nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng ức vi sinh vật của cây lá lốt

HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN MÁY & THIẾT BỊ --- // --- CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do - Hạnh phúc --- // --- ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty tra

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI SINH VẬT CỦA CÂY LÁ

ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae

74Thursday, June 13, 20249:47:37 PM9:47:37 PM74Thursday, June 13, 20249:47:37 PM9:47:37 PM74Thursday, June 13, 20249:47:37 PM9:47:37 PM

ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae

ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae74Thursday, June 13, 20249:47:39 PM9:47:39 PM74Thursday, June 13, 20249:47:39 PM9:47:39 PM74Thursday, June 13, 20249:47:39 PM9:47:39 PM

74ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeThursday, June 13, 2024

Trang 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI SINH VẬT CỦA CÂY LÁ

Trang 3

NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: PHẠM TUẤN ANH

MSSV: 18081861 Lớp: DHHC14B

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HOÁ HỌC

1 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI

SINH VẬT CỦA CÂY LÁ LỐT

2 Nhiệm vụ:

− Điều và chiết các cao phân đoạn − Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

− Thử hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết phân đoạn

3 Ngày giao nhiệm vụ đề tài: 25/09/2021 4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 14/11/2021

5 Họ và tên người hướng dẫn : PGS-TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN

PGS-TS.LÊ TIẾN DŨNG

Chủ nhiệm bộ môn

Chuyên ngành

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2021

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Trần Nguyễn Minh Ân

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN MÁY & THIẾT BỊ

- // -

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do - Hạnh phúc - // -

ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM

Trang 4

chia sẻ kinh nghiệm, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Thứ ba, em cảm ơn các anh chị, các bạn sinh viên, học viên trong phòng thí nghiệm Hóa sinh dược tại Viện Vật liệu ứng dụng - Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ em trong suốt 3 tháng thực hiện đề tài

Và cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình lúc nào cũng động viên,chia sẻ, tin tưởng, giúp em có thêm động lực để học tập và thực hiện đề tài

Tuy nhiên kiến thức chuyên môn còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót Nên em mong nhận được sự góp ý của thầy cô và mọi người để đề tài của em hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Trang 5

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

TRƯỞNG BỘ MÔN

Chuyên ngành

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2021

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Trần Nguyễn Minh Ân

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM

Trang 6

TP.Hồ Chí Minh, ngày …tháng…năm 2021

Giảng viên phản biện

(Ký ghi họ và tên)

Trang 7

1.5 Phương pháp docking phân tử 11

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Mục tiêu đề tài 13

2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Phương pháp cô lập và tinh chế hợp chất hữu cơ 13

2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 16

2.4.3 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng 17

2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 18

2.4.5 Phương pháp Docking phân tử trên phần mềm Autodock 19

Trang 8

3.3.3 Khảo sát phân đoạn PLEA8 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

4.5.1 Đặc tính hoá lý của thuốc 42

4.5.2 Tính dược học của thuốc 43

Trang 9

Hình 2.4 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng 18

Hình 2.5 Quy trình docking của thuốc (ligand) đến DNA của protein 20

Hình 3.1 Mẫu lá lốt tươi thu hái ở huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang 21

Hình 3.2 Quy trình xử lý nguyên liệu ban đầu 22

Hình 3.3 Quy trình phân chia cao tổng thành cao phân đoạn 22

Hình 3.4 Sắc kí lớp mỏng (TLC) của cao EA với các hệ dung môi 23

Hình 3.5 Quy trình phân lập cao Ea 24

Hình 3.6 TLC của các phân đoạn được phân lập từ cao Ea 24

Hình 3.7 TLC của phân đoạn PLEA8 với các hệ dung môi 25

Hình 3.8 Quy trình trình phân lập PLEA8 26

Hình 3.9 Quy trình phân lập PLEA816 27

Hình 3.10 Quy trình phân lập PLEA8169 28

Hình 4.6 Tương quan HMBC của hợp chất APL4 36

Hình 4.9 Các liên kết Hydro hình thành giữa các amino acid trên chuỗi xoắn X với các nguyên tử hoạt tính trên ligand cấu dạng bền nhất, ligand (pose 404) 38

