Có nhiều loại chế phẩm sinh họcđược phê duyệt để sử dụng tại Hoa Kỳ, bao gồm protein điều trị như filgrastim,monoclonal kháng thể như adalimumab và vắc-xin như phòng bệnh cúm và uốnván.B
QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG
Chế phẩm sinh học
Các chế phẩm sinh học được quản lý bởi Cục Thực phẩm và Dược phẩm Quản lý (FDA) và được sử dụng để chẩn đoán, ngăn ngừa, điều trị, chữa khỏi các bệnh và tình trạng y tế Chế phẩm sinh học là một loại sản phẩm đa dạng Những sản phẩm này có thể được sản xuất thông qua công nghệ sinh học trong một hệ thống sống, chẳng hạn như vi sinh vật, tế bào thực vật hoặc tế bào động vật Có nhiều loại chế phẩm sinh học được phê duyệt để sử dụng tại Hoa Kỳ, bao gồm protein điều trị (như filgrastim), monoclonal kháng thể (như adalimumab) và vắc-xin (như phòng bệnh cúm và uốn ván).
Bản chất của các chế phẩm sinh học, bao gồm cả những đặc tính vốn có những biến đổi có thể xảy ra do quá trình sản xuất, có thể đưa ra những thách thức trong việc mô tả đặc điểm và sản xuất những sản phẩm này thường không tồn tại trong phát triển các loại thuốc phân tử nhỏ Sự khác biệt nhỏ giữa các lô sản xuất cùng loại chế phẩm sinh học (tức là các biến thể có thể chấp nhận được trong sản phẩm) là bình thường và dự kiến trong quá trình sản xuất Như là một phần trong quá trình xem xét của mình, FDA đánh giá quy trình sản xuất và chiến lược của nhà sản xuất để kiểm soát bên trong sản phẩm các biến thể Những chiến lược kiểm soát này được đưa ra để giúp đảm bảo rằng các nhà sản xuất sản xuất các chế phẩm sinh học với hiệu quả lâm sàng nhất quán.
Chế phẩm sinh học là tên gọi chung của các sản phẩm được điều chế từ các thành phần được điều chế từ các thành phần có nguồn gốc từ tự nhiên như thực vật, động vật, vi sinh vật, các hoạt chất từ vi sinh và một số thành phần khác.
Trong chế phẩm vi sinh có chứa số lượng lớn các loài vi sinh vật, dựa vào chức năng của từng chủng mà người ta chia thành các nhóm như sau:
Nhóm vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng, kích thích tiêu hóa ở động vật: Bacillus sp.,Lactobacillus sp.,….
Nhóm vi sinh vật đối kháng côn trùng và bệnh hại: Bacillus thuringiensis (Bt), một số chủng nấm đối kháng như Trichoderma, Chaetomium, Metarhirizum sp.,….
Nhóm vi sinh vật hỗ trợ quá trình xử lí đất - nước: Nitrosomonas, Nitrobacter….
Cơ chế tác động chính:
Hệ vi sinh vật trong chế phẩm sẽ cạnh tranh với vi sinh vật gây hại bằng cạnh tranh giành vị trí bám, các chất dinh dưỡng thiết yếu.
Vi sinh vật trong chế phẩm tiết ra hoạt chất có khả năng diệt các nấm khuẩn gây hại và tiêu diệt các nấm khuẩn gây hại (các vi sinh vật gây hại không được thai khác trong mục chế phẩm sinh học) Các sản phẩm từ vi sinh tránh được dư lượng tồn tại trong sản xuất.
Hoặc từ Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) và từ tuyến trùng sống trong đất nhưng có khả năng gây bệnh cho các loại côn trùng như Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng (do vậy được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng.
Các dẫn xuất như Polysaccharid, Lipoprotein và các hoạt chất khác có mặt trong thành phần của chế phẩm giúp kích thích quá trình đại thực bào, tăng cường hệ miễn dịch trên cây trồng và vật nuôi.
- An toàn cho người sử dụng, thân thiện với môi trường.
- Không lo về dư lượng chất hóa học trong thực phẩm.
- Không xảy ra hiện tượng kháng thuốc.
- Giá thành cao do chưa có nhiều nguồn cung ứng, và còn sản xuất thủ công.
