nuôi cấy phôi soma cây keo lai acacia hybrids

PHÔI SOMA: 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật: Năm 1838 hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : mọi cơ thể sinh vật phức t

ĐẠI HỌC MỞ BÁN CÔNG THÀNH PHỐ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Vậy là đã kết thúc những năm học tại trường và trong suốt những năm học qua em đã được sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cô , sự giúp đỡ của bạn bè , sự hỗ trợ và động viên của gia đình , sự cố gắng nỗ lực của bản thân Suốt đời chắc em khó có thể quên tất cả những năm học tập tại trường

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô , gia đình và bạn bè đã giúp em hoàn tất được khoá học này

Em cũng xin chân thành cảm ơn sự chỉ dẫn rất nhiệt tình và tận tình của thầy Trần Văn Minh trong quá trình thực hiện đề tài này Và cũng xin gởi lời cảm ơn đến cô Thu , chị Uyên , anh Định và tất cả các anh chị đang công tác tại phòng Cây ăn trái thuộc Viện Sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành được đề tài

Tp Hồ Chí Minh , tháng 06 năm 2005

Phần 1 :

MỞ ĐẦU 1

Phần 2 : NỘI DUNG 4

Chương 1 : TỔNG QUAN 1 Tổng quan về Keo lai .5

1.1 Sự phát hiện và nghiên cứu Keo lai trên thế giới và trong nước 5

1.2 Đặc điểm sinh trưởng 7

1.3 Các đặc tính của Keo lai 8

1.4 Các kỹ thuật nhân giống đã sử dụng 10

2 Phôi soma .13

2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.2 Định nghĩa phôi soma 15

2.3 Sự hình thành phôi soma 16

2.4 Kỹ thuật nuôi cấy phôi soma 17

3 Điều kiện và môi trường trong nuôi cấy mô 21

3.1 Môi trường nuôi cấy 21

3.2 Điều kiện nuôi cấy 23

4 Vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng 24

4.1 Auxin 24

4.2 Cytokinin 25

4.3 Gibberilin 26

4.4 Một số chất khác 26

Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1 Vật liệu thí nghiệm 28

1.1 Vật liệu nuôi cấy 28

1.2 Môi trường nuôi cấy 28

1.3 Điều kiện nuôi cấy 30

2 Phương pháp thí nghiệm 31

3 Phương pháp thu thập số liệu 34

4 Phương thức thống kê 34

Chương 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Thí nghiệm 1 35

2 Thí nghiệm 2 38

3 Thí nghiệm 3 40

4 Thí nghiệm 4 42

5 Thí nghiệm 5 44

6 Thí nghiệm 6 48

Phần 3 :KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận 51

2 Kiến nghị 51

Tài liệu tham khảo 52

Phần 1

MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦU

Rừng là một nguồn tài nguyên rất quan trọng , gỗ cây rừng được sử dụng nhiều trong cuộc sống của con người , như cung cấp gỗ cho xây dựng nhà cửa, làm bàn ghế , làm các vật dụng trong gia đình, làm giấy,… Bên cạnh đó rừng là nguồn cung cấp oxy , làm môi trường trong lành hơn mà mỗi quốc gia cần phải duy trì và bảo vệ Nhưng trong tình trạng hiện nay rừng bị khai thác rất bừa bãi , diện tích rừng ngày càng thu hẹp, điều này ảnh hưởng rất nhiều đến cuộc sống của con người , làm cho lũ lụt dữ dội hơn , không khí ngột ngạt hơn

Ở nước ta hiện nay , diện tích rừng đã bị thu hẹp đáng kể , do khai thác gỗ lậu , đốt rừng làm rẫy, cháy rừng… Hiện đã và đang có những dự án trồng lại rừng đã bị mất , và hướng mới mở ra là trồng rừng sản xuất và thương mại , đồng thời phủ xanh đất trồng đồi núi trọc , tạo thêm công ăn việc làm và thu nhập cho người nghèo Bây giờ các tỉnh đang rộ lên việc đưa cây Keo lai ( là giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm, thuộc họ đậu) vào trồng rừng thương mại vì những tính ưu việt của nó như :

- Sinh trưởng nhanh , 2,5 tuổi đạt chiều cao 4,5m , 4,5 tuổi đạt 9,68m , nhanh và chiều cao đạt được hơn Keo tai tượng và Keo lá tràm 1,2 – 1,6 lần

- Mang các ưu điểm của giống bố và mẹ như thân thẳng , tròn , khả năng tỉa cành tốt …

- Gỗ của Keo lai tuy không thể dùng làm đồ gỗ tốt như cây khác nhưng làm nguyên liệu giấy rất tốt , giấy từ gỗ Keo lai tốt hơn cả một số loài khác

- Có tính chịu hạn tốt , có thể trồng ở các vùng đất khắc nghiệt Hệ rễ Keo lai có nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm nên có thể cải tạo đất Lá không chứa tinh dầu , dễ phân huỷ

- Dễ trồng và không cần chăm sóc nhiều

Tỉnh Tuyên Quang đã trồng thử Keo lai và cho biết cây này đạt hiệu quả kinh

6 năm, khả năng sinh khối lớn , năng suất thu hoạch cao(300m3/ha) Ngoài ra còn có các tỉnh khác như Đồng Nai , Long Thành – Bà Rịa cũng tiến hành trồng rừng Keo lai để phủ xanh đất trồng đồi núi trọc và phục vụ cho việc sản xuất giấy Tại Cà Mau, đã đưa vào trồng thử nghiệm Keo lai, và theo nhận định đánh giá thì Keo lai dễ trồng và cho năng xuất rất cao Tỉnh Cà Mau có dự định phá 5000ha rừng Tràm tự nhiên để trồng Keo lai, nhằm xoá đói nghèo cho dân tại vùng Nhưng đã có nhiều ý kiến phản đối, các nhà khoa học và phân tích đã tranh cãi rất nhiều về vấn đề này Hiện nay, Chính phủ đã ra lệnh không cho tỉnh Cà Mau thực hiện việc phá rừng Tràm để trồng Keo lai thương mại

