Tạo chế phẩm lactase cố định trên phức chất mang CMC alginate để thăm dò ứng dụng tạo sản phẩm sữa nghèo lactose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THANH TRUYỀN TẠO CHẾ PHẨM LACTASE CỐ ĐỊNH TRÊN PHỨC CHẤT MANG CMC-ALGINATE ĐỂ THĂM DÒ ỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM SỮA NGHÈO LACTOSE CHUYÊN NGÀNH MÃ NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2012 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG TP HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Đức Lượng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 01 tháng 09 năm 2012 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) PGS TS Bùi Văn Lệ PGS TS Nguyễn Đức Lượng PGS TS Nguyễn Tiến Thắng PGS TS Nguyễn Thúy Hương TS Lê Thị Thủy Tiên Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: MAI THANH TRUYỀN MSHV: 10310620 Ngày, tháng, năm sinh: 1981 Nơi sinh: An Giang Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 604280 Khoá (năm trúng tuyển): 2010 TÊN ĐỀ TÀI: “TẠO CHẾ PHẨM LACTASE CỐ ĐỊNH TRÊN PHỨC CHẤT MANG CMC-ALGINATE ĐỂ THĂM DÒ ỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM SỮA NGHÈO LACTOSE” NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát kỹ thuật tối ưu trình cố định lactase - Khảo sát động học lactase cố định lactase tự - Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose lactase cố định NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) Tp HCM, ngày tháng năm 20 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Em xin bày tỏ lịng tri ân sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thúy Hương Cơ nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức bổ ích ln ln đồng hành em suốt thời gian thực đề tài Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy PGS TS Nguyễn Đức Lượng, thầy cô môn Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM cho em học hữu ích kiến thức chuyên môn suốt thời gian học thực đề tài Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nga, môn Sinh Hóa, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp HCM hỗ trợ enzyme lactase Tôi xin cám ơn tập thể bạn khóa 2010 học tập, trao đổi động viên, trợ giúp trình học thực đề tài Xin cảm ơn gia đình ln sát cánh, đồng hành suốt thời gian qua TÓM TẮT Ngày nay, sữa sản phẩm từ sữa thực phẩm quan trọng đời sống chúng ta, sữa có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như: khoáng (Ca, Mg, Zn…), vitamin (A, B1, B2, BB…) giàu lượng Tuy nhiên, việc tiêu thụ sữa thị trường bị giới hạn tượng khơng dung nạp đường lactose hay gọi đường sữa thiếu enzyme lactase hệ tiêu hóa người Dùng lactase thủy phân lactose thành đường đơn dễ tiêu hóa giải pháp tốt Trong công nghiệp thực phẩm, lactase sử dụng dạng: tự cố định Mỗi loại có ưu nhược điểm riêng Ngày nay, với phát triển công nghệ enzyme, xu hướng sử dụng enzyme cố định phổ biến khắc phục số nhược điểm enzyme tự Cùng với xu hướng đó, đề tài chúng tơi tập trung nghiên cứu cố định lactase chất mang alginate/carboxylmethyl cellulose (A/C) thăm dò tạo sản phẩm sữa nghèo lactose với kết thu được: - Tỷ lệ khối lượng alginate/CMC thích hợp để cố định lactase 1/1 điều kiện thí nghiệm: nồng độ A/C 3% (w/v); dung dịch CaCl 2%, tỷ lệ enzyme/chất mang ½ - Các yếu tố ảnh hưởng: + Khoảng pH hoạt động ổn định lactase cố định từ 6,5 – 8, với pHopt = 7,5 + Nhiệt độ tối ưu Topt = 500C với khoảng nhiệt độ hoạt động ổn định từ 40 – 550C + Các thông số động học lactase cố định: K m=9,23 mM; Vmax=3,69 µM/ph - Hiệu suất thủy phân lactose sữa lần đạt 90,69% giảm 61,1% sau 12 lần tái sử dụng Phần trăm hoạt tính chế phẩm lactase sau 12 lần tái sử dụng lại 71,4% ABSTRACT Milk and dairy products are one of important food cause