kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật đánh giá chất lượng của mực trước và sau khi bảo quản lạnh

Vì thế mà vấn đề vệ sinh và đảm bảo chất lượng thực phẩm phải được thực hiện một cách nghiêm túc trong quá trình sản xuất.. Chính nhờ hàm lượng lớn các chất này mà xác định được các tính

  

Đề tài:

KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA MỰC TRƯỚC

VÀ SAU KHI BẢO QUẢN LẠNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH

NIÊN KHOÁ : 2000 - 2004

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất, em xin gởi lời cảm ơn đến:

Thầy Nguyễn Văn Hanh - giảng viên hướng dẫn đề tài đã tận tâm truyền

đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báo để em hoàn thành tốt luận văn này

Ban Giám hiệu cùng Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học của trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt khoá học

Ông bà, ba me, chú thiếm,cùng những người thân trong gia đình, những người đã sinh thành giáo dưỡng, người đã tạo cho con tất cả sự quan tâm, tình yêu thương, luôn động viên, an ủi và chia sẽ cùng con những lúc khó khăn cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con học tập để đạt được như ngày hôm nay

Ban lãnh đạo, các anh chị trong Công ty THHHTM Toàn Sáng đã tận tình

hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em được thực tập trong suốt quá trình làm luận văn

Tất cả các bạn lớp SH00A1 khoa CNSH đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Thành Phố Hồ Chí Minh tháng 10 năm 2004

Phạm Thị Mai Trâm

GVHD : PGS-TS NGUYỄN VĂN HANH

SVTH : Phạm Thị Mai Trâm MSSV : 30000710

Đề tài : “Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật đánh giá chất lượng của mực trước và sau khi bảo quản lạnh”

Đặt vấn đề

Công nghệ là một ngành đang phát triển và được áp dụng rộng rãi nhiều nơi trên thế giới Hiện nay, ở nước ta việc áp dụng công nghệ sinh học đã tạo được bước đột phá trong các lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, chế biến thực phẩm… Việc áp dụng công nghệ sinh học vào chế biến thực phẩm đang được nhiều nước cũng như các bộ ngành quan tâm, đặc biệt là chế biến thủy sản xuất khẩu, bởi vì xuất khẩu thủy sản chiếm một vị trí khá cao trong kim ngạch xuất khẩu nước ta hiện nay Vì thế mà vấn đề vệ sinh và đảm bảo chất lượng thực phẩm phải được thực hiện một cách nghiêm túc trong quá trình sản xuất

Hiện nay tình hình kinh tế nước ta trên đà phát triển, vấn đề xuất khẩu các sản phẩm đông lạnh cũng chiếm ưu thế cao Do đó, để đảm bảo uy tín trên thị trường chúng ta cần phải quan tâm đến việc kiểm tra chất lượng sản phẩm

Xuất phát từ tầm quan trọng trên và để nâng cao tầm hiểu biết của việc kiểm tra chất lượng sản phẩm thủy sản Được sự đồng ý của khoa công nghệ sinh học trường, được sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Văn Hanh, cùng với sự giúp đỡ của các anh chị phòng phân tích kiểm nghiệm Công ty TNHH TM Toàn Sáng, em xin thực hiện đề tài

“Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật đánh giá chất lượng của mực trước và sau khi bảo quản lạnh”

Vì thời gian và kiến thức còn hạn hẹp nên đề tài còn nhiều hạn chế Bước đầu nghiên cứu khoa học còn nhiều bỡ ngỡ, với kinh nghiệm thực tế còn ít Do đó đề tài còn nhiều thiếu sót Mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô, anh chị và các bạn

Đối tượng vi sinh vật kiểm tra gồm:

- Tổng vi khuẩn hiếu khí - Coliform

- E.Coli - Salmonella

- Staphylococcus aureus - Vibrio cholerea

- Vibrio parahemotylicus

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ

PHẦN MỘT: TỔNG QUAN 1

1: Tình hình phát triển của ngành thuỷ sản 2

2: Giá trị dinh dưỡng và tính chất sử dụng của mực 3

2.1: Giá trị dinh dưỡng 3

2.2: Tính chất sử dụng 3

3: Các phương pháp bảo quản lạnh 3

3.1: Phương pháp ướp đá 4

3.2: Phương pháp lạnh đông 4

4: Các chất khử trùng làm sạch thuỷ sản 5

4.1: Chlorin 5

4.2: Muối NaCl 6

4.3: Oxy già 6

5: Yêu cầu cơ bản trong phòng kiểm nghiện vi sinh vật 6

5.1: Các yêu cầu về phòng kiểm nghiệm 6

5.2: Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm 7

6: Đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, tính chất gây độc và triệu chứng của một số vi sinh vật nhiễm vào mực có thể gây bệnh cho người 7