Hình 4.10 Các tương tác ligand quan trọng hình thành giữa các amino acid hoạt tính và các nguyên tử hoạt đông trên ligand cấu dạng bền nhất, (docking pose 404/500) được trình bày trên một sơ đồ 2D 39

Hình 4.11 Bản đồ ligand trình bày các tương tác thứ cấp giữa amino acid của DNA

của protein với các vị trí hoạt động trên ligand trên 1 sơ đồ 2D gồm tương tác Hydrogen

Trang 10

Hình 4.14 Bản đồ ligand trình bày các tương tác thứ cấp giữa amino acid của DNA

của protein với các vị trí hoạt động trên ligand trên 1 sơ đồ 2D gồm tương tác Hydrogen (đường màu xanh) tương tác lập thể (đường màu nâu đỏ), tương tác phủ lấp đường tròn màu

Trang 11

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 4.1 Kết quả thực nghiệm hoạt tính khoáng khuẩn 30

Bảng 4.2 Bảng so sánh phổ NMR của APL-2 với vanillic acid 34

Bảng 4.3 Bảng so sánh phổ NMR của APL-4 với 4-hydroxy benzaldehyde 36

Bảng 4.4 Các giá trị quan trọng tính toán được từ phần mềm Autodock của hai hợp chất APL-2 và APL-4 với protein mã hiệu 2VF5:PDB 38

Bảng 4.5 Đặc tính hoá lý của APL-2 and APL-4 42

Bảng 4.6 Tính dược học của APL-2 and APL-4 43

Bảng 4.7 Tính hấp thụ APL-2 and APL-4 44

Bảng 4.8 Tính phân phối của APL-2 and APL-4 45

Bảng 4.9 Trao đổi chất của APL-2 and APL-4 46

Bảng 4.10 Độc tính của APL-2 and APL-4 47

Trang 12

CTPT Molecular formula Công thức phân tử

1H-NMR Hydro (1) Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)

Bond Cohenrence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

Quantum Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

SKLM Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

Trang 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặt vấn đề

Bên cạnh rừng và biển thì thực vật cũng là một món quà mà thiên nhiên mang lại cho con người chúng ta Thực vật được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau như làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị cho thức ăn, làm vật liệu để xây dựng…Chính vì vậy mà có rất nhiều ngành nghiên cứu đến thực vật ra đời đời tiêu biểu trong số đó phải kể đến ngành dược học y học cổ truyền, một ngành nghề đã bắt đầu phát triển từ lúc con người xuất hiện

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại con người không còn sử dụng các loại dược liệu một cách kinh nghiệm mà thay vào đó là sự tìm hiểu, nghiên cứu các hợp chất có chứa trong dược liệu có tác dụng sinh học Các nhà khoa học công nhận rằng hầu hết các cây cỏ đều có tính kháng sinh, đó là khả năng miễn dịch tự nhiên của thực vật Tác dụng kháng khuẩn do các hợp chất tự nhiên có mặt phổ biến trong thực vật như phenolic, , ancaloid, flavonoid, saponin, [1],[2],[3] Cho đến nay, nhiều hợp chất tự nhiên đã được giải mã về cấu trúc, những hợp chất này được chiết xuất từ cây cỏ để làm thuốc Dựa vào cấu trúc được giải mã, người ta có thể tổng hợp nên các chất nhân tạo để chữa bệnh

Chi hồ tiêu (Piper) thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae) có hơn 2000 loài [4] Lá lốt (Piper lolot C.DC.)là một loài thuộc chi hồ tiêu (Piper) được tìm thấy hầu như ở

khắp các vùng miền Việt Nam, nó có công dụng như một vị thuốc trong y học cổ truyền Trong y học cổ truyền, lá lốt có vị nồng, hơi cay, tính ấm, công dụng ôn trung (làm ấm bụng), giảm đau lưng, đau chân, trị nôn mửa, đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy…Chính vì có nhiều công dụng nêu ở trên nên lá lốt đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hoá học, đánh giá hoạt tính sinh học Thông qua đó có thể tổng hợp nên những loại thước có giá trị sử dụng cao Để góp phần nhỏ vào công trình nghiên cứu này, Trong khoá luận tốt nghiệp lần này tôi thực hiện nghiên cứu thành phần hoá học của cây lá lốt tác dụng ức chế vi sinh vật

1.2 Giới thiệu về cây lá lốt (Piper CD.C)

1.2.1 Nguồn gốc

Cây lá lốt có nguồn gốc từ vùng Tây Ghast, Kerela của Ấn Độ được phân bố khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi có nhiều họ hồ tiêu (Piperaceae) sống ngoài tự nhiện Lá lốt đã được phát hiện cách đây hơn vài ngàn năm Sau đó đó chung được con người đem về trồng

Lá lốt được đem đến vào Đông Dương từ thế kỉ 17 nhưng mà đến đầu thế kỉ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh khi mà món gói thịt bầm trong lá nho để nướng có nguồn gốc ở Trung Đông, đã được đưa đến Ấn Độ bởi người Ba Tư, sau đó đã được giới thiệu bởi những người Ấn Độ đến khu vực Đông Nam Á Tuy nhiên, nho không phát triển tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới, do đó, người Việt Nam bắt đầu sử dụng lá lốt thay vì lá nho Chính món thịt nướng lá lốt này từ Việt Nam phổ biến sang nhiều nước Đông Nam Á khác

Trang 14

Ở miền nam Việt Nam, người ta thường gọi là lá lốt hoặc tùy vào từng vùng miền mà tên gọi có sự khác nhau: tất bát, pâu pat, phjăc pat (Tày), anakhia táo, lau khuẩy (Dao) Tên tiếng Anh: Lolot, Lolot Piper, Poivrelolot Hay tên tiếng Pháp: Cha Plu, La-lot, Lalot, Lolo du Tonkin, Poivre Lolot

Hình 1.1 Lá lốt (Piper lolot C DC.) 1.2.3 Vị trí phân loại

− Giới: Plantae;

− Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta); − Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida); − Phân lớp: Ngọc Lan (Magnoliidae); − Bộ: Hồ tiêu (Piperales);

− Họ: Hồ tiêu (Piperaceae); Chi: Hồ tiêu (Piper); Loài: Piper lolot [6]

1.2.4 Điều kiện sinh trưởng

Cây lá lốt là một loại cây ưa khí hậu nhiệt đới, là loại cây dễ sống và chủ yếu sống tự nhiên Nhưng do nhu cầu sửa dụng ngày càng cao của con người như dùng các vị thuốc mang tính thực vật, những sản phẩm đậm chất dân dã gắn liền với tự nhiên nên lá lốt đang được gây trồng là sản phẩm kinh tế Do tính chất hoang dã nên việc gây trồng không quá khó khăn ta chọn những cây lá lốt sinh trưởng mạnh (lá xanh bóng, mượt, kích thước lá to), tách từng nhánh đã mang rễ hoặc cắt thành từng đoạn dài 20– 30cm để giâm Giâm những đoạn thân vừa cắt trực tiếp trên luống đã chuẩn bị để trồng, giâm từng hàng vào đất (ngập

Trang 15

2/3 đoạn thân vừa cắt), sau đó tưới nước nhẹ cho cây đủ ẩm Hàng ngày tưới nước 2 lần cho cây và dùng thêm số loại phân hữu cơ vì lá lốt là loài cây ít bị bệnh hại [7, 8]

1.2.5 Đặc tính thực vật

Lá lốt thuộc dạng cây thân cỏ, cao 30-40 cm Thân phồng lên ở các mấu, có vạch