they contains many kinds of mineral (Ca, Mg, Zn…), energy and vitamine (A, D, B1, B2, BB…) However, the consumption of these products are limited in the market Lactose intolerance symptom which is caused by lacking of lactase in small intestine is considered as the main reason Lactose hydrolysis in milk are the good method to solve this problem Lactase in food industry can be used in two types: free lactase and immobilized lactase Each type of lactase has its advantages and disadvantages Nowaday, immobilized lactase have been interested cause it can improve some disadvantages of free enzyme Following this trend, our thesis researched lactase immobilization on alginate/Carboxylmethyl Cellulose (A/C) to apply in low lactose milk production Through our research we had some results: - The suitable weight rate of A/C which were used as a substrate in lactase immobilization was 1/1 This rate was a result when we did the practice under these conditions: concentration of A/C 3% (w/v); solution CaCl 2%, the rate of lactase/matrix ½ - Some affected factors of this research: + The pH range of immobilized lactse is 6.5 – with optimum pH (pHopt) is 7.5 + The thermal range of immobilized lactse is 40 – 550C with optimum temperature is 500C + The kinetic parameters of immobilized lactase: K m=9.23 mM; Vmax=3.69 µM/ph - At the first trial, lactose hydrolysis yield in milk was 90,69% and reduced to 61.1% after 12 times reuse The activated percentage of immobilized lactase was 71.4% after 12 repeated times LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc MỤC LỤC MỤC LỤC .i MỤC LỤC BẢNG iv MỤC LỤC HÌNH, ĐỒ THỊ v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzyme lactase (β-galactosidase) 1.1.1 Giới thiệu enzyme lactase 1.1.2 Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase 1.2 Enzyme cố định 1.2.1 Định nghĩa enzyme cố định 1.2.2 Lịch sử phát triển enzyme cố định 1.2.3 Các phương pháp cố định enzyme β-galactosidase 1.2.4 Phức chất mang CMC-Alginate 13 1.2.5 Một số loại lactase cố định thương phẩm 17 1.3 Sữa thành phần sữa 18 1.3.1 Đạm whey casein 18 1.3.2 Chất béo 18 1.3.3 Đường lactose 18 1.3.4 Vitamin khoáng chất 20 1.3.5 Sữa nghèo lactose (sữa thủy phân lactose) 20 i 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 1.4.1 Các nghiên cứu nước 21 1.4.2 Các nghiên cứu nước 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu 25 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 26 2.4 Phương pháp thí nghiệm 27 2.4.1 Một số khảo sát tiền đề tài 27 2.4.2 Nghiên cứu trình cố định lactase phức Alginate/CMC 32 2.4.3 Động học lactase: Xác định số K m Vmax enzyme lactase 34 2.4.4 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose chế phẩm lactase cố định khả tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 35 2.5 Xử lí số liệu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Một số khảo sát tiền đề tài 37 3.1.1 Định lượng protein – enzyme lactase theo phương pháp Lowry 37 3.1.2 Xác định hoạt tính, hoạt tính riêng yếu tố ảnh hưởng lactase tự 38 3.2 Nghiên cứu trình cố định lactase phức Alginate/CMC 42 3.2.1 Xác định nồng độ Alginate CMC tạo phức chất mang A/C 42 3.2.2 Nghiên cứu tính chất chế phẩm lactase cố định 45 3.3 Động học lactase: Xác định số K m Vmax enzyme lactase 53 ii 3.4 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose chế phẩm lactase cố định khả tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 55 3.4.1 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose chế phẩm lactase cố định 55 3.4.2 Khả tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 55 CHƯƠNG KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO i PHỤ LỤC Thiết bị, dụng cụ, hóa