dạng nhiều, lớp bề mặt ngoài của hạt cầu trương lên và giảm cấp nhanh chóng Xét về mặt cấu trúc mạch phân tử tác giả cho biết sau khi hòa tan insulin và chitosan trong axit axetic, các nhóm amin chính (-NH2) trên dọc xương sống mạch phân tử chitosan bị ion hóa thành -NH3 Những nhóm chức này có thể tạo ra tương tác tĩnh điện với các axit amin mang điện tích âm trên phân tử insulin, hình thành đơn vị ion phức Những đơn vị phức hợp này từ từ giải phóng insulin trong môi trường đệm và có thể ức chế insulin giải phóng đột ngột ở thời điểm

đầu Với thử nghiệm trong môi trường in vitro của hạt chitosan mang insulin cho thấy

trong vòng 9 ngày đã giải phóng gần như toàn bộ thuốc được đóng gói bên trong hạt

Đối với môi trường thử nghiệm in vivo cho thấy thời gian mà hạt mang thuốc giải phóng

vào cơ thể (hay sự phân hủy sinh học diễn ra trên khối gel) là ngắn hơn so với thời gian

thử nghiệm trong môi trường in vitro nhờ các sự tác động liên tục của các tác nhân sinh

HVCH: TRỊNH THÚY AN 20

học của cơ thể sống (mà chủ yếu là đại thực bào tấn công và loại bỏ các mô/ tế bào lạ xuất hiện trên cơ thể)… Vì vậy, cần một hệ vận chuyển thuốc, bao bọc hạt mang thuốc, dẫn truyền thuốc vào da và lưu trữ thuốc lại một vị trí trong khối gel, sau đó giải phóng từ từ phù hợp với phác đồ điều trị của bệnh nhân

1.3.2 Quá trình phân hủy sinh học của hydrogel trong môi trường in vivo a/ Sự phân hủy sinh học của hydrogel trong môi trường in vivo

Để kiểm tra sự gel hóa tại chỗ trên cơ thể chuột, tác giả (Nguyễn Trí Đăng 2019) đã tiêm dung dịch hydrogel nhạy nhiệt độ/pH (OSM-PCL-PEG-PCL-OSM) với 300L

(30wt%, tại pH 10) ở trạng thái sol tiêm qua da chuột bằng kim tiêm 26G Sự gel hóa

xảy ra và định hình dưới lớp da trên lưng của chuột SD Tiếp tục, đánh giá khả năng phân hủy sinh học của pentablock copolymer theo thời gian đã chọn trước thông qua mẫu da chuột SD Tốc độ giảm kích thước của khối gel ở những ngày đầu tương đối chậm; sau 7 ngày đầu tiên ~ 83% gel còn lại trong lưng của những con chuột Với số ngày càng tăng, tốc độ giảm cấp phân tử polymer tăng lên, cho thấy sau sự khuếch tán vào trong khối gel của chất lỏng sinh học làm cho hydrogel xuống cấp nhanh chóng Sau 3 tuần, hơn 70% hydrogel đã bị biến mất và được tìm thấy có xung quanh khối gel có khả năng hấp thụ sinh học sau thời gian 4 tuần Điều đáng chú ý là không có triệu chứng như sưng, viêm xung quanh các vị trí tiêm, chứng minh khả năng tương thích của hydrogel pentablock copolymer Những kết quả đã chứng minh rằng hydrogel có khả năng phân hủy sinh học tốt do các nhóm ester có trên mạch phân tử của chuỗi polymer pentablock xuống cấp và bị loại bỏ thể hiện ở hình 1.14 [36]

HVCH: TRỊNH THÚY AN 21

Hình 1.14 Sự phân hủy sinh học của pentablock nhạy pH/ nhiệt độ ở môi trường in

vivo 300L dung dịch copolymer (30wt%, Mn = 1750g/mol; PCL/PEG =1,8/1; OS = 1,34kDa) được tiêm dưới lớp da của lưng chuột SD tại (A) 3h; (B) 1 tuần; (C) 2 tuần;

(D) 3 tuần (E) Khả năng phân hủy sinh học của hydrogel in vivo được xác định bằng

phương pháp giảm khối lượng [36]

b/ Sự giải phóng tác nhân điều trị bệnh từ hydrogel vận chuyển

Thông số thiết kế hệ hydrogel mang thuốc còn nhiều trở ngại, đặc tính vật liệu phụ thuộc vào nồng độ liên kết ngang và tính chất vật lý như độ cứng cơ học, kích thước mạng lưới hoặc lỗ rỗng, tốc độ giảm cấp và mật độ phối trộn với các tác nhân trị liệu Bên cạnh đó, hệ hydrogel vận chuyển thuốc còn phụ thuộc vào các thông số liên quan khác bao gồm: tính tương thích sinh học của vật liệu y sinh đối với mô, tế bào; vị trí tiếp xúc với hệ vật liệu, điều kiện chuyển trạng thái sol-gel, độ xốp phù hợp và kích thước mắt lưới của hydrogel được thiết kế, tốc độ phân hủy sinh học và mức độ hoạt động sinh

học của hydrogel mang thuốc trong môi trường in vivo [46]

