Nghiên cứu thành phần nuôi cấy sinh khối nấm cordyceps chủng DI0077

Mẫu IUH1521 BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN NUỐI CẤY SINH KHỐI NẤM Cordyceps CHỦNG DL0077 Mã số đề tài 171 4280 Chủ nhiệm đề tài TRƯƠNG KIỀU HOA Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh, ngày 2 tháng 4 năm 2018 1 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, chúng em xin chân thành cảm ơn B.

Mẫu IUH1521 BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN NUỐI CẤY SINH KHỐI NẤM Cordyceps CHỦNG DL0077 Mã số đề tài: 171.4280 Chủ nhiệm đề tài: TRƯƠNG KIỀU HOA Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, chúng em xin chân thành cảm ơn BGH Trường Đại học Cơng nghiệp TP.HCM giúp chúng em có hội tham gia nghiên cứu tiếp cận với thực tế, có hội hợp tác chun mơn với ngành nghề để nâng cao trình độ nghiên cứu kiến thức chuyên môn Chúng em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đàm Sao Mai, Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm nhiệt tình hỗ trợ tạo điều kiện tối đa trình đăng ký thực đề tài Chúng em xin cảm ơn đến thầy Lâm Khắc Kỷ, thầy Đinh Minh Hiệp tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu để chúng em thực tốt đề tài Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn tất quý thầy cô tham gia giảng dạy Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm- môn Công nghệ Sinh học giúp chúng em trau dồi kiến thức q trình học tập trường PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần nuối cấy sinh khối nấm Cordyceps chủng DL0077 1.2 Mã số: 171.4280 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Trương Kiều Hoa ĐH Công nghiệp TPHCM Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Huỳnh Tố Như ĐH Công nghiệp TPHCM Thư ký Nguyễn Thị Mỹ Nhân ĐH Công nghiệp TPHCM Thành viên Nguyễn Thị Ngọc Linh ĐH Công nghiệp TPHCM Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 10 năm 2017 1.5.2 Gia hạn (nếu có): 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 10 năm 2017 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: Năm triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Nấm Cordyceps – loại nấm kí sinh trùng, biết đến loại dược liệu quý y học cổ truyền Lồi nấm chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao mà nghiên cứu giới chứng minh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe người Tuy nhiên, nước ta việc nghiên cứu nhóm nấm chưa đầu tư nuôi trồng nghiên cứu Dựa sưu tập nhóm nghiên cứu gồm TS Trương Bình Nguyên TS Đinh Minh Hiệp với mẫu nấm kí sinh trùng thuộc chi Cordyceps Langbiang-Lâm Đồng, nhóm em chọn chủng Cordyceps sp để khảo sát số thành phần môi trường nuôi cấy sinh khối nấm nhằm tìm mơi trường ni cấy giống nấm phát triển tốt mặt sinh khối nâng cao hàm lượng số hoạt chất Đề tài “Nghiên cứu thành phần nuôi cấy sinh khối nấm Cordyceps chủng DL0077” tiền đề cho nghiên cứu việc sử dụng chúng nguồn dược liệu quý nước cho công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng Mục tiêu a) Mục đích: Xác định thành phần ni cấy sinh khối nấm Cordyceps sp từ xác định thành phần mơi trường ni cấy thích hợp qui trình ni cấy thu nhận sinh khối nấm tốt nhất, tạo tiền đề cho nghiên cứu đánh giá sử dụng hoạt tính sinh học chúng nghiên cứu b) Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng Cordyceps sp - Xác định nguồn carbon lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh - Xác định nguồn nitrogen lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh - Xác định nguồn khoáng lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh 3 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng chủng Cordyceps sp Chủng nấm nuôi phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh với điều kiện môi trường, nhiệt độ, độ ẩm Tiến hành nuôi cấy sinh khối hộp nhựa 500 ml, chứa 200 ml môi trường PG, khoảng thời gian lấy mẫu cách tuần Theo dõi tăng trưởng chủng nấm thu sinh khối chúng sau tuần 1,2,3 … tới đưa đường cong tăng trưởng cho chủng nấm 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen khoáng lên phát triển Cordyceps sp môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh 3.2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon: Glucose, Saccharose, Lactose, Manitol, Mantose - MT thí nghiệm : -200g/l khoai tây xắt lát luộc 1000ml nước cất, lấy dịch chiết -20g/l carbohydrate Các lơ thí nghiệm bố trí sau: Bảng 3.1 Khảo sát tốc độ tăng trưởng nấm mơi trường có nguồn carbon khác Nguồn TN Carbon Glucose Maltose Saccharose Mannitol Lactose Tuần Ghi nhận, cân khối lượng đưa nhận định chủng nấm mọc nhanh môi trường với nguồn carbon xác định ngày thu sinh khối 3.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen: Peptone, Yeast Extract, Natri nitrate, Amoni nitrate, Ure MT thí nghiệm : -200g khoai tây xắt lát luộc 1000ml nước cất,lấy dịch chiết -20g carbohydrate lựa chọn, bổ sung 10 g/l lơ có nguồn nitrogen khác Các lơ thí nghiệm bố trí sau: Bảng 3.2 Khảo sát tốc độ tăng trưởng nấm nguồn nitrogen khác Nguồn TN Nitrogen Yeast Extract Pepton NaNO3 Ure NH4NO3 Tuần Ghi nhận đưa nhận định chủng nấm mọc nhanh môi trường với nguồn nitrogen ý số liệu ngày thu sinh khối, cân nặng sinh khối 3.3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen, khoáng: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaCl2 MT thí nghiệm : -200g khoai tây xắt lát luộc 1000ml nước cất,lấy dịch chiết -20g/l carbohydrate lựa chọn, 10 g/l có nguồn nitrogen lựa chọn - Bổ sung nguồn khống khác Các lơ thí nghiệm bố trí sau: Bảng 3.3 Khảo sát tốc độ tăng trưởng nấm mơi trường có nguồn khoáng khác Nguồn Tuần TN khoáng KH2PO4 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 Ghi nhận đưa nhận định chủng nấm mọc nhanh môi trường với nguồn khoáng ý số liệu ngày thu sinh khối, cân nặng sinh khối khô Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng chủng Cordyceps sp Tuần SK khô (g) 0.2386 ±0.045 0.4425 ±0.043 0.9227 ±0.176 1.0448 ±0.072 1.0526 ±0.059 0.7805 ±0.008 0.6222 ±0.186 0.5032 ±0.031 Bảng 4.1 Sinh khối Cordyces sp thu nhận phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh môi trường PG (Potato + Glucose) Biểu đồ 4.1 biểu đồ thể sinh khối khô Cordyceps sp môi trường PG 4.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nitrogen khoáng lên phát triển Cordyceps sp môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh 4.2.1 Khảo sát tốc độ tăng trưởng nấm môi trường có nguồn carbon khác Tuần PG PS PMn PL PMt 0.2386 ±0.045 0.5045 ±0.009 0.3592 ±0.071 0.0733 ±0.023 0.1403 ±0.053 0.4425 ±0.043) 1.0167 ±0.049 0.4425 ±0.022 0.0997 ±0.074 0.3632 ±0.028 0.9227 ±0.176 1.2610 ±0.065 0.7998 ±0.048 0.2725 ±0.039 0.6778 ±0.150 1.0448 ±0.072 1.5033 ±0.074 0.9506 ±0.147 0.7875 ±0.134 0.7646 ±0.087 1.0526 ±0.059 1.3874 ±0.156 1.3909 ±0.478 0.4013 ±0.015 0.6829 ±0.080 0.7805 ±0.008 1.2862 ±0.086 1.1739 ±0.162 0.3860 ±0.031 0.6311 ±0.138 0.6222 ±0.186 1.0941 ±0.053 1.0616 ±0.090 0.3896 ±0.035 0.6166 ±0.086 0.5032 ±0.031 1.1659 ±0.005 1.1637 ±0.090 0.2976 ±0.019 0.6035 ±0.078 Bảng 4.7 Sinh khối khô Cordyceps sp nguồn carbon khác Sau thí nghiệm nhận thấy khối lượng nấm lô PS cao Trong lơ có nguồn carbon khác nhau, lơ PS lơ PMn cho kết cao lơ cịn lại ta tiến hành sàng lọc kết chương trình IBM SPSS Statistics 20 hàm Anova one way Kết thu sinh khối nấm Cordyceps sp cao môi trường chứa 200g potato, 20g saccharose tuần thứ 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitrogen lên phát triển hệ sợi nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh Tuần 0.7678 ±0.041 0.6795 P.S.PEP (g) ±0.075 0.5 P.S.NaNO3 (g) ±0.049 P.S.YE (g) 1.6167 ±0.015 1.6066 ±0.073 0.701 ±0.033 2.0335 ±0.170 1.7724 ±0.090 1.1869 ±0.065 1.8019 ±0.055 1.1211 ±0.128 1.2569 ±0.065 1.4845 ±0.172 0.7232 ±0.023 1.0368 ±0.003 0.6044 ±0.164 0.6501 ±0.036 0.8797 ±0.097 0.5611 ±0.096) 0.5156 ±0.065 0.9476 ±0.069 0.5285 ±0.029 0.6386 ±0.047 0.9765 ±0.019 P.S.Ure (g) 0 0 0 0 P.S.NH4NO3 (g) 0.2431 ±0.07 0.378 ±0.041 0.4649 ±0.017 0.429 ±0.084 0.4562 ±0.148 0.2295 ±0.056 0.1591 ±0.296 0.1987 ±0.637 Bảng 4.12 Sinh khối khơ Cordyceps sp mơi trường có nguồn nitrogen khác Sau thí nghiệm nhận thấy khối lượng khô nấm lô P.S.YE cao Trong lơ có nguồn nitrogen khác nhau, lơ P.S.YE lơ P.S.PEP cho kết cao lơ cịn lại ta tiến hành sàng lọc kết chương trình IBM SPSS Statistics 20 hàm Anova one way Kết thu sinh khối nấm Cordyceps sp cao môi trường chứa 200g potato, 20g saccharose, 10g Yeast extract tuần thứ 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn khoáng lên phát triển hệ sợi nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh Tuần KH2PO4 0.8678 ±0.042 1.7759 ±0.017 2.2866 ±0.113 1.9830 ±0.018 1.6357 ±0.137 0.6643 ±0.121 0.6175 ±0.017 0.5787 ±0.025 K2HPO4 0.7674 ±0.017 1.6904 ±0.027 2.1935 ±0.122 1.6906 ±0.521 1.4878 ±0.128 0.8098 ±0.153 0.6105 ±0.027 0.5440 ±0.062 CaCl2 0.7989 ±0.012 1.7183 ±0.022 2.1623 ± 0.046 1.9267 ±0.016 1.5795 ± 0.083 0.6406 ±0.041 0.5949 ±0.005 0.5492 ±0.043 MgSO4 0.8 ±0.078 1.7287 ±0.029 2.1673 ±0.037 1.9309 ±0.027 1.5835 ±0.082 1.5269 ±0.019 0.6038 ±0.070 0.5644 ±0.022 Bảng 4.17 Sinh khối khô Cordyceps sp thu nhận phương pháp ni cấy lỏng tĩnh mơi trường có nguồn khống khác tuần Sau thí nghiệm nhận thấy khối lượng khô nấm lô PS.YE.KH2PO4 cao Trong lơ có nguồn khống khác nhau, lơ có khối lượng khác gần ta tiến hành sàng lọc kết chương trình IBM SPSS Statistics 2.0 hàm Anova one way Kết thu sinh khối nấm Cordyceps sp cao môi trường chứa 200g potatos, 20g sacharse, 10g cao nấm men,1g KH2PO4 tuần thứ Đánh giá kết đạt kết luận Đã hoàn thành 5/5 nhiệm vụ Sau thí nghiệm ta lựa chọn thành phần nuôi cấy sinh khối nấm Cordyceps sp : 200g potatos, 20g Saccharose, 10 g cao nấm men, 1g KH2P04 thu tuần thứ Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) TĨM TẮT Nấm Cordyceps- loại nấm kí sinh trùng, biết đến loại dược liệu quý y học cổ truyền.Tại Việt Nam, có nhiều nhóm nghiên cứu phân lập số chủng nấm vùng cao nguyên, có chủng Cordyceps sp Ts Trương Bình Nguyên Đinh Minh Hiệp tìm thấy Langbiang, Lâm Đồng Việc để thu nhận sinh khối cao nguồn dược liệu quý nước để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng ( có tính kháng oxi hố kháng viêm cao) điều kiện ni cấy nhân tạo để chủ động cho nguồn nghiên cứu sản xuất quan trọng cần thiết Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân tích khảo sát số thành phần môi trường sinh khối nấm nhằm tìm cơng thức mơi trường ni tốt Sinh khối nấm thu phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh loại môi trường khác kết hợp với sàng lọc phần mềm tin-sinh IBM SPSS Statistics 2.0 hàm Anova one way để lựa chọn môi trường nuôi cấy tốt Kết thu 200g khoai tây, 20g saccharose, 10g Yeast extract, 1g K2HPO4 ABSTRACT Cordyceps fungus - a parasitic fungus on insects, is known as a preciousmedicine in traditional medicine In Vietnam, some strains of Cordyceps sp are found in Langbiang, Lam Dong by Truong Binh Nguyen and Dinh Minh Hiep How to obtain the highest biomass of domestic precious source of medicine in the country to protect public health (high antioxidant and anti-inflammatory) in artificial conditions to take the initiative in research sourse as well as production is very important and necessary In this study we analyse and survey some of the culture medium of fungal biomass in order to find the best culture Mushroom biomass was obtained by static liquid culture on different types of cultureand culture conditions combined with screening by software-biology to select the best culture Mushroom biomass obtained by static liquid culture on other types of media combined with screening using IBM SPSS Statistics 2.0 software with Anova one way function to select the best culture environment Results obtained 200g potatoes, 20g saccharose, 10g Yeast extract, 1g K2HPO4 III Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu ( sản phẩm dạng 1,2,3) TT Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Sinh khối nấm Cordyceps sp sau nuôi trồng điều kiện nuôi cấy lỏng tĩnh Đạt Xác định thành phần môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh cho chủng Cordyceps sp Xác định thành phần carbon, nitrogen, khống cho mơi trường ni cấy chủng Cordyceps sp … 3.2 Kết đào tạo TT Họ tên Thời gian thực đề tài Tên đề tài Tên chuyên đề NCS Tên luận văn Cao học Đã bảo vệ Nghiên cứu sinh Học viên cao học Sinh viên Đại học IV Tình hình sử dụng kinh phí T T A B Nội dung chi Chi phí trực tiếp Thuê khốn chun mơn Ngun, nhiên vật liệu, Thiết bị, dụng cụ Cơng tác phí Dịch vụ th ngồi Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu kỳ In ấn, Văn phịng phẩm Chi phí khác Chi phí gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nước Tổng số Kinh phí duyệt (triệu đồng) Kinh phí thực (triệu đồng) 5.000.000 5.000.000 Ghi Đặt vấn đề Nấm Cordyceps – loại nấm kí sinh côn trùng, biết đến loại dược liệu quý y học cổ truyền Loài nấm chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao mà nghiên cứu giới chứng minh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe người Tuy nhiên, nước ta việc nghiên cứu nhóm nấm chưa đầu tư ni trồng nghiên cứu Dựa sưu tập nhóm nghiên cứu gồm TS Trương Bình Ngun TS Đinh Minh Hiệp với mẫu nấm kí sinh trùng thuộc chi Cordyceps Langbiang-Lâm Đồng, nhóm em chọn chủng Cordyceps sp để khảo sát số thành phần mơi trường ni cấy sinh khối nấm nhằm tìm môi trường nuôi cấy giống nấm phát triển tốt mặt sinh khối nâng cao hàm lượng số hoạt chất Đề tài “Nghiên cứu thành phần nuôi cấy sinh khối nấm Cordyceps chủng DL0077” tiền đề cho nghiên cứu việc sử dụng chúng nguồn dược liệu quý nước cho công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng Sự thành công đề tài khẳng định thương hiệu tập thể nhà trường nguồn động lực giúp sinh viên trường tiếp tục tham gia nghiên cứu, quảng bá hình ảnh giáo dục đào tạo chất lượng cao nhà trường, không ngừng nâng cao trình độ kiến thức chun mơn, tiếp cận nghiên cứu ứng dụng thực tế phục vụ cộng đồng theo kịp trào lưu nghiên cứu chung khu vực giới 15 1.1 Tổng quan Cordyceps 1.1.1 Giới thiệu chung Cordyceps Cordyceps danh pháp khoa học chi nấm túi (Ascomycota) Chi nấm Cordyceps xác lập Frank Link vào năm 1833, với khoảng 150 loài; có 450 lồi phát khắp giới [9] Tuy nhiên, nước ta thành phần lồi chi nấm chưa tìm hiểu trừ cơng bố nhóm nghiên cứu Hàn Quốc việc phát bốn loài thuộc chi Cordyceps vườn quốc gia Cúc Phương năm 2005 bao gồm loài Cordyceps nutans, C pruinosa, C sphecocephala C sp [10] Theo hệ thống phân loại cổ điển chi nấm Cordyceps thuộc: điển chi nấm Cordyceps thuộc: Ngành (phylum): Ascomycota Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina Lớp (class): Sordariomycetes Bộ (odor): Hypocreales Họ (familia): Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Khi nấm Cordyceps công vật chủ, hệ sợi nấm xâm chiếm cuối thay mô vật chủ, thể thuôn dài (chất bao gồm nhiều sợi nấm sinh sản vơ tính) có dạng hình trụ, phân cành hình dạng phức tạp Chất mang nhiều thể túi nhỏ hình bình thót cổ, có chứa nhiều nang Các nang nấm chứa bào tử nang dạng sợi chỉ, thơng thường vỡ thành mảnh có lẽ thể lây nhiễm Một vài lồi Cordyceps có khả tác động tới hành vi côn trùng vật chủ Chẳng hạn, Cordyceps unilateralis làm cho kiến phải leo lên gắn vào trước chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ thể mọc từ thể côn trùng chết.[19] Chi có phân bố rộng khắp giới phần lớn số khoảng 400 [20] loài sinh sống chủ yếu châu Á (đáng ý Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam Thái Lan) Chúng phát triển tốt khu rừng ôn đới nhiệt đới ẩm ướt Chúng có nhiều trạng thái sinh sản vơ tính, Beauveria (có lẽ gộp Beauveria 16 bassiana, Metarhizium Isaria) biết đến nhiều nhất, dạng sử dụng kiểm soát sinh học dịch hại trùng Một vài lồi chi Cordyceps có chứa hoạt chất sinh học [21] dược học thú vị cordycepin; dạng sinh sản vơ tính Cordyceps subsessilis (Tolypocladium inflatum) nguồn cyclosporin loại dược chất hữu ích cấy ghép phận thể người, kìm hãm hệ miễn dịch (thuốc ngăn chặn miễn dịch).[22] 1.1.2 Thành phần hóa học có sinh khối nấm Cordyceps 1.1.2.1 Thành phần hóa học Nấm Cordyceps chứa thành phần hóa học chủ yếu protein, acid béo, vitamin, khoáng chất, cordycepin, cordycepic acid polysaccharide Theo nghiên cứu thành phần hóa học thể nấm C.Militaris cho thấy loài nấm chứa thành phần protein chiếm 40,69%; loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al., 2007) Còn theo kết nghiên cứu Huyn Hur cho thấy amino acid tổng thể (69,32 mg/g) cao so với sinh khối nấm (the corpus) Khối lượng loại amino acid có thể sinh khối nấm dao dộng khoảng từ 1,15 đến 15,06 mg/g từ 0,36 đến 2,99 mg/g Các amino acid có nồng độ 5,00 mg/g thể lysine (15.06 mg/g), glutamic acid (8.79 mg/g), prolin (6.68 mg/g), threonine (5.99 mg/g), arginine (5.29 mg/g), and alanine (5.18 mg/g); thể nấm C.Militaris giàu acid béo khơng bao hịa (chiếm khoảng 70% lượng acid béo tổng); Adenosine chiếm 0,18% thể 0,06% sinh khối nấm; Cordycepin chiếm 0,97% thể nấm 0,36% sinh khối nấm 1.1.2.2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học Cordyceps Cordycepin Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin purin alkaloid có dạng nucleosid adenosin bị oxy vị trí 3’ phần đường ribose Cordycepin phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) IR (infrared), cordycepin xem hợp chất có hoạt tính sinh học ly trích từ thể sợi nấm Cordycepin có cơng thức C10H13N5O3 có phân tử 17 lượng 251, điểm nóng chảy 230-231OC, độ hấp thu cực đại 259 nm Có thể hồ tan dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, khơng hồ tan benzen, ether hay chloroform, nhiều nghiên cứu sử dụng dung dịch muối khử trùng đệm phosphat làm dung mơi.[1] Vì cordycepin có cấu trúc tương tự adenosin nên RNA polymerase phân biệt Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin ngăn chặn trình kéo dài thêm RNA tạo phân tử RNA kết thúc sớm Do đó, cordycepin xem chất kháng ung thư hiệu [1] Năm 2003, Sun cs chứng minh hàm lượng cordycepin với hoạt tính kháng khối u Cordyceps kyushuensis cao Cordyceps sinensis Cordyceps militaris, Cordyceps nuôi cấy cao tự nhiên, sợi nấm cao ấu trùng chủ Tác giả khẳng định hợp chất có tiềm dược học cao Cordycepin có hoạt tính kháng ung thư hiệu thơng qua việc ức chế q trình methyl hóa acid nucleic polyadenin hóa Đồng dạng cordycepin 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thơng qua việc ức chế reverse transcriptase Tác giả chứng minh tiền chất cordycepin adenosin có hoạt tính kháng ung thư.[1] Polysaccharides Trong thành phần nấm Cordyceps polysaccharides hiểu hợp chất có hoạt tính sinh học Một số polysaccharides chất dẫn xuất dường khác acid cordycepic [d-mannito] nhận dạng báo cáo hoạt tính dược lý Nghiên cứu cho thấy polysaccharides có hiệu việc điều tiết đường máu, chống di hiệu chống ung thư tăng cường miễn dịch Protein hợp chất Nitragenous Cordyceps đông trùng hạ thảo chứa proteins, peptides tất acid amin thiết yếu khác, Cordyceps đông trùng hạ thảo chứa số dipeptide cyclic không phổ biến bao gồm cyclo -[Gly-Pro], cyclo – [Leu-Pro], cyclo -[Ala-Leu], cyclo – [Ala-Val] Cyclo – [Thr-Leu] Khối lượng nhỏ polyamines bao gồm 1,3 diamino propane, cadaverine, spermidine, spermine pustrescine nhận dạng Người ta nghi chúng có tác dụng kháng sinh.[5] Sterols Một số hợp chất loại sterol tìm thấy Cordyceps đơng trùng hạ thảo Một số chất ergosterol, Delta – ergosterol, ergosterol peroxide, daucosterol campasterol Chúng có liên quan tới sex-steroid chống rối loạn tình dục [5] 18 Nucleotid Nucleotid chất có nhiều Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích tín hiệu dẫn truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lượng guanosin thường cao Hàm lượng nucleotid Cordyceps nuôi cấy cao hẳn Cordyceps tự nhiên, điều liên quan đến hoạt động biến dưỡng nhanh q trình ni cấy Hàm lượng nucleotid tự nhiên thấp thối biến nucleotid q trình ủ đơng Khí hậu ấm ẩm ướt điều kiện làm tăng nucleotid Cordyceps Năm 2003, Sun cs nghiên cứu thấy có loại nucleosid nitrogen base có Cordyceps kyushuensis Năm 2010, xác định loại thymin, adenosin, adenin cordycepin có Cordyceps sinensis, nghiên cứu cho thấy hàm lượng nucleotid khác tùy theo vị trí phân lập.[23] Acid Cordyceptic Acid cordyceptic, isomer acid quinic, nghiên cứu Cordyceps sinensis năm 1957 Cấu trúc tinh thể acid cordyceptic xác định D-mannitol Mannitol hợp chất sinh học có nhiều hoạt tính quan trọng kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho Chất tồn tự nhiên chủ yếu rễ, thân cây; tìm thấy nhiều nấm ăn, cà rốt rêu Hàm lượng acid cordyceptic Cordyceps khoảng 7-29% Mannitol có cấu tạo gồm alcohol đường, polyol; tương tự xylitol hay sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu hướng loại bỏ ion hydrogen nước làm dung dịch trở nên acid Cơng thức hóa học mannitol C6H14O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166C, tỷ trọng 1,489 (20C) nhiệt độ sơi 290-295C (467 kPa) Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng sử dụng y học thực phẩm, hàm lượng mannitol có thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm có hàm lượng acid cordyceptic cao so với thể.[24] Protein & acid amin Hàm lượng protein Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein tryptophan Các acid amin có hàm lượng cao glutamat, arginin acid aspartic có dược tính cao arginin, glutamat, tryptophan tyrosin [25] 19 Adenosine Ổn định huyết áp, hỗ trợ điều trị phòng tránh bệnh tim mạch: Theo chuyên gia, Adenosine có mặt tế bào thể người đồng thời tham gia vào hoạt động sống Hoạt chất tham gia vào q trình điều hịa nhịp tim, khắc phục tượng loạn chậm nhịp tim, cải thiện hệ tuần hoàn ngoại biên tim mạch, tăng lượng oxy máu Bên cạnh đó, adenosine ghi nhận với khả ức chế hoạt động ngưng trệ tiểu cầu mức, đồng thời hạn chế tình trạng mắc phịng chống bệnh mạch máu như: nhồi máu tim, tắc mạch máu não, máu lưu thơng …[23] Duy trì q trình tuần hồn, tăng cường oxy máu: Adenosin có Đông trùng hạ thảo giúp gia tăng lượng oxy máu, hỗ trợ giãn nở mạch máu, cung cấp dưỡng khí cho tuần hồn máu thể Cải thiện sức khỏe: Adenosine thành phần khác đơng trùng hạ thảo có khả cung cấp lượng chất dinh dinh dưỡng cần thiết giúp trì hoạt động sống thể đồng thời hồi phục sức khỏe người ốm, thể suy nhược [27] Cải thiện khả sinh lí: Adenosine có tác dụng tích cực việc cải thiện tuần hoàn vi lưu lượng máu cục thận, bên cạnh đó, hoạt chất điều tiết hàm lượng prostaglandin thận nội tiết tố, tổ chức thần kinh chức sinh dục Ổn định thần kinh: Hoạt chất giúp ổn định tinh thần, giải tỏa căng thẳng, mệt mỏi, giảm bớt tình trạng đau đầu, chóng mặt, hỗ trợ hoạt động hệ thần kinh Bên cạnh đó, Adenosine giúp điều tiết q trình sinh hóa giấc ngủ, giúp có giấc ngủ sâu, ổn định thông qua tác dụng ổn định chống thiếu dưỡng khí Theo số kết nghiên cứu giới, Adenosine ghi nhận với tác dụng giảm kích thích thần kinh, hoạt chất có nồng độ thấp bất thường bệnh nhân bị động kinh đồng thời làm giảm co giật bệnh thí nghiệm chuột.[26] Hoạt chất adenosine đông trùng hạ thảo ghi nhận với hàm lượng cao Bởi vậy, việc sử dụng đông trùng hạ thảo giúp thể hấp thụ dưỡng chất đồng thời thu nhận giá trị tích cực adenosine với sức khỏe người.[28] Các thành phần cấu tạo khác Hai mươi tám acids béo bão hòa hay chưa bão hòa chất dẫn xuất chúng tách chiết từ C.sinensis Hợp chất phân cực chiết xuất Cordyceps - đông trùng 20 hạ thảo bao gồm nhiều hợp chất hydrocarbons, alcohols aldehydes Đặc biệt thú vị chuỗi hydrocarbon aromatic polycylic PAH sản xuất Cordyceps sinensis chất chuyển hóa thứ cấp Các nghiên cứu y học dược học chứng minh tác dụng Cordyceps: - Làm hạ huyết áp người cao huyết áp.[29] - Chống lại tượng thiếu máu tim.[30] - Tan huyết khối - Tăng cường lực thực bào tế bào miễn dịch.[31] - Nâng cao lực chống ung thư thể.[33] - Kháng viêm tiêu viêm.[34] - Có tác dụng cường dương chống liệt dương.[30] Các thành phần hoạt tính nấm chịu trách nhiệm cho việc đưa khả chống ung thư lentinan, krestin, hispolon, lectin, Calcaelin, illudin S, psilocybin, Hericium polysaccharide A and B (HPA HPB), axit ganoderic, schizophyllan, laccase, vv Lentinan chứng minh có khả kích thích tế bào hệ miễn dịch (như tế bào lympho máu ngoại vi) làm tăng sức đề kháng Nó kích thích “tế bào sát thủ tự nhiên” thể để chúng công tế bào ung thư Một nghiên cứu Nhật cho thấy, bệnh nhân ung thư hóa trị dùng thêm Lentinan hiệu hóa trị tăng lên, khả sống sót cao tiến triển ung thư bị kìm hãm Lentinan cịn có khả giúp người bị lao phổi chống lại độc tố vi khuẩn lao Nếu sử dụng Lentinan g/ngày, tuần lần tỷ lệ opsonin máu cao, ngăn chặn hoàn toàn độc tố vi khuẩn lao thể Lectin loại protein khơng có nguồn gốc miễn dịch có khả liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà khơng thay đổi cấu trúc carbohydrate liên kết Lectin gắn kết với tế bào có glycoprotein glycolipid bề mặt 1.2 Chủng nghiên cứu Cordyceps sp (DL0077) Chủng Cordyceps sp thuộc sưu tập nhóm nghiên cứu gồm TS Trương Bình Nguyên TS Đinh Minh Hiệp với mẫu nấm kí sinh trùng thuộc chi Cordyceps Langbiang- Lâm Đồng.[35] Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên Nam Bộ, khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược” TS Trương Bình Nguyên ThS Đinh Minh Hiệp đồng chủ 21 nhiệm, Hội Sinh học TP.HCM làm quan chủ trì theo hợp đồng nghiên cứu khoa học số 320/HĐ-SKHCN ngày 29 tháng 12 năm 2010 Hình Hình thái Cordyceps sp (DL0077) 1.3 Các nghiên cứu Cordyceps sp Việt Nam Vừa qua, lần Việt Nam, Giáo sư, Tiến sĩ khoa học, Viện sĩ Hoa Kỳ Đái Duy Ban nhà khoa học uy tín cơng ty Daibio tìm nhân ni thành công đông trùng hạ thảo Việt Nam để phát triển thành Đông Trùng Hạ Thảo Daibio Trang thông tin Y Học Bộ Y tế giới thiệu vào tháng năm 2009 "Nghiên cứu phát loài đông trùng hạ thảo (ĐTHT) Isaria cerambycidae N.SP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học đông trùng hạ thảo" GS Đái Duy Ban cộng Nhà xuất Y Học phát hành sách "Đông Trùng Hạ Thảo" GS VS TSKH Đái Duy Ban chủ biên lĩnh vực này.[5] Có 400 phân lồi Cordyceps tìm thấy mơ tả, nhiên có khoảng 36 lồi ni trồng điều kiện nhân tạo để sản xuất thể.[36] Trong số lồi này, có lồi C militaris trồng quy mơ lớn có dược tính tốt có thời gian sản xuất ngắn.[37] NDĐT - Ngày 2-8, TP Hồ Chí Minh, nhóm nghiên cứu TS Trương Bình Ngun, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao (thuộc Trường ĐH Đà Lạt) đứng đầu, cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học “Sản xuất viên thực phẩm chức All&All từ chi nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis” “Nghiên cứu quy trình ni cấy sinh khối hệ sợi khảo sát số hoạt tính sinh học cao chiết từ sinh khối nấm đông trùng hạ thảo- Cordyceps sinensis” - Công trình nghiên 22 cứu nhóm nhà khoa học TS Trương Bình Nguyên, TS Đinh Minh Hiệp, PGS-TS Lê Huyền Ái Thúy thực Tại buổi nghiệm thu, Hội đồng khoa học thẩm định đánh giá cao cơng trình nhóm nghiên cứu Căn vào kết thu q trình ni trồng trình bày kèm theo bảng phân tích DNA thành phần lý hóa, Hội đồng khoa học xác định sản phẩm thu sinh khối ĐTHT nuôi trồng từ nguồn gen Cordyceps sinensis GSTS Nguyễn Minh Đức - Trưởng ban Nghiên cứu khoa học Thư viện, khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM, Chủ tịch Hội đồng khoa học - thay mặt hội đồng kết luận: “Cơng trình nghiên cứu đạt 82,7 điểm (trong cần 50 điểm đạt yêu cầu khẳng định nghiên cứu thành công), đủ điều kiện để cấp giấy chứng nhận cơng trình khoa học”.[7] 1.4 Tổng quan nuôi cấy Cordyceps 1.4.1 Các thành phần môi trường nuôi cấy sinh khối Cordyceps 1.4.1.1 Nguồn carbon Nấm Cordyceps sử dụng nguồn carbon để tổng hợp thành phần cấu trúc tế bào, trao đổi chất lượng tế bào thể Với loài nấm khác yêu cầu nguồn carbon khác cho q trình sống chúng chúng có đặc điểm hình thái, cấu tạo khác sử dụng nguồn carbon đa dạng, chủ yếu nấm cần nguồn carbon yếu tố bắt buộc Thử nghiệm nhiều nguồn carbon glucose, maltose, mannitol, saccharose, lactose, arabinose, xylose… nấm Cordyceps sử dụng nguồn carbon Tuy nhiên, tùy thuộc vào lồi Cordyceps mà thích hợp phát triển mạnh loại đường, loài Cordyceps sinensis phát triển tất nguồn carbon nêu phát triển tốt nguồn carbon saccharose.[4] Các loại polysaccharid cellulose, starch, glycogen nấm Cordyceps sử dụng thường thủy phân thành oligosaccharid maltose, saccharose, lactose có số lồi Cordyceps có khả sử dụng trực tiếp, điều tùy thuộc vào có mặt enzym cần thiết.[2] Theo kết nghiên cứu Yu - Xiang Gu cộng (2007) cho thấy sử dụng 4% đường glucose sinh khối nấm Cordyceps militaris tăng mạnh giảm nguồn đường bị cạn kiệt Nguồn carbon nguồn hỗ trợ cho sinh trưởng tế bào tốt so với nước chiết khoai tây (từ 20,4 ± 1,3g đến 29,6 ± 1,4g vào ngày thứ 5) Sự sinh trưởng tế bào cực đại sử dụng PS (20% nước chiết khoai tây có bổ sung 2% đường saccharose) Khi sử dụng PG (20% nước chiết khoai tây có bổ sung 2% đường glucose) 23 sinh khối thấp so với sử dụng PS, glucose nguồn carbon thích hợp cho tích lũy nucleoside base Các tác giả nhận thấy nồng độ glucose tăng từ 0,5 đến 6% sinh khối tăng từ 20,2 ± 1,5g đến 31,2 ± 1,4g Tuy nhiên, tăng nucleoside base khơng theo khuynh hướng đó, cụ thể adenosin, guanosin, cytidin, uracid đạt tối đa sử dụng 2% glucose.[2] 1.4.1.2 Nguồn Nitrogen Nấm Cordyceps sử dụng nitrogen tạo nên màng tế bào nấm, thành phần cấu trúc tế bào, thể Nấm sử dụng nguồn nitrogen khác nitrat, amon nitrogen hữu cơ, nguồn nitrogen thích hợp cho tất lồi nấm Do đó, việc chọn nguồn nitrogen thích hợp để đạt chất lượng sinh trưởng cao hệ sợi hình thành thể nấm.[3] Sự ảnh hưởng peptone, cao nấm men (yeast extract) kết hợp peptone cao nấm men nồng độ khác lên sinh trưởng nấm Cordyceps militaris không lớn Nhưng kết hợp 0.3% yeast extract, 0.3% peptone với nguồn carbon nấm Cordyceps militaris phát triển tốt.[2] Khi nguồn nitrogen sử dụng riêng lẻ xác định gần nồng độ tối ưu nguồn nitrogen cho phát triển nấm Khi dùng muối amon acid mạnh nồng độ tối ưu thường thấp nồng độ muối amon cao dẫn đến tình trạng ngộ độc giảm pH dung dịch.[1] Thông thường sợi nấm tập trung nguồn nitrogen hữu cao so với nguồn nitrogen vô Nguồn nitrogen hữu thích hợp amino acid (arginin, acid glutamic, glycin…) peptid, protein, ure Peptone hỗn hợp phức tạp peptide protein, chứa phần lớn vitamin tan nước nguồn nitrogen hữu ích sử dụng nuôi trồng số loại nấm đặc trưng.[8] 1.4.1.3 Nguồn khoáng Đối với Cordyceps, muối khoáng thành phần giúp tăng phát triển hệ sợi nấm, thường dùng để bổ sung thêm dinh dưỡng cho nấm Các loại khoáng thường sử dụng cho nấm như: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaSO4… Theo báo đọc “môi trường tối ưu cho phát triển nấm sản xuất exopolysaccharide” thu thập phương pháp tối ưu hóa Dưới 24 ảnh hưởng thành phần đến phát triển nấm C jiangxiensis JXPJ 0109 theo thứ tự chất men> tryptone> maltoza> CaCl2> glycerol> MgSO4> KH2PO4 nồng độ tối ưu chế phẩm 15g maltose, 10 g glycerol, 10 g tryptone, chiết xuất nấm men 10 g, g KH2PO4, 0,2 g MgSO4, 0,5 g CaCl2 lít nước cất, thứ tự tác động thành phần sản xuất exopolysaccharide chiết xuất từ nấm men> maltose > tryptone> glycerol> KH2PO4> CaCl2> MgSO4, tương ứng với nồng độ tối ưu môi trường sau: 20g maltose, g glycerol, g tryptone, 10 g chiết xuất nấm men, g KH2PO4, 0.5 g CaCl2 lít nước cất.[26] Sợi nấm C militaris nuôi cấy sử dụng kỹ thuật lên men lỏng thành phần môi trường ni cấy tối ưu hóa phương pháp thử trực giao Kết cho thấy kết hợp tối ưu cho phát triển nấm glucose 3%, peptone 3%, 0.1% MgSO4, 0.2% KH2PO4 Phương pháp đánh giá dinh dưỡng tổng hợp áp dụng cho việc đánh giá giá trị dinh dưỡng protein nấm nuôi trồng môi trường lỏng C militaris.[21] Môi trường tối ưu cho sản xuất polysaccharide C pruinosa (tinh bột khoai tây 2%, saccharose 2.5%, đậu nành 0.5%, chiết xuất thịt bò 1.0%, chiết xuất từ nấm men 0.1%, KCl 0.02%, K2HPO4 0.1% MgSO4.5H2O ± 05%.[31] 1.4.2 Phương pháp ni cấy Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy Cordyceps với loại loại có chứa thành phần dinh dưỡng nồng độ thành phần khác tuỳ vào mục đích ni cấy Các phương pháp ni cấy thường sử dụng là: Phương pháp nuôi cấy môi trường lỏng: sử dụng môi trường nuôi cấy trạng thái lỏng Dùng que cấy thẳng que cấy móc lấy giống cấp I môi trường đĩa thạch cho vào môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh lắc, nuôi ủ nhiệt độ, thời gian thích hợp Lưu ý kích thước, mật độ tơ miếng thạch chứa sợi nấm phải đồng bình ni cấy Phương pháp thường sử dụng để thu tơ nấm [30] 25 Hình C militaris (CGMCC2459) ni mơi trường lỏng.[31] Phương pháp nuôi cấy môi trường rắn: sử dụng môi trường nuôi cấy trạng thái rắn Giống dùng để cấy bào tử nấm, tai nấm tơ nấm Dùng que cấy dao cấy giống vào môi trường nuôi cấy, nuôi ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Phương pháp thường sử dụng để thu hoạch thể nấm Phương pháp nuôi cấy môi trường giá thể tổng hợp: thành phần ni cấy cơm, bột ngô [8], bột nhộng tằm, gạo lứt,… Cấy giống với lượng giống cho bình ni cấy, ni ủ nhiệt độ, thời gian ánh sáng thích hợp Ở giai đoạn đầu nên nuôi ủ điều kiện tối để tơ nấm mọc kín bình ni cấy Giai đoạn sau nên nuôi cấy điều kiện sáng để thu thể Hình C militaris mơi trường giá thể tổng hợp https://dinhduong.online/ Phương pháp nuôi cấy môi trường thân nhộng tằm: môi trường nuối cấy thân nhộng tằm nguyên Giống dạng dịch lỏng tiêm vào thân nhộng phun 26 bề mặt thân nhộng sau nhộng tằm đặt hộp ni cấy vơ trùng có phần đáy lót giấy lọc chất Sau ni ủ nhiệt độ, thời gian thích hợp Hình Cordyceps militaris ni cấy thân nhộng tầm [6] 1.5 Chọn lọc thành phần môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh ct IBM SPSS Statistics 20 Khảo sát năm nguồn carbon, năm nguồn nitrogen, bốn nguồn khoáng thành phần môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh chủng Cordyceps sp Khi nghiên cứu nguồn carbon sử dụng nguồn glucose, saccharose, manitol, maltose, lactose với khối lượng 20g/l Khi nghiên cứu nguồn nitrogen sử dụng nguồn cao nấm men, peptone, ure, natri nitrat, amoni nitrat với khối lượng 10g/l Khi nghiên cứu nguồn khoáng sử dụng nguồn KH2PO4, K2HPO4 với khối lượng 1g/l, nguồn CaSO4, MgSO4 với khối lượng 0,5g/l Mỗi công thức lặp lại ba lần Sàng lọc yếu tố có ý nghĩa phần mềm IBM SPSS Statistics 20 [33] SPSS chương trình sử dụng rộng rãi để phân tích thống kê khoa học xã hội Nó nhà nghiên cứu khoa học , nhà nghiên cứu thị trường , công ty khảo sát, phủ, nhà nghiên cứu giáo dục, tổ chức tiếp thị, khai thác liệu [34] nhiều ngành khác Sử dụng hàm Anova oneway chương trình cách hiệu để sàng lọc thơng số Nguồn carbon, nitrogen, khống sau ni trồng sàng lọc thí nghiệm để chọn yếu tố có ý nghĩa cho sinh khối nấm cao 27 Mục tiêu c) Mục đích: Xác định thành phần nuôi cấy sinh khối nấm Cordyceps sp từ xác định thành phần mơi trường ni cấy thích hợp qui trình ni cấy thu nhận sinh khối nấm tốt nhất, tạo tiền đề cho nghiên cứu đánh giá sử dụng hoạt tính sinh học chúng nghiên cứu d) Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng Cordyceps sp - Xác định nguồn carbon lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh - Xác định nguồn nitrogen lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh - Xác định nguồn khoáng lên phát triển nấm môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh 28 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp ni cấy Vì mục đích nghiên cứu xác định thành phần nuôi cấy nấm Cordyceps sp Bằng cách so sánh khối lượng nấm thu từ sau nuôi cấy nên định chọn phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh để ni cấy nấm Cordyceps sp Quy trình ni cấy nấm phương pháp lỏng tĩnh: Bước 1: Tạo giống gốc (giống cấp I) cấy nấm vào môi trường PGA (Potato + Glucose + Agar) ống thạch thạch đĩa thạch Cấy nấm vào môi trường ống thạch để lưu giữ giống, tiến hành cầy chuyền tháng lần.cấy nấm vào môi trường đĩa thạch để tạo giống cấy chuyền Tiến hành cấy chuyền tuần/lần Bước 2: Tạo giống cấp cấy nấm vào môi trường PG (200ml/bình) Ni ủ nhiệt độ 22C ngày Bước 3: Khảo sát nguồn Carbon Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi tiến hành môi trường dinh dưỡng có thành phần sau: + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) 20g/l Glucose + CT2: 200g/l khoai tây (dịch chiết) 20g/l Saccharose + CT3: 200g/l khoai tây (dịch chiết) 20g/l Maltose + CT4: 200g/l khoai tây (dịch chiết) 20g/l Manitose + CT5: 200g/l khoai tây (dịch chiết) 20g/l Lactose Thí nghiệm tiến hành cấy 5% giống vào môi trường Cho 200ml mơi trường có chứa giống vào 40 hộp thể tích 500ml, lặp lại lần, nuôi cấy 56 ngày Thu nấm lần lần cách ngày, cân nấm ghi chép lại khối lượng sinh khối tươi khô nấm Chọn nguồn carbon nấm phát triển tốt thời gian thu sinh khối cao chương trình IBM SPSS Statistics 20 hàm Anova one way Bước 4: Khảo sát nguồn nitrogen Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi tiến hành mơi trường dinh dưỡng có thành phần sau: + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) , 20g/l nguồn Carbon xác định, 10g/l Yeast extract + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) , 20g/l nguồn Carbon xác định, 10g/l Peptone + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) , 20g/l nguồn Carbon xác định, 10g/l Natri nitrate + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) , 20g/l nguồn Carbon xác định, 10g/l Amoni nitrate + CT1: 200g/l khoai tây (dịch chiết) , 20g/l nguồn Carbon xác định, 10g/l Ure 29 ... phần môi trường nuôi cấy sinh khối nấm nhằm tìm mơi trường ni cấy giống nấm phát triển tốt mặt sinh khối nâng cao hàm lượng số hoạt chất Đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần nuôi cấy sinh khối nấm Cordyceps. .. ni cấy Vì mục đích nghiên cứu xác định thành phần nuôi cấy nấm Cordyceps sp Bằng cách so sánh khối lượng nấm thu từ sau nuôi cấy nên định chọn phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh để ni cấy nấm Cordyceps. .. cho sinh khối nấm cao 27 Mục tiêu c) Mục đích: Xác định thành phần ni cấy sinh khối nấm Cordyceps sp từ xác định thành phần mơi trường ni cấy thích hợp qui trình ni cấy thu nhận sinh khối nấm