- Nguồn vi sinh vật sử dụng làm chế phẩm sinh học không đa dạng, giống nhập từ nước ngoài có khả năng thích nghi kém.
- Thời gian để phát huy hiệu quả lâu.
Một số chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng
Chế phẩm vi sinh Pseudomonas: có thành phần chính là vi khuẩn Pseudomonas spp Loại vi khuẩn này tồn tại chủ yếu trong đất và nước Vi khuẩn được tách chiết từ môi trường nên đặc biệt an toàn cho người sử dụng, cây trồng và môi trường xung quanh Chế phẩm này dùng phòng và trị bệnh thối rễ, thối thân trên rau màu, bệnh héo xanh, đốm lá, phán thư…
Chế phẩm vi sinh P-Gro: Chế phẩm P – Gro giúp cây trồng phòng trừ bệnh phấn trắng, đốm lá, bọ trĩ, nhện đỏ, rệp,… Giúp cây tăng sức đề kháng, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trường Ngoài ra, chế phẩm còn được dùng như phân bón lá, kích thích mầm phát triển nhanh và mạnh hoặc dùng để ủ phân chuồng, phân hữu cơ
Chế phẩm từ nấm Trichoderma: có nhiều loại phù hợp với yêu cầu sử dụng khác nhau Trichoderma tồn tại trong đất, nước, không khí, thực vật được tách chiết và sử dụng vào nhiều mục đích như bón thúc, bón lót, ủ phân hữu cơ hay dùng phòng và trị các bệnh như: thắt cổ rễ, chết rạp cây con, héo rũ trắng gốc, đốm lá,…
Quy trình tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong nông nghiệp
1.3.1.Quy trình tạo chế phẩm sinh học
Bước 1: thu thập chủng gốc (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, tuyến trùng, ) Bước 2: nhân sinh khối:
Bước 3: tùy vào đặc điểm của từng loại vi sinh vật mà tiến hành nhân giống cấp 2 hoặc thu sinh khối.
Bước 4: phơi sinh khối nhằm làm mất nước, giảm độ ẩm để bảo quản và lưu trữ được.
Bước 5: nghiền để thu sản phẩm cuối cùng.
Bước 6: kiểm tra, đóng gói.
1.3.2 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Nomuraea rileyi
Chủng nấm Nomuraea rileyi Nhân giống cấp 1 Môi trường MYAR Nhân giống cấp 2 Môi trường gạo, trấu 5% Lên men trên khay inox Thu và phơi khô sinh khối Kiểm tra mật số bào tử Xay, đóng gói, bảo quản chế phẩm.
1.3.3 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae
Chủng nấm Metarhizium anisopliae Nhân giống cấp 1 Môi trường gạo, trấu hoặc bắp, cám Lên men trên khay Thu và phơi sinh khối Nghiền, trộn, đóng gói, bảo quản.
1.3.4 Sơ đồ cấy chuyền nấm Xanh từ dĩa nấm cấp I sang bọc
Gạo (ngâm 1 - 1,5h rồi để ráo) Cho vào bọc (buộc kín) Khử trùng 2h (để nguội) Cho nấm nguồn vào bọc (nấm nguồn cần chia nhỏ thành 6 phần) Lắc bọc (kiểm tra và lắc sau ba ngày) Trữ nấm (10 - 15 ngày, nấm xanh phát triển đạt mật độ
1.3.5 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma
Nguyên liệu (1kg): cám mì (24%); mụn xơ dừa (16%); nước (60%) cần trộn đều môi trường và hấp khử trùng Giống Trichoderma sp (giống bán rắn cấp 1) Trộn đều giống Trichoderma sp (ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 o C, 4 ngày) Canh trường
Trichoderma sp Sau nuôi cấy (800 - 950g) Sấy và rây bào tử Có 2 loại BTP 1 khoảng 235 - 282g (phối trộn chất mang và các chủng Trichoderma sp khác Sản phẩm bón gốc) và BTP 2 khoảng 15 - 18g (phối trộn chất mang và các chủng
Trichoderma sp khác Sản phẩm phun xịt).
1.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm Bt theo công nghệ lên men hiếu khí
Chuẩn bị môi trường Khử trùng môi trường Cấy giống sản xuất (giống gốc sản xuất giống cấp 1) Ủ và theo dõi quá trình lên men Thu hoạch và tạo dạng chế phẩm (nghiền, lọc, bổ sung phụ gia sấy khô đóng gói, bảo quản).
1.3.7 Sơ đồ thu thập và phun NPV trừ sâu hại
Thu sâu bị bệnh ngoài đồng Nghiền nhỏ sâu bị bệnh trong nước sôi để nguội (250 con/l) Lọc qua vải mỏng để lọc cặn bã Bảo quản trong bình màu, đậy kín để ở nơi mát (nếu dùng ngay) hoặc cho xuống ao, giếng sâu nếu giữ cho vụ sâu Phun diệt sâu pha 1 lít với 500 - 600 lít nước/ha.
1.3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học Bacillus
Bước 1: chủng giống Lactobacillus Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Nuôi cấy tạo sinh khối Ly tâm thu sinh khối Trộn với chất mang Sấy ở 41 o C.
Bước 2: chủng giống Bacillus Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Nuôi cấy tạo sinh khối Ly tâm thu sinh khối Trộn với chất mang Sấy ở 41 o C.
Bước 3: phối trộn hai chủng lại với nhau.
Bước 4: đóng gói và bảo quản.
NUÔI NẤM TRICHODERMA ĐỂ TẠO SINH KHỐI LỚN
Tổng quan về nấm Trichoderma sp
Nấm Trichoderma spp là một loại nấm đối kháng có khả năng kiểm soát tất cả các loại nấm gây bệnh khác, giết được nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như:
Nấm Trichoderma spp gồm 4 loại: Trichoderma aureaviride, Trichoderma viride, Trichoderma koningii và Trichoderma harzianum.
Nấm đối kháng Trichoderma là loài hoại sinh, tức chúng sẽ sinh sống bằng cách phân hủy chất mùn hữu cơ trong đất, xác bả thực vật như lá cây, quả non rụng, cỏ dại
Hình 2.1 Nấm Trichoderma spp (a) Nấm Trichoderma spp được quan sát gần; (b) Nấm
Trichoderma được nuôi trên môi trường thạch. b) a) sau khi cắt,… thành các chất hữu cơ, vô cơ để sử dụng cho quá trình phát triển chính nó và biến các chất này thành dinh dưỡng dễ tiêu hóa cho cây trồng.
Chi Trichoderma được phân loại là nấm thiên dưỡng, thường sống dưới dạng nội sinh của thực vật thân gỗ Trichoderma không chỉ phổ biến trong môi trường và dễ phân lập mà còn có thể dễ dàng nhân lên trong các điều kiện có kiểm soát trên nhiều loại giá thể và có thể bảo quản trong nhiều tháng mà không bị mất khả năng sống và đặc tính của nó.
Trichoderma sp không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường
PGA, ban đầu Trichoderma sp có màu trắng, khi sinh ra bào tử chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Bào tử đính có màu sắc khác nhau tùy theo từng loại nấm Thông thường có màu xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Bào tử có thể mọc dày đặc hoặc từng chùm riêng lẽ Ở một số loài, sợi nấm tiết ra những chất làm cho môi trường bên trong có màu vàng, hay tiết ra mùi thơm mang tính đặc trưng Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma sp là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, màu vàng hay xám Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc oval, đa số các bào tử trơn lỏng, kớch thước khụng quỏ 5àm.
Nấm Trichoderma sinh sản vô tính bằng bào tử Bào tử nấm có dạng hình trứng (elip), màu xanh lục đính trên những sợi nấm Tốc độ phát triển của loài nấm này tương đối nhanh, chúng có thể đạt đường kính từ 2 - 9cm sau khoảng 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20 o C.
Hiệu quả của việc sử dụng nấm Trichoderma trong nông nghiệp phụ thuộc vào hoạt động trao đổi chất của chúng và kiểu tương tác với thực vật và các vi sinh vật khác Những loại nấm này cư trú hiệu quả trên thân rễ cây, sinh quyển, đồng thời tạo ra một số chất chuyển hóa có tính năng chống vi khuẩn (enzyme phân hủy thành tế bào, kháng sinh, các hợp chất dễ bay hơi và không bay hơi) và kích thích sinh học(phytohormones, phytoregulators) Hơn nữa, Trichoderma được biết đến với khả năng hấp thụ sâu lịch trình rễ và tương tác không chỉ với vi sinh vật gây bệnh, mà còn tương tác với toàn bộ hệ vi sinh vật trong đất.
Nấm Trichoderma được sử dụng nhiều trong quá trình xử lí phân chuồng giúp rút ngắn quá trình ủ và khử mùi hôi của phân chuồng và phế phẩm nông nghiệp.
Trichoderma tiết ra loại enzyme có khả năng làm tan vách tế bào của các loại nấm có hại khác, các enzyme này tấn công vào bên trong nấm bệnh gây hại, biến chúng thành thức ăn và tạo nên hữu cơ có lợi cho đất trồng, bảo vệ vùng rễ cây trồng và chống lại nấm thối rễ.
Trichoderma giúp tiêu diệt nấm Fusarium solani (tác nhân gây Vàng lá thối rễ trên nhiều loại cây trồng, chết nhanh chết chậm trên cây tiêu) Giúp phân hủy cellulose, phân giải lân tan chậm Giúp tăng số lượng rễ mọc sâu Tăng khả năng chống khô hạn của cây trồng, cân bằng pH, giải độc đất hiệu quả.
Trichoderma giúp tiết kiệm được lượng phân bón trong quá trình chăm sóc.
Chúng có khả năng phòng trị, cạnh tranh hoặc tiêu diệt các tác nhân gây bệnh giúp cải thiện sức khỏe của cây.
Ngoài hiệu quả trực tiếp trên các tác nhân gây bệnh ở cây, nhiều loài
Trichoderma kí sinh ở bề mặt rễ cây giúp thay đổi khả năng biến dưỡng của cây.
Nhiều dòng nấm đã kích thích sự tăng trưởng của cây Giúp gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng được bệnh.
Nấm Trichoderma khi sử dụng trong đất cũng sẽ bám vào xung quanh rễ cây, tiết ra đất những chất kích thích giúp rễ cây ăn sâu vào lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ trước nấm và khuẩn cho rễ.
Trichoderma khi sống trong đất, sẽ liên tục sinh khối tạo thành lớp lớp Trichoderma xung quanh rễ như một lớp bảo vệ rễ cây tránh được sự xâm nhập của nhiều loại nấm hại từ bên ngoài Làm giảm khả năng nhiễm bệnh vùng rễ cho cây lên đến trên 70%.
Nhờ nấm Trichoderma bám vào các đầu rễ, liên tục sản sinh ra enzyme và chất dinh dưỡng cho rễ nên giúp cho cây tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất, chất lượng cây trồng. Đối với nấm Trichoderma có khả năng sinh khối rất nhanh trong đất Gần như chúng sẽ xâm chiếm hoàn toàn vùng đất xung quanh tán cây khi được cấy vào đó Tuy nhiên, Trichoderma có một điểm yếu đó là khi các chủng nấm hại trong đất quá đông sẽ khiến khả năng đối kháng của chúng giảm đi khá nhiều Đây là lý do vì sao
Trichoderma chủ yếu được sử dụng trong việc phòng bệnh chứ không phải là trị bệnh.
Địa điểm thực hành
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 23/02/2024 đến ngày 01/03/2024.
Thực hành được thực hiện tại phòng Xưởng thực nghiệm vi sinh Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Chuẩn bị vật liệu
Chuẩn bị môi trường nhân giống
Bước 1: cân 100g nito được pha vào 1L nước.
Bước 2: cân 8kg tấm và 150g trấu.
Hình 2.2 Chuẩn bị nito và nước (a) Cân nito; (b) Pha nito với nước. a) b)
Bước 3: chuẩn bị bịch và nút bông Bịch gấp lại từ ngoài vào trong và được cố định bằng kim bấm để chừa một lỗ vừa đủ để đậy nút.
Bước 4: trộn đều tấm và trấu sau đó thêm từ từ dung dịch nito vào và trộn đều. a) b)
Hình 2.3 Chuẩn bị tấm và trấu (a) Cân tấm; (b) Cân trấu. b) a)
Hình 2.4 Chuẩn bị vật liệu (a) Gấp nút bông; (b) Chuẩn bị bịch đựng.
Bước 3: cho vào mỗi bịch đã chuẩn bị sẵn 400g và đóng nút bông. b) a)
Hình 2.5 Trộn đều các thành phần (a) Trộn đều trấu với tấm; (b) Trộn hỗn hợp trấu và tấm với dung dịch nito. b) a)
Hình 2.6 Hoàn thành sản phẩm (a) Bỏ môi trường vào bịch; (b) Đậy nút bông.
Bước 4: cho 20 bịch môi trường vào nồi hấp khử trùng ở 121 o C trong vòng 2 tiếng.
Quy trình tiến hành nhân giống
Bước 1: lấy môi trường ra khỏi nồi hấp.
Bước 2: cho 10mL nước đã hấp khử trùng vào đĩa nấm chọn làm giống và trang đều để lấy giống nấm.
Bước 3: cho dung dịch sau khi trang vào trong bình chứa có chứa 1L nước đã hấp khử trùng và lắc đều.
Bước 4: cho vào túi giống đã chuẩn bị mỗi túi 40mL dung dịch giống nấm và lắc đều.
Bước 4: đem túi giống đặt ở nơi có nhiệt độ, độ ẩm phù hợp.
Hình 2.8 Túi giống sau khi hấp.
Hình 2.9 Bổ sung dung dịch nấm vào túi giống (a) Dung dịch nấm; (b) Đổ dung dịch vào túi giống. a) b)
Kết quả và biện luận
Sau một tuần nấm Trichoderma spp phát triển tốt, bào tử lan rộng hết túi giống.
Tăng sinh thành công Trichoderma vì có xuất hiện màu xanh đặt trưng của
Hình 2.11 Túi tăng sinh Trichoderma sau 1 tuần.
KIỂM TRA MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS
Tổng quan về Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (Bt) là một loài vi khuẩn Gram dương hiếu khí; Sống trong đất, trong nước, lá cây, côn trùng, tuyến trùng… Có khả năng tạo ra các tinh thể protein độc trong quá trình sinh bào tử Bt là một thành viên của họ Bacillaceae, thuộc nhóm Bacillus cereus bao gồm các loài B cereus, B thuringiensis, B anthracis, B. mycoides, B pseudomycoides, và B weihenstephanensis Ứng dụng nổi bật nhất của
Bt trong thế kỷ qua là trong lĩnh vực nông nghiệp, chế tạo thuốc trừ sâu sinh học diệt côn trùng gây hại Tính đến nay các nhà khoa học Việt Nam cũng có khoảng thời gian nghiên cứu và ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt hơn 35 năm
Hình 3.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Vi khuẩn đất, tế bào cú dạng que, kớch thước 3 - 6àm, cú thể đứng riờng lẻ hoặc tạo thành chuỗi Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào.
Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kớnh cú thể đạt tới 8 - 10àm Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn.
Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6 - 2àm Bào tử được hỡnh thành trong điều kiện mụi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng.
Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp.
Tinh thể cú kớch thước 0,6 - 2 àm, cú hỡnh dạng khụng cố định (cú thể là hỡnh lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu) Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt.
Hình 3.2 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi.
3.1.4 Sơ lược về các loại độc tố của Bacillus thuringiensis
Bt có hai pha riêng biệt trong quá trình phát triển tế bào: phân chia tế bào sinh dưỡng và hình thành bào tử Trong cả hai pha, Bt sản sinh ra các protein gây độc cho côn trùng, tuyến trùng, động vật nguyên sinh và động vật có vú Các độc tố Bt xác định mục tiêu cụ thể của chúng thông qua nhận dạng các protein thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào đích
Protein Cry (Crystal protein) là độc tố được biết đến và công bố nhiều nhất từ Bt.
Cry gây độc tế bào cho ấu trùng côn trùng ảnh hưởng đến cây trồng Hơn nữa, một số độc tố Cry như Cry4A, Cry4B và Cry11A có tác dụng hiệp đồng với độc tố Cyt chống lại các vectơ ấu trùng gây bệnh ở người
PS là một nhóm nhỏ các Cry nhưng không có cấu trúc tương đồng cao với Cry, không có hoạt tính diệt côn trùng và tế bào bình thường, có thể tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư bằng cách nhận ra các thụ thể màng cụ thể, sau khi đã được hoạt hóa bởi các enzym phân giải thành các phân tử polypeptide nhỏ hơn Độc tố Cyt (Cytolytic protein) có cấu trúc hầu như khác xa độc tố Cry Những độc tố này ảnh hưởng chủ yếu đến muỗi là vectơ của các bệnh ở người. Độc tố Cry, PS và Cyt được biểu hiện trong quá trình hình thành bào tử, có thể tạo thành các tinh thể protein độc.
Địa điểm thực hành
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 23/02/2024 đến ngày 01/03/2024.
Thực hành được thực hiện tại phòng Xưởng thực nghiệm vi sinh Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
- Chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis.
- Ống pha loãng, dụng cụ cấy và đèn cồn.
Quy trình kiểm tra mật độ
Bước 1: lắc hỗn hợp gồm 10 g/10 mL sản phẩm nuôi cấy cùng với 90mL nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,9% trong 15 - 20 phút.
Hình 3.3 Chế phẩm sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Bước 2: pha loãng hỗn hợp vừa lắc theo nồng độ bậc 10 liên tiếp đến nồng độ 10 -
7 (mỗi nồng độ 3 lần lặp lại).
Bước 3: hỳt 200àL dịch từ cỏc ống nghiệm của ba nồng độ liờn tiếp (10 -4 , 10 -5 , 10 -6 ) để cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng với 2 lần lặp lại
Hình 3.5 Dung dịch mẫu sau khi lắc
Hình 3.6 Pha loãng hỗn hợp mẫu vừa lắc.
Bước 4: ủ trong thời gian 24 giờ và đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri.
Bước 5: tính toán kết quả.
Công thức tính tổng số tế bào:
Mật độ khuẩn(CFU/ml)= C1+C2+C3+C4
C1, C2: lần lượt là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10 -4 C3, C4: lần lượt là số khuẩn lac đếm được trên đĩa 1 và đĩa 2 ở nồng độ 10 -5 n1, n2: lần lượt là số khuẩn lạc đếm được ở nồng độ pha loãng 10 -4 và 10 -5 d: độ pha loãng nhỏ nhất.
V: thể tích dịch khuẩn cấy ở mỗi đĩa (mL).
Kết quả và biện luận
Hình 3.8 Đĩa petri nuôi cấy Bt ở mức pha loãng 10 -4 (a) Lặp lại lần 1; (b) Lặp lại lần 2. b) a)
Hình 3.9 Đĩa petri nuôi cấy Bt ở mức pha loãng 10 -5 (a) Lặp lại lần 1; (b) Lặp lại lần 2. a) b)
Bảng 3.1 Kết quả đếm số lượng khuẩn lạc ở 3 nồng độ 10 -4 , 10 -5 , 10 -6
Mật số vi sinh vật
Mật độ khuẩn(CFU/ml)= C1+C2+C3+C4
Số khuẩn lạc: đếm số khuẩn lạc sau khi ủ, chọn những đĩa có từ 25-250 khuẩn lạc: Ở nồng độ 10 -4 , mật độ khuẩn lạc lớn, không thể đếm được số khuẩn lạc. Ở nồng độ 10 -5 , có khuẩn lạc đơn và số lượng nằm trong phạm vi 25 - 250 nên đếm được. Ở nồng độ 10 -6 , ở lần lặp lại 1 số khuẩn lạc đơn có thể đếm được nhưng ở lần lặp lại 2 số lượng khuẩn lạc nằm ngoài phạm vi 25 – 250 nên không đếm được. Điều này có thể do trong quá trình cấy, thao tác cấy không chuẩn làm cho số lượng khuẩn lạc ở các đĩa có sự chênh lệch và mọc không đều không rõ khuẩn lạc đơn. Ở các nồng độ 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 đều có xuất hiện Bt Tuy nhiên, số khuẩn lạc đơn ở các nồng độ không thỏa điều kiện để tính mật độ khuẩn trong mẫu theo phương phápCFU.