Trong một hệ thống phân phối thuốc thuộc dạng phối trộn giữa hydrogel và tác nhân điều trị/hạt mang tác nhân điều trị (thuốc/protein), tác nhân điều trị được phân tán dưới dạng chất rắn thành một phức hợp hydrogel (gọi là hệ complex, hoặc composites) Việc giải phóng thuốc từ khối gel phụ thuộc vào tính chất của khối gel đó Khi khối gel

HVCH: TRỊNH THÚY AN 22

đó được đặt vào môi trường nước/chất lỏng sinh học, nước/chất lỏng sinh học bắt đầu khuếch tán len lõi vào trong, do đó quá trình hydrat hóa được xem là như nhau Quá trình hydrat hóa của khối gel bắt đầu từ bề mặt và tiếp tục hướng về trung tâm của lõi Sự giải phóng thuốc/hạt mang thuốc phụ thuộc vào sự khuếch tán của nước/chất lỏng sinh học vào trong khối gel sau đó là sự hòa tan của thuốc/protein (hoặc là sự trương lên của lớp bề mặt của hạt mang thuốc) và cuối cùng là sự khuếch tán của thuốc hòa tan khỏi khối gel (hình 1.15)

Các hydrogel có thời gian phân hủy sinh học dài hay ngắn cũng được thiết kế dựa trên các nguyên tác trên [46] Sự tương tác giữa tác nhân điều trị (thuốc/protein) với hydrogel vận chuyển có vai trò quan trọng trong hành vi giải phóng thuốc (số liệu được chứng minh các tương tác liên kết ở phép đo thế zeta) Do đó, dựa trên các tương tác của hydrogel với thuốc có thể được điều chỉnh thời gian giải phóng thuốc theo mong muốn Độ dày (100L, 200L, 300L…) của khối gel được ngâm trong môi trường nước/ chất lỏng sinh học được xem là chiều dài đoạn đường khuếch tán của thuốc Nếu chúng ta giả sử hệ hydrogel trơ và sự phóng thích thuốc được kiểm soát thông qua quá trình khuếch tán, sau đó tốc độ giải phóng của thuốc có thể được mô tả bằng phương trình Higuchi, thì khả năng giải phóng thuốc/protein là căn bậc hai của thời gian:

Bệnh này thường khởi phát nhanh, rầm rộ, các triệu chứng thể hiện rõ rệt khi giai đoạn đầu khởi phát bệnh: ăn nhiều, uống nhiều (hay khát nước) tiểu nhiều (do đường trong nước tiểu cao, gây lợi niệu thẩm thấu), gầy nhiều (gầy sút cân) Biến chứng cấp tính: Hôn mê, mệt mỏi, khát nước, khô da, chuột rút, mạch nhanh, tụt huyết áp (dấu hiệu mất nước), rối loạn ý thức (lơ mơ, ngủ gà, hôn mê), buồn nôn, thở nhanh, hơi thở mùi táo thối Biến chứng mạn tính: nhìn mờ (do biến chứng võng mạc, đục thủy tinh thể), đau ngực thường không điển hình (do biến chứng mạch vành), tê bì dị cảm ở bàn chân (biến chứng thần kinh), loét, nhiễm trùng bàn chân, đầy bụng, chậm tiêu, nuốt khó (biến chứng thần kinh tự động gây liệt dạ dày, thực quản) [40,41]

Nguyên nhân của bệnh:

 Tiền sử gia đình: gia đình có bố hoặc mẹ mắc tiểu đường tuýp 1 thì con cái có nguy cơ mắc bệnh cao hơn

 Các yếu tố môi trường: phơi nhiễm với virus như Coxsackie, Rubella có thể khởi phát tình trạng phá hủy tế bào beta đảo tụy…[41]

Cơ chế tác động gây bệnh tiểu đường loại 1 của dược chất Streptozotocin

Streptozocin hay streptozotocin, thuốc được phát hiện trong một chủng vi khuẩn Streptomyces achromogenes trong đất STZ là một chất gây độc hại có chọn lọc đối với các tế bào beta của đảo tụy (tuyến tụy), các tế bào thường điều chỉnh lượng đường trong