7: Quy trình sản xuất mực ống và mực nang fillet 18

7.1: Quy trình sản xuất mực ống 18

7.2: Quy trình sản xuất mực nang fillet 19

PHẦN HAI: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM 20

1: Vật liệu thí nghiệm 21

1.1: Dụng cụ kiểm nghiệm 21

1.2: Hóa chất và môi trường dùng để định danh và định tính vi sinh vật 21

2.: Phương pháp kiểm nghiệm 23

2.1: Phương pháp lấy mẫu và cảm quan 23

2.2: Phương pháp bảo quản mẫu và xử lý mẫu cho phân tích vi sinh 24

2.3: Phương pháp định lượng vi sinh vật 25

2.4: Phương pháp kiễm tra vi sinh vật trước và sau khi bảo quản lạnh lạnh 26

3: Các phương pháp thử nghiệm sinh hóa: 39

3.1: Thử nghiệm khả năng lên men 39

3.2:Thử nghiệm khả năng sinh indol 39

3.3: Thử nghiệm LIA,TSI 40

3.4: Thử nghiệm Methyl Red (MR) 41

3.5: Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) 41

3.6: Thử nghiệm Citrate 42

3.7: Thử nghiệm khả năng sinh H2S 43

PHẦN BA: KẾT QUẢ 44

1: Đánh giá cảm quan của mực nguyên liêu và thành phẩm 45

1.1: Kết quả 45

1.2: Thảo luận 46

2: Kết quả kiểm tra vi sinh vật trong mẫu 46

2.1:Kết quả kiểm tra 46

2.2: Thảo luận 49

3: Kết luận và đề nghị 53

3.1: Kết luận 53

3.2: Đề nghị 54

4: Thuận lợi, hạn chế và thiếu sót 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

PHẦN MỘT

TỔNG QUAN

1 TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN CỦA NGÀNH THUỶ SẢN

Ngành thuỷ sản của của nước ta nói chung và của các nước khác trên thế giới nói riêng một phần được đánh bắt xa bờ ở các vùng biển, một phần được nuôi trồng Sản lượng toàn cầu theo FAO đã biên soạn số liệâu thống kê chi tiết về số lượng nuôi trồng thuỷ sản giai đoạn từ năm 1984-1995 và thống kê tạm thời giai đoạn 1996-1999 Số liệu hiện nay cho thấy sản lượng nuôi trồng cá và các loài thuỷ sản khác tăng gấp 3 lần từ 6,94 triệu tấn năm 1990 lên 22,8 triệu tấn năm 1999, tương đương với mức tăng trung bình 1,24 triệu tấn/ năm

Từ năm 2000 đến nay tình hình phát triển của nghành thuỷ sản nước ta đã liên tục tăng mạnh, tốc độ tăng trưởng bình quân đạt 18,7% / năm (TLTK - tuổi trẻ trang 11 ngày 13/09/04)

Theo thống kê của bộ thuỷ sản thì sản lượng thuỷ sản 9 tháng đầu năm 2004 đạt kim ngạch xuất khẩu 1,66 tỉ USD tăng 2,2% so với cùng kỳ năm ngoái Thuỷ sản sản của nước ta xuất khẩu sang các thị trường như: Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và các nước ASEAM tăng mạnh ước khỏang 34.650 tấn, tăng 25,2% so cới cùng kỳ Ngoài tôm, Nhật Bản là thị trường tiêu thụ mực và bạch tuộc lớn nhất Việt Nam, chiếm khoảng 40% tổng giá trị xuất khẩu (TLTK: www.vietlinh.com.vn)

Hiện nay nước ta có 6.236 tàu khai thác thủy sản xa bờ có công suất từ 90 mã lực trở lên, do đó số lượng khai thác thủy sản tăng mạnh, đạt khoảng 612.280 tấn bằng 42,23% so với kế hoạch năm và tăng gần 2% so với cùng kỳ (TLTK:

Phan Thảo - báo SGGP ngày 24/05/2004)

2 GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG VÀ TÍNH CHẤT SỬ DỤNG CỦA MỰC

Các loài mực thuộc lớp động vật chân đầu ( Cephlopoda ) ngành động vật thân mềm ( Mollusca ) là những loài hải sản cung cấp nguồn Protein cho nhu cầu

của con người, có giá trị dinh dưỡng và tính chất sử dụng rất cao

2.1 Giá trị dinh dưỡng:

Trong thịt đa số các loài mực chứa 16-20% các chất chứa nitơ, 76-79% nước và 1-2% mỡ Các chất chứa nitơ gồm 70% protid, 30-35% các chất phi protid ( trang 14 tin chọc lọc bảo quản chế biến thuỷ sản ) Chính nhờ hàm lượng lớn các chất này mà xác định được các tính chất đặc trưng của thịt mực ( mùi, vị ) và tính chất hư hỏng của vi sinh vật khi bảo quản lạnh Các chất phi protid của thịt mực chủ yếu là các acid amin tự do, các nucleotit, trymetilaminoaxit, betain Mực có giá trị dinh dưỡng cao, trong mỡ chứa 30% acid béo Easentialas như: acid oleic (8:1), acid linoleic (18:2), acid linolenoic (18:3), acid arachidonic (20:4), acid dixozapentainoleic (20:5) và acid dokozahekxanoleic (22:6)

2.2 Tính chất sử dụng:

Mực có tính chất sử dụng gần như toàn bộ các cơ quan, chỉ loại một phần nhỏ không ăn được như ruột, nang mực, mắt và răng Thân mực gồm đầu kể cả râu và xoang áo kể cả vây Các tế bào sắc tố gây nên màu sắc của mực nằm giữa các lớp da ngoài Kích thước của các loài mực giao động từ 20-50 cm, phần ăn được chiếm 80%