Nhưng Keo lai chỉ có tính ưu việt ở thế hệ F1 , và chỉ ở một số dòng nhất định (theo nghiên cứu của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) Ở thế hệ F2 cây Keo lai không còn những tính năng ưu việt nữa , thậm chí còn kém hơn loài Keo bố mẹ Vì thế cần phải tạo dòng vô tính của những cây Keo lai tốt nhất Hiện nay Keo lai được nhân giống vô tính bằng hom là chính , đã có nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng và đã thành công Nhân giống bằng hom đơn giản , dễ làm nhưng thời gian nhân giống dài và tốn nhiều nhân công Nhân giống bằng nuôi cấy mô thì nhanh hơn , ít tốn nhân công hơn và số lượng cây con được nhân ra nhiếu hơn

Phương pháp nuôi cấy mô được dùng phổ biến hiện nay là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng , nhưng chưa được đồng đều và dễ bị thoái hoá và đột biến nếu sử dụng mẫu quá lâu Nuôi cấy bằng phôi thì ít gây đột biến hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo tính đồng đều cho cây con đưa ra sản xuất Và tạo dòng đầu nguồn từ cây vô tính

Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài với nội dung :

“ Nuôi cấy phôi soma cây Keo lai (Acacia hybrids ) “

Phần 2

NỘI DUNG

Chương 1: TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VỀ KEO LAI:

1.1 Sự phát hiện và nghiên cứu Keo lai trên thế giới và trong nước :

1.1.1 Sự phát hiện :

a Trên thế giới :

Keo lai là tên gọi tắt để chỉ giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformois) Giống lai tự nhiên này được Messrs Herburn và Shim phát hiện lần đầu vào năm 1972 trong các cây Keo tai tượng ven đường ở Sook Telupid thuộc bang Sabah của Malaysia Tháng 07 năm

1978, sau khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland (Australia) được gửi đến từ tháng 01 năm 1977, Pedgley đã xác định đó là giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm Keo lai tự nhiên cũng được phát hiện ở vùng Balamuk và Old Tonda của Papua New Giunea (Turnbull , 1986 ; Gun

et al, 1987 ; Griffin , 1988) , ở một số nơi khác tại Sabah (Rufelds , 1987) và Ulu Kukut (Darus và Rasip , 1989) của Malysia, keo lai cũng được phát hiện ở Thái Lan (Kijkar , 1992) , ở trong vườn ươm Keo tai tượng của trạm nghiên cứu Jon-pu của viện nghiên cứu lâm nghiệp Đài Loan, ở khu trồng Keo tai tượng tại Quảng Châu (Trung Quốc)

b Trong nước :

Ơû nước ta Keo lai được Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng (Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam ) phát hiện tại Ba Vì (Hà Tây) , Đông Nam Bộ (Tân Tạo , Trảng Bom , Sông Mây , Trị An ), Trung bộ ( Bình Định , Quảng Nam , Đà Nẵng…) , Tây Nguyên (Pleyku , Kong Hà Nừng ) , Bắc Bộ ( Hoà Bình , Phú Thọ , Tuyên Quang …).Các cây lai xuất hiện trong các rừng trồng Keo tai tượng cạnh Keo lá tràm , với Keo tai tượng là mẹ , Keo lá tràm là bố Khả năng phát triển của keo lai ở các vùng sinh thái chính ở nước ta đều như nhau

1.1.2 Nghiên cứu :

Keo lai được gây trồng thành đám khoảng 30 cây tại Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng ASEAN – Canada ở Muak-Lek , Saraburi Năm 1992 , ở Indonesia đã bắt đầu có thí nghiệm trồng Keo lai từ nuôi cây mô phân sinh , cùng Keo tai tượng và Keo lá tràm Keo lai ở khu Ulu Kukut có thể xuất hiện với tỷ lệ

3 -4 cây/ha Tại các vườn ươm ở Sabah , tỷ lệ Keo lai xuất hiện trong các vườn ươm Keo tai tượng là 3,3 – 9,3% , cao nhất là 23% , trong vườn ươm Keo lá tràm là 6,8 – 10,3% , cao nhất là 22,5%

Ơû giai đoạn vườn ươm cây con Keo lai hình thành lá giả sớm hơn Keo tai tượng và muộn hơn Keo lá tràm (Rufelds , 1988 ) Và các tính trạng như hoa tự, chiều dài , chiều rộng hoa tự , số hoa , chiều dài , chiều rộng , chiều dày của hạt của cây Keo lai đều có tính chất trung gian giữa Keo tai tựơng và Keo lá tràm

Về hình dáng của Keo lai thì có rất nhiều ý kiến khác nhau , theo thông báo của Tham ( 1976 ) thì cây lai thường cao hơn cả bố mẹ nhưng vẫn giữ hình dáng kém của Keo lá tràm ,theo Wong ( dẫn từ Pinso và Nasi , 1991 ) thì cây lai vẫn giữ hình dáng đẹp của Keo tai tượng , cây lai thường to hơn và cao hơn bố mẹ , còn Rufelds ( 1987 ) lại không thấy sự sai khác nào về sự sinh trưởng của cây lai so với bố mẹ , không có ưu thế lai thật sự

Đánh giá Keo lai tại Sabah một cách tổng hợp , Pinso và Nasi (1991) nhận thấy rằng cây lai có thể có ưu thế lai song không bắt buộc và có thể bị ảnh hưởng bởi yếu tố di truyền và điều kiện lập địa Ngoài ra hai ông còn nhận thấy độ thẳng thân cây , đoạn thân dưới cành, độ tròn đều của thân , đỉnh ngọn , khả năng tỉa cành đều hơn bố mẹ , Keo lai rất thích hợp với các chương trình trồng rừng thương mại

Keo lai đã được nghiên cứu nhân giống bằng hom (Griffin ,1988) hoặc nuôi cấy mô phân sinh(đỉnh sinh trưởng ) bằng môi trường cơ bản Murashige và Skooge (MS) có thêm 6-Benzylaminopurine (BAP) 0,5mg/l

1.2 Đặc điểm sinh trưởng :

Hình thái của keo lai thể hiện tính trạng trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm Cụ thể ở kích thước lá , số gân chính ở lá, hình dạng quả, hình thái tán và màu sắc của vỏ cây , số lá chét ở lá kép đầu tiên …

