VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 02 năm 2021 đến tháng 06 năm 2022
- Địa điểm: Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM, 268 Lý Thường Kiệt, Quận 10,
Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Chủng vi sinh vật, plasmid
Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 4.4T và PVN02 được phân lập từ mẫu vật cá tra bị bệnh và nước ao nuôi cá tra tại Cần Thơ.
- Chủng E coli BL21 (DE3) được sử dụng cho việc biểu hiện endolysin tái tổ hợp
- Plasmid pET28a(+) được sử dụng làm vector biểu hiện endolysin tái tổ hợp Tất cả các chủng vi sinh vật và plasmid pET28a(+) nêu trên được lưu trữ và cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thực khuẩn thể của PGS.TS Hoàng Anh Hoàng tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP HCM
3.2.2 Môi trường, hóa chất, vật liệu
- Môi trường: Luria-Bertani Broth (LB) (hãng Himedia, Ấn Độ), Tryptone Soya Broth (TSB) ((hãng Himedia, Ấn Độ)
- Hóa chất: Q5® High-Fidelity Master Mix (2X) (New England Biolabs, Mỹ); T4 DNA ligase, enzyme cắt giới hạn (BamHI, HindIII) (New England Biolabs, Mỹ); imidazole (Biobasic, Canada); IPTG (Bioline, Mỹ); GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ); PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen, Mỹ); hóa chất điện di gel agarose: agarose, GelRed (Biotium), TAE 1X; hóa chất điện di SDS-PAGE (chi tiết ở phần phụ lục)
Máy luân nhiệt PCR, máy ly tâm và máy vortex tạo nên hệ thống xét nghiệm cần thiết cho chuẩn bị mẫu Bể ổn nhiệt, máy đo pH và máy đo mật độ quang là các thiết bị đo đạc quan trọng Hệ thống chụp ảnh gel UV và tủ ủ nuôi cấy lắc hỗ trợ quá trình nuôi cấy vi sinh vật Cân điện tử, tủ đông lạnh, tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, tủ ấm và tủ sấy là các thiết bị bảo quản và chuẩn bị vật liệu Nồi hấp vô trùng đảm bảo vô trùng trong các quy trình Hệ thống điện di gel agarose và điện di SDS-PAGE là các kỹ thuật tách phân tử.
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu
Cắt bằng RE Tinh sạch
Phân tích trình tự endolysin phage PVN02
Sản phẩm gene endolysin endolysin
PCR Tối ưu hóa codon và tổng hợp gene endolysin
Cắt bằng RE Tinh sạch
Các dòng khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) đã biến nạp Plasmid pET-28a(+) mang gene endolysin Gene endolysin đã cắt RE Plasmid pET-28a(+) đã cắt RE
Biến nạp vào E coli BL21 (DE3)
Khảo sát hoạt tính kháng
Aeromonas hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô Kiểm tra endolysin tái tổ hợp thô bằng
SDS-PAGE Dịch endolysin tái tổ hợp thô
Thu nhận và phá tế bào
Dịch tế bào biểu hiện
Các khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) mang pET-28a(+)-gene endolysin
Giải trình tự plasmid Kiểm tra trình tự gene endolysin
3.3.2 Phân tích trình tự endolysin cell wall hydrolase
Việc phân tích trình tự gene endolysin để: (1) tối ưu hóa codon khi biểu hiện ở tế bào E coli; (2) đánh giá tính kị nước của protein để định hướng cho quá trình tinh sạch; (3) xác định vùng gắn màng để dự đoán hoạt tính của enzyme endolysin thô Trình tự amino acid của endolysin được xác định dựa vào nghiên cứu trước đó với mã số truy cập QLI47613.1 trên Genbank, NCBI [11] Domain chức năng của endolysin được phân tích sử dụng cơ sở dữ liệu Conserved Domain Database (CDD) trên NCBI Việc dự đoán cấu trúc của endolysin được thực hiện dựa trên Phyre2 server [82] Độ kỵ nước của protein và xác định các xoắn xuyên màng đã được dự đoán bằng cách sử dụng các chương trình sau: TMpred (https://embnet.vital- it.ch/software/TMPRED_form.html), transmembrane topology prediction server – HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html) và TCDB (http://www.tcdb.org/progs/?tool=hydro) [78]
3.3.3 Tối ưu hóa codon gene endolysin cell wall hydrolase
Do sự khác biệt về trình tự codon mã hóa endolysin của phage PVN02 với các codon mã hóa ở tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) nên cần thiết tối ưu hóa codon gene này Gene endolysin cell wall hydrolase xuất phát từ thực khuẩn thể PVN02 của vi khuẩn Aeromonas hydrophila có chứa nhiều codon hiếm với tần số xuất hiện thấp ở tế bào E coli, đặc biệt là bộ ba mở đầu GTG Bộ ba mở đầu phổ biến nhất ở vi khuẩn E coli là ATG chiếm 83%, GTG chiếm 14% và TTG chỉ chiếm 3% [83] Việc tối ưu hóa codon được thực hiện bằng cách sử dụng công cụ hỗ trợ tối ưu hóa codon của Integrated DNA Technologies-IDT (https://sg.idtdna.com/pages/tools/codon- optimization-tool) Các thông số sau khi tối ưu hóa như chỉ số thích ứng codon (CAI – codon adaptation index) và thành phần %GC được tính toán sử dụng công cụ CAIcal [84] Trình tự gene endolysin cell wall hydrolase đã tối ưu hóa được tổng hợp và được chèn vào vector pUC19 bởi công ty TNHH Một Thành Viên Sinh Hóa Phù
3.3.4 Tạo dòng gene endolysin cell wall hydrolase
Do enzyme cắt giới hạn khác nhau sau khi tổng hợp gen endolysin và đưa vào vector pUC19, gen endolysin được thu và khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế Trong đó, mồi xuôi ORF52_F và mồi ngược ORF52_R gắn các enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII để thực hiện tạo dòng và biểu hiện với vector pET-28a(+).
Bảng 3.1 Trình tự mồi cho gene endolysin cell wall hydrolase
Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’ Enzyme cắt giới hạn
ORF52_F TACCCGGATCCATGCAAAACATCATCA BamHI (gạch chân)
ORF52_R TGTCCAAGCTTTTACAGGGTATAGAAC HindIII (gạch chân)
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch sử dụng (àl)
Tổng thể tích phản ứng 25
Các thành phần của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và chương trình phản ứng PCR như sau: biến tính khởi đầu ở 98°C trong 30 giây; sau đó là 30 chu kỳ: 98°C trong 10 giây, 54°C trong 20 giây và 72°C trong 15 giây; bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 2 phút
Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose 1%, hiệu điện thế 110V, 400 mA, thời gian 30 phút và quan sát vạch DNA hiển thị trên gel trong hệ thống chụp gel đèn
The endolysin gene product was purified using the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) The purification steps were performed according to the manufacturer's instructions, and the purified product was analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel.
Gen endolysin sau đó được thực hiện phản ứng cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII Sau đó tiến hành tinh sạch gene endolysin đã cắt bằng Kit
GeneJET PCR Purification (hãng Thermo Scientific), quy trình tinh sạch được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Vector biểu hiện pET-28a(+) cũng được cắt mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII Sau đó tiến hành phản ứng nối gene endolysin và vector pET-28a(+) đã cắt sử dụng enzyme T4 DNA ligase Phản ứng nối được tiến hành như sau: Trộn vector và gene endolysin theo tỷ lệ nồng độ gene endolysin:vector là 3:1 cựng với 4àl T4 ligase buffer và 0.2àl enzyme T4 DNA ligase Sau đó ủ hỗn hợp ở 22 ° C trong 2h và trữ ở -20 ° C
Hình 3.1 Vector pET28a(+) mang gene endolysin cell wall hydrolase
Vector pET-28a(+) mang gene endolysin (hình 3.1) được biến nạp vào tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt (heat shock) Quy trình biến nạp được tiến hành như sau: Trộn 2àl plasmid tỏi tổ hợp vào eppendorf chứa tế bào khả biến E coli BL21 (DE3) và ủ trong đá lạnh 4 ° C trong 15 phút Sau đó đặt mẫu vào ủ nhiệt ở 42 ° C trong 30 giây Sau đó đặt ngày vào bể đá lạnh 4 ° C ủ trong 2 phỳt Tiếp theo, cho 250àl mụi trường SOC vào mẫu biến nạp và nuụi cấy lắc ở 37 ° C trong 1h Sau đú tiến hành hỳt 100àl mẫu biến nạp và trải đều trờn đĩa thạch mụi pET28a(+)-endolysin cell wall hydrolase trường LB cú bổ sung khỏng sinh kanamycin 50àg/mL và nuụi ủ ở 37 ° C trong 16- 18h
Các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch được chọn để kiểm tra kết quả của quá trình biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) với cặp mồi đặc hiệu gene endolysin cell wall hydrolase là ORF52_F và ORF52_R Các thành phần của phản ứng PCR khuẩn lạc được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc
Thành phần Thể tớch sử dụng (àl)
Tổng thể tích phản ứng 25
Chương trình phản ứng PCR khuẩn lạc như sau: biến tính khởi đầu ở 98°C trong
30 giây; sau đó là 30 chu kỳ: 98°C trong 10 giây, 54°C trong 20 giây và 72°C trong
15 giây; bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 2 phút
Sản phẩm PCR khuẩn lạc được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 110V, 400 mA, thời gian 30 phút và quan sát vạch DNA hiển thị trên gel bằng hệ thống chụp gel UV
3.3.5 Tách chiết plasmid và giải trình tự
Từ phương pháp PCR sàng lọc khuẩn lạc, khuẩn lạc sở hữu plasmid chứa gen endolysin được tuyển chọn Nuôi cấy khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin, tiến hành lắc qua đêm ở 37°C Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy và thu cặn tế bào Quá trình tách chiết và tinh sạch plasmid được thực hiện bằng kit PureLink™ Quick Plasmid Miniprep.
(Invitrogen), theo quy trình của hãng sản xuất Plasmid sau khi tách chiết, tinh sạch được kiểm tra bằng cách điện di gel agarose 1% Mẫu plasmid tái tổ hợp sau đó được giải trình tự với cặp mồi có trên vector pET-28a(+) là T7 promoter (F) và T7 terminator (R) Việc giải trình tự được thực hiện bởi công ty TNHH Dịch vụ và thương mại Nam Khoa Kết quả giải trình tự plasmid tái tổ hợp được phân tích, sắp gióng cột với trình tự gene endolysin đích bằng công cụ Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)
3.3.6 Biểu hiện endolysin tái tổ hợp trong tế bào E coli BL21 (DE3)
Tế bào E coli BL21 (DE3) chứa plasmid pET28a(+) mang gene endolysin cell wall hydrolase được nuụi cấy trong mụi trường LB lỏng cú chứa 50àg/ml khỏng sinh kanamycin trong thời gian 16-18h ở 37 ° C Sau đó cấy chuyền dịch nuôi cấy (tỷ lệ 2% v/v) sang erlen cú chứa 200ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung 50àg/ml khỏng sinh kanamycin để nuôi cấy tiếp Khi giá trị OD600nm củadịch nuôi cấy đạt 0.6-0.8, tiến hành cảm ứng bằng 0.5mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ở 37 0 C và thu nhận tế bào sau 4h cảm ứng [9]
Sử dụng lactose thay thế IPTG để cảm ứng biểu hiện protein màng được đề xuất do IPTG có thể không phù hợp [85, 86] Quá trình cảm ứng bằng lactose tương tự như IPTG nhưng sử dụng nồng độ lactose khác nhau Khi mật độ tế bào đạt OD600nm 0,6-0,8, tiến hành cảm ứng bằng lactose với nồng độ 0,5mM, 1mM, 2mM và 5mM ở 37°C và thu nhận tế bào sau 4 giờ cảm ứng.