chất loại dung dịch đệm .ix PHỤ LỤC Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định .xi PHỤ LỤC Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định xii PHỤ LỤC Phương pháp định lượng lactose sữa xiii PHỤ LỤC Kết kiểm nghiệm lactose Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Tp HCM xv iii 28 Dashevsky A (1998) Protein loss by the microencapsulation of an enzyme (lactase) in alginate beads International Journal of Pharmaceutics, 161, 1– 29 Fernanda F Freitas et al (2011) A comparison of the kinetic properties of free and immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase Biochemical Engineering Journal, 58-59, 33 – 38 30 Gekas, V., and Lopez-Leiva, M (1985) Hydrolysis of Lactose: A Literature Review Process Biochem, 20, 2-12 31 G O Phillips and P A Williams (2009) Handbook of hydrocolloids (2nd ed.) Woodhead Publishing Limited, Cambridge CB21 6AH, UK 32 Gulay Bayramoglua et al (2007) Immobilization of β-galactosidase onto magnetic poly (GMA–MMA) beads for hydrolysis of lactose in bed reactor Catalysis Communications, 8, Issue 7, 1094-1101 33 Ha N, T, T, et al (2008) Purification and characterisationof galactosidase (lactase) from Lactobacillus acidophilus Hội nghị khoa học lần thứ 20 – ĐHBK Hà Nội 34 Haider et al (2008) Concanavalin A layered calcium alginate – starch beads immobilized β-galactosidase a therapeutic agent for lactose intolerant patients International journal of pharmaceutics, 359, 1-6 35 I Tilemann, E Tokhtaeva et al (2003) Lactase in Immobilized Cells of Watermelon Chemistry of Natural Compounds, 39, No 4, 394-398 36 J M Guisan (2006) Immobilization of Enzymes as the 21st Century Begins- An Already Solved Problem or Still an Exciting Challenge? In J M Guisan (Eds.), Immobilization of Enzymes and Cells, 2nd ed, vol, 22, (pp 1-13) New Jersey: Humana Press 37 Juan Ignacio Sanz Valero B S (2009) Production of galactooligosaccharides from lactose by immobilized -galactosidase and posterior chromatographic separation The Degree Doctor of Philosophy in the Graduate School of The Ohio State University iv 38 Larry D, Bowers and Peter W, Carr (1980) Immobilized enzymes in analytical chemistry Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 15, 89-129 39 L Cao (2005) Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Applications and Design Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co, KgaA 40 Lin Xu et al (2011) Encapsulation of Pannonibacter phragmitetus LSSE09 in alginate–carboxymethyl cellulose capsules for reduction of hexavalent chromium under alkaline conditions J Ind Microbiol Biotechnol, 38, 1709–1718 41 Meei-Yn Lin, et al (1993) Comparative effects of exogenous lactase (βgalactosidase) preparations onin vivo lactose digestion Digestive Diseases and Sciences, 38, No 11, 2022-2027 42 Medow MS et al (1990) Beta-galactosidase tablets in the treatment of lactose intolerance in pediatrics Am J Dis Child, 144 (11), 1261-4, Department of Pediatrics, Pediatric Gastroenterology, New York Medical College 43 M.L Richmond et al (2010) Beta-Galactosidase: Review of Recent Research Related to Technological Application, Nutritional Concerns, and Immobilization Department of Food Science and Human Nutrition, Michigan State University, East Lansing 48824 44 M M El-Masryl et al (2001) Influence of the immobilization process on the activity of β-galactosidase bound to Nylon membranes grafted with glycidyl methacrylate: Part 1, Isothermal behavior Journal of Molecular Catalysis B: Enzymeatic,16, Issues 3-4, 175-189 45 M Di Serio et al (2003) Lactose hydrolysis by immobilized βgalactosidase: the effect of the supports and the kinetics Catalysis Today, 79-80, 333-339 v 46 O A Olafadehan et al (2009) Mathematical modeling and simulation of steady state plug flow for lactose-lactase hydrolysis in fixed bed, Theoretical Foundations of Chemical Engineering, 43, No 1, 58-69 47 Onladda Juajun et al (2011) Cloning, purification, and characterization of β-galactosidase from Bacillus licheniformis DSM 13 Appl Microbiol Biotechnol, 89, 645–654 48 P J Halling and P Dunnill (1979) Hydrolysis of lactose in milk by lactase immobilized to a non-porous magnetic support Applied Microbiology and Biotechnology, 8, No 1-2, 27-36 49 Parmjit S, Panesar et al (2010) Potential Applications of Immobilized βGalactosidase in Food Processing Industries Enzyme Research AGEHindawi Access to Research, Article ID 473137, 16 50 Quinn Z.K Zhou, Xiao Dong Chen (2001) Effects of temperature and pH on the catalytic activity of the immobilized β-galactosidase from Kluyveromyces lactis Food and Bioproduct Processing Research Cluster, Department of Chemical and Materials Engineering, The University of Auckland, New Zealand 51 Q Husain (2010) β-galactosidase and their potential applications Critical Review Biotechnol, 30, 41-62 52 Reeba Panesar et al (2007) Production of lactose-hydrolyzed milk using ethanol permeabilized yeast cells Food Chemistry, 101, Issue 2, 786-790 53 Robert F H Dekker (1989) Immobilization of a lactase onto a magnetic support by covalent attachment to polyethyleneimine-glutaraldehydeactivated magnetite Applied Biochemistry and Biotechnology, 22, No 3, 289-310 54 Susanne Rugh (1982) A comparison of the formation of intermediary products during lactose hydrolysis with free and immobilized thermophilic lactase Applied Biochemistry and Biotechnology, 7, No 1-2, 27-29 vi 55 Su fang Sun et al (2010) Immobilization of β-galactosidase from Aspergillus Oryzae on Macroporous PloyGMA Newly Prepared International Journal of Chemistry, 2, No 56 Terry Finocchiaro et al (1980) Use of immobilized lactase in milk systems Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 15 57 Toshiba Haider, Qayyum Husain (2008) Concanavalin A layered calcium alginate – starch beads immobilized β - galactosidase as a therapeutic agent for lactose intolerant patients Department of Biochemistry Faculty of Life Sciences, Aligarh Muslim University, India 58 Terry Finocchiaro et al (1980) Use of Immobilized Lactase in Milk Systems Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 15, 71-88 59 Xuemei Lia et al (2007) Pilot-scale lactose hydrolysis using βgalactosidase immobilized on cotton fabric Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 46, Issue 5, 497-500 60 Wijffels et al (1996) Immobilized Cells: Basics and Applications Progress in Biotechnology, 11 61 Xiao Hong Yang, Wei Ling Zhu (2007) Viscosity properties of sodium carboxymethylcellulose solutions Cellulose, 14, 409–417 Tài liệu internet 62 Lactose pathway http://2009.igem.org/Team:UNIPV- Pavia/Project/Solution 63 Sigma quality control procedure http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Enzyme_Assay/g60 08enz.Par.0001.File.tmp/g6008enz.pdf 64 A oryzae http://enfo.agt.bme.hu/drupal/node/9590 65 Bacillus licheniformis http://nsspo.com/p1/UP.htm 66 Alginate http://image.made-in-china.com/2f0j00QewapYPERRgZ/Food- Grade-Sodium-Alginate-Milk-White-Powder-.jpg vii 67 Carboxylmethyl Cellulose http://image.made-in- china.com/2f0j00uCwEmVHPaRrU/Carboxymethyl-Cellulose-LowViscosity-CMC-.jpg 68 Dự án bò sữa Việt Bỉ (2007) Quản lý chất lượng sữa http://www.dairyvietnam.com/vn/TT-Sua-Viet-nam/Quan-ly-chat-luongsua.html 69 Martin Chaplin, Alginate, http://www.lsbu.ac.uk/water/hyalg.html#mol 70 Martin Chaplin, Carboxymethylcellulose (CMC), http://www.lsbu.ac.uk/water/hycmc.html#sou 71 Nam Sun Wang, Enzyme immobilization protocol entrapment in alginate gel, Biochemical Engineering Laboratory, Department of Chemical & Biomolecular Engineering University of Maryland, http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab7b.htm 72 Phương pháp cố định enzyme http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0S073497501100156X-gr2.sml viii PHỤ LỤC Thiết bị, dụng cụ, hóa chất loại dung dịch đệm  - Thiết bị dụng cụ Dụng cụ: Erlen, becher, ống nghiệm, ống đong, micropipette, đầu típ, đũa khuấy, ống tiêm ml… - Thiết bị: Bếp điện, máy vortex, bếp ổn nhiệt, cân điện tử, máy đo quang phổ, máy đo pH, máy ly tâm, tủ sấy, máy khuấy từ gia nhiệt…  Hóa chất STT Hóa chất Xuất xứ Alginate Kanto – Nhật 2-Nitrophenyl-β-D-galacto pyranoside Sigma Carboxylmethyl Cellulose Trung Quốc Albumin Ấn Độ Na2CO3 Trung Quốc NaOH Trung Quốc CuSO4.5H2O Trung Quốc Sodium citrate Trung Quốc Folin Merck 10 CaCl2 Trung Quốc 11 MgCl2 Trung Quốc 12 NaCl Trung Quốc 13 Acid Citric Trung Quốc 14 Sodium citrate Trung Quốc 15 2-Mercaptoethanol Ấn Độ 16 Acid acetic Trung Quốc 17 Amoniac Trung Quốc  - Dung dịch đệm Dung dịch đệm citrate nồng độ 0,1M, pH 6: 9,5 ml (A) + 40,5 ml (B) ix + Dung dịch acid citric 0,1M (A): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan 1000 ml nước cất + Dung dịch sodium citrate 0,1M (B): 29,41 g C6H5O7Na3.H2O hòa tan 1000 ml nước cất - Đệm TRIS - HCl pH Dung dịch TRIS 0,1M Dung dịch HCl 0,1M 6,5 100 112,8 100 93,2 7,5 100 80,6 8,0 100 58,5 x PHỤ LỤC Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định 2.1 Phần trăm hoạt tính chế phẩm lactase cố định so với giá trị cực đại theo pH: pH Hoạt tính lactase tự (%) Hoạt tính lactase cố định alginate (%) Hoạt tính lactase cố định phức A/C (%) 52,94 62,01 67,15 6,5 82,78 91,78 93,97 90,66 93,55 96,91 7,5 100 100 100 85,24 90,68 92,79 2.2 Độ bền pH chế phẩm lactase cố định: 7,5 HT HT HT HT HT HT Thời HT lactase HT lactase HT lactase lactase lactase lactase gian lactase lactase lactase cố cố cố cố định cố định cố định (giờ) tự tự tự định định định alginate alginate alginate (%) A/C (%) A/C (%) A/C (%) (%) (%) (%) (%) (%) 88,23 89,01 92,57 92,57 92,87 96,54 72,14 74,27 82,28 73,48 78,56 85,72 85,67 86,23 93,18 52,04 55,15 67,70 55,61 75,11 79,34 79,31 80,08 89,95 37,55 40,96 55,70 52,18 68,77 73,46 73,41 74,36 86,83 27,08 30,41 45,84 48,51 61,25 68,02 67,94 69,04 83,81 0,16 22,59 37,71 40,28 58,79 62,97 62,89 64,12 80,90 0,00 16,77 31,03 xi PHỤ LỤC Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm lactase cố định 3.1 Phần trăm hoạt tính chế phẩm lactase cố định so với giá trị cực đại theo nhiệt độ: Nhiệt độ (0C) Hoạt tính lactase tự (%) Hoạt tính lactase cố định alginate (%) Hoạt tính lactase cố định phức A/C (%) 40 85,92 87,70 85,82 45 92,94 95,88 94,56 50 100 100 100 55 48,20 79,74 75,17 60 8,10 16,38 23,97 3.2 Khả chịu nhiệt chế phẩm lactase cố định: 450C 550C 500C HT HT HT HT HT HT Thời HT lactase HT lactase HT lactase lactase lactase gian lactase lactase cố cố cố lactase lactase cố định cố định cố định (giờ) tự định tự định tự định alginate alginate alginate A/C A/C A/C (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 99,60 99,39 91,69 92,56 94,75 95,62 72,15 73,31 81,51 98,12 79,23 84,89 85,67 86,23 92,30 52,04 54,42 67,06 90,00 75,76 78,59 79,30 80,08 89,09 37,53 40,42 55,17 77,90 69,35 72,75 73,40 78,32 86,01 27,09 30,03 45,39 72,00 61,78 67,36 67,94 71,68 83,02 0,15 22,28 37,35 63,90 59,30 62,36 62,89 64,13 80,14 0,00 16,56 30,74 xii PHỤ LỤC Phương pháp định lượng lactose sữa* 4.1 Giới thiệu Định lượng lactose (carbohydrate sữa) quan trọng, lactose có liên quan đến thuộc tính cảm quan, chức giá thành sữa Thành phần chất có sữa phức tạp, bao gồm hỗn hợp hạt chất béo, protein (casein, whey), lactose, khoáng chất thành phần phụ khác Ngoài ra, trình chế biến ảnh hưởng đến thành phần sữa Định lượng thành phần sữa nhằm mục đích cho việc chế biến đánh giá chất lượng sữa Lactose có sữa bị dao động từ 3,8 – 5,3% (38.000 - 53.000 µg/mL) Phương pháp 984.15 Hiệp hội nhà hóa phân tích (AOAC) dùng để xác định lactose sữa phức tạp thời gian Phương pháp sử dụng β-galactosidase thủy phân lactose thành glucose galactose pH 6,6 Sau oxy hóa β-galactose tạo thành acid galactonic pH 8,6; xúc tác β-galactose dehydrogenase, khử adenine dinucleotide nicotinamide (NAD +) NAD khử hình thành đo λ=340 nm, giá trị tỷ lệ thuận với nồng độ lactose Phương pháp đòi hỏi phải có loại thuốc thử khác nhau, số phải chuẩn bị hàng tuần Phương pháp đơn giản, nhanh chóng xác để xác định lactose sữa Đó sử dụng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với tách sóng (CAD™) Mẫu sữa pha loãng tỷ lệ 1:100, HPLC định lượng phút Phương pháp HPLC có độ nhạy, đặc hiệu, độ tuyến tính, độ xác độ lặp cao 4.2 Thiết bị, điều kiện Hệ thống HPLC Thermo Scientific Dionex UltiMate™ 3000, với cột Prevail Carbohydrate ES, 4,6 × 250 mm, μm Hệ thống gồm: bơm, bơm mẫu tự động, tách sóng Dionex Corona charged aerosol (P/N 70-9116), máy cấp khí N (P/N 70-6003) * Theo tài liệu “Measuring Lactose in Milk: A Validated Method” Application Update 182 hãng Thermo Scientific Địa internet: http://www.dionex.com/en-us/webdocs/110944-AU182-HPLC-Lactose-Milk29Jul2011-LPN2894.pdf xiii - Pha động: 65% (v/v) dung dịch acetonitrile - Lưu lượng: 1,0 mL/phút - Thể tích bơm: 10 µL - Nhiệt độ cột: 350C - Đầu dò: Dionex Corona detector, 100 pA 4.3 Mẫu chuẩn Lactose (Sigma-Aldrich Chemical Co.) có nồng độ chuẩn: 50, 100, 200, 500 µg/mL acetonitrile 70% Lập đường chuẩn 4.4 Chuẩn bị mẫu Mẫu sữa pha loãng với nước từ 0,5 đến 5,0 mL Sau pha lỗng 0,5 mL dung dịch acetonitrile 70%, trộn mẫu, lọc syringe lọc hay ly tâm lọc 4.5 Kết 4.5.1 Đường chuẩn lactose 4.5.2 Kết sắc ký đồ xiv PHỤ LỤC Kết kiểm nghiệm lactose Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Tp HCM 5.1 Lượng lactose mẫu sữa chưa bổ sung lactase xv 5.2 Lượng lactose mẫu sữa thủy phân lactase tự xvi 5.3 Lượng lactose mẫu sữa thủy phân lactase cố định xvii LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Mai Thanh Truyền Ngày sinh: 1981 Nơi sinh: An Giang Điện thoại liên lạc: 0918923636 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Từ 2010-2012: học viên cao học môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa TP HCM Từ 2001-2005: sinh viên khoa Công nghệ sinh học, Đại học Dân lập Văn Lang, TP HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC Từ tháng 8/2005 – 08/2008, cơng tác công ty TNHH Rồng Tiến, Tp HCM Từ 09/2008 đến nay, cơng tác tài phịng Quản lý chất lượng, Bệnh viện Truyền máu Huyết học, Tp HCM ... ĐỀ TÀI: “TẠO CHẾ PHẨM LACTASE CỐ ĐỊNH TRÊN PHỨC CHẤT MANG CMC- ALGINATE ĐỂ THĂM DÒ ỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM SỮA NGHÈO LACTOSE? ?? NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát kỹ thuật tối ưu trình cố định lactase. .. nghiên cứu ? ?Tạo chế phẩm lactase cố định phức chất mang CMC- Alginate để thăm dò ứng dụng tạo sản phẩm sữa nghèo lactose? ?? Với mục tiêu, thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose Việt Nam a Căn mục tiêu... nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose chế phẩm lactase cố định khả tái sử dụng chế phẩm lactase cố định 2.4.4.1 Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa nghèo lactose Điều kiện thí nghiệm: - Nguyên liệu: sữa