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠNH

Thực phẩm bị hư hỏng gây nên hiện tượng ngộ độc chủ yếu là do vi sinh vật với sự hỗ trợ của các yếu tố khác như: enzyme, nhiệt độ, ẩm độ… cho nên để khống chế sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm là nguyên lý cơ bản của phương pháp bảo quản thực phẩm

Các loài sản phẩm thuỷ sản nói chung người ta thường dùng phương pháp bảo quản lạnh và phương pháp bảo quản lạnh đông để đảm bảo việc phân phối, tiêu thụ và xuất khẩu trong thời gian dài

3.1 Phương pháp ướp đá:

Dùng nước đá ướp lạnh sản phẩm thuỷ sản là phương pháp phổ biến, nước dùng sản xuất nước đá, bảo quản sản phẩm thuỷ sản phải đảm bảo vệ sinh

Muốn nhiệt độ bảo quản bằng đá thấp hơn nữa thì ta có thể bổ sung một số hoá chất vào nước như: NaCl, Nh4Cl, NaNo3

3.2 Phương pháp lạnh đông:

Làm lạnh đông thuỷ sản là làm hạ thấp nhiệt độ của thuỷ sản, làm chậm sự hư hỏng của thuỷ sản trong quá trình bảo quản, thông thường nhiệt độ bảo quản -180C trở xuống Phương pháp này đóng vai trò quan trọng vì nó quyết định một phần chất lượng của sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu

Trong sản phẩm thuỷ sản nước chiếm đa phần khoảng 80%, do đó nhiệt độ bảo quản tốt nhất là -150C, -200C với ẩm độ là 80-85% Trong điều kiện này

sản phẩm có thể bảo quản 5÷10 tháng ( TLTK - Tô Minh Châu - giáo trình kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm - trang 85 )

4 CÁC CHẤT KHỬ TRÙNG LÀM SẠCH THUỶ SẢN:

Trong sản xuất các sản phẩm thuỷ sản, vấn đề vệ sinh được đăït lên hàng đầu Do đó, để hạn chế sự nhiễm vi sinh vật cần phải sử dụng các hoá chất sát trùng làm sạch trong thuỷ sản:

Nồng độ chlorine được kiểm tra bằng giấy kiểm tra chlorine ( chloritest papers), giấy được nhúng vào nước chlorine màu sắc hiện diện trên giấy cho biết nồng độ chlorine tương ứng

Trong chế biến thuỷ sản đông lạnh chlorine thường dùng ở dạng muối calcium của acid hydrochloreux có công thức Ca(OCl)2, thuốc trắng mịn, không bị ố vàng hay đóng cục, dễ hoà tan trong nước và không làm thay đổi màu sắc dung dịch, đơn vị sử dụng là ppm

Theo quy trình sản xuất của nhà máy thì chlorine được sử dụng theo nhiều nồng độ khác nhau:

- Nguồn nước dùng trong chế biến: 0,5÷1 ppm - Nước rửa sản phẩm: 20 ppm

- Nước rửa rổ, dụng cụ chế biến, sàn xi măng …: 50÷100 ppm

4.2 Muối NaCl

4.3 Oxy già

5 YÊU CẦU CƠ BẢN TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

5.1 Các yêu cầu về phòng kiểm nghiệm:

Phòng kiểm nghiệm vi sinh vật phải có diện tích làm việc và cách bố trí phù hợp Khoảng cách làm việc phải hợp lý nhằm làm giảm nguy cơ nhiễm trong quá trình phân tích kiểm nghiệm Thông thường phòng kiểm nghiệm cần được phân thành các khu riêng biệt như:

- Thu mẫu và lưu mẫu

- Rửa dụng cụ thuỷ tinh, khử trùng dụng cụ, tủ ấm ủ mẫu - Bảo quản hoá chất

- Chuẩn bị môi trường

- Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu

- Khu vực thao tác các vi sinh vật gây bệnh

Ngoài ra phòng được chiếu sáng đầy đủ, khu nuôi cấy nên được lấp đặt đèn tử ngoại để đảm bảo tiệt trùng không khí và không gian thao tác Khu vực này nên được trang bị máy điều hoà không khí vì nó đem lại các lợi ích sau:

Không khí đi vào luôn được lọc để làm giảm ngoại nhiễm từ môi trường bên ngoài

Cửa đóng làm giảm tối thiểu sự di chuyển của không khí, ngăn ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễãm

Điều hoà không khí giúp chủ động kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ theo hướng có lợi cho quá trình làm việc

5.2 Các qui tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh:

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 TB/ml) Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh cho nên phải luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác Mặt khác khi làm kiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hoá chất, trong đó có các acid hoặc những hoá chất có tính độc Do vậy, cần tuân thủ một số nguyên tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm

- Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật - Mặt áo blouse trong thời gian làm việc

Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 650 Thực hiện tương tự cho hai tay

( TLTK: Trần Linh Thước - phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước thực phẩm và mỹ phẩm - NXBGD 2002 - trang 30,31,32)

6 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, TÍNH CHẤT NUÔI CẤY, TÍNH CHẤT GÂY ĐỘC VÀ TRIỆU CHỨNG CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHIỄM VÀO MỰC CÓ THỂ GÂY BỆNH CHO NGƯỜI:

Ngày nay kinh tế ngày càng phát triển, đời sống con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu về nguồn năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của con người được tăng lên Do đó, vấn đề đảm bảo an toàn thực phẩm cần được kiểm tra chặt chẽ Nếu sản phẩm không được bảo quản ở nhiệt độ thích hợp có thể sẽ xảy ra nhiều sự phân huỷ khác nhau dẫn đến ngộ độc thực phẩm

Sự ngộ độc xảy ra do nhiễm vi sinh vật và độc tố của chúng Ở mực ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật phân huỷ đạm sản sinh nội độc tố và ngoại độc tố

điển hình ở một số vi sinh vật sau: vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E.coli

Salmonella, Staphylococcus, Vibrio…

6.1 Vi sinh vật hiếu khí:

Là những vi sinh vật tồn tại trong điều kiện có oxy tự do

Chỉ tiêu về tổng số vi sinh vật hiếu khí cho biết sơ bộ mức độ nhiễm khuẩn chung của mẫu Muốn đánh giá và kết luận thực phẩm có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không cần phải dựa vào một số chỉ tiêu vi sinh chỉ danh và vi sinh gây bệnh

6.2 Coliform:

Thuộc họ Enterobacteriaceae ( tộc Escherichia ) có khả năng lên men sinh hơi đường lactose Đây là vi khuẩn nằm trong nhóm có dạng E.coli

6.2.1 Hình dạng:

Trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ nghi, không hình thành nha bào

6.2.2 Đặc điểm nuôi cấy và tính chất sinh hoá:

Lên men sinh hơi đường lactose trong vòng 24÷48 giờ ở 370C

Nhóm Coliforms ngoài nguồn gốc từ phân người, phân động vật còn có trong đất,

nước, không khí…

6.3 Ecoli:

Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae chúng

có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Chúng được nhiễm từ đất, nước… từ phân của động vật, chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi

6.3.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hoá:

6.3.1.1 Hình dạng:

E.coli thuộc loài cầu trực gam âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực thì không có capsul, một số có lông bám pi li Kích thước trung bình 0,5µ ÷3µ hai đầu tròn

6.3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy và sinh hoá:

Hiếu khí hay hiếu khí tuỳ nghi, nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C

Trên môi trường NA: khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục, kích thước 2 ÷3 mm

Trên môi trường EMB ( Eozin Methyl blue ): khuẩn lạc tím ánh kim Trên môi trường Maconkey: tạo khóm hồng đỏ

Trên môi trường KIA: vàng/vàng

Lên men sinh hơi lactose, glucose, lên men không điều sacharose

Phản ứng sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-), H2S (-), khử Nitrat thành Nitric

6.3.2 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố:

E.coli có 4 loại kháng nguyên: O, H, K, F

Độc tố của E.coli: loại có giáp mô (kháng nguyên K) gây độc mạnh hơn

không có giáp mô Kháng nguyên K có 3 loại: KA, KB, KL Độc tố gồm 2 loại: nội độc tố và ngoại độc tố

Nội độc tố gây tiêu chảy

Ngoại độc tố gây phù thũng, tan huyết có 2 loại: loại chịu nhiệt ST và loại không chịu nhiệt LT

6.3.3 Tính chất gây bệnh:

E.coli gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi gồm các nhóm sau:

Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coi ): gồm các type thường gặp

O26.B6 O124.B17 O55.B5 O125.B15 O112.B11O86.B7 O126.B16 O111.B4 O127.B8 O128.B12Gây tiêu chảy cho trẻ em dưới 2 tuổi

Nhóm ETEC ( Enterinvasine E.coli ) : Gây tiêu chảy có đàm lẫn máu,

thường gặp các type O125, O157, O144…

Nhóm VETEC ( Verocytoxin producy E.coli ): Gây bệnh tiêu chảy, viêm

đại tràng, xưng phù, thường gặp các type: O26, O111, O113, O145, O57

6.3.4 Triệu chứng trúng độc:

Thời kỳ ủ bệnh 2÷20 giờ Người trúng độc thấy đau bụng dữ dội, phân lỏng nhiều lẫn trong máu, ít khi nôn mửa, hơi sốt Nặng có thể sốt cao, người mỏi mệt, chân tay co quắp, đổ mồ hôi Thời gian khỏi bệnh vài ngày

6.3.5 Biện pháp phòng ngừa:

Cần phải nấu chín kỹ thức ăn, nước uống

(TLTK – Tô Minh Châu – Giáo trình kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm – trang 55, 56)

6.4 Salmonella:

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện ở mức cả triệu tế

bào trong một gam thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là

tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12÷36 giờ Triệu chứng ngộ độc kéo dài từ 2÷7 ngày Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm

Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng,

thuỷ sản Nguồn lây nhiễm các loại thực phẩm này là phân người và động vật,

được nhiễm gián tiếp hoặc trực tiếp Đặc biệt gây nhiễm cho người là các loài

Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C, gây sốt thương hàn

6.4.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hoá của Salmonella:

Thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriacae, chúng có nhiều trong

tự nhiên và là loài vi khuẩn gây bệnh thương hàn, phó thương hàn cho nhiều loài động vật kể cả người

6.4.1.1 Hình dạng:

Hình trực, gam âm, kích thước 0,4÷0,6 x 1÷3µ, không tạo giáp mô, không tạo bào tử, di động nhờ lông ( flagella ) quanh tế bào

6.4.1.2 Đặc điểm nuôi cấy:

Là loại hiếu khí và hiếu khí tuỳ nghi, nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7,2÷7,6 dễ mọc trên các môi trường dinh dưỡng bình thường

Môi trường NA: khóm trắng tròn

Trên môi trường chuẩn đoán chuyên biệt : BSA: xanh đen hay nâu đen, BGA: khóm trắng, môi trường chuyển vàng sang đỏ

Trên KIA/TSI: đỏ/ vàng sau 16÷24 giờ

6.4.1.3 Các phản ứng sinh hoá:

Indol (-) , Methyred (+), VP (-) , Citrat (+), H2S (+), Ure (-), Lysindecacboxylase(+) chuyển nitrat -> nitrit, lên men sinh hơi glucose, manitol, sorbitol

Lên men không đều sacharose, không lên men lactose

6.4.2 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố:

Có 3 loại kháng nguyên:

Kháng nguyên O: chia 34 nhóm A, B, C1, C2, D1, E mỗi nhóm có nhiều thành phần

Kháng nguyên H: gồm hai pha đặc hiệu và không đặc hiệu Pha đặc hiệu: kí hiệu Ha, Hb (a, b, c, g…m)

Pha không đặc hiệu: ký hiệu H1 ,H2 ,H5…

Kháng nguyên vi: nằm ngoài kháng nguyên O Độc tố có hai loại:

Nội độc tố ruột có hai loại ST và LT Ngoại độc tố tác động lên thần kinh

6.4.3 Tính chất gây bệnh:

Gây bệnh thương hàn và phó thương hàn với triệu chứng sốt cao tiêu chảy lẫn máu Bệnh tích biểu hiện viêm loét ruột, lách sưng

Salmonella có trong cơ thể người và gia súc với tỉ lệ 5%÷10% số người

mang nang trùng

Trường hợp trúng độc Salmonella là do ăn phải thức ăn bị nhiễm số lượng lớn Salmonella

Vi khuẩn khi nhiễm vào ruột theo đường tiêu hoá sẽ phát triển ở ruột rồi theo hệ thống bạch huyết đi vào máu gây nhiễm khuẩn huyết

6.4.4 Triệu chứng trúng độc:

Thời kỳ ủ bệnh 12÷24 h nhưng dài hay ngắn còn tuỳ thuộc vào sức chống đở của cơ thể

Nhiệt độ có thể tăng 38÷400C biểu hiện triệu chứng nhức đầu, chán ăn, đau bụng, tiêu chảy

Tỷ lệ tử vong thấp nhưng nếu sức đề kháng của cơ thể yếu, không chữa trị kịp thời có thể chết

6.4.5 Phòng ngừa và điều trị:

Cách ly người bệnh, thức ăn phải được nấu chín kỹ

Điều trị bằng chất kháng sinh và sulfamid như bactrium chloramphênicol, furazolidon

(TLTK - Tô Minh Châu - Giáo trình kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm - trang 57, 58)

6.5 Staphylococus aureus:

Là loại vi khuẩn phân bố rộng rãi trong đất, nước trên da, họng…và chỉ gây

bệnh trúng độc khi gặp chủng hình thành độc tố ruột (enterotoxin) bền với nhiệt

6.5.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hoá: 6.5.1.1 Hình dạng:

Hình cầu, tụ thành đám như chùm nho, bắt màu gram dương, kích thước 0,8÷1µm, không di động, không bào tử, có hay không có capsul

Loại hiếu khí tuỳ nghi, thích hợp ở 30÷370C, pH =7.0÷7.5, dể mọc trên môi trường dinh dưỡng NA hay TSA tạo khóm màu vàng đậm

6.5.1.2 Nuôi cấy:

Trên môi trường thạch máu gây dung huyết

Trên môi trường Chapmam tạo khóm vàng và chuyển môi trường từ hồng sang vàng

Trên môi trường gelatin gây tan chảy Trên môi trường coagulase tạo khóm vàng Trên canh dinh dưỡng NB đục điều có mùi mủ

6.5.1.3 Sinh hoá:

Lên men glucose, mannit, lactose, không lên men glycerin

Indol (-) methyred (+) VP (+) H2S(-) NO3(+)coagulaza (+) Catalaza (+) photphataza (+)

6.5.2 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố:

Tế bào Staphylococcus aureus là hỗn hợp của hơn 30 loại kháng nguyên

Kháng nguyên thân O ở thành tế bào gồm nhiều thành phần kháng nguyên như peptydoglucan, protein A, acid teichoic và một số enzyme gây độc

Kháng nguyên độc tố: gồm nội độc tố và ngoại độc tố Độc tố ruột có 6 loại: A, B, C, D, E, F

Các enzyme ngoại bào: catalaza, coagulaza gây đông huyết tương,

Staphylococcus aureus làm tan sợi huyết, hemolynaza phá huỷ hồng cầu

6.5.3 Tính chất gây bệnh:

Gây viêm mũi nhiễm trùng da, ung nhọt, viêm khớp, apxe Vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm trùng máu và đi đến các cơ quan gây viêm tuỷ sương, viêm não, viêm tim, có thể gây tử vong

6.5.4 Triệu chứng trúng độc:

Độc tố chủ yếu tác động lên đường tiêu hoá gây đau bụng, buồn nôn, nôn mửa dữ dội, gây tiêu chảy Độc tố thấm vào máu gây nhức đầu, tiêu chảy, co giật cơ và hạ huyết áp Thời gian ủ bệnh ngắn (2÷3), bệnh kéo dài 1÷2 ngày, tỷ lệ tử vong thấp

Độc tố trúng tuỳ lứa tuổi, tuổi càng ít tính nhạy cảm càng mạnh, trẻ em dễ bị ngộ độc

6.5.5 Biện pháp phòng ngừa:

Bằng cách khống chế sự phát triển của vi sinh khuẩn và sự tạo độc tố ruột bằng cách trữ lạnh các sản phẩm chín hoặc giữ nóng các thực phẩm ăn nóng

(TLTK - Tô Minh Châu - Giáo trình kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm - trang 63 - 64 )

6.6 Vibrio cholerae:

Là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩm sữa, các loài thuỷ sản tươi sống

6.6.1 Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hoá:

6.6.1.1 Hình dạng:

Trực khuẩn cong, gam âm, có một tiêm mao ở đầu, không tạo bào tử, không tạo giáp mô

6.6.1.2 Đặc điểm nuôi cấy:

Là loại hiếu khí tuỳ nghi, nhiệt độ tối ưu 370C, nhưng có thể mọc ở 16÷420C, pH=8,5÷9,5 Là loại vi khuẩn ưa kiềm do đó mọc tốt trong môi trường pepton kiềm

Trên thạch NA có pH kiềm vi khuẩn tạo khóm tròn lồi hơi đục và rất nhỏ Trên thạch TCBS ( thyosulphat, citrat, bile salt ) vi khuẩn tạo khóm vàng do lên men saccarpse

6.6.1.3 Đặc điểm sinh hoá:

Lên men không sinh hơi saccarose, manit và glucose, không lên men lactose H2S ( - ) KIA: đỏ/ vàng không tạo H2S TSI: vàng/ vàng

Indol: ( + ) , MR: ( + ) , Citrat: ( + ) , VP: ( + ) , NO3 chuyển thành NO2

6.6.2 Kháng nguyên và độc tố:

Có hai loại kháng nguyên O và H: trong đó kháng nguyên O bền với nhiệt, kháng nguyên H không bền với nhiệt Nhóm O1 gây dịch tả

Độc tố: Độc tố ruột enterotoxin gây tiêu chảy Enterotoxin của Vibrio

cholerae có liên hệ kháng nguyên với enterotoxin LT của Ecoli gây độc ETEC (

Thời gian ủ bệnh 1÷4 ngày, bệnh phát ra với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy dữ dội, co thắt cơ bụng Bệnh nặng có thể tử vong do mất nhiều nước, 20 l nước/ ngày

Vibrio parahemotylicus tạo độc tố hemolysin bền với nhiệt, có phản ứng

kháng nguyên konagama

Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ xuất hiện 2÷96 giờ Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng muối cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thuỷ sản, trong các vùng nước ấm ven bờ biển

Về cơ bản Vibrio cholera và Vibrio parahemotylicus giống nhau, nhưng do cấu tạo kháng nguyên mà người ta chia Vibrio ra thành nhiều nhóm

Để phân biệt các chủng Vibrio ta dựa vào đặc tính sinh hoá của nó

7 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỰC ỐNG VÀ MỰC NANG

7.1 Quy trình sản xuất mực ống:

Bảo quản thành phẩm Bảo quản nguyên liệu Tiếp nhận nguyên liệu

Bao gói thành phẩm Sơ chế 1

7.2 Quy trình sản xuất mực nang fillet:

Bảo quản nguyên liệu Tiếp nhận nguyên liệu

Bảo quản thành phẩm Bao gói thành phẩm

Sơ chế 1

PHẦN HAI

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

1 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM:

1.1.Dụng cụ kiểm nghiệm:

1.1.1 Dụng cụ xử lý mẫu

- Kéo Inox, kẹp Inox, máy dập mẫu, cân điện tử, đèn cồn, khay Inox, khay nhựa, bao PE, phòng xử lý mẫu

Tất cả các dụng cụ trên đều phải vô trùng

1.1.2 Dụng cụ pha chế môi trường:

- Nồi hấp thanh trùng autoclave, ống đong có chia độ, ống nghiệm, ống Dulham, cốc thuỷ tinh, chai thuỷ tinh 250 ml, 500 ml, 1000 ml, muỗng Inox, pipet

1.1.3 Dụng cụ nuôi vi khuẩn và bảo quản mẫu:

- Tủ lạnh dùng bảo quản mẫu và môi trường, tủ ấm để nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 370 C, ống nghiệm, giá để, đĩa petri

1.1.4 Dụng cụ cấy vi khuẩn:

- Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy có đầu uốn tròn, phòng cấy

1.2.Hoá chất và môi trường dùng để định danh và định tính vi sinh vật:

1.2.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí:

- Môi trường PCA ( Plate Count Agar)

- Dung dịch pha loãng: Buffered Peptone Wate ( BPW)

1.2.2 Vi khuẩn Coliform – E-coli:

- Canh Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL) - Canh EC ( Ecoli Medium)

- Canh Tryptone - Thuốc thử Kovacs

- Esin Methylene Blue Lactose Sucrose Agar (EMB Agar )

- IMVC: ( Indol, Methyl Red, Voges Peoskauer, Citrat )

1.2.3 Vi khuẩn Salmonella:

- Thạch Xylose Lysine Deoxycholate ( XLD ) - Canh Tetrathionate Broth

- Bismuth Sulfite Agar ( BSA )

- Thạch Triple Sugar Iron Agar ( TSI Agar ) - Lysin Iron Agar ( LIA )

- IMVC:( Indol, Methyl Red, Voges Peoskauer, Citrat )

1.2.4 Vi khuẩn Staphylococcus aureus:

- Buffer Pepton Water ( BPW )

- Tryppic Soy Broth ( TSB) + 10% NaCl - Manitol Salt Egg Yoll ( MSEY )

- Brain Heart Infusion Broth (BHI ) + Rabbit Plasma

1.2.5 Vibrio cholerae:

- Canh Alkaline Pepton Water 1% NaCl - Thiosulphat Citrat Bile Sucrose ( TCBS ) - Thạch LIA , TSI

- Thạch Kháng huyết thanh Vibrio cholerae polyvalent 01 - Canh Trypton 0% NaCl (T1N0)

- Canh Trypton 3% NaCl (T1N3)

1.2.6 Vibrio parahaemolyticus:

- Canh Alkaline Pepton Water 3% NaCl

- Thạch Thiosulphat Citrat Bile Sucrose (TCBS) 3% NaCl - Thạch LIA, TSI

- Canh Trypton 0% NaCl (N1T0) - Canh Trypton 3% NaCl (N1T3)

- Canh Trypton 6% NaCl (N1T6) - Canh Trypton 8% NaCl (N1T8)

2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM:

Trong tất cả các mặt hàng thuỷ sản nói chung và mực nói riêng, vấn đề chất lượng an toàn thực phẩm là chỉ tiêu quan trọng được đặt lên hàng đầu, vì nó liên quan đến sức khoẻ người tiêu dùng, đến việc xuất khẩu… chính vì những yêu cầu nghiêm ngặt này mà đòi hỏi các nhà sản xuất phải đề ra phương án kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật đánh giá chất lượng của sản phẩm thuỷ sản nói chung và mực nói riêng bao gồm:

Tổng vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn Coliform- Ecoli Vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Staphilococcus Vi khuẩn Vibrio cholerae

Vi khuẩn Vibrio parahaemotylicus

Mẫu kiểm nghiệm trong phương pháp này bao gồm:

Mực tươi ướp đá (mực ống và mực nang fillet nguyên liệu), mực đông lạnh (mực ống và fillet đông block) do công ty cung cấp

2 1 Phương pháp lấy mẫu và cảm quan:

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu:

Trước khi lấy mẫu cần ghi mã số mẫu lên bao PE gồm số lô, ngày tháng lấy mẫu

B1: Mang găng tay

B2: Khử trùng tay và dụng cụ lấy mẫu bằng cồn 650

B3: Lấy mẫu ở nhiều vị trí khác nhau cho vào bao PE buột miệng lại

B4: Khi thực hiện xong rửa tay bằng nước sạch sau đó rửa lại bằng cồn 650là kết thúc quá trình lấy mẫu

2.1.2 Phương pháp đánh giá cảm quan thuỷ sản:

Việc đánh giá cảm quan mực được thực hiện dựa vào tài liệu hướng dẫn của công ty về hình dạng, màu sắc, mùi, vị…

2.1.2.1 Hình dạng bên ngoài và trạng thái:

Có vết xước và trầy da nhẹ, không bị thủng rách Đầu dính chặt vào thân, mắt sáng, râu nguyên vẹn, thịt chắc đàn hồi hoặc cho phép có một vết thủng diện tích không quá 1 cm2

2.1.2.2 Màu sắc:

Màu tự nhiên đặc trưng của loài: sáng bóng, sau khi bảo quản ướp đá thịt có màu trắng tự nhiên hoặc hơi phớt vàng, không cho phép 1/5 diện tích toàn thân

2.1.2.3 Mùi:

Mùi tự nhiên, không có mùi lạ

2.2 Phương pháp bảo quản mẫu và xử lý mẫu cho phân tích vi sinh:

2.2.1 Phương pháp bảo quản:

Mẫu sau khi lấy được chuyển về phòng kiểm nghiệm vi sinh tại đây mẫu được bảo quản trong tủ lạnh trong khi chờ phân tích

Mẫu chờ phân tích phải tuân theo các yêu cầu và điều kiện bảo quản như sau:

Mẫu đông lạnh < -180C (tủ đông) Không quá 24 h Mẫu tươi (kể cả sản phẩm ướp đá) 20C ÷ 50C (tủ lạnh) Không quá24h

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu cho phân tích vi sinh

Phương pháp này gồm các bước:

Bước 1: Cân mẫu cho phân tích

Dùng kéo, kẹp đã vô trùng để mở bao bì của mẫu

Sau khi mở mẫu, ta dùng kéo, kẹp vô trùng để lấy mẫu ngẫu nhiên cho vào bao PE và cân

Bước 2: Thêm dung dịch pha loãng Bước 3: Đồng nhất mẫu

Bước 4: Mẫu trong bao PE sau khi đồng nhất có nồng độ mẫu là 10-1 Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml chuyển vào ống nghiệm đựng 9 ml dung dịch pha loãng Ống nghiệm này sẽ có nồng độ pha loãng là 10-2

Lập lại các bước trên ta được mẫu có nồng độ pha loãng là 10n tuỳ vào các chỉ tiêu vi sinh vật phân tích mà ta có nồng độ pha loãng khác nhau

2.3 Phương pháp định lượng vi sinh vật:

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định, định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn ( phương pháp MPN ) :

2.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phương pháp này cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Trong phương pháp này cần pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch

Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm

2.3.2 Phương pháp MPN ( Most Probable Number ):

Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu Việc định lượng này được thực hiện ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng có 3 x3=9 ống nghiệm

Quy trình thực hiện phương pháp:

Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (1/10; 1/100; 1/1000) ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Dựa vào kết quả ta chứng minh được sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường có hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục…) Ghi nhận số ống lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mack Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml hay số MPN/1 g mẫu

( TLTK - Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh – NXBGD - trang 65,68 )

2.4 Phương pháp kiểm tra vi sinh vật trước và sau khi đông lạnh:

2.4.1 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường PCA (plate count agar):

2.4.1.1 Chuẩn bị mẫu :

Cân 10 gr mẫu trong điều kiện vô trùng Trộn mẫu này với 90 ml dung dịch pha loãng BPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, thời gian dập mẫu 30 giây

Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW Trộn đều dịch mẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc

Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào ống thứ hai chứa 9 ml dung dịch pha loãng Tiếp tục như vậy cho đến khi có đủ các nồng độ pha loãng cần thiết

2.4.1.2 Cấy mẫu:

Ghi trên nắp đĩa petri: ngày cấy, mã số mẫu và nồng độ pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng Mỗi nồng độ hai đĩa Trong vòng 15 phút, đỗ vào mỗi đĩa 10 ml môi trường PCA (plate count agar) đã được thanh trùng và để ổn định ở 450C Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 đến 7 lần sau khi đổ môi trường

Đặt các đĩa trên bề mặt phẳng ngang cho đông khô tự nhiên

2.4.1.3 Nuôi ủ:

Lật ngược đĩa lại và ủ ở 37+ 10C trong 48 giờ

2.4.1.4 Đọc kết quả:

Đếm khuẩn lạc trên các đĩa sau 48 giờ

2.4.1.5 Tính kết quả:

Tính tổng số vi sinh vật trong 1 ml mẫu bằng số đếm trung bình từ hai đĩa của mỗi nồng độ nhân với số lần pha loãng mẫu

Quy trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm

2.4.2 Định lượng coliforms, coliforms giả định (coliform phân) bằng phương pháp MPN (Most Probale Number) và E.coli bằng phương pháp định tính

2.4.2.1 Coliform:

Tuần tự cấy 1 ml mẫu đã pha loãng 10-1 ,10-2

, 10-3 vào dãy 9 ống nghiệm (mỗi nồng độ 3 ống) chứa 5 ml môi trường BGBL ủ các ống nghiệm ở 37+ 10C trong 48 giờ ghi nhận số ống có sinh hơi Đọc số lượng các ống cho kết quả

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3…

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1 ml

mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa 10 ml môi trường PCA đã được làm nguội 450 C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 37oC /48giờ

Chọn các đĩa có khoảng 25÷250 khuẩn lạc trên một đĩa để đếm

Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu

(CFU/ml)

dương tính Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng

được tra bảng MPN để xác định tổng số coli forms trong 1 ml sản phẩm

2.4.2.2 Coliforms phân

Dùng khuyên cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống sinh hơi trên môi trường BGBL sang môi trường canh tryptone, EC, ủ ở 44 + 0.2 0C trong 24 giờ, nhỏ thuốc thử kovac/s vào các ống nghiệm tryptone đã ủ Phản ứng cho kết quả dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trường trong vài phút Đọc kết quả số lượng các ống dương tính, số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các

nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số coli forms phân

trong 1 ml sản phẩm

2.4.2.3 Ecoli:

Dùng khuyên cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ các ống dương tính trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa Maconkey nuôi ủ 370C trong 24 giờ, đọc kết quả có khuẩn lạc màu đỏ tía, tròn, dẹt

Chọn các khẩn lạc điển hình thử nghiệm (test) sinh hoá IMVIC để xác

định chính xác sự hiên diện của E.coli trong 1 ml sản phẩm