Tên cây Chỉ số lá

dài/rộng

Số gân chính

Mặt cắt quả

Số lá chét ở lá kép đầu tiên (trung bình) Keo tai tượng

Keo lai

Keo lá tràm

2,73 – 2,79 3,09 – 3,37 5,23 – 6,69

4

3 – 4

2 – 3

Hình tròn Hình bầu dục Hình dẹt

7,6 8,5 5,8 Từ bảng trên cho thấy , lá Keo tai tượng lớn và to bản , lá Keo lá tràm dài và hẹp, lá Keo lai thì có kích thước trung gian Trong giai đoạn vườn ươm cây con Keo lai hình thành lá giả sớm hơn Keo tai tượng và muộn hơn Keo lá tràm

Ngoài những tính trạng trung gian, Keo lai cũng có một số tính trạng trội hơn bố mẹ , hoặc mang những ưu điểm của bố hoặc mẹ, như tuyến mật ở nách lá (tính trạng của Keo tai tượng ), thân thẳng và cao ( tính trạng của Keo lá tràm )

Điểm nổi bật của Keo lai là sinh trưởng nhanh hơn Keo tai tượng (1,2 – 1,6 lần về chiều cao và 1,3 – 1,8 lần về đường kính) và Keo lá tràm (1,3 lần về chiều cao , 1,5 lần về đường kính) Hệ số biến động về chiều cao và đường kính của Keo lai nhỏ hơn Keo tai tượng và lớn hơn Keo lá tràm, hay nói cách khác hệ số biến động tương đối ổn định, đường kính và chiều cao đồng đều hơn Keo tai tượng

Trong khi ở một số nơi Keo lai có ưu thế lai hết sức rõ rệt, cây lai vượt lên tán rừng Keo tai tượng, thân thẳng tròn đều rất đẹp, tán lá phát triển cân đối, thì một số nơi khác trên đất nước ta thì không thấy rõ ưu thế lai thậm chí ngọn còn kém phát triển Vì thế không phải hễ phát hiện ra Keo lai là có thể nhân giống và đưa vào sản xuất được mà phải qua quá trình chọn lọc cẩn thận những cá thể tốt

nhất, vượt trội hơn hẳn bố mẹ.Từ đó tiến hành nhân giống sinh dưỡng và khảo nghiệm dòng vô tính đưa vào sản xuất đại trà

1.3 Các đặc tính của Keo lai :

1.3.1 Tiềm năng bột giấy:

Năm 1998 – 1999 , Viện công nghiệp giấy và cenlulose đã tiến hành xác định tiềm năng bột giấy của các dòng Keo lai được lựa chọn, và so sánh với các loài bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm và cả Bạch đàn trắng caman (Eucalyptus camaldulensis) qua xác định tỷ trọng gỗ, phân tích thành phần hóa học gỗ, hiệu suất bột , tính chất cơ học và độ trắng của giấy

Qua các số liệu đã thu được trong thí nghiệm , nhóm nghiên cứu đã có những kết luận như sau :

- Tỷ trọng gỗ khô kiệt trung bình của các dòng Keo lai ( 0,491) ở mức trung gian giữa Keo tai tượng (0,474) và Keo lá tràm (0,493 – 0,541) và thấp hơn

so với Bạch đàn trắng caman(0,576) Số vết nứt trên mặt cắt và chiều rộng vết nứt trung bình của các dòng Keo lai cũng ở mức trung gian giữa hai loài bố mẹ và cao hơn Bạch đàn trắng caman Trong các dòng Keo lai đem khảo nghiệm thì có một dòng không có vết nứt, rất thích hợp dùng làm gỗ xây dựng vì ít có tính co rút

- Hàm lượng cenlulose của các dòng Keo lai cao hơn cả bố mẹ và Bạch đàn trắng caman , thấp hơn giống Keo lá tràm xuất xứ từ Morehead River Các chất khác như Lignin, Pentozan, các chất tan trong cồn và Benzen , chất tan trong NaOH, chất tan trong nước nóng, chất tan trong nước lạnh, tro đều tương đương với bố mẹ và Bạch đàn trắng caman

- Theo các kết quả thử nghiệm, ở tất cả các mức dùng kiềm ( 18%, 20%, 22%, 24% ) đa số dòng Keo lai đều có hiệu suất bột giấy cao hơn bố mẹ, và hiệu suất bột của Bạch đàn trắng caman là thấp nhất

- Giấy được sản xuất từ gỗ các dòng Keo lai được lựa chọn có độ dài đứt và

độ chịu xé, độ trắng và hiệu suất tẩy trắng của giấy từ các dòng Keo lai tương đương với các loài bố mẹ và Bạch đàn trắng caman

- Qua tất cả các thử nghiệm đã chứng tỏ tiềm năng bột giấy của Keo lai hơn các loài keo bố mẹ và hơn hẳn Bạch đàn trắng caman Đặt biệt có một vài dòng Keo lai có tính ưu việt trội hẳn, có thể từ các dòng này để nhân giống, phát triển đưa vào trồng rừng thương mại

1.3.2 Khả năng chịu hạn của cây Keo lai :

Hầu hết diện tích trồng rừng ở nước ta là đất trống đồi núi trọc vừa thiếu dinh dưỡng vừa thiếu nước trầm trọng trong mùa khô Cây trồng trên các lập địa này phải là những cây có khả năng chịu hạn tốt, có thể sinh trưởng trong điều kiện nước ngầm ở rất sâu hoặc không có nước ngầm

Kết quả gây trồng thử ở nhiều nơi đều cho thấy những dòng Keo lai được chọn thử đều có sức chống chịu với điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ, kể từ khi là cây non.Tính chịu hạn của cây có thể được đánh giá dựa vào các chỉ tiêu áp suất thẩm thấu của dịch tế bào lá , khả năng giữ nước của lá, cường độ thoát hơi nước, độ ẩm cây héo Người ta đã thử nghiệm sự chịu hạn của các cây con Keo lai và các cây con của hai loài bố mẹ qua các chỉ tiêu trên tại vùng khô nóng , kết quả thu được là cây Keo lai non có thể chịu hạn hơn cây non của hai loài bố mẹ, và cũng thể hiện tính chịu hạn khá ở từng chỉ tiêu

1.3.3 Nốt sần và khả năng cải tạo đất :

Đến nay người ta đã biết có 640 loài cây gỗ ( chủ yếu là thuộc họ Đậu ) có thể cố định đạm trong khí quyển Keo tai tượng và Keo lá tràm thuộc họ phụ

