Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng aeromonas hydrophila quy mô phòng thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN TẤN LỘC

TẠO PROTEIN ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP

TỪ THỰC KHUẨN THỂ KHÁNG AEROMONAS HYDROPHILA QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2022

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Lê Phi Nga

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – Chủ tịch

2 PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên – Thư ký 3 TS Nguyễn Thị Lệ Thủy – Phản biện 1 4 TS Phạm Thị Kim Trâm – Phản biện 2 5 PGS.TS Lê Phi Nga – Uỷ viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 19/12/1996 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng

Aeromonas hydrophila quy mô phòng thí nghiệm

(Cloning, expression and purification of the recombinant bacteriophage-derived

endolysin protein against Aeromonas hydrophila)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tạo dòng, biểu hiện endolysin cell wall hydrolase tái tổ hợp từ thực khuẩn thể

PVN02 trong tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3)

- Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của endolysin tái tổ hợp

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/06/2022

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):

1 PGS.TS Lê Phi Nga

2 PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

LỜI CẢM ƠN

Thời gian học tập và làm luận văn tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP Hồ Chí Minh đã để lại trong tôi nhiều kỷ niệm đẹp cùng những kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các Thầy Cô, anh chị, các bạn, các em và cả gia đình

Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn chân thành nhất đến Cô PGS.TS Lê Phi Nga và Thầy PGS.TS Hoàng Anh Hoàng Thầy Cô đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sẵn lòng giúp đỡ, động viên và hỗ trợ em rất nhiều để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Em xin cảm ơn đến các Thầy Cô giảng dạy Cao học ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP Hồ Chí Minh Quý Thầy Cô đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt việc học cũng như công việc của mình

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thành viên tại phòng thí nghiệm 107B2 đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ và gia đình Cảm ơn cả nhà đã luôn ở bên cạnh, luôn là niềm động lực to lớn, giúp con vượt qua mọi khó khăn và có được ngày hôm nay

Kính chúc quý thầy cô, anh chị, các bạn, các em và gia đình luôn dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống!

TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2022

Học viên

Nguyễn Tấn Lộc

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Bệnh xuất huyết trên cá tra do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra, làm thiệt

hại lớn về kinh tế cho người nuôi Các chất kháng sinh thường được sử dụng để điều

trị bệnh này, tuy nhiên do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn A hydrophila nên rất

cần thiết để nghiên cứu các tác nhân kháng khuẩn mới để thay thế các chất kháng sinh Endolysin là các enzyme phân cắt peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn được tổng hợp ở giai đoạn cuối quá trình sao chép của phage tan, chúng ly giải thành tế bào vi khuẩn chủ và giải phóng các phage mới Trong nghiên cứu này, endolysin cell

wall hydrolase có nguồn gốc từ phage PVN02 xâm nhiễm vi khuẩn A hydrophila đã được tổng hợp gene và tạo dòng thành công trong tế bào E coli BL21 (DE3)

Endolysin cell wall hydrolase PVN02 tái tổ hợp dạng thô thể hiện hoạt tính kháng vi

khuẩn A hydrophila với làm giảm 1.83±0.17 log CFU/ml vi khuẩn sau 60 phút Ngoài ra, endolysin tái tổ hợp có hoạt tính kháng A hydrophila mà không cần sử dụng các

chất thấm màng ngoài tế bào vi khuẩn Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu endolysin tái tổ hợp tiếp theo

ABSTRACT

Hemorrhagic septicemia disease in striped catfish is caused by Aeromonas hydrophila bacteria that may lead to the seriously economic losses in fish production

Antibiotics are commonly used to treat this disease, however, due to antibiotic

resistance in A hydrophila, it is necessary to have an alternative antibacterial agent

to antibiotics Endolysins are bacteriophage-encoded peptidoglycan hydrolases that are synthesized at the end of the lytic phage replication cycle, they lyse the host bacterial cell wall and release new bacteriophage virions In this study, an endolysin

(cell wall hydrolase) derived from Aeromonas phage PVN02 was artificially synthesized and cloned successfully in E coli BL21 (DE3) cells The crude

recombinant endolysin, cell wall hydrolase strongly exhibited antimicrobial activity

against A hydrophila with a reduction of 1.83±0.17 log CFU/ml of A hydrophila

after 60 minutes of incubation It should be emphasized that the antibacterial activity

by the recombinant endolysin to A hydrophila bacteria did not require a pretreatment

with an outer-membrane permeabilizer The result in this study is the premise for further recombinant endolysin studies

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của Cô PGS.TS Lê Phi Nga và Thầy PGS.TS Hoàng Anh Hoàng Các nội dung, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và chưa được công bố trong các công trình nào khác Các thông tin tham khảo, trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ và chú thích nguồn gốc rõ ràng trong phần tài liệu tham khảo

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về cam đoan này

TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2022

Học viên thực hiện

Nguyễn Tấn Lộc

1.2.Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.4.Nội dung nghiên cứu 3

1.5.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila và bệnh xuất huyết ở cá tra 4

2.2 Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể 6

2.3.3 Cơ chế hoạt động của endolysin kháng các vi khuẩn gây bệnh Gram

dương 11

2.3.4 Ứng dụng của endolysin kháng các vi khuẩn Gram âm 12

2.3.5 Sự đề kháng endolysin 13

2.3.6 Ứng dụng của endolysin 13

2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2 Vật liệu nghiên cứu 20

3.2.1.Chủng vi sinh vật, plasmid 20

3.2.2.Môi trường, hóa chất, vật liệu 20

3.2.3.Thiết bị, dụng cụ 21

3.3.Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1.Sơ đồ nghiên cứu 21

3.3.2 Phân tích trình tự endolysin cell wall hydrolase 23

3.3.3 Tối ưu hóa codon gene endolysin cell wall hydrolase 23

3.3.4 Tạo dòng gene endolysin cell wall hydrolase 24

3.3.5 Tách chiết plasmid và giải trình tự 26

3.3.6 Biểu hiện endolysin tái tổ hợp trong tế bào E coli BL21 (DE3) 27

3.3.7 Thu hồi endolysin tái tổ hợp bằng cột Ni-NTA 28

3.3.8 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô 29

3.3.9 Độ lặp lại và phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả phân tích trình tự endolysin và tối ưu hóa gene endolysin 31

4.2 Kết quả tạo vector biểu hiện mang gene endolysin tái tổ hợp 34

4.3 Kết quả biểu hiện endolysin tái tổ hợp trong tế bào E coli BL21(DE3) 374.3.1 Kết quả biểu hiện endolysin khi cảm ứng bằng IPTG 37

4.3.2 Kết quả biểu hiện endolysin khi cảm ứng bằng lactose 38

4.4 Kết quả thu hồi endolysin tái tổ hợp bằng cột Ni-NTA 39

4.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 4

Hình 2.2 Bệnh xuất huyết ở cá tra 5

Hình 2.3 Thực khuẩn thể và chu trình sống của thực khuẩn thể 7

Hình 2.4 Hình thái thực khuẩn thể phage PVN02 9

Hình 2.5 Bản đồ genome của phage PVN02 10

Hình 2.6 Các vị trí cắt của endolysin trên lớp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn 11

Hình 3.1 Vector pET28a(+) mang gene endolysin cell wall hydrolase 25

Hình 4.1 Kết quả phân tích độ kỵ nước của endolysin cell wall hydrolase 31

Hình 4.2 Mô hình cấu trúc 3D của endolysin cell wall hydrolase 32

Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gene endolysin cell wall hydrolase 34

Hình 4.4 Kết quả PCR khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) chứa plasmid pET28a(+) mang gene cell wall hydrolase 35

Hình 4.5 Kết quả sắp gióng cột trình tự sau khi giải trình tự mẫu plasmid tái tổ hợp pET-28a(+)-endolysin với trình tự gene endolysin đích 36

Hình 4.6 Kết quả theo dõi giá trị OD600nm khi cảm ứng biểu hiện endolysin bằng IPTG 37

Hình 4.7 Kết quả theo dõi giá trị OD600nm khi cảm ứng biểu hiện endolysin bằng lactose 38

Hình 4.8 Kết quả điện di SDS-PAGE sau khi biểu hiện và thu hồi endolysin tái tổ hợp 39

Hình 4.9 Kết quả khảo sát hoạt tính ly giải vi khuẩn A hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô bằng phương pháp spot test 41

Hình 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila

của dịch endolysin tái tổ hợp thô bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 42

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các nghiên cứu endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể 17

Bảng 3.1 Trình tự mồi cho gene endolysin cell wall hydrolase 24

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 24

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 26

Bảng 4.1 Tổng hợp các codon có tần số xuất hiện thấp ở E coli có trên gene endolysin cell wall hydrolase 32

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBD: Cell wall binding domain EAD: Enzymatically active domain

IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride APS: Ammonium Persulfate

TEMED: Tetramethylethylenediamine DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid ORF: Open Reading Frame PFU: Plaque-Forming Unit CFU: Colony Forming Unit

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis OD: Optical Density

PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction enzyme

A hydrophila: Aeromonas hydrophila E coli: Escherichia coli

kDa: Kilo Dalton aa: Amino acid bp: Base pair

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Lý do chọn đề tài

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những loài cá da trơn nước

ngọt, có giá trị kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam Trong năm 2021, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt trên 8,9 tỷ USD, trong đó xuất khẩu cá tra đạt trên 1,6 tỷ USD (chiếm hơn 17,9%) là mặt hàng đứng thứ hai chỉ sau xuất khẩu tôm [1] Tuy nhiên sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh là yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển bền vững của ngành cá tra Trong đó, một trong những tác nhân phổ biến nhất gây bệnh xuất huyết trên cá tra đó

là vi khuẩn Aeromonas hydrophila, có thể gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi

cá tra

Các chất kháng sinh thường được sử dụng để điều trị và ngăn chặn bệnh này, tuy nhiên gần đây cho thấy rằng việc kiểm soát bằng kháng sinh có thể không còn

thích hợp do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila Theo một

nghiên cứu của Quách Văn Cao Thi và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã kháng hoàn toàn một số loại kháng sinh như nhóm penicillin, cefalexin và trimethoprim/sulfamethoxazole; kháng cao với các kháng sinh tetracyclin, florfenicol và các chủng vi khuẩn này đều đa kháng thuốc [2] Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh cũng đã được phát hiện trong khi xuất khẩu, nhiều lô hàng của Việt Nam đã bị từ chối do tồn dư dư lượng thuốc kháng sinh cao hơn mức đã được phê duyệt Việc tiêu thụ dư lượng kháng sinh vượt quá giới hạn chấp nhận có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người về lâu dài Ngoài ra, việc sử dụng kháng sinh không phù hợp có thể ảnh hưởng đến tính bền vững lâu dài của ngành công nghiệp thủy sản nói chung và ngành cá tra nói riêng do những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường nuôi và hệ sinh thái [3] Do những yếu tố trên, vì thế nhu cầu cấp thiết để có một giải pháp thay thế, hiệu quả và thân thiện với môi trường đó là liệu pháp phage

Thực khuẩn thể (bacteriophage hay phage) là virus xâm nhiễm vi khuẩn Nó có thể sao chép sau khi xâm nhiễm và có khả năng ly giải hoặc tích hợp bộ gen của nó vào tế bào chủ [4] Việc sử dụng phage ly giải để chống lại các tác nhân vi khuẩn gây

bệnh đã được sử dụng từ lâu, cách đây hàng trăm năm [5] nhưng phương pháp này chỉ mới được chú ý trong ngành thủy sản trong vòng 40 năm qua, đặc biệt là khi đối mặt với sự lan truyền vi khuẩn kháng lại kháng sinh Nghiên cứu của Richards (2014) cũng đã báo cáo liệu pháp phage đã được sử dụng để chống lại các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản [6] Jun và cộng sự báo cáo rằng phage pAh1-C và pAh6-C

có tác dụng bảo vệ chống lại sự chết hàng loạt của cá chạch do A hydrophila gây ra [7] Ngoài ra, các liệu pháp sử dụng A hydrophila-phage 2 và A hydrophila-phage 5

được áp dụng cho cá da trơn trong quá trình nhiễm vi khuẩn đã làm tăng tỷ lệ sống sót của cá thử nghiệm một cách đáng kể [8] Liệu pháp phage cũng đã được nghiên

cứu để kiểm soát A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra [3]

Thay vì sử dụng thực khuẩn thể thì sử dụng enzyme ly giải của nó (endolysin) để diệt tế bào vi khuẩn chủ được xem như là một ứng viên, tác nhân kháng khuẩn đặc hiệu mới Endolysin (còn được gọi là phage lysin hoặc lysin) là các enzyme của thực khuẩn thể có khả năng phân cắt lớp peptidoglycan, làm mất ổn định thành tế bào và phá vỡ tế bào vi khuẩn, dẫn đến việc giải phóng các phage mới

Đã có nhiều nghiên cứu về tạo dòng, biểu hiện endolysin tái tổ hợp kháng lại các tác nhân vi khuẩn gây bệnh [9], [10] Tuy nhiên, cho đến hiện tại các công bố

nghiên cứu về endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng vi khuẩn A hydrophila,

tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá tra còn rất hạn chế Nghiên cứu trước đó của Từ Quang Vinh và cộng sự (2020) đã khảo sát cho thấy phage PVN02 có hoạt tính ly

giải cao vi khuẩn A hydrophila và toàn bộ genome của phage PVN02 đã được giải

trình tự [11]

Các kết quả này là tiền đề để thực hiện nghiên cứu: “Tạo protein endolysin tái

tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng Aeromonas hydrophila quy mô phòng thí

nghiệm”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá khả năng tạo endolysin tái tổ hợp từ gene cell wall hydrolase của phage PVN02

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Phạm vi của nghiên cứu là thiết lập hệ thống biểu hiện gene endolysin tái tổ hợp và đánh giá định tính hoạt tính endolysin tái tổ hợp thô ở phòng thí nghiệm

1.4 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích các ORF từ trình tự genome của phage PVN02 để xác định các gene mã hóa cho endolysin

- Tối ưu hóa codon và tổng hợp gene endolysin cell wall hydrolase

- Tạo dòng và biểu hiện gene endolysin cell wall hydrolase trong tế bào biểu

hiện E coli BL21 (DE3)

- Khảo sát hoạt tính ly giải vi khuẩn Aeromonas hydrophila của endolysin tái tổ

hợp dạng thô

- Khảo sát sử dụng cột Ni-NTA để thu hồi enzyme

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: đề tài bước đầu tạo chủng E coli BL21 (DE3) mang plasmid

pET28a(+) có mang gene endolysin cell wall hydrolase, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

- Ý nghĩa thực tiễn: với phạm vi nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu cách thức tái tổ hợp endolysin, do đó chưa đặt ra ý nghĩa ý thực tiễn

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila và bệnh xuất huyết ở cá tra

Aeromonas hydrophila (hình 2.1) là một loài vi khuẩn dị dưỡng, Gram âm, hình

que, có thể tồn tại trong cả môi trường hiếu khí và thiếu khí, nó thường được tìm thấy trong môi trường nước Vi khuẩn này thường gây bệnh trên một số loài động vật như: cá, rùa, rắn và động vật lưỡng cư Trong số các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá thì

Aeromonas hydrophila là vi khuẩn gây bệnh nhiều nhất cho nhiều loài cá nước ngọt

trên toàn thế giới với các dấu hiệu bệnh lý như nhiễm trùng máu, xuất huyết và lở loét [12] Ở cá tra, một trong những bệnh do vi khuẩn phổ biến nhất là bệnh xuất

huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra Nó gây ra tỷ lệ tử vong lên đến 80%

với các dấu hiệu lâm sàng như xuất huyết trên đầu, miệng và ở gốc vây, hậu môn xuất huyết và sự hiện diện của chất dịch màu hồng tới vàng tích tụ trong khoang bụng (hình 2.2) Sự xâm nhiễm này thường xảy ra vào thời điểm thay đổi từ mùa khô sang mùa mưa, đặc biệt là trong thời kỳ cá bị căng thẳng trong khi xử lý và vận chuyển [13]

Hình 2.1 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila [14]

(https://atlas.sund.ku.dk/microatlas/food/bacteria/Aeromonas_hydrophila/)

Hình 2.2 Bệnh xuất huyết ở cá tra [13]

Độc lực của Aeromonas hydrophila đối với cá là do nhiều yếu tố, do vi khuẩn

này sản xuất, tiết ra các yếu tố độc lực chẳng hạn như chất kết dính (adhensin) cytotoxin, hemolysin, lipase và protease cũng như là khả năng hình thành màng biofilm, sử dụng con đường trao đổi chất đặc trưng và sự biểu hiện các yếu tố độc lực trung gian thông qua một dạng quorum sensing (tín hiệu giao tiếp của vi khuẩn) [15]

Nhìn chung, việc phòng ngừa và điều trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào việc áp dụng rộng rãi các chất kháng sinh [16] Thuốc kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu mà còn có thể phá vỡ hệ sinh vật và sự cân bằng sinh thái của môi trường nước [17] Với việc sử dụng thường xuyên các loại thuốc kháng sinh trong nuôi trồng

thủy sản, các chủng A hydrophila kháng thuốc đang ngày càng tăng lên; tồn dư thuốc

kháng sinh trong sản phẩm và môi trường ngày càng nghiêm trọng [18], [19]

Vivekanandhan và cộng sự đã chỉ ra rằng 99% các chủng A hydrophila phân lập từ

cá và tôm đã kháng với methicillin, rifampicin, bacitracin và novobiocin [20] Gần đây, De Silva và cộng sự (2019) đã thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của 32

chủng Aeromonas, và thấy rằng tất cả các chủng đều kháng đa thuốc và 100% kháng

ampicillin, colistin, vancomycin và cephalothin [21] Các chủng kháng thuốc có thể sinh sản và truyền sức đề kháng của nó, tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh và kháng với nồng độ ngày càng cao [22] Ngoài ra, nhiều bệnh nhiễm khuẩn là

do vi khuẩn hình thành màng sinh học (biofilm) [23] Vi khuẩn A hydrophila có khả

năng hình thành màng sinh học trên mô vật chủ, cũng như các cơ chất khi nuôi trồng thủy sản [24] Vi khuẩn trong màng sinh học có khả năng kháng thuốc kháng sinh

cao hơn, vì cấu trúc màng sinh học giúp giảm sự xâm nhập của các hợp chất kháng khuẩn khiến việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gặp phải thách thức nghiêm trọng [25] Vì vậy, các liệu pháp kháng khuẩn mới là cấp thiết phải được phát triển [26]

2.2 Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể

2.2.1 Thực thuẩn thể

Thực khuẩn thể (bacteriophage, hay phage) là các virus xâm nhiễm vi khuẩn Chúng tồn tại phổ biến ở khắp mọi nơi và cần vật chủ là vi khuẩn Chúng cũng là một trong những loài sinh vật phong phú nhất được tìm thấy trên sinh quyển Sự tương tác giữa thực khuẩn thể và vi khuẩn chủ đã được các nhà nghiên cứu khai thác như một công cụ để hiểu về sinh học phân tử cơ bản, tái tổ hợp di truyền, chuyển gene ngang và sự tiến hóa của vi khuẩn được thúc đẩy bởi phage [27]

Phage có thể trải qua hai chu trình sống khác nhau, đó là chu trình tan (lytic) và chu trình tiềm tan (lysogenic) (hình 2.3) Trong chu trình tan có các giai đoạn sau: phage nhận biết tế bào vi khuẩn chủ (1), sau đó phage bám vào vi khuẩn chủ đặc hiệu trên một thụ thể được tìm thấy trên bề mặt vi khuẩn (2) và tiêm vật chất di truyền của nó vào tế bào vi khuẩn chủ (3) Sau đó phage sẽ dùng hệ thống của vi khuẩn chủ để sao chép vật chất di truyền (4), tổng hợp các protein cấu trúc (5) và lắp ráp các protein tạo thành các phage hoàn chỉnh mới (6) Bước cuối cùng là các protein được mã hóa bởi phage chẳng hạn như endolysin và holin giúp ly giải tế bào vi khuẩn chủ (7) Holin là những protein nhỏ tích tụ trong màng tế bào chất của tế bào chủ và hỗ trợ endolysin phân cắt peptidoglycan và giải phóng phage mới [28] Việc tạo ra một số lượng lớn phage mới (progeny) bởi phage ly giải là một lợi thế khi sử dụng phage ly giải trong liệu pháp phage Tuy nhiên, phage ly giải có phạm vi tế bào chủ hẹp và thường xâm nhiễm các loài vi khuẩn đặc hiệu Việc này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng nhiều phage kết hợp lại (phage cocktail)

Trong chu trình tiềm tan (lysogenic), phage không ly giải ngay tế bào chủ; thay vào đó, bộ gen của chúng được đưa vào nhiễm sắc thể tế bào chủ tại các vị trí cụ thể DNA của phage này trong bộ gen vật chủ được gọi là prophage, trong khi tế bào chủ chứa prophage được gọi là lysogen Prophage được sao chép cùng với bộ gen của vật

chủ vi khuẩn, thiết lập một mối quan hệ ổn định Nhược điểm của việc sử dụng lysogenic phage trong liệu pháp phage là một số phage chèn bộ gen của chúng vào nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn chủ và có thể không hoạt động hoặc thay đổi kiểu hình của vi khuẩn chủ Chu trình tiềm tan có thể tiếp tục vô thời hạn cho đến khi vi khuẩn tiếp xúc với các điều kiện bất lợi của môi trường Có các tín hiệu cảm ứng khác nhau nhưng prophage thường được cảm ứng khi các phản ứng của vi khuẩn được kích hoạt do điều trị kháng sinh, stress oxy hóa hoặc tổn thương DNA [29] Khi chu trình tiềm tan kết thúc, sự biểu hiện của DNA phage bắt đầu và chu trình tan bắt đầu [28]

Hình 2.3 Thực khuẩn thể và chu trình sống của thực khuẩn thể [30]

2.2.2 Liệu pháp thực khuẩn thể

Phage được phát hiện độc lập bởi hai nhà khoa học: Frederick Twort, nhà nghiên cứu bệnh học người Anh vào năm 1915 và bởi Félix d’Hérelle, một nhà vi sinh vật học người Canada vào năm 1917 [31] Liệu pháp phage lần đầu tiên được d’Herelle cố gắng làm trị liệu cho con người Những thử nghiệm liệu pháp phage ban đầu đã mang lại kết quả ấn tượng Tuy nhiên, những phát hiện đã gây tranh cãi bởi vì các nghiên cứu gặp phải các vấn đề như kiểm soát chất lượng không đầy đủ và không có

nhóm đối chứng để so sánh [32] Kết quả không nhất quán do thiếu khả năng tái lặp đã dẫn đến giảm sự quan tâm đến liệu pháp thực khuẩn thể [33] Ngoài ra, việc khám phá và sử dụng nhiều kháng sinh hóa học tiếp tục làm giảm sự quan tâm đến nghiên cứu liệu pháp thực khuẩn thể ở Hoa Kỳ Trong khi đó, liệu pháp phage vẫn tiếp tục được khảo sát ở Liên Xô, Đông Âu và Pháp

Vào đầu những năm 1980, mối quan tâm mới đến liệu pháp thực khuẩn thể hình thành chủ yếu là do gia tăng mầm bệnh đa kháng thuốc và mong muốn tìm ra các phương pháp điều trị thay thế sử dụng kháng sinh hóa học [34] Do đó, các nghiên cứu mới tập trung vào việc sử dụng liệu pháp thực khuẩn thể để điều trị các bệnh nhiễm trùng ở người cũng như trong nông nghiệp, khoa học thú y, công nghiệp và an toàn thực phẩm

Liệu pháp phage có một số ưu điểm hơn so với liệu pháp kháng sinh truyền thống như việc phân lập phage nhanh chóng, tương đối đơn giản và rẻ tiền [35] Đề kháng với phage phát triển chậm hơn khoảng mười lần so với đề kháng kháng sinh và phage có độ đặc hiệu cao với vi khuẩn chủ Phage có khả năng xâm nhiễm trong điều kiện môi trường rất khắc nghiệt và có xu hướng tiếp tục nhân lên cho đến khi mật độ quần thể của vi khuẩn chủ giảm đáng kể [36]

Việc xác định tác nhân gây bệnh là một bước quan trọng trong liệu pháp thực khuẩn thể Việc lựa chọn phage có thể xâm nhiễm vi khuẩn đích và đánh giá tiềm năng của những phage này để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn trong thủy sản là rất cần thiết Quy trình bao gồm các bước: (1) phân lập phage ly giải từ môi trường xung quanh, sử dụng phương pháp tăng sinh; (2) nuôi cấy phage; (3) xác định đặc điểm về về kiểu hình và kiểu gene của phage; (4) xác định loại phage của vi khuẩn đích; (5) chọn lựa phage ly giải cho liệu pháp Ngoài ra còn có các bước thực nghiệm để ứng dụng phage trong thủy sản: (6) đánh giá hiệu quả liệu pháp phage trong phòng thí nghiệm và trong điều kiện thực nghiệm (xâm nhiễm tự nhiên); (7) xác định sự tồn tại của các gene độc lực hoặc các yếu tố độc lực khác trong phage Cuối cùng, liệu pháp phage phải thiết lập nuôi cấy ở quy mô lớn với phương pháp bảo quản lâu dài cho phát triển thương mại [37], [38]

2.2.3 Aeromonas phage PVN02

Phage PVN02 (hình 2.4) sử dụng trong nghiên cứu này là một phage xâm nhiễm

đặc hiệu vi khuẩn Aeromonas hydrophila, được phân lập bởi nghiên cứu trước đó của

Từ Quang Vinh và cộng sự (2020) [11] từ mẫu nước ao cá tra ở thành phố Cần Thơ, Việt Nam Phage PVN02 có hoạt tính ly giải cao với thời gian xâm nhiễm là 20 phút và hệ số nhân khoảng 105 PFU/tế bào Toàn bộ genome của phage PVN02 (hình 2.5) đã được giải trình tự và phân tích bởi nghiên cứu trước đó cho thấy PVN02 là một

loài mới thuộc họ Myoviridae, bộ gene của nó là DNA mạch đôi với chiều dài 51,668

bp, thành phần GC 52%

Hình 2.4 Hình thái thực khuẩn thể phage PVN02 [11]

Hình 2.5 Bản đồ genome của phage PVN02 [11]

Phân tích genome của phage PVN02 cho thấy có 16 trong 64 ORF đã được dự đoán mã hóa các protein có chức năng và không tìm thấy các gene đề kháng kháng sinh, các gene độc lực trong genome [11] Genome của phage PVN02 có chứa 2 ORF mã hóa cho 2 endolysin (lytic protein trên hình 2.5), đó là endolysin cell wall hydrolase có chiều dài 179 amino acid thuộc ORF52 và endolysin peptidase thuộc ORF53 có chiều dài 122 amino acid Hai endolysin này giúp cho phage PVN02 có thể ly giải tế bào vi khuẩn chủ

2.3 Tổng quan về endolysin

2.3.1 Giới thiệu endolysin và phân loại

Endolysin là enzyme phân cắt peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối quá trình sao chép của phage ly giải (lytic phage), làm phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt virus mới hình thành Quá trình này xảy ra sau khi endolysin đã được tích lũy trong tế bào chất, xâm nhập qua màng tế bào và ly giải petidoglycan từ trong ra Vì lớp peptidoglycan giúp cho tế bào có cấu trúc ổn định và khá vững chắc nên phân cắt lớp này sẽ làm cho thành tế bào bất ổn định và bị phá hủy do sự khác biệt về áp suất thẩm thấu giữa bên trong tế bào và môi trường [39] Lớp peptidoglycan ở vi khuẩn Gram dương (khoảng 20-80nm) có độ dày hơn so với ở vi khuẩn Gram âm (khoảng 10nm)

Mạng lưới lớp peptidoglycan bao gồm mạch thẳng các N-acetylmuramic acid (NAM) liên kết với các N-acetylglucosamine (NAG) [40]

Endolysin có thể được phân loại dựa trên các vị trí cắt của nó trên cấu trúc của peptidoglycan: (1) glycosidase, cắt liên kết giữa các glycan; (2) amidase, cắt liên kết amide giữa NAM và L-alanine; (3) endopeptidase cắt liên kết peptide giữa các amino acid Glycosidase được phân loại thành: muramidase, cắt liên kết β-1,4 glycosidic giữa NAM và NAG (giống với lysozyme) và glucosaminidase cắt liên kết giữa NAG và NAM (autolysin) [39]

Hình 2.6 Các vị trí cắt của endolysin trên lớp peptidoglycan của thành tế bào vi

khuẩn.[41]

2.3.2 Cấu trúc endolysin

Các endolysin từ phage xâm nhiễm vi khuẩn Gram dương có cấu trúc bao gồm các domain hoạt hóa enzyme (enzymatically active domain – EAD) ở đầu N-terminal và một domain gắn thành tế bào (cell wall-binding domain – CBD) ở C-terminal, chúng được kết nối với nhau bằng một đoạn linker ngắn [42] Vì sở hữu cả EAD và CBD nên các endolysin có cả hoạt tính enzyme phân giải và các chức năng nhận biết vi khuẩn chủ Cụ thể, EAD có hoạt tính enzyme để cắt các liên kết cấu trúc peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn, trong khi đó CBD nhận biết, dẫn đường và bám vào thành tế bào vi khuẩn với độ đặc hiệu cao Trong khi đó, các endolysin từ phage xâm nhiễm vi khuẩn Gram âm trong cấu trúc thường chỉ có EAD [43] Một vài endolysin của Gram âm có cấu trúc bị đảo ngược với endolysin Gram dương: EAD

nằm ở đầu C-terminal và CBD nằm ở đầu N-terminal (endolysin từ Pseudomonas

phage KZ144) [44] Endolysin thể hiện độ đặc hiệu cao vì nó có CBD nhận biết và gắn với cơ chất Do đó các EAD hoạt động hiệu quả hơn khi nó cùng tồn tại với CBD và kết quả là endolysin có thể nhắm tới vi khuẩn đích một cách đặc hiệu [45]

2.3.3 Cơ chế hoạt động của endolysin kháng các vi khuẩn gây bệnh Gram dương

Các phage xâm nhiễm vi khuẩn Gram dương thường có một hệ thống endolysin để ly giải tế bào vi khuẩn từ bên trong, trong đó holin sẽ giúp endolysin đi

holin-qua màng tế bào chất và phá hủy thành tế bào vi khuẩn [46] Khi endolysin được ứng dụng để ly giải tế bào vi khuẩn Gram dương từ bên ngoài, chúng có thể đi vào trực tiếp thành tế bào và phân cắt lớp peptidoglycan của vi khuẩn từ bên ngoài tế bào, do đó nó hoạt động như là các tác nhân kháng khuẩn [43] Hơn nữa, một lượng nhỏ endolysin tinh sạch là đủ để ly giải nhanh chóng các tế bào vi khuẩn Gram dương từ bên ngoài chỉ trong vòng vài phút hay thậm chí là vài giây [47] Do đó, các nhà nghiên cứu đã sử dụng endolysin như các tác nhân kiểm soát sinh học kháng lại nhiều vi

khuẩn gây bệnh như Streptococcus pneumonia, S aureus, L monocytogenes, Enterococcus faecalis và Clostridium perfringens [45]

2.3.4 Ứng dụng của endolysin kháng các vi khuẩn Gram âm

Ngược lại với vi khuẩn Gram dương, các tế bào vi khuẩn Gram âm có khả năng đề kháng lại endolysin từ bên ngoài vì chúng sở hữu lớp màng ngoài trên thành tế bào, giúp ngăn cản sự tương tác giữa endolysin và lớp peptidoglycan Một vài nghiên cứu gần đây đã báo cáo các phương pháp để vượt qua lớp màng ngoài và ly giải vi khuẩn Gram âm [48], [49]

Việc sử dụng các tác nhân thấm màng ngoài (permeabilizing agents) như các chất kìm (chelator) là chiến lược phổ biến nhất để tăng hiệu quả của endolysin kháng vi khuẩn Gram âm Các chất kìm như EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) và các acid hữu cơ (acid citric, acid malic) thường được sử dụng như chất thấm màng ngoài [49] Ngoài ra, sự kết hợp endolysin với áp suất thủy tĩnh cao cũng có hiệu quả kháng khuẩn [49]

Để kiểm soát vi khuẩn Gram âm, các nhà nghiên cứu đã phát triển dung hợp endolysin với các peptide xuyên màng Các endolysin biến đổi như vậy gọi là các Artilysin, chúng bao gồm các domain endolysin, các đơn vị liên kết và các peptide kỵ nước (hydrophobic) hoặc lưỡng phần (amphipathic peptide) Chiến lược này thì không cần phải tiền xử lý với các chất thấm màng tế bào vì Artilysin có thể đâm xuyên qua màng ngoài của tế bào Gram âm Tuy nhiên, cần các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến để lựa chọn các peptide tối ưu và xây dựng các protein được biến đổi gene [50]

Một vài endolysin đã báo cáo cho thấy có khả năng ly giải vi khuẩn Gram âm từ bên ngoài mặc dù hoạt tính ly giải của chúng không mạnh như endolysin từ

phage SPN9CC có khả năng tiêu diệt 2-log CFU/ml tế bào E coli chỉ trong 1h phản

ứng [51] Một nghiên cứu mới về endolysin kháng vi khuẩn Gram âm đã được phát triển bằng cách ứng dụng hệ thống bọc endolysin qua trung gian liposome Vì liposome được biết đến là có khả năng xuyên qua màng vi khuẩn bằng cách dung hợp

màng, liposome bọc endolysin Salmonella BSPLys được nghiên cứu làm giảm log CFU/ml vi khuẩn Salmonella mà không cần xử lý với chất thấm màng tế bào [48]

2.2-Việc ứng dụng endolysin để kháng các tác nhân vi khuẩn Gram âm vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu và phát triển

2.3.5 Sự đề kháng endolysin

Phần lớn các vi khuẩn đều có khả năng phát triển các cơ chế đề kháng để bảo vệ chúng kháng lại với các chất kháng khuẩn Các cơ chế này bao gồm sự biến đổi về các thành phần của thành tế bào, cơ chế bơm đẩy thuốc ra khỏi tế bào, biến đổi enzyme và các porin [52] Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có các báo cáo nào về cơ

chế kháng đối với các endolysin từ thực khuẩn thể Chủng vi khuẩn Streptococcus pneumononiae phát triển trên môi trường đĩa thạch chứa các nồng độ thấp lysin Pal và kết quả không có sự đề kháng lysin đó [53] Vi khuẩn S aureus cũng được thử

nghiệm với các nồng độ ức chế khác nhau của Lysin LysH5 và cũng không có sự đề

kháng với lysin [54] Các thí nghiệm cũng được tiến hành với lysin PlyG, kết quả là không có chủng Bacillus anthracis nào được tìm thấy có khả năng kháng lysin PlyG,

trong khi cùng một phương pháp đó đã làm tăng sự đề kháng với kháng sinh novobiocin và streptomycin [55] Trong khi chưa được chứng minh, giả thuyết là có thể trong quá trình liên kết của thực khuẩn thể và vi khuẩn qua hàng trăm năm, các domain gắn (binding domain) của enzyme ly giải của phage đã tiến hóa để nhắm đến một phân tử cấu trúc duy nhất, thiết yếu, có độ bảo tồn cao trong thành tế bào vi khuẩn, do đó sự đề kháng của vi khuẩn đối với endolysin là hiếm khi xảy ra [56]

2.3.6 Ứng dụng của endolysin

 Bảo quản thực phẩm

Đã có nhiều nghiên cứu về endolysin được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chủ yếu được ứng dụng cho các sản phẩm sữa Nghiên cứu của Garcia và cộng sự

(2010) đã sử dụng endolysin LysH5 từ phage của Staphylococcus kết hợp với nisin –

một loại bacteriocin như là một chất bảo quản sinh học trong thực phẩm đã làm giảm

mật độ 8-log CFU/mL vi khuẩn S aureus chỉ trong 6h [57] Hoạt tính kháng khuẩn của endolysin LysSA11 có nguồn gốc từ phage của S aureus SA11 đã làm giảm đáng kể hơn 2- log CFU/mL vi khuẩn S aureus kháng methicillin (MRSA) trong sản phẩm

sữa chỉ trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng [58] Trong một nghiên cứu khác,

endolysin LysZ5 đã làm giảm hơn 4-log CFU/mL vi khuẩn Listeria monocytogenes

trong sữa đậu nành sau 3 giờ ủ ở nhiệt độ lạnh 40C [59]

Các nghiên cứu trên đã cho thấy endolysin là một tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

 Liệu pháp trị liệu

Việc dùng endolysin như một liệu pháp trị liệu mới là hướng tiếp cận tiềm năng để kiểm soát các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn gây bệnh gây ra ở người và động

vật Khả năng của endolysin chống lại vi khuẩn gây bệnh in vitro và in vivo trên mô

hình chuột đã được chứng minh trong một số phòng thí nghiệm Nghiên cứu đầu tiên của nhóm Fishetti và cộng sự (2001) cho thấy Lysin PlyC có khả năng kháng

Streptococcus pyogenes trong mô hình thử nghiệm trên chuột [60] Các nghiên cứu liên quan đến các ứng dụng in vivo của lysin trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn ở các

vị trí giải phẫu khác trên mô hình chuột cũng đã được báo cáo Một nghiên cứu đã

báo cáo việc điều trị viêm nội nhãn do S aureus gây ra bằng lysin ply187, một lần

tiêm lysin vào cơ thể sau khi nhiễm 6h đã làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn trong mắt chuột và cũng cho thấy tác dụng bảo vệ võng mạc ở cấp độ mô [61] Trong nghiên cứu khác, một mũi tiêm lysin IME-EF1 ở phúc mạc trong mô hình chuột nhiễm trùng

huyết cho thấy khả năng kháng Enterococcus faecalis tốt hơn so với sử dụng thực

khuẩn thể [62]

Việc sử dụng lysin tại chỗ trên da cũng đã được báo cáo, trong đó lysin chimeric ClyS được nghiên cứu có hiệu quả kháng vi khuẩn từ những con chuột bị nhiễm bệnh da Trong nghiên cứu này, lysin được bào chế trong thuốc mỡ có hiệu quả tốt hơn so

với chất kháng khuẩn chuẩn mupirocin [63] Đối với nhiễm trùng đường hô hấp, lysin Cpl-1 cũng đã được chứng minh có thể được đưa đến đường hô hấp ở dạng khí dung để chống lại nhiễm trùng phổi do phế cầu khuẩn trên mô hình chuột, trong đó Cpl‑ 1 được khí dung làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn trong phổi, do đó bảo vệ chuột khỏi phế cầu khuẩn [64]

Các nghiên cứu về tính an toàn của endolysin đối với động vật hoặc con người là cần thiết để thực hiện Một số nghiên cứu cho thấy sau khi tiêm endolysin SAL-1, Cpl-1 và Pal, các động vật thử nghiệm không có các dấu hiệu độc tính hoặc tử vong [65] Các nghiên cứu như vậy sẽ thúc đẩy việc sử dụng endolysin như là một liệu pháp tiềm năng trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh ở động vật và con người [41]

 Loại bỏ biofilm bằng endolysin

Một đặc điểm quan trọng của nhiều vi khuẩn gây bệnh là khả năng hình thành màng sinh học của chúng, dẫn đến khả năng chống chịu với nhiều chất kháng khuẩn [66] và lysin có khả năng loại bỏ các cấu trúc này Các vi khuẩn gây nhiễm trùng liên quan đến màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất là tụ cầu vàng [67] và lysin với khả năng phá vỡ các màng sinh học của chúng đã được báo cáo Nghiên cứu của Sass và Bierbaum (2007) đã cho thấy rằng lysin phi11 có khả năng loại bỏ màng sinh học của

S aureus [68] Một lysin khác được báo cáo khả năng loại bỏ màng sinh học là

LysH5, enzyme này có khả năng làm giảm mật độ vi khuẩn trong các màng sinh học

được hình thành bởi S aureus hoặc S epidermidis, nồng độ ức chế của enzyme này

đã hoàn toàn loại bỏ màng sinh học của tụ cầu vàng đối với một số chủng được thử nghiệm trong nghiên cứu này [69] Các nghiên cứu khác cũng cho thấy lysin có khả năng loại bỏ màng sinh học của tụ cầu vàng bao gồm SAL-1 [70], PlyGRCS [71] và Ply187 [61]

 Ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh

Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng endolysin cũng có một ứng dụng tiềm năng trong việc phát hiện và định lượng vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm [72] Việc phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm bằng cách sử dụng CBD (cell wall binding domain) có ái lực cao như là lựa chọn thay thế cho các phương pháp phát hiện tiêu chuẩn [72] Nghiên cứu của Kretzer và cộng sự (2007) đã cho thấy rằng

trong thực phẩm bị nhiễm L monocytogenes, tỷ lệ phát hiện cao hơn 90% có thể đạt

được bằng cách phân tách từ tính dựa trên CBD, sử dụng các hạt từ được phủ bởi

CBD của Listeria phage [73] Phương pháp này đã được chứng minh là vượt trội so

với quy trình đĩa thạch tiêu chuẩn về độ nhạy và thời gian và cũng được áp dụng để

phát hiện các tác nhân khác khác như Bacillus cereus và Clostridium perfringens

[73]

Một cách tiếp cận khác là phát triển công nghệ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) dựa trên CBD [74] Trong đó, CBD đã được biến đổi bằng cách gắn glutathione S-transferase vào đầu N-terminal của nó, cho phép cố định CBD đã biến đổi vào chip glutathione Các công nghệ phát hiện được đề cập ở trên đã cho phép một số ứng dụng sử dụng CBD để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh Chẳng hạn như cố định CBD

của endolysin từ B cereus phage PBC1 trên chip glutathione cho phép phát hiện đặc hiệu, định lượng vi khuẩn B cereus và cường độ phản ứng SPR cao hơn đáng kể khi

so sánh với cường độ của chip dựa trên kháng thể được sử dụng [74]

2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

Endolysin tái tổ hợp từ các thực khuẩn thể đã được nghiên cứu, biểu hiện trong các hệ thống tế bào chủ khác nhau và hoạt tính của chúng đã được khảo sát để kháng lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh khác nhau Một số nghiên cứu về các endolysin tái tổ hợp cũng như hoạt tính của chúng được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nghiên cứu endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể

M15A

Burkholderia pseudomalle

phage

E coli

BL21 (DE3)

Ly giải 18 loài vi khuẩn Gram âm khi màng ngoài tế bào được xử lý bằng chloroform

Endolysin được gắn thêm 3-12 amino acid kỵ nước, tăng hoạt tính ly

giải ngoại bào E coli

[10]

khi được xử lý với EDTA

[77]

Abtn-4

Acinetobacter baumannii phage D2

E coli

BL21 (DE3)

Hoạt tính kháng cao với nhiều chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc và Gram dương

[78]

vB_VpaP _KF2_Lys

Vibrio

parahaemolyticus phage

E coli

Rosetta 2 (DE3) pLysS

Endolysin KF2_Lys có hoạt tính kháng các

chủng Vibrio thử nghiệm

mà không cần tiền xử lý màng ngoài tế bào vi khuẩn

[79]

Nghiên cứu của Khakhum và cộng sự (2016) đã tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch

endolysin (peptidase M15A) từ phage ST79 của Burkholderia pseudomalle trong hệ thống biểu hiện E coli BL21 (DE3), enzyme này có khả năng ly giải 18 loài vi khuẩn

Gram âm khi màng ngoài tế bào được xử lý bằng chloroform [9]

Endolysin Lysep3 từ phage của Escherichia coli đã được nghiên cứu gắn thêm thành công 3-12 amino acid kỵ nước ở C-terminus có khả năng kháng E coli từ bên

ngoài tế bào, tăng hoạt tính ly giải ngoại bào [10]

Endolysin tái tổ hợp LysVPMS1 từ Vibrio phage đã được biểu hiện trong hệ thống E coli Rosetta 2 có hoạt tính ly giải V parahaemolyticus và một số loài vi khuẩn Vibrio khi màng ngoài tế bào vi khuẩn được xử lý với EDTA [75]

Nghiên cứu của Yu Larpin và cộng sự (2018) đã biểu hiện thành công lysin

PlyE146 từ phage E coli trong hệ thống L lactis NZ9000, lysin PlyE146 có hoạt tính

độ 400 μg/mL, pH 6 Ngoài ra PlyE146 còn có khả năng kháng các vi khuẩn khác

như Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumannii [80]

Hai protein chủ yếu của phage liên quan đến ly giải tế bào là endolysin LytSD

và protein holin HolSD từ phage của Streptomyces avermitilis, phiSASD1 đã được tạo dòng và biểu hiện trong hệ thống biểu hiện E coli BL21 (DE3) LytSD đã ly giải được 7 chủng vi khuẩn được thử nghiệm, bao gồm S avermitilis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea và Enterococcus faecalis Liên quan đến

HolSD, nó có khả năng ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn thử nghiệm [76]

Nghiên cứu của Yuan và cộng sự (2021) đã báo cáo endolysin từ Acinetobacter baumannii bacteriophage D2 là Abtn-4 chứa một chuỗi xoắn lưỡng cực và có hoạt tính kháng lại các chủng Gram âm đa kháng thuốc, tiêu diệt hơn 3-log CFU/mL A baumannii trong vòng 2h Ngoài ra, Abtn-4 còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng đối với một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm, chẳng hạn như S aureus, P aeruginosa, K pneumonia, Enterococcus và Salmonella Abtn-4 cũng có khả năng

làm giảm sự hình thành màng sinh học (biofilm) [78]

Endolysin tái tổ hợp KF2_Lys từ V parahaemolyticus phage vB_VpaP_KF2 đã thể hiện hoạt tính ly giải kháng tất cả chủng vi khuẩn Vibrio thử nghiệm mà không

cần tiền xử lý màng ngoài tế bào vi khuẩn Ngoài ra KF2_Lys cũng có hoạt tính kháng

yếu với các vi khuẩn khác như E coli K12, S Enteritidis và B cereus [79]

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hải và cộng sự (2018) đã tạo dòng và biểu

hiện endolysin LysSA từ thực khuẩn thể của Staphylococcus NA6 Gen LysSA mã

hóa protein endolysin (LysSA) có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa Endolysin tái

tổ hợp thu được có hoạt tính kháng cao với vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus

[77]

Nghiên cứu của Bùi Thị Thùy Dương và cộng sự (2018) đã tách dòng và biểu

hiện lysin K (LysK) được phân lập từ phage Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E coli Kết quả thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy LysK tái tổ hợp có hoạt tính kháng S aureus cao [81]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tạo endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể để kháng lại các vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có công trình khoa học nào cả trong và ngoài nước nghiên cứu tạo protein endolysin tái tổ hợp

từ thực khuẩn thể có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila – gây bệnh

xuất huyết trên cá tra

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 02 năm 2021 đến tháng 06 năm 2022

- Địa điểm: Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM, 268 Lý Thường Kiệt, Quận 10, Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Chủng vi sinh vật, plasmid

- Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 4.4T được phân lập từ một mẫu cá tra

bị bệnh vào tháng 9 năm 2019 tại Thành phố Cần Thơ và chủng thực khuẩn thể PVN02 được phân lập từ mẫu nước ao nuôi cá tra ở Thành phố Cần Thơ bởi nghiên cứu của Từ Quang Vinh và cộng sự trước đó [11]

- Chủng E coli BL21 (DE3) được sử dụng cho việc biểu hiện endolysin tái tổ

hợp

- Plasmid pET28a(+) được sử dụng làm vector biểu hiện endolysin tái tổ hợp Tất cả các chủng vi sinh vật và plasmid pET28a(+) nêu trên được lưu trữ và cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thực khuẩn thể của PGS.TS Hoàng Anh Hoàng tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP HCM

3.2.2 Môi trường, hóa chất, vật liệu

- Môi trường: Luria-Bertani Broth (LB) (hãng Himedia, Ấn Độ), Tryptone Soya Broth (TSB) ((hãng Himedia, Ấn Độ)

- Hóa chất: Q5® High-Fidelity Master Mix (2X) (New England Biolabs, Mỹ);

T4 DNA ligase, enzyme cắt giới hạn (BamHI, HindIII) (New England Biolabs,

Mỹ); imidazole (Biobasic, Canada); IPTG (Bioline, Mỹ); GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ); PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen, Mỹ); hóa chất điện di gel agarose: agarose, GelRed (Biotium), TAE 1X; hóa chất điện di SDS-PAGE (chi tiết ở phần phụ lục)

3.2.3 Thiết bị, dụng cụ

Máy luân nhiệt PCR, máy ly tâm, máy vortex, bể ổn nhiệt, máy đo pH, máy đo mật độ quang, hệ thống chụp ảnh gel UV, tủ ủ nuôi cấy lắc, cân điện tử, tủ đông lạnh, tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, hệ thống điện di gel agarose, hệ thống điện di SDS-PAGE và các thiết bị, dụng cụ khác

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu Cắt bằng RE Tinh sạch

PCR

Tối ưu hóa codon và tổng hợp gene endolysin

Cắt bằng RE Tinh sạch

Các dòng khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) đã biến nạp

Plasmid pET-28a(+) mang gene endolysin

Gene endolysin đã cắt RE Plasmid pET-28a(+) đã cắt RE

Biến nạp vào E coli BL21 (DE3)

Khảo sát hoạt tính kháng

Aeromonas hydrophila của

dịch endolysin tái tổ hợp thô Kiểm tra endolysin

tái tổ hợp thô bằng SDS-PAGE

Dịch endolysin tái tổ hợp thô

Thu nhận và phá tế bào

Dịch tế bào biểu hiện

Biểu hiện endolysin

Các khuẩn lạc E coli BL21 (DE3)

mang pET-28a(+)-gene endolysin

Giải trình tự plasmid Kiểm tra trình tự

gene endolysin

PCR khuẩn lạc

3.3.2 Phân tích trình tự endolysin cell wall hydrolase

Việc phân tích trình tự gene endolysin để: (1) tối ưu hóa codon khi biểu hiện ở

tế bào E coli; (2) đánh giá tính kị nước của protein để định hướng cho quá trình tinh

sạch; (3) xác định vùng gắn màng để dự đoán hoạt tính của enzyme endolysin thô Trình tự amino acid của endolysin được xác định dựa vào nghiên cứu trước đó với mã số truy cập QLI47613.1 trên Genbank, NCBI [11] Domain chức năng của endolysin được phân tích sử dụng cơ sở dữ liệu Conserved Domain Database (CDD) trên NCBI Việc dự đoán cấu trúc của endolysin được thực hiện dựa trên Phyre2 server [82] Độ kỵ nước của protein và xác định các xoắn xuyên màng đã được dự đoán bằng cách sử dụng các chương trình sau: TMpred (https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html), transmembrane topology prediction server – HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html) và TCDB (http://www.tcdb.org/progs/?tool=hydro) [78]

3.3.3 Tối ưu hóa codon gene endolysin cell wall hydrolase

Do sự khác biệt về trình tự codon mã hóa endolysin của phage PVN02 với các

codon mã hóa ở tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) nên cần thiết tối ưu hóa codon

gene này Gene endolysin cell wall hydrolase xuất phát từ thực khuẩn thể PVN02 của

vi khuẩn Aeromonas hydrophila có chứa nhiều codon hiếm với tần số xuất hiện thấp ở tế bào E coli, đặc biệt là bộ ba mở đầu GTG Bộ ba mở đầu phổ biến nhất ở vi khuẩn E coli là ATG chiếm 83%, GTG chiếm 14% và TTG chỉ chiếm 3% [83] Việc

tối ưu hóa codon được thực hiện bằng cách sử dụng công cụ hỗ trợ tối ưu hóa codon của Integrated DNA Technologies-IDT (https://sg.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool) Các thông số sau khi tối ưu hóa như chỉ số thích ứng codon (CAI – codon adaptation index) và thành phần %GC được tính toán sử dụng công cụ CAIcal [84] Trình tự gene endolysin cell wall hydrolase đã tối ưu hóa được tổng hợp và được chèn vào vector pUC19 bởi công ty TNHH Một Thành Viên Sinh Hóa Phù Sa (PhuSa Biochem)