Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tạo chế phẩm Lactase cố định trên phức chất mang CMC-Alginate để thăm dò ứng dụng tạo sản phẩm sữa nghèo Lactose

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát kỹ thuật và tối ưu quá trình cố định lactase.- Khảo sát động học lactase cố định và lactase tự do.- Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng lactas

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MAI THANH TRUYỀN

TẠO CHẾ PHẨM LACTASE CỐ ĐỊNH TRÊN PHỨCCHẤT MANG CMC-ALGINATE ĐỂ THĂM DÒỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM SỮA NGHÈO LACTOSE

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2012

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG TP HCMCán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

2 PGS TS Nguyễn Đức Lượng3 PGS TS Nguyễn Tiến Thắng4 PGS TS Nguyễn Thúy Hương5 TS Lê Thị Thủy Tiên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: MAI THANH TRUYỀN MSHV: 10310620

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 604280Khoá (năm trúng tuyển): 2010

1 TÊN ĐỀ TÀI: “TẠO CHẾ PHẨM LACTASE CỐ ĐỊNH TRÊN PHỨCCHẤT MANG CMC-ALGINATE ĐỂ THĂM DÒ ỨNG DỤNG TẠO SẢNPHẨM SỮA NGHÈO LACTOSE”.

2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát kỹ thuật và tối ưu quá trình cố định lactase.- Khảo sát động học lactase cố định và lactase tự do.- Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng lactase cố định

3 NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:4 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:5 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên ngành thôngqua

LỜI CÁM ƠN

Em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương Côđã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức bổ ích và luôn luôn đồng hànhcùng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy PGS TS Nguyễn Đức Lượng,cùng các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Bách KhoaTP.HCM đã cho em những giờ học hữu ích và những kiến thức chuyên môn trongsuốt thời gian học và thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nga, bộ môn Sinh Hóa, trường Đạihọc Khoa Học Tự Nhiên, Tp HCM đã hỗ trợ enzyme lactase

Tôi xin cám ơn tập thể các bạn khóa 2010 đã cùng học tập, trao đổi và độngviên, trợ giúp tôi trong quá trình học cũng như thực hiện đề tài

Xin cảm ơn gia đình luôn sát cánh, đồng hành cùng con trong suốt thời gianqua

TÓM TẮT

Ngày nay, sữa và các sản phẩm từ sữa là thực phẩm quan trọng đối với đờisống của chúng ta, vì trong sữa có chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng như:khoáng (Ca, Mg, Zn…), vitamin (A, B1, B2, BB…) và giàu năng lượng Tuy nhiên,việc tiêu thụ sữa trên thị trường bị giới hạn vì hiện tượng không dung nạp đườnglactose hay còn gọi là đường sữa do sự thiếu enzyme lactase trong hệ tiêu hóa củacon người Dùng lactase thủy phân lactose thành các đường đơn dễ tiêu hóa là giảipháp tốt nhất hiện nay Trong công nghiệp thực phẩm, lactase được sử dụng dưới 2dạng: tự do và cố định Mỗi loại có ưu và nhược điểm riêng Ngày nay, với sự pháttriển của công nghệ enzyme, xu hướng sử dụng enzyme cố định phổ biến vì đã khắcphục được một số nhược điểm của enzyme tự do Cùng với xu hướng đó, đề tàichúng tôi tập trung nghiên cứu cố định lactase trên chất mangalginate/carboxylmethyl cellulose (A/C) và thăm dò tạo sản phẩm sữa nghèo lactosevới kết quả thu được:

- Tỷ lệ khối lượng alginate/CMC thích hợp để cố định lactase là 1/1 trongđiều kiện thí nghiệm: nồng độ A/C 3% (w/v); dung dịch CaCl2 2%, tỷ lệenzyme/chất mang là ½

Milk and dairy products are one of important food cause they contains manykinds of mineral (Ca, Mg, Zn…), energy and vitamine (A, D, B1, B2, BB…).However, the consumption of these products are limited in the market Lactoseintolerance symptom which is caused by lacking of lactase in small intestine isconsidered as the main reason Lactose hydrolysis in milk are the good method tosolve this problem Lactase in food industry can be used in two types: free lactaseand immobilized lactase Each type of lactase has its advantages and disadvantages.Nowaday, immobilized lactase have been interested cause it can improve somedisadvantages of free enzyme Following this trend, our thesis researched lactaseimmobilization on alginate/Carboxylmethyl Cellulose (A/C) to apply in low lactosemilk production Through our research we had some results:

- The suitable weight rate of A/C which were used as a substrate in lactaseimmobilization was 1/1 This rate was a result when we did the practiceunder these conditions: concentration of A/C 3% (w/v); solution CaCl2 2%,the rate of lactase/matrix ½

- Some affected factors of this research:

+ The pH range of immobilized lactse is 6.5 – 8 with optimum pH (pHopt) is7.5

+ The thermal range of immobilized lactse is 40 – 550C with optimumtemperature is 500C

+ The kinetic parameters of immobilized lactase: Km=9.23 mM; Vmax=3.69

µM/ph.- At the first trial, lactose hydrolysis yield in milk was 90,69% and reduced to

61.1% after 12 times reuse The activated percentage of immobilizedlactase was 71.4% after 12 repeated times

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làtrung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọisự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin tríchdẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

1.1 Enzyme lactase (β-galactosidase) 3

1.1.1 Giới thiệu enzyme lactase 3

1.1.2 Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase 4

1.2 Enzyme cố định 7

1.2.1 Định nghĩa enzyme cố định 7

1.2.2 Lịch sử phát triển của enzyme cố định 8

1.2.3 Các phương pháp cố định enzyme β-galactosidase 9

1.2.4 Phức chất mang CMC-Alginate 13

1.2.5 Một số loại lactase cố định thương phẩm 17

1.3 Sữa và các thành phần chính trong sữa 18

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước 21

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu 25

2.3 Sơ đồ thí nghiệm 26

2.4 Phương pháp thí nghiệm 27

2.4.1 Một số các khảo sát tiền đề tài 27

2.4.2 Nghiên cứu quá trình cố định lactase trong phức Alginate/CMC 32

2.4.3 Động học lactase: Xác định hằng số Km và Vmax enzyme lactase 34

2.4.4 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng chế phẩm lactase cố địnhvà khả năng tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 35

2.5 Xử lí số liệu 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Một số các khảo sát tiền đề tài 37

3.1.1 Định lượng protein – enzyme lactase theo phương pháp Lowry 37

3.1.2 Xác định hoạt tính, hoạt tính riêng và các yếu tố ảnh hưởng của lactase tựdo 38

3.2 Nghiên cứu quá trình cố định lactase trong phức Alginate/CMC 42

3.2.1 Xác định nồng độ Alginate và CMC tạo phức chất mang A/C 42

3.2.2 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định 45

3.3 Động học lactase: Xác định hằng số Km và Vmaxenzyme lactase 53

3.4 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng chế phẩm lactase cố định

và khả năng tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 55

3.4.1 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng chế phẩm lactase cốđịnh 55

3.4.2 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm lactase cố định 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO i

PHỤ LỤC 1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và các loại dung dịch đệm ix

PHỤ LỤC 2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định xi

PHỤ LỤC 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định xii

PHỤ LỤC 4 Phương pháp định lượng lactose trong sữa xiii

PHỤ LỤC 5 Kết quả kiểm nghiệm lactose của Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thínghiệm Tp HCM xv

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn vi sinh vật thu nhận β-galactosidase 5

Bảng 1.2 Tính chất của β-galactosidase của nấm mốc, nấm men, vi khuẩn 6

Bảng 1.3 Các phương pháp cố định lactase 11

Bảng 1.4 Một số chế phẩm lactase cố định thương mại 17

Bảng 1.5 Thành phần sữa bò 20

Bảng 3.1 Nồng độ protein – enzyme 37

Bảng 3.2 Hoạt tính, hoạt tính riêng lactase 38

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của lactase tự do 39

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lactase tự do 40

Bảng 3.5 Tỷ lệ alginate và CMC 42

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH lên lactase tự do và chế phẩm lactase cố định 45

Bảng 3.7 Khảo sát độ bền pH của lactase tự do và cố định (A/C và alginate-ĐC) 47Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên lactase tự do và cố định 49

Bảng 3.9 Khả năng chịu nhiệt của lactase tự do và cố định 51

Bảng 3.10 Thông số động học lactase tự do và cố định 54

Bảng 3.11 Hàm lượng đường lactose trước và sau thủy phân bằng lactase 55

Bảng 3.12 Khảo sát số lần tái sử dụng của chế phẩm lactase cố định 56

Hình 1.5 Cấu trúc của alginate 13

Hình 1.6 Cơ chế tạo gel từ bên ngoài của alginate 14

Hình 1.7 Cơ chế tạo gel từ bên trong của alginate 15

Đồ thị 3.1 Đường chuẩn nồng độ albumin (µg/ml) 37

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính lactase tự do 39

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lactase tự do 41

Đồ thị 3.4 Hiệu suất cố định 43

Đồ thị 3.5 Hiệu suất hoạt tính riêng lactase cố định 43

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính lactase cố định và tự do 46

Đồ thị 3.7 Khảo sát độ bền pH của lactase tự do và cố định(a) pH 7; (b) pH 7,5; (c) pH 8 48

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên % hoạt tính lactase tự do và cố định 49

Đồ thị 3.9 Khả năng chịu nhiệt của lactase tự do và cố định(a) 450C; (b) 500C; (c) 550C 52

Đồ thị 3.10 Phương trình động học lactase theo Lineweaver-Burk 53

Đồ thị 3.11 Số lần tái sử dụng chế phẩm lactase 56

MỞ ĐẦU

Ngày nay, chúng ta rất quen thuộc với nhiều loại sản phẩm làm từ sữa như:sữa chua, sữa đặc, sữa nước, sữa bột, bơ, pho mát Không ai có thể phủ nhận mộtthực tế rằng, bản chất của sữa là một nguồn dinh dưỡng dồi dào, đáp ứng tốt nhucầu dinh dưỡng của con người và đặc biệt rất thơm ngon

Sữa là nguồn cung cấp các yếu tố thiết yếu cho sinh trưởng và phát triển củacon người Mỗi người chúng ta ngay từ lúc sinh ra đều cần đến sữa để bắt đầu sựsống Tất cả chúng ta đều biết rằng bò sữa có thể sản xuất ra sữa phục vụ nhu cầucủa con người Sữa rất giàu năng lượng, đạm, khoáng và các loại vitamin Các nhàkhoa học còn chỉ ra rằng trong sữa có đến hơn 100 loại thành phần khác nhau [68]

Lactose [4-O-(β-D-galactopyranosyl)-D-glucopyranose] là carbohydrate(disaccharite) chủ yếu của sữa, nồng độ khoảng 5% (w/v) Khi thủy phân lactose tạothành 2 đường đơn glucose và galactose Enzyme thủy phân lactose là β-galactosidase (EC.3.2.1.23), thường được gọi là lactase Ngày nay, sữa bò và cácsản phẩm khác từ sữa được xem là thực phẩm thường nhật của con người Vì thế,lactose là nguồn cung cấp lượng carbohydrate đáng kể hàng ngày của chúng ta

Nhưng lactose trong sữa và các sản phẩm từ sữa lại ảnh hưởng đến sự tiêuhóa Không dung nạp lactose do thiếu enzyme lactase trong niêm mạc ruột non làvấn đề của hơn 70% dân số trên thế giới Lượng lactose không hấp thu trong ruột bịchuyển hóa bởi các quần thể vi khuẩn ở ruột dẫn đến tiêu chảy, đau bụng, đầy hơivà khó chịu Vấn đề này có thể được giải quyết nếu lactose trong sản phẩm sữađược thủy phân thành các dạng đường đơn dễ hấp thu Sử dụng lactase ngoại bàothủy phân lactose sẽ giải quyết triệt để vấn đề này Lactase có thể được sử dụng ởdạng hòa tan, cố định Nhưng với sự phát triển của công nghệ enzyme cố định manglại rất nhiều ưu điểm trong quá trình thủy phân lactose [58]

Theo Q Husain (2010), có khoảng 70% dân số thế giới bị triệu chứng khôngdung nạp lactose (lactose intolerance) Tỷ lệ không dung nạp lactose khác nhau ởcác khu vực trên thế giới từ 5% đến gần như 100% Ước tính có khoảng 75% người

trưởng thành có hiện tượng giảm hoạt động của lactase trong giai đoạn trưởngthành Tỷ lệ giảm hoạt động của lactase từ 5% ở Bắc Âu, lên 71% ở Nam Âu, và lêntới 90% ở các nước Châu Phi và Châu Á [51].

Hiện nay, thế giới có rất nhiều sản phẩm sữa đã thủy phân lactose hay còngọi sữa nghèo lactose (lactose-reduced milk), nhưng tại Việt Nam, các công ty sữavẫn chưa sản xuất được sản phẩm này, tất cả sản phẩm đều nhập ngoại nên giáthành rất cao

Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Tạo chế phẩm lactase cố định trên

phức chất mang CMC-Alginate để thăm dò ứng dụng tạo sản phẩm sữa nghèolactose” Với mục tiêu, thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose tại Việt Nam.

a Căn cứ trên mục tiêu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ba nội dung:- Khảo sát kỹ thuật và tối ưu quá trình cố định lactase

- Khảo sát động học lactase cố định và lactase tự do.- Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose bằng lactase cố định.b Luận điểm mới của đề tài thể hiện ở hai khía cạnh:

- Tạo chế phẩm lactase cố định.- Góp phần giải quyết được vấn đề không dung nạp lactose của đa số dân số

Khai thác tiềm năng thị trường sữa tại Việt Nam.* Quy mô nghiên cứu: quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.Enzyme lactase (β-galactosidase)

Lactase có mã số phân loại EC.3.2.1.23, là một enzyme thủy phân đườnglactose thành các monomer là glucose và galactose Việc sử dụng β-galactosidase đểthủy phân lactose trong sữa và dịch whey là một trong những ứng dụng tiềm năngtrong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sản phẩm từ sữa Enzyme này có thểđược sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng dạng hòa tan chỉ có thểsử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hơn là có thểsử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục Mặc dù hầu hết cácngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzyme tự do, nhưng việc sử dụngenzyme β-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năngcủa nó

Lactase là một trong những enzyme được nghiên cứu ở dạng tự do và cố địnhtrên quy mô lớn Enzyme này có rất nhiều ứng dụng, nhưng do giá thành cao nênngười ta khuyến khích sử dụng enzyme này dưới dạng cố định Lactase cố định rấtquan trọng chủ yếu trong việc xử lí huyết thanh sữa, khi đó chất béo và proteintrong nhũ tương sữa có xu hướng bám lên bề mặt chất xúc tác sinh học Điều này sẽlàm giảm hoạt tính của enzyme và làm tăng sự ngoại nhiễm vi sinh vật [49]

Hình 1.1 Cấu trúc β-galactosidase của Penicillum sp [15]

1.1.2.Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase

Enzyme β-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhưvi sinh vật, thực vật và động vật Tuy nhiên, tính chất của enzyme được thu nhận từcác nguồn khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Enzyme thu nhận từ nguồn thực vật vàđộng vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưuthế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thunhận sản phẩm cao Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng củaloại enzyme này

Hình 1.2 A oryzae [64]

Hình 1.3 Bacillus licheniformis [65]

Bảng 1.1 Nguồn vi sinh vật thu nhận β-galactosidaseNguồnVi sinh vật

Vi khuẩn

Alicyclobacillus acidocaldarius subsp rittmannii Arthrobacter sp.Bacillus acidocaldarius, B circulans, B coagulans, B subtilis, B.megaterum, B stearothermophilus

Bacteriodes polypragmatusBifidobacterium bifidum, B infantisClostridium acetobutylicum, C thermosulfurogensCorynebacterium murisepticum

Enterobacter agglomerans, E cloaceaeEscherichia coli

Klebsiella pneumoniaeLactobacillus acidophilus, L bulgaricus, L helviticus,L.kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L.delbrueckii

Leuconostoc citrovorumPediococcus acidilacti, P pentoPropioionibacterium shermaniiPseudomonas fluorescensPseudoalteromonas haloplanktisStreptococcus cremoris, S lactis, S thermophiusSulfolobus solfatarius

Thermoanaerobacter sp.Thermus rubus, T aquaticusTrichoderma reesei

Vibrio choleraXanthomonas campestris

Nấm

Alternaria alternate, A palmiAspergillus foelidis, A fonsecaeus, A fonsecaeus, A.Carbonarius, A Oryzae

Auerobasidium pullulansCurvularia inaequalisFusarium monilliforme, F oxysporumMucor meihei, M pusillus

Neurospora crassaPenicillum canescens, P chrysogenum, P expansumSaccharopolyspora rectivergula

Scopulariapsis spStreptomyces violaceus

Nấm men

Bullera singularisCandida pseudotropicalisSaccharomyces anamensis, S lactis, S fragilisKluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K marxianus

[49]

Bảng 1.2 Tính chất của β-galactosidase của nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

Sterigmatomyceselviae CBS8119

Ca2+,Cu2+,Zn2+

-Lactobacillusthermophilus

Bullera singularis

KCTC 7534

Bacillusstearothermophilus

7,0702,9670-Fe2+, Zn2+,

Cu2+, Pb2+,Sn2+

Bifidobacteriumbifidum

4,845800362EDTAZn2+, Mn2+

Co2+, Ca2+,Sn2+

Bifidobacteriuminfantis

5,0602,6470Na+, K+ Cr3+, EDTAc,

urea,galactose

PCMB

Zn2+,galactose

kD = kiloDalton; oNPG = o-nitrophenyl β - D galactopyranoside; SDS = sodium dodecyl sulfate;EDTA = ethylene diamine tetraacetic acid; PCMB = p-chloromercuribenzoate [27].

1.2.Enzyme cố định

Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khu biệt về mặt vật lý ở mộtvùng không gian nhất định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể được táisử dụng nhiều lần [37]

Các ưu điểm của enzyme cố định:- Khả năng tái sử dụng: enzyme cố định có thể được sử dụng lại nhiều lần,

quá trình xúc tác có thể xảy ra liên tục và có thể được kiểm soát triệt để nênviệc sử dụng enzyme cố định kinh tế hơn so với enzyme hòa tan

- Có các ứng dụng đa dạng với nhiều kiểu cố định khác nhau phù hợp chotừng ứng dụng đó

- Có thể bất hoạt nhanh enzyme khi cần.- Sản phẩm của quá trình chuyển hóa do enzyme cố định xúc tác có thể được

tách ra dễ dàng trong khi vẫn giữ được các đặc tính của enzyme.- Các đặc tính lý hóa có thể thay đổi đa dạng: Độ ổn định, pH tối ưu, khả

năng chịu nhiệt và mức độ đặc hiệu có thể thay đổi tùy theo phương phápcố định enzyme Đặc biệt, có một số enzyme nhạy cảm với nhiệt trở nênbền nhiệt hơn khi gắn vào chất mang trơ về mặt hóa học

- Có thể được sử dụng như các mô hình của enzyme trong tự nhiên Ví dụnhư việc cố định nhiều loại enzyme trong một con đường chuyển hóa sinhhóa tự nhiên trong các cấu trúc lỗ nano có thể xúc tác in vitro cho một quátrình chuyển hóa phức tạp diễn ra theo nhiều bước [10,36]

Tuy nhiên theo Parmjit S Pannesar và cộng sự (2010) vấn đề chính trong hệthống cố định enzyme là sự nhiễm khuẩn, kết dính protein và phân dòng Các vấnđề này có thể được khắc phục bằng phương pháp rửa định kỳ, thanh trùng pasteurvà hướng dòng chảy của nguồn cung cấp Vấn đề nhiễm khuẩn cũng có thể khắcphục bằng cách khai thác đặc tính nhiệt độ của enzyme Các enzyme ổn định nhiệtcó khả năng duy trì hoạt tính của chúng ở nhiệt độ cao trong thời gian dài và do cónhiệt độ hoạt động cao nên quá trình ít bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm khuẩn

Các thông số quan trọng của một enzyme cố định cần đạt được:

- Năng suất của enzyme từ nguồn ban đầu.- Giá cả của chất mang hay các hóa chất cố định.- Hoạt tính của enzyme cố định.

- Độ bền của enzyme cố định.- Khả năng tái sử dụng chất mang [10]

Có thể chia lịch sử phát triển của enzyme cố định ra thành ba giai đoạn pháttriển chính:

- Giai đoạn 1: năm 1815, ứng dụng enzyme cố định trong các quá trình nhưsản xuất acid acetic, xử lý nước thải

- Giai đoạn 2: thập niên 1960, cố định đơn enzyme để sản xuất L-amino acid,đồng phân hóa glucose

- Giai đoạn 3: từ 1985 – 1995, cố định đa enzyme bao gồm tái sinh co-factorvà cố định tế bào [21]

Trong đó, nổi bật lên một số nghiên cứu:Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzyme invertase(EC.3.2.1.2.6) của nấm men khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đườngsaccharose

Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzyme nhưcarboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liênkết đồng hóa trị qui mô phòng thí nghiệm

Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme đểchống lại dị ứng khi đưa enzyme vào cơ thể

Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzymenhư amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide

Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cốđịnh carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng trong năm này Chang đã triểnkhai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzyme carbonic anhydrase

Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuấtglucose bằng glucoamylase cố định

Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku –Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzyme cố địnhvào sản xuất công nghiệp Theo phương pháp cố định enzyme của các tác giả ngườiNhật, enzyme aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thôngqua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân.

Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzyme: β-galactosidase,hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex

Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase.Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thànhcông trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium

fumarate bằng gel acrylamid Tế bào E coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất

cao

Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzyme glucoisomerase cố định,đã tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến naycó khoảng 4,5 triệu tấn siro fructose được sản xuất theo phương pháp enzyme cốđịnh

Ngoài sản phẩm trên, enzyme cố định còn được ứng dụng nhiều trong côngnghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học [10]

1.2.3.1 Phương pháp hấp phụ vật lý

Đây là phương pháp cố định đơn giản nhất, các chất xúc tác sinh học đượcgiữ trên bề mặt của chất mang không hòa tan trong nước bằng các liên kết vật lýnhư liên kết Van der waals Ngoài ra còn các liên kết khác giữa chất mang và chấtxúc tác sinh học như các tương tác kỵ nước, cầu hydrogen, và liên kết ion

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện và có ít ảnh hưởng lên cấu tạocủa chất xúc tác sinh học

Nhược điểm của phương pháp là lực liên kết hấp phụ tương đối yếu.Các chất mang sử dụng trong phương pháp hấp phụ gồm chất mang vô cơ(alumina, silica, thủy tinh xốp, gốm, đất sét…) và chất mang hữu cơ (cellulose, tinhbột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion như Amberlite, Sephadex, Dowex)

Ngoài ra, sự hấp phụ enzyme có thể được ổn định khi xử lý bằngglutaraldehyde [49].

1.2.3.2 Phương pháp bao gói

Phương pháp bao gói là phương pháp nhốt enzyme trong một không giannhỏ Bao gói mạng lưới và bao gói màng (bao gồm vi gói) là các phương pháp baogói chính Ưu điểm chính của kỹ thuật này là tính đơn giản, trong đó, các phần tửhình cầu được thu nhận thông qua sự nhỏ giọt dịch treo polymer-tế bào vào môitrường chứa các ion tích điện dương hay bằng phương pháp polymer hóa nhiệt

Nhược điểm chính của kỹ thuật này là có sự thất thoát enzyme trong suốt quátrình sử dụng liên tục do kích thước enzyme nhỏ Tuy nhiên, nhược điểm này có thểđược khắc phục bằng phương pháp liên kết thích hợp

Chất mang thường được sử dụng là các vật liệu polymer như Ca-alginate,agar, k-carragenin, polyacrylamide và collagen Một số chất mang rắn cũng có thểđược sử dụng như than hoạt tính, gốm xốp Đối với phương pháp bao gói màng,chất mang thường sử dụng là nylon, cellulose, polysulfone và polyacrylamide [49].1.2.3.3 Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Trong phương pháp này các enzyme được duy trì trên bề mặt chất mangbằng sự hình thành các liên kết cộng hóa trị Các phân tử enzyme liên kết với chấtmang bằng các nhóm chức năng xác định như amino, carboxyl, hydroxyl vàsulfydryl Các nhóm chức năng này phải không thuộc trung tâm hoạt động củaenzyme Phương pháp được khuyến khích thực hiện là cố định enzyme với sự cómặt của cơ chất hay chất ức chế cạnh tranh của enzyme để bảo vệ trung tâm hoạtđộng Các nhóm chức năng của chất mang thường được hoạt hóa bằng các tác nhânhóa học như cyanogen bromide, carbodimide và glutaraldehyde [49]

Hình 1.4 Các phương pháp cố định enzyme [72]

Bảng 1.3 Các phương pháp cố định lactasePhương pháp

cố định Nguồn gốc β-galactosidase Chất mang

K fragilis và K lactis Chitosan

A oryzae Polyvinyl chloride và Silica gel membrane

B circulans Polyvinyl chloride và Silica

B stearothermophilus Chitosan

Thermus sp T2 PEI- sepabeads, DEAE-agarose

Hấp phụ vật lý

Pisum sativum Sephadex G-75 và chitosan beads

Thermus aquaticus YT-1 Agarose bead

Penicillium expansum F3 Calcium alginateBao gói

K lactis, A oryzae, S.cerevisiae

Poly(vinylalcohol) hydrogel

A oryzae Silica gel activated với TiCl3 và FeCl3

E coli (Recombinant galactosidase)

β-Cyanuric chloride-activated cellulose

B circulans Eupergit C (Spherical acrylic polymer)

A oryzae Cotton cloth và activated tosyl chloride

1.2.3.4 Chất mang cố định enzyme

Theo Brena và cộng sự (2006), các tính chất của chất mang đóng vai trò quantrọng trong sự biểu hiện của hệ thống enzyme Một số đặc điểm lý tưởng của chấtmang như khả năng kháng lại lực nén, tính háo nước, trơ đối với enzyme, khả năngtương thích sinh học, khả năng kháng khuẩn, và chi phí thấp

Chất mang cố định enzyme có thể được chia thành hai nhóm lớn: chất mangvô cơ và chất mang hữu cơ (gồm polymer tổng hợp và polymer sinh học)

a Chất mang vô cơThông dụng là vật liệu thủy tinh xốp Loại vật liệu này có cấu trúc lỗ xốp,kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được Vật liệu oxid kim loại như: oxidnhôm, oxid mangan, oxid magie, oxid titan Vật liệu này có cấu trúc lỗ xốp và cókhả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào Ngoài ra còn có các vật liệu khác nhưdiatomite (celit) và gốm [1]

b Chất mang hữu cơ

- Chất mang polymer tổng hợp gồm một số polymer thường dùng như:polystyren, polyvinylacol, polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic…Hầu hết các polymer tổng hợp được dùng cố định enzyme và tế bào bằngphương pháp nhốt trong lòng chất mang

- Chất mang polymer tự nhiên (polymer sinh học) gồm:

+ Chất mang protein: gelatin, keratin và albumin Phương pháp chủ yếu vớiloại chất mang này là nhốt trong cấu trúc gel Gần đây có một số công trìnhnghiên cứu tiến hành ghép gellatin với một số polymer tổng hợp nhưpolyhydrosyethylmethacrylate

+ Chất mang polysacharid: cellulose, agarose, sephadex và một số dẫn xuấtcủa chúng Ngoài ra, còn có một số vật liệu mới có nhiều triển vọng là tinhbột, chitin, alginate, carrageenan, carboxymethylcellulose (CMC) [1].c Để đánh giá hiệu quả của sự cố định, có thể dựa theo những chỉ số sau:

- Độ bền cơ học của chất mang: được đánh giá trên cơ sở chúng có sức chịuđựng ở pH, nhiệt độ

- Hiệu suất cố định

- Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau

- Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau

- Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nốivới nhau

Hình 1.5 Cấu trúc của alginate [31]

a Cơ chế tạo gelAlginate cĩ khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hĩa trị caohoặc khi phân tử alginate bị acid hĩa Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cáchacid hĩa phân tử alginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp.

Alginate cĩ khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hĩa trị cao để tạothành gel đồng thể Ái lực của alginate đối với các ion hĩa trị 2 khác nhau giảmtheo trình tự: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+ > Ni2+ > Zn2+ > Mn2+.Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành cĩ tính chất khácnhau Thơng thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel

Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loạihĩa trị cao cĩ thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngồivà phương pháp tạo gel từ bên trong [1,60,31]

b Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngồiĐây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate Phương pháp này cĩưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản

Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch cĩ chứa cation cĩ khả năng tạo gel(thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngồi của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hĩa Tiếptheo đĩ, các cation tạo gel ở bên ngồi hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bêntrong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hĩa Quá trình nàyxảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh,tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại khơng cao [31]

Hạt gel Cacium Alginate Na-Alginate

Ca

Ca

CaCaCaCa

CaCl2

Na-AlginateLực đẩy

Hình 1.6 Cơ chế tạo gel từ bên ngồi của alginate [31]

c Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trongCho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (ví dụ: CaCO3,CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate Thay đổi pH củadung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hóa (ví dụ: D-glucono-δ-lactone(GDL)) Khi đó, do pH giảm, mà độ hòa tan của các muối chứa các cation tạo gelnhư ở trên lại phụ thuộc vào pH nên các ion Ca2+ sẽ được giải phóng dần và thamgia vào quá trình tạo gel với alginate Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thểcao hơn hẳn phương pháp khuếch tán do các ion Ca2+ phân bố đồng đều hơn Hơnthế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gel với các hình dạng khác nhau như mongmuốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuôn thích hợp trước khi quá trình tạogel diễn ra Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bên ngoài thường chỉ tạo thànhcác hạt có hình cầu [31].

H2OG D LH +

C O2H C O3

C aC O3

H +

C aC a

C aN a-A lginate

Hình 1.7 Cơ chế tạo gel từ bên trong của alginate [31]d Ưu, nhược điểm của việc cố định bằng gel alginate

- Ưu điểm

+ Quá trình cố định dễ thực hiện

+ Điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó,các tế bào cố định không bị mất hoạt tính

+ Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học

+ Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm

+ Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm

+ Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ cao

+ Giá thành rẻ [1,21,31]

1.2.4.2 Carboxymethyl Cellulose (CMC)

Carboxymethylcellulose (CMC) (2,4-6) là muối natri của ethercarboxymethyl của cellulose Trong thành phần ghi nhãn, nó có thể được ghi làcarboxymethyl cellulose, CMC, Natri CMC, Cacboximetyl xenluloza natri, haycacboximetyl xenluloza

Hình 1.8 Cấu trúc của CMC [70]

- Trạng thái hoà tan của CMC rất ổn định với khoảng pH = 4–10 (Fredrick j.Rancis) Tuy nhiên, ở pH = 5–9 dung dịch ít thay đổi nhưng ở pH < 3 độnhớt của dung dịch gia tăng thậm chí kết tủa do đó không sử dụng CMCcho các sản phẩm có pH thấp pH > 7 độ nhớt bị giảm ít.

- CMC sử dụng với nhiều mục đích: giữ nước, tạo đặc, trợ phân tán, chốngcũ, tạo láng, làm bóng, ổn định mùi vị… Trong nước uống dùng ổn địnhcác pha rắn trong dung dịch ngoài ra còn có khả năng ngăn cản phân ly tinhdầu/nước trong các sản phẩm nước quả Nồng độ thường sử dụng là 1%

- CMC và sodium alginate là hai polymer quan trọng và dễ tìm trong tựnhiên Sodium alginate là một polysaccharide tích điện âm gồm các nhómthế α-L-guluronic acid và β-D-mannuronic acid CMC là một ether tíchđiện của cellulose và các dẫn xuất đã được thương mại hóa của cellulose.Các polysaccharide này có các nhóm carboxylate (-COO-) ưa nước CMCvà sodium alginate sau khi biến đổi hóa học để cải thiện các đặc tính có thểđược dùng trong nhiều lãnh vực không chỉ do giá thành thấp mà chủ yếu dotính tương thích sinhh học và phân hủy sinh học [14]

Bảng 1.4 Một số chế phẩm lactase cố định thương mạiCông ty Nguồn enzyme Quy trình cố định

Gist Brocades Saccharomyces lactis Enzyme cố định trong các sợi cellulose

triacetateSnampogetti Kluyveromyces lactis Enzyme cố định trong các sợi cellulose

triacetateCorn Glass Works Aspergillus niger Enzyme liên kết cộng hóa trị trên các hạt silicaValio laboratory Aspergillus niger Enzyme hấp phụ hay liên kết chéo với nhựa

phenol formadehydeSturge Aspergillus oryzae Enzyme bằng liên kết cộng hóa trị với ferrit

Mn-Zn đã silan hóaRohm GmbH Aspergillus oryzae Enzyme cố định bằng liên kết cộng hóa trị

trong plexiglass có lỗ lớnSumitomo Aspergillus oryzae Enzyme cố định bằng liên kết cộng hóa trị với

nhựa trao đổi ion lưỡng tính có lỗ lớnAmerace Corp Aspergillus oryzae Enzyme cố định bằng liên kết cộng hóa trị với

tấm PVC-silica lỗ nhỏ

[30]

1.3.Sữa và các thành phần chính trong sữa

Sữa là một chất lỏng màu trắng đục được tạo ra bởi loài cái động vật có vú.Khả năng tạo ra sữa là một trong những đặc điểm phân định động vật có vú Sữađược tạo ra làm nguồn dinh dưỡng ban đầu cho các con sơ sinh ăn trước khi chúngcó thể tiêu hóa các loại thực phẩm khác Sữa được tiết ra ban đầu gọi là sữa non cóchứa các kháng thể từ mẹ để cung cấp cho con non, do đó sữa non giúp con nongiảm nguy cơ bị nhiễm một số bệnh

Sữa tươi của các loài khác nhau thì có sự khác nhau về thành phần trong sữa,nhưng vẫn gồm các thành phần chủ yếu sau: chất béo no, protein, canxi, vitamin C,lactose [68]

Đạm whey cũng bị đông lại dưới sức nóng, chứ không phải là axit và muối.Đây chính là bí quyết cơ bản để tạo ra sữa chua và phô-mai

1.3.3. Đường lactose

Lactose là carbohydrate chính trong sữa các loài Lactose là một disaccharidegồm glucose-D monosacarit và D-galactose, liên kết bằngβ-1,4-glycosidic Tên hóa

học của lactose là 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucopyranose Đơn vị cơ bản củasữa, mặc dù có thể tìm thấy trong quả của một loài cây Lactose đóng một vai tròquan trọng trong tổng hợp sữa Nó là “đơn vị osmole” chính trong sữa và quá trìnhtổng hợp lactose có liên quan chặt chẽ đến hàm lượng nước trong sữa.

Lactose không ngọt bằng các đường disaccharide khác như sucrose hoặcmonosaccharide như glucose, fructose Lactose bị phân hủy thành glucose vàgalactose trong ruột của trẻ sơ sinh nhờ enzyme lactase (β-galactosidase) Lactose lànguồn chính cung cấp glucose, nguồn năng lượng cho trẻ sơ sinh Không dung nạplactose có thể xảy ra ở người trưởng thành hoặc người không có lactase trong hệtiêu hóa

Không có lactase, lactose không thể phân chia thành glucose và galactose đểcó thể hấp thụ và đốt cháy thành năng lượng Khi lactose lên men trong hệ tiêu hóa,nó sẽ sinh ra khí và một số acid (những người bất dung nạp lactose sẽ không thểchuyển hóa năng lượng từ lactose) Lactose sẽ bị caramen hóa khi sữa được làmnóng và sẽ biến sữa thành màu xỉn

Hình 1.9 Sơ đồ chuyển hóa của lactose bởi β- galactosidase [62]

1.3.4.Vitamin và khoáng chất

Sữa là một nguồn tuyệt vời của rất nhiều vitamin và khoáng chất Can-xi vàma-giê giúp các mixen trong sữa ổn định Can-xi giúp tăng cường sức khỏe choxương và răng

Sữa cũng rất giàu riboflavin, một vitamin có thể bị phá hủy bởi ánh sáng, vìvậy cần bảo quản sữa trong những hộp ngăn ánh sáng

Chất béo trong sữa có chứa vitamin A

Bảng 1.5 Thành phần sữa bòCác thành phần chính Khoảng biến thiên Giá trị trung bình

Một trong các ứng dụng chính của enzyme lactase cố định là sử dụng trongcông nghiệp sữa, tạo sữa nghèo lactose và nhũ thanh sữa nghèo lactose Một phầnlớn dân số không dung nạp được lactose có thể dùng dạng sữa này Việc thủy phânlactose cũng làm tăng đáng kể độ ngọt và khả năng hòa tan của các loại đường đôi

Dịch nhũ thanh sữa sau lên men đã thủy phân lactose có thể được sử dụnglàm đồ uống có cồn, các chất làm bánh, đồ ăn hay để sản xuất cồn và nấm men

Centrale del Latte of Milan, Ý là công ty đầu tiên sử dụng lactase cố định đểthương mại hóa sản phẩm sữa nghèo lactose, sử dụng công nghệ của Snamprogetti.Quá trình này sử dụng lactase trung tính từ nấm men được nhốt trong sợi tổng hợp.Liên doanh giữa Specialist Dairy Ingredients và Milk Marketing Board đã thiết lậpmột quy trình cố định lactase thực vật ở xứ Wales để sản xuất nhũ thanh sữa lênmen đã thủy phân lactose

1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Năm 2007, Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự đã nghiên cứu “Khảo sát quá trìnhcố định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang CMC-Alginate” Enzyme cốđịnh có nhiều ưu điểm trong ứng dụng, tuy nhiên việc tạo enzyme cố định còn phụthuộc nhiều yếu tố và đang là đề tài cho nhiều nhà nghiên cứu khoa học Đây là mộtđề tài nghiên cứu khả năng cố định enzyme α-amylase bởi chất mang dạng phứcCMC-Alginate Kết quả đạt được là hoạt tính của enzyme α-amylase Termamyl cốđịnh bởi gel CMC-Alginate cao tại nồng độ alginate 0,75%, nồng độ CaCl2 6%.Nồng độ CMC (Cacboxymethyl cellulose) thích hợp để cố định enzyme Termamyllà 2% Hoạt tính enzyme Termamyl cố định phụ thuộc vào cơ chất, pH và nhiệt độphản ứng: Kết quả cho thấy khả năng chịu nhiệt của enzyme cố định còn phụ thuộcvào chất mang Cơ chất có kích thước càng nhỏ càng dễ tiếp xúc enzyme cố định.Tuy nhiên enzyme cố định sẽ bị thất thoát sau quá trình tái sử dụng, ở lần sử dụngthứ 10 hoạt tính giảm một nửa

Năm 2007, Mai Ngọc Dũng thủy phân Saccharose bằng Invertase cố địnhtrên hạt Calcium Alginate Tác giả tập trung so sánh một số tính chất của invertasetự do với chế phẩm invertase được cố định theo phương pháp nhốt trong gelalginate So sánh tính chất giữa enzym cố định với enzym tự do như hoạt độ riêng,nhiệt độ và pH tối ưu, khả năng chịu nhiệt theo thời gian, số lần tái sử dụng và khảnăng thủy phân saccharose theo thời gian Tác giả thu nhận được kết quả như sau:nồng độ tối ưu cố định là alginate 3,5% với hoạt độ riêng = 3,62 UI/mg-Pr, hiệusuất hoạt độ riêng cố định = 39,14%, hiệu suất protein–enzym cố định = 64,27%, táisử dụng là 20 lần, khả năng chịu nhiệt khi thủy phân saccharose 7% là 72 giờ liêntục

Năm 2007, Lê Văn Việt Mẫn bước đầu khảo sát quá trình thủy phân liên tụcsaccharose bằng enzyme invertase cố định trong gel alginate Hai yếu tố được khảosát là ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ pha loãng đến quá trình thủy phânsaccharose trong thiết bị phản ứng liên tục Tác giả thu được: Trong những giờ thủyphân đầu tiên, hoạt tính của enzyme ở nhiệt độ 550C cao hơn hoạt tính của enzyme

ở 350C Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme bị giảm nhanh hơn trong những giờ thủyphân tiếp theo Thời gian “bán hủy” của invertase cố định khi vận hành thiết bị ở550C và 350C lần lượt là 4 và 95 ngày Còn khi tăng tốc độ pha loãng của hệ thống,năng suất hoạt động của thiết bị sẽ tăng nhưng hiệu suất thủy phân saccharose giảmđi Với tốc độ pha loãng của hệ thống là 0,12 và 0,17 giờ-1, hiệu suất thủy phânsaccharose sau 7 ngày vận hành lần lượt là 82% và 72%.

Năm 2007, Đặng Thị Thu và cộng sự tuyển chọn và nghiên cứu điều kiện lênmen sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Tác giảtuyển chọn được 3 chủng A oryzae có khả năng sinh tổng hợpβ-galactosidase

Năm 2009, Bùi Thị Hải Hòa và cộng sự khảo sát các điều kiện thích hợp chophản ứng transgalactosyl sử dụng β-galactosidase Aspergillus ozyrae 3 để sản xuất

galactooligosaccharid (GOS) từ lactose Tác giả đã đưa ra được điều kiện thích hợpcho phản ứng transgalactosyl lactose tạo galactooligosaccharid sử dụng β-

galactosidase A oryzae.

Năm 2011, Huỳnh Văn Diên nghiên cứu enzymeβ-galactosidase (lactase) từ

Bacillus licheniformis Tác giả thu được chủng Bacillus licheniformis Cải 1 được

phân lập từ nước cải chua lactase từ chủng này là enzyme nội bào mang hoạt tínhthủy phân ONPG; nhiệt độ và pH thích hợp cho hoạt động của enzyme lactase thô là500C và pH 7,5; thông số động học của lactase bán tinh sạch đối với cơ chất ONPGxác định được là Km 7,53 mM; Vmax 35,7 UmM-1

Từ năm 1964, Arthur P Klotz đã báo cáo công trình nghiên cứu hiện tượngtiêu chảy xảy ra ở người lớn do thiếu hụt enzyme lactase trong đường tiêu hóa

Năm 1979, P J Halling và P Dunnill nghiên cứu “Thủy phân lactose trongsữa bằng enzyme lactase cố định trên vật liệu rắn có từ tính”, thu được kết quả nhưsau: Cố định lactase bằng tiểu phân tử ferrite để thủy phân lactose trong sữa nguyênchất, dễ dàng hồi phục từ tính Lactase từ nấm mốc có hoạt tính thấp ở độ pH củasữa, trong khi lactase từ nấm men bị bất hoạt bởi một thành phần của sữa Chất

mang rắn có từ tính dễ dàng loại bỏ bằng cách khuấy trong dung dịch đệm hoặcdung dịch tẩy rửa.

Năm 1980, Terry Finocchiaro và cộng sự đã nghiên cứu “Sử dụng lactasetrong hệ thống sữa”, tác giả kết luận: Cố định lactase để thủy phân liên tục lactosetrong hệ thống sữa có tiềm năng đáng kể cho việc cải tiến chất lượng sản phẩm sữatrong khẩu phần thức ăn hàng ngày Sản phẩm thủy phân chứa glucose và galactose,giúp cải thiện đặc tính chức năng và dinh dưỡng của sữa Mặc dù lactase có mặt khárộng rãi trong tự nhiên, nhưng chỉ có enzyme lactase chiết xuất từ vi sinh vật có giátrị thương mại Các phương pháp cố định lactase và các yếu tố ảnh hưởng đã đượcxem xét đến Hiện nay, ứng dụng lactase cố định trong sản xuất sữa công nghiệpnghèo lactose xuất hiện và có tiềm năng kinh tế rất lớn

Năm 1982, Susanne Rugh đã nghiên cứu “So sánh các sản phẩm trung giantrong quá trình thủy phân lactose bằng enzyme lactase cố định và tự do” Tác giảkết luận: Cố định lactase chịu nhiệt là nguyên nhân làm giảm sự hình thành các sảnphẩm trung gian Điều này có nghĩa dịch thủy phân lactose bằng lactase chịu nhiệtcố định chứa ít sản phẩm trung gian hơn so với thủy phân bằng lactase tự do

Năm 1989, Robert F H Dekker nghiên cứu cố định lactase trên chất mangtừ tính polyethyleneimine-glutaraldehyde bằng phương pháp liên kết chéo cộng hóatrị 360 µg/g chất mang, điều kiện tối ưu pH = 4,5; nhiệt độ 650C Enzyme cố địnhổn định hơn enzyme tự do, 83% còn lại sau 14 ngày ở 550C

Năm 1990, A Illanes và cộng sự nghiên cứu cố định enzyme lactase thủyphân liên tục dịch whey (huyết thanh) sữa, tối ưu hóa quá trình cố định lactase trênchitin và chitosan

Năm 1993, Meei-Yn Lin và cộng sự nghiên cứu hiệu quả tiêu hóa lactose invitro bằng enzyme lactase (β-galactosidase) ngoại sinh

Năm 2003, I Tilemann và cộng sự nghiên cứu cố định lactase trênWatermelon Nuôi cấy dịch treo tế bào Citrullus vulgaris Schrad cv Samara đượcthấm bằng Tween 80 và cố định bằng glutaraldehyde, pH tối ưu 4,3; nhiệt độ nuôicấy dịch treo 500C, nhiệt độ cố định tối ưu 580C

Năm 2009, O A Olafadehan, D S Aribike và A M Adeyemo, nghiên cứuứng dụng toán học trong mô hình và mô phỏng hóa thủy phân lactose bằng lactasecố định trong ống phản ứng dòng chảy.

Năm 2010, nhóm tác giả Parmjit S Panesar, Shweta Kumari, và ReebaPanesar nghiên cứu “Tiềm năng ứng dụng β-Galactosidase cố định trong côngnghiệp thực phẩm” β-galactosidase có thể tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau nhưvi sinh vật, thực vật và động vật Việc sử dụng β-galactosidase thủy phân lactosetrong sữa là một trong những ứng dụng đầy tiềm năng trong ngành công nghiệp chếbiến sữa nói riêng và công nghiệp chế biến thực phẩm nói chung β-galactosidase cóthể sử dụng một trong hai hình thức hòa tan hoặc cố định, nhưng enzyme cố định cóưu điểm hơn so với enzyme hòa tan là được tái sử dụng nhiều lần và liên tục Cốđịnh là tăng khả năng chịu nhiệt β-galactosidase, hạn chế sự thất thoát enzyme.Nghiên cứu này tổng hợp các kỹ thuật cố định β-galactosidase và tiềm năng ứngdụng trong công nghiệp thực phẩm

Qua các nghiên cứu trong nước và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy thiếulactase trong đường tiêu hóa ở người trưởng thành gây nên triệu chứng không dungnạp lactose sữa đã được nghiên cứu từ lâu (Arthur P Klotz, 1964) Từ đó mở rahướng nghiên cứu thu hút nhiều sự quan tâm trên thế giới và Việt Nam để phục vụcho ngành công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa

Nghiên cứu trong nước tập trung chủ yếu về nghiên cứu phân lập chủng visinh có khả năng tổng hợpβ-galactosidase, bước đầu ứng dụng thử nghiệm sản xuấtGOS

Với hệ chất mang cố định enzyme ngày càng phong phú, hiện nay xu hướngnghiên cứu trên thế giới tập trung chủ yếu nghiên cứu về cố định lactase trên cácloại chất mang khác nhau và ứng dụng của nó (P J Halling và P Dunnill, 1979;Terry Finocchiaro và cộng sự, 1980; Susanne Rugh, 1982; Robert F H Dekker,1989; I Tilemann, 2003; O A Olafadehan, 2009…)

Cùng với xu hướng trên, đề tài của chúng tôi nghiên cứu quá trình cố địnhlactase và bước đầu ứng dụng của chế phẩm lactase cố định này

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu- Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật

Hóa học, Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh

- Thời gian: tháng 2/2012 đến 7/2012

2.2.Vật liệu- Lactase sử dụng trong thí nghiệm được tách chiết từ Bacillus licheniformis

có nguồn gốc từ trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM Bacilluslicheniformis là trực khuẩn Gram (+), có khả năng di động, sống hiếu khí,có mối quan hệ họ hàng gần gũi với Bacillus subtilis B licheniformis tạo

nội bào tử và thường được tìm thấy trong đất [3]

- CMC: Trung Quốc

- Alginate của hãng Kanto – Nhật, dung dịch 1% ở 200C có độ nhớt 350 cP

- Nguyên liệu: sữa tươi có hàm lượng lactose 1,72%

- Dụng cụ, thiết bị và các loại hóa chất khác (xem phụ lục)

Hình 2.1 Carboxylmethyl Cellulose [67]

Hình 2.2 Alginate [66]

2.3.Sơ đồ thí nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm

2.4.Phương pháp thí nghiệm

2.4.1.1 Định lượng protein-enzyme lactase theo phương pháp Lowrya Nguyên tắc

Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan Hàm lượng của nhữngacid amin này tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, những loại protein cùng loại vớinhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau

Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất cómàu Màu này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein) Vìthế, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trongmột phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta cóthể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu [5]

b Dụng cụ, hoá chất Dụng cụ

- Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1g Albumin pha với nước thành100ml dung dịch

- Dung dịch A: Cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml

- Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Natri Citrate 1%thành 100ml

- Dung dịch C: Chỉ pha để dùng trong ngày, gồm hỗn hợp của hai dung dịchA và B theo tỉ lệ 49:1

- Thuốc thử Folin