Mimosoideae của các loài cây họ Đậu nên có khả năng cố định đạm rất lớn Keo

lai là cây lai tự nhiên của Keo tai tượng và Keo lá tràm nên keo lai cũng thuộc họ đậu , và Keo lai cũng có thể cố định đạm Theo kết quả kiểm tra lượng nốt sần, số

vi khuẩn cố định đạm, lượng vi khuẩn dưới tán đất rừng trồng keo, thì có thể xác định Keo lai hơn hẳn loài bố mẹ Số nốt sần của các dòng Keo lai nhiều hơn , số tế bào vi sinh vật trong 1g đất và số tế bào vi khuẩn cố định đạm trong 1g đất

cuõng cao hôn raât nhieău so vôùi hai loaøi boâ mé Neđn Keo lai coù khạ naíng taíng ñoô phì cụa ñaât , coù khạ naíng cại táo ñaât cao hôn Keo tai töôïng vaø Keo laù traøm

1.3.4 Nhöôïc ñieơm :

Haău heât caùc tính chaât cụa Keo lai ñeău theơ hieôn tính trung gian giöõa Keo tai töôïng vaø Keo laù traøm ,do ñoù Keo lai ñaõ taôp hôïp ñöôïc caùc öu ñieơm cụa boâ mé vaø khaĩc phúc ñöôïc moôt soâ nhöôïc ñieơm cụa boâ mé Tuy vaôy , do sinh tröôûng nhanh neđn moôt soâ doøng Keo lai coù theơ bò gioù mánh hoaịc baõo laøm gaõy ngang

1.4 Caùc kyõ thuaôt nhađn gioâng ñaõ söû dúng :

1.4.1 Nhađn gioâng baỉng hom :

Nhađn gioâng baỉng hom laø kyõ thuaôt ñôn giạn, deê laøm, ít toân keùm Nhöõng khađu cô bạn trong nhađn gioâng hom cho Keo lai laø xađy döïng vöôøn laây gioâng hom, caĩt caønh laây hom vaø giađm hom, muøa giađm hom, chaím soùc hom giađm vaø cađy hom, khu giađm hom

a Xađy döïng vöôøn gioâng laây hom :

Vöôøn gioâng laây hom laø vöôøn gioâng ñöôïc xađy döïng baỉng cađy hom ñôøi F1 cụa nhöõng doøng Keo lai toât nhaât ñaõ ñöôïc ñaùnh giaù qua khạo nghieôm doøng vođ tính Vöôøn gioâng laây hom ñöôïc gađy troăng tređn ñaât vöôøn öôm gaăn khu nhađn gioâng baỉng hom Dieôn tích vöôøn gioâng laây hom baỉng 1/1000 – 1/1500 dieôn tích troăng röøng sạn xuaât

Ñaât ñeơ gađy troăng vöôøn gioâng laây hom neđn coù thaønh phaăn cô giôùi nhé , deê thoaùt nöôùc , taăng ñaât sađu tređn 50m Phöông phaùp laøm ñaât laø caøy böøa toaøn dieôn 2 laăn vaø phađn luoâng ñeơ gađy troăng Tuyø ñieău kieôn ñòa hình vaø quy mođ vöôøn gioâng maø cađy gioâng trong moêi doøng vođ tính coù theơ troăng theo haønh hoaịc theo khoâi rieđng reõ vaø phại ghi roõ soâ hieôu cụa töøng doøng

Sau khi troăng 3 - 4 thaùng coù theơ caĩt táo choăi cho cađy gioâng Táo choăi laăn ñaău ñöôïc thöïc hieôn baỉng caùch duøng keùo caĩt caønh caĩt caùch maịt ñaât 70cm, goẫc cađy ñöôïc caĩt phại khöû truøng Vieôc caĩt táo choăi cađy gioâng laăn ñaău tieđn ñöôïc keât hôïp vôùi vieôc

lấy hom giâm Hàng năm cuối mùa sinh trưởng phải đốn tạo chồi và làm trẻ hóa cây giống, xới đất ,làm cỏ gốc , tưới nước, bón phân

b Cắt cành lấy hom và giâm hom :

Dùng kéo cắt cành hoặc dao sắc cắt cành lấy hom từ vườn giống vào buổi sáng, tránh làm gập hom, chiều dài mỗi hom 6 – 7 cm, mỗi hom có 1 – 2 lá có 2/3 diện tích phiến lá, phần gốc cắt vát 45o Cành đã cắt phải được bảo quản nơi râm mát hoặc ngâm gốc cành vào nước

Khi cắt cành phải để lại trên gốc ít nhất 2 đôi lá hoặc 2 chồi ngủ , tuỳ mức độ phát triển của cành mà quyết định lần cắt tiếp theo Hom đã cắt phải ngâm vào dung dịch khử trùng trong 1 giờ và chấm gốc thuốc ra rễ, rối cấy ngay vào luống giâm, không để hom đã xử lý qua đêm Keo lai rất dễ giâm hom và tỷ lệ ra rễ khá cao

c Mùa giâm hom :

Mùa giâm hom phụ thuộc vào mùa trồng cây ở từng vùng Nhưng nguyên tắc chung là giâm hom phải được thực hiện trước khi trồng 3 tháng, nếu giâm hom trước quá lâu thì phải có biện pháp hãm sự phát triển của hom

d Chăm sóc hom giâm và cây hom:

Muốn có tỷ lệ ra rễ cao và tạo được nhiều cây hom thì phải thực hiện tốt khâu chăm sóc Sau khi cấy hom phải phủ nylon lên hom và tưới đủ để giữ ẩm Nếu trời nắng gắt thì phải che râm hoàn toàn cho luống hom , chắn gió , giữ ẩm tốt Sau khi giâm 1 tháng thì chuyển hom đã ra rễ vào bầu đất hoặc chuyển bầu hom còn sống

ra khỏi lều nylon nhưng vẫn để dưới dàn che râm Đến khi cây hom đã ổn định thì có thể tháo dàn che và trồng ngoài trời Trong giai đoạn non này cần chú ý chăm sóc và phun thuốc phòng và trị bệnh cho cây

Trong quá trình nuôi dưỡng cây hom phải kịp thời bấm tỉa các chồi bất định, trên mỗi cây hom chỉ để một chồi phát triển Khi cây hom cao 20cm – 25cm thì đem đi trồng Trước khi xuất vườn 1 tháng phải cắt bớt lá, đảo bầu, loại bỏ cây yếu kém để đảm bảo tỷ lệ sống cao và chất lượng rừng tốt

e Khu giâm hom , luống giâm hom:

Khu giâm hom và luống giâm hom là nơi để sản xuất và huấn luyện cây hom cho các yêu cầu trồng rừng Khu giâm hom là một khu có mái che bằng nhựa, bằng nylon hay tấm đan tre nứa có độ che 60%, trong được thiết kế để thoát nước tốt Chung quanh có bao che, cao 1,5m Phía trong là các luống giâm hom hoặc lều giâm hom đặt cách nhau 30cm và có đường đi lại thuận tiện Nền luống dạng bể nông có chiều rộng 1,4m, chiều dài thay đổi theo địa hình, thành luống cao 6cm , nền luống được lát gạch có độ dốc cần thiết và có hệ thống thoát nước tốt Trên luống được che bằng nylon , hệ thống tưới tiêu tốt , không để cây héo

1.4.2 Nhân giống bằng nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng ( hay mô phân sinh):

Nuôi cấy mô phân sinh Keo lai đã được Darus tiến hành lần đầu bằng môi trường cơ bản MS có thêm 6-Benzylaminopyrine(BAP) 1,5mg/l và cho ra rễ trên nền cát sông 100% Ở nước ta, người đầu tiên tiến hành nuôi cấy mô phân sinh cây Keo lai là Nguyễn Ngọc Tân, sau đó là Đoàn Thị Mai Phương pháp nuôi cấy mô phân sinh là một hình thức nhân giống khác của Keo lai ngoài giâm hom Cách này tạo ra nhiều cây hơn và nhanh hơn rất nhiều so với giâm hom

Những kỹ thuật cơ bản của nuôi cấy mô phân sinh :

a Khử trùng bề mặt mẫu :

Chồi non của các dòng keo lai ưu việt được cắt thành đoạn khoảng 3 – 4 cm, đem rửa xà bông bằng cách cọ nhẹ lên mẫu bằng bông mềm, sau đó trứơt sạch xả bông bằng vòi nước chảy mạnh, lấy sáp nóng chảy chấm vào vết cắt của mẫu Đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng, tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần Cho mẫu vào nước cồn 70o ngâm trong 1 phút để khử trùng , rửa lại bằng nươc cất vô trùng Rồi cho mẫu vào dung dịch hypoclorite 10% ngâm 10 phút , gắp ra rửa lại bằng nước cất cho sạch Đem cấy các chồi đó vào môi trường MS , trước khi cấy cần cắt bỏ phần gốc đã bị nhúng sáp

b Nhân chồi :

Sau khi chồi đã sống được trong môi trường MS thì sẽ chuyển chồi đó vào môi trường nhân chồi có chứa các chất kích thích cần thiết cho việc nẩy chồi của mẫu Khi chồi đã lên được nhiều, ta cấy truyền để tăng số mẫu cây lên , khi đã có một sồ lượng lớn cây ta sẽ cho ra rễ

c Cho ra rễ :

Môi trường tạo rễ là môi trường dinh dưỡng có chứa các chất kích thích ra rễ như IAA, IBA , NAA Khi rễ dài và tốt, cây con sẽ được chuyển đem ra trồng ở vườn ươm, chăm sóc tốt trước khi đem trồng rừng

2 PHÔI SOMA:

2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Năm 1838 hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ , các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hoá mang nhiều thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên , đó là trứng sau khi thụ tinh , và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm , nhưng ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hoá tách từ lá của một số cây một lá mầm Sở dĩ ông thất bại vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy và các tế bào ông dùng nuôi cấy là những tế bào đã mất hết khả năng tái sinh

Năm 1922, Kotte đã tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây thân hoà thảo trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại một thời gian , sau đó chậm dần và ngừng lại mace dù đã được chuyển sang môi trường mới

Năm 1934 bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ của cà chua

(Lycopersicum esculentum) với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Ít lâu sau, White đã chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (thiamin, pyridoxin, nicotinic acid) Cùng thời gian đó , Gautheret đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô thượng tầng một số cây thân gỗ

Từ năm 1934 đến năm 1954 , nhiều nhà khoa học đã phát hiện ra các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật, như acid - β -indolacetic (IAA), 6-furfurylaminopurine (kinetin), gibberellin ,butyric acid (BA) … và đồng thời tổng hợp được các chất sinh trưởng nhân tạo trong nhóm auxin như α-napthylacetic acid (NAA), 2,4-dichlophenonxyacetic acid (2,4 D) , indolbutyric acid (IBA) Ngoài ra còn phát hiện được những chất khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy như vitamin, nước dừa, các dịch chiết

Việc phát hiện ra vai trò của IAA , NAA , 2,4D và Kinetin cùng với vitamine và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật, đó là tiền đề cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hoá học và cho việc làm làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này

Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Hiện tượng này được xác định trên nhiều cây khác nhau, và nó đóng góp rất nhiều vào việc điều khiển các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, phát sinh các cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật

Từ năm 1954 đến 1959 , kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã đựơc phát triển Muir , Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một dịch huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lên máy lắc Các tế bào đơn có thể gieo

Năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành protocom, và khi đem chia cắt và nuôi cấy tiếp thì lại thu được các protocom mới, trong điều kiện nhất định có thể phát triển thành cây con Người ta nhận thấy nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng để nhân giống và phục tráng cây trồng, và đỉnh sinh trưởng là đối tượng dùng trong nuôi cấy mô để phục tráng lại giống đã bị bệnh vì các tế bào ở đỉnh sinh trưởng thực vật hoàn toàn không chứa virus Cùng năm , Cooking (Anh ) công bố có thể dùng men cellulse để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật , thu được các tế bào tròn , không vỏ bọc , gọi là protoplast Và protoplast đã được tái sinh thanh cây hoàn chỉnh bẳng cách trải dịch huyền phù tế bào (Takebe , 1970)

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia) , từ đó có sự chú ý nhiều hơn về nuôi cấy túi phấn Năm 1967, Bourgin và Nitsch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá

Từ năm 1980 đến 1992 hàng loạt thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố và nhanh chóng được đưa vào sản xuất

Chúng ta đang ở giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

2.2 Định nghĩa phôi soma:

Phôi vô tính ( somatic embryos) được hình hành thông qua quá trình tạo mô sẹo, tế bào phôi vô tính có thể được tạo ra trực tiếp và nhân sinh khối bằng hệ thống nuôi cấy thích hợp Những tế bào phôi vô tính này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc được dùng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo với lớp bao alginate Phôi vô tính hiện nay được xem như một kỹ thuật mang nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng mà kỹ thuật nhân giống cũ còn nhiều hạn chế , nhất là cây thân gỗ Ngoài ra nhân giống vô tính có thể thực hiện

trên quy mô công nghiệp mà diện tích thực hiện không nhiều và được tự động hoá với chi phí nhân công thấp nhất Kỹ thuật nuôi cấy phôi vô tính có thể thực hiện trên môi trường lỏng hoặc bán rắn

2.3 Sự hình thành phôi soma :

Từ năm 1958 , khi những tế bào phôi thực vật từ mô dinh dưỡng của cây cà rốt (Daucus catora ) được nuôi cấy in vitro thì nhiều loài cây trồng và mô được nghiện cứu sự phát sinh phôi , những mô chứa nhiều tế bào phôi chưa trưởng thành , tế bào phôi hợp tử

Tế bào trong phôi hợp tử ở giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi gọi là tế bào tiền phôi (PEDC – preembryogenic determined cell) Tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành tế bào phôi trực tiếp ,gọi là sự phát sinh phôi trực tiếp Ngoài tế bào tiền phôi còn có tế bào phát sinh phôi cũng có khả năng hình thành tế bào phôi, tế bào phát sinh phôi (IEDC – induced embryonic determined cell) có thể hình thành từ tế bào bình thường được nuôi cấy trên môi trường có auxin và có thể không có cytokitin Phương thức tác động của auxin trong sự phát sinh tế bào phát sinh phôi (IEDC) cho đến nay cũng chưa được rõ ràng, nhưng sự có mặt của auxin thường thúc đẩy nhanh sự phân chia tế bào và thường tạo ra tế bào xốp, khi một tế bào hoặc một cụm tế bào được tách riêng biệt thì sự có mặt của auxin giúp cho sự hình thành các tế bào có tính phân cực, sự phân cực này đi đôi với sự biệt hoá tế bào Nếu các chất kích thích sinh trưởng tác động thích hợp sẽ xảy ra quá trình phát sinh phôi, kết quả là hình thành phôi mới, chu kỳ phát sinh phôi tiếp tục vào các điểm thời gian khác nhau, lặp đi lặp lại quá trình phát sinh phôi và tế bào phôi được tạo ra liên tục Phụ thuộc vào từng loại cây trồng và hệ thống nuôi cấy khác nhau, sự lặp đi lặp lại chu kỳ phân chia tế bào phôi ở các thời điểm khác nhau , thể hiện nhân liên tục các giai đoạn phôi khác nhau, bao gồm sự tăng sinh khối tế bào tiền phôi Những nhân tố khác ảnh hưởng đế sự hình thành phôi như tỷ lệ ammonium và nitrate trong môi trường, sự giảm hay bỏ hẳn auxin ra khỏi môi

và IEDC (tế bào phát sinh phôi) con đường PEDC là con đường không thông qua quá trình tạo mô sẹo, con đường IEDC là con đường phát sinh phôi thông qua quá trình tạo mô sẹo

Sự hình thành cây từ tế bào cây nhị bội thường có tế bào chất đậm đặc, hạt tinh bột lớn tế bào nhân to tương đối những tế bào phôi nay có hàm lượng protein và RNA cao Sự phát triển phôi đều thông qua các giai đoạn của sự hình thành phôi (dạng hình cầu, đến hình trái tim, hình thuỷ lôi) Có 2 bước dấn đến sự hình thành phôi : 1 sự biệt hoá của tế bào có khả năng phát sinh phôi ,2 sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành

2.4 Kỹ thuật nuôi cấy phôi soma :

Phôi soma được hình thành theo 2 con đường IEDC (tế bào phát sinh phôi) và PEDC (tế bào tiền phôi) nên cách nuôi cấy phôi soma cũng có 2 cách là trực tiệp và gián tiếp Trực tiếp là nuôi cấy từ phôi hạt bên trong noãn, hạt, trái Gián tiếp là nuôi cấy từ các cơ quan của cây nuôi cấy mô

2.4.1 Nuôi cấy trực tiếp :

a Khử trùng mẫu :

Phôi hạt nằm bên trong noãn , hạt , trái , do đó được bao bọc trong một môi trường hoàn toàn vô trùng Nên việc khử trùng bề mặt phôi hạt là không cần thiết, nhưng nếu vỏ bọc phôi hạt bị nứt hoặc nhiễm nấm khuẩn thì cần phải khử trùng Nếu vỏ bọc không bị nứt hoặc nhiễm nấm thì chỉ cần khử trùng bề mặt ngoài của vỏ bao phôi Phương pháp khử trùng thông thường được áp dụng đối với noãn , hạt, trái Thường dùng alcohol 70% khử trùng mẫu sơ bộ , rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần , khử trùng bề mặt bằng các chất thông dụng như Ca-hypoclorite , Na-hypoclotite , HgCl2 ….với nồng độ 5-15% , ngoài ra còn dùng các chất tăng sức căng bề mặt như teepol, tween … và rửa lại bằng nước cất vô trùng

Mẫu sau khi được khử trùng sẽ tách ra lấy phôi hạt và cấy vào môi trường nuôi phôi Các dụng cụ dùng để tách phải vô trùng và được làm mát, và phải duy trì độ ẩm để tránh mất nước cho phôi hạt

b Môi trường nuôi cấy phôi :

Phôi được tách ra hoàn toàn trong tình trạng tự dưỡng , nên cần nuôi cấy phôi trong môi trường chứa những dinh dưỡng cần thiết để phôi có khả năng tái sinh Các chất vô cơ trong môi trường nuôi cấy phôi là các môi trường cơ bản White (1963) ,Murashige - Skoog (1962) đôi khi được thay đổi hoặc bổ sung thêm một số chất tuỳ vào từng loại cây Nguồn nitrogen được lấy từ các chất vô

cơ Nguồn carbon được bổ sung từ đường, thông thường đường được sử dụng 30g/lit môi trường Nước dừa được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô, cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác Nước dừa kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và tác động trong sự phát triển phôi Ngoài nước dừa người ta còn sử dụng các loại dịch chiết để kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ ngô , chà là , chuối , mầm đậu , mầm luá mì , nước chiết cà chua …

Chất sinh trưởng ( cytokinin, auxin , gibberellin….) có tác dụng lên phôi non, kích thích sự phát triển của phôi non , kích thích quá trình biệt hóa phôi, tất cả đều được dùng ở nồng độ rất thấp Môi trường nuôi cấy ở dạng bán rắn hoặc lỏng tuỳ từng loại cây Muốn dùng môi trường bán rắn thì phải sử dụng agar làm thành môi trường thạch , tỷ lệ agar dùng để nuôi cấy phôi là 7g/lit môi trường Đối với một số cây thì phải bổ sung thêm than hoạt tính cho quá trình phát triển của phôi Độ pH trong môi trường cũng rất quan trọng , vì mỗi cây có một pH riêng thích hợp cho sự phát triển , thông thường là từ 5 – 6

c Điều kiện nuôi cấy phôi :

Tuỳ vào phôi của loại cây mà phôi cần hay không cần ánh sáng , cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng Nhiệt độ nuôi cấy của từng cây khác nhau nên phôi cũng không giống nhau, thường người ta căn cứ vào xuất xứ của cây mà chọn nhiệt độ thích hợp Trên cùng một loại cây trồng, phôi của các bộ phận khác nhau cũng cần nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ nuôi cấy và thời gian chiếu sáng phải được

d Nhân sinh khối tế bào phôi :

Trên cơ sở những hệ thống phát sinh phôi và đặc tính phát sinh phôi được lặp lại theo chu kỳ mà phôi của một loại cây trồng có thể được nhân sinh khối Trên lý thuyết, từ một mẫu mô nuôi cấy có thể sản xuất vô hạn tế bào phôi Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với nhân từ mô phân sinh, tốc độ nhân giống chỉ là một ưu thế mà quá trình phát sinh phôi hơn các phương pháp nhân giống vô tính khác

Phôi soma khác với hệ thống sinh sản hữu tính do không thông qua sự trao đổi chéo và tái tổ hợp Vậy phôi dinh dưỡng tiêu biểu cho một hệ thống nhân giống vô tính, duy trì đặc tính di truyền của cây mẹ, và đột biến sinh ra là do đột biến trong quá trình nuôi cấy in vitro Cây tái sinh từ phôi có đột biến thấp hơn tái sinh từ cơ quan

Phôi soma thường được nhân giống trong môi trường lỏng để tạo sự đồng nhất tế bào , trong môi trường nuôi cấy có chất sinh trưởng ABA để kích thích phôi soma trưởng thành đồng nhất ngăn chặn sự hình thành mầm và cụm phôi

e Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma :

Môi trường để cho phôi tái sinh có nồng độ chất sinh trưởng thấp hơn hoặc không có so với môi trường nhân sinh khối Nuôi cấy trên môi trường có auxin trong thời gian kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sự tái sinh mô phân sinh của phôi Do đó nuôi cấy có auxin trong một thời gian ngắn sau đó phải tách hay giảm nồng độ ở mức thấp nhất của auxin ra khỏi hệ thống nuôi cấy

Khi phôi chuyển qua giai đoạn tái sinh phân hóa mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh cần làm khô phôi Trong thời gian này, hàm lượng đường cao trong môi trường nuôi cấy phôi cần thiết cho sự phát sinh và hình thành phôi

2.4.2 Nuôi cấy gián tiếp :

a Tạo nguyên liệu ban đầu :

Các đoạn chồi mọc thẳng dài 2 -3cm , được cắt bỏ lá , rửa sạch bằng xà phòng , sau đó rửa bằng cồn 70% trong 30giây – 1 phút , rửa sạch cồn bằng nước

cất vô trùng 3 lần , rồi vô trùng bằng Ca-hypoclorite 10% trong 10 – 15 phút Mẫu được cắt thành từng đoạn có đốt thân và cấy vào môi trường mọc chồi có chất sinh trưởng kích thích mọc chồi Sau một thời gian chồi ngủ phát triển , cấy truyền liên tục bằng phương pháp cắt đốt , cho vào môi trường không có chất sinh trưởng hoặc nồng độ thấp

b Tạo phôi :

Phôi là sản phảm của quá trình sinh sản hữu tính trong tự nhiên , nhưng phôi có thể hình thành từ các tế bào soma ( tế bào dinh dưỡng ) qua quá trình nuôi cấy in vitro, được gọi là phôi vô tính Phôi vô tính được tạo từ việc cắt thân ( đoạn thân không có chồi nách , chồi ngủ ) , lá ( cắt thành mẫu nhỏ , không có gân lá và cuống lá ) , rễ ( cắt thành từng đoạn khoảng 0,5 – 1 cm) đặt trên môi trường thạch Sau một thời gian , ở những vết cắt đó xuất hiện những đốm nhỏ , dính với nhau , đó là mô sẹo (cellus ) có các tính đặc trưng của phôi

c Môi trường và điều kiện nuôi cấy :

Môi trường gồm có môi trường cơ bản White , MS … , đường , vitamine , chất sinh trưởng tuỳ vào từng loại cây và từng giai đoạn nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng cũng giống như nuôi cấy trực tiếp

d Nhân phôi :

Các phôi đã được hình thành được chuyển qua môi trường nhân sinh khối Đó là môi trường bán rắn hoặc lỏng có chứa những chất cần thiết cho quá trình tăng sinh khối (chất vô cơ, vitamine, chất sinh trưởng …) Khi phôi đã tăng sinh khối được nhiều sẽ chuyển qua môi trường để tái sinh thành cây hoàn chỉnh

e Tái sinh :

Khi phôi đã phát triển trưởng thành (rễ và lá sò) thì chuyển qua môi trường tái sinh không có hoặc ít chất sinh trưởng Qua một thời gian, tuỳ theo loài thì cây lớn đến một chiều cao nhất định thì có thể chuyển ra vườn ươm

3 ĐIỀU KIỆN VÀ MÔI TRƯỜNG TRONG NUÔI CẤY MÔ:

3.1 Môi trường nuôi cấy :

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thự vật thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy Môi trường còn thay đổi tuỳ theo sự phân hoá của mô cấy Tuy vậy , tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm 5 thành phần :

- Đường làm nguồn carbon

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Các chất sinh trưởng

Ngoài ra còn có thể cho thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định (EDTA, acid amin…) hoặc không xác định( nước dừa , dịch chiết…)

a Đường :

Đường cung cấp cho mô nguồn carbon chính chứ không phải do quá trình quang hợp của mô Hai dạng đường thường sử dụng nhất là saccharose và glucose, nhưng hiên nay saccharose được sử dụng rộng rãi hơn

b Các muối khoáng đa lượng:

Nhu cầu muối khoáng của mô cũng không khác gì thực vật trong tự nhiên , cũng cần phải cung cấp cho mô nitrogen, kali, calci, magie, sắt, phospho

Nguồn nitrogen được cung cấp dưới dạng muối như calci nitrate Ca(NO3)2 4H2O, kali nitrate KNO3, natri nitrate NaNO3, amon nitrate NH4NO3

Nguồn phospho thường dùng ở dạng KH2PO4 và NaH3PO4.7H2O

Nguồn kali được cung cấp dưới dạng KNO3 , KCl, KH2PO4

Calci được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2 4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.4H2O Magie được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O

Trước đây người ta thường dùng sắt ở dạng clorua sắt , sulfuate sắt , citrate sắt , nhưng hiện nay người ta dùng ở dạng chelate kết hợp với Na2 – Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA) vì nó không bị kết tủa

c Các muối khoáng vi lượng :

Các loại khoáng vi lượng thông dụng:

Riboflavine (vitamin B12) 1 – 5

Các vitamin dễ hỏng do nhiễm nấm khuẩn nên phải bảo quản lạnh dưới 5oC

e Các chất sinh trưởng:

Thường được pha cao hơn dung dich làm việc 1000 lần Bảo quả dung dịch mẹ

đối bền nên có thể để trong 1 năm BA, 2ip, IBA, GA3 chỉ bảo quản được trong

2-3 tháng Còn IAA thì cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính

Tên chất sinh trưởng Nồng độ(mg/l)

• Dịch chiết nấm men:

Là dung dịch thuỷ phân casein , thành phần hoá học chưa được rõ, cung cấp một số acid amin, thường dùng 1g/1lit môi trường

3.2 Điều kiện nuôi cấy :

a Ánh sáng :

Trong nuôi cấy mô thực vật, ánh sáng không cần thiết vì mô được cung cấp carbon từ đường nên không cần phải quang hợp Nhưng ánh sáng cần cho phản ứng tạo hình của cây nuôi cấy

Mỗi loài cây cần thời gian chiếu sáng và cường độ chiếu sáng khác nhau Thường là 16 – 18 giờ một ngày, và cường độ chiếu sáng 1000 – 3000 lux

b Nhiệt độ:

Nhiều loại cây trồng có nhiệt độ nuôi cấy khác nhau, nhưng thường ở khoảng

22 – 26oC

c Các yếu tố khác:

- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong nuôi cấy : điều này quan trọng vì nếu để tạp nhiễm thì cây nuôi cấy mô không phát triển được và lụi dần.Môi trường nuôi cấy cũng là môi trường thích hợp cho các loại vi khuẩn , nấm mốc phát triển nên cần phải vô trùng môi trường nuôi cấy , các dụng cụ dùng trong nuôi cấy

- Thời gian các lần cấy truyền cũng cần quan tâm , nếu cấy truyền chậm quá thì cây có thể bị tàn hoặc chết không phục hồi được Thời gian giữa 2 lần cấy truyền thường là 20 – 30 ngày

4 VAI TRÒ CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG :

Các chất điều hoà sinh trưởng được tìm thấy trong thực vật được gọi là những chất sinh trưởng Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberellin, ethylene, acid abscisic (ABA), acid salixylic (SA) … Chất điều hoà sinh trưởng là chất có tác động kích thích hay kìm hãm một quá trình phát triển của thực vật với một nồng độ cực kỳ nhỏ Chúng tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên những chức năng của DNA, RNA, ảnh hưởng lớn đến những quá trình sống chủ yếu như sự tổng hợp các enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp, ….trong cây luôn có cùng lúc các cặp chất sinh trưởng , chất này kích thích , chất kia kìm hãm , tuỳ vào giai đoạn phát triển thích hợp

4.1 Auxin :

Năm 1880, Darwin phát hiện ra rằng bao lá mầm cây họ lúa rất nhạy cảm với ánh sáng , nếu chiếu sáng một chiều thì cây quang hợp hướng vế phía ánh sáng, nếu che tối hay cắt bỏ ngọn thì không xảy ra hiện tượng như vậy, ông cho rằng

ngọn có một chất gì đó làm cho cây hướng sáng Năm 1928, Went đã làm một thí nghiệm chứng minh có một chất kích thích cây hướng động, và cũng cho rằng có một chất nào đó trong bao lá mầm gây nên sự hướng động , ông gọi chất đó là chất sinh trưởng Ngày nay được gọi là auxin

Auxin tự nhiên trong cây có tên gọi là β - indolacetic acid (IAA), công thức là

C10H9O2N Ngoài ra nhóm auxin còn bao gồm những chất tương tự có tác động giống IAA và được tổng hợp bằng hóa học, như indol butyric acid (IBA), napthen acetic acid (NAA), napthen oxy acid(NOA), 2,45T Các chất này có tác động giống IAA nhưng không tác động giúp cây sản sinh ra IAA

Auxin thường tập trung ở đỉnh sinh trưởng, các mô non, đặc biệt là lá non và vùng đỉnh chồi, từ những phần này auxin được chuyển xuống các phần dưới của cây Auxin tạo ra tính hướng quang, tạo ưu thế ngọn, ức chế chồi bên, làm phát triển rễ thứ cấp

Auxin có các tác dụng sau:

- Kích thích sinh trưởng ở tế bào

- Kéo dài tế bào

- Kích thích sự phát triển của rễ

- Tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy

- Tăng hoạt tính enzyme

- Aûnh hưởng đến trao đổi chất của nitơ

- Tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong tế bào

4.2 Cytokinin :

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, gồm các chất như : kinetin( được phát hiện đầu tiên trong dịch thuỷ phân của nấm men ), zeatin ( là những cytokinin tự nhiên, benzyl adenine ( BA ), pyranul benzyl adenin (PBA) ) Cytokinin được tổng hợp ở rễ và hạt đang phát triển, việc vận chuyển cytokinin trong cây chưa được rõ

Các tác dụng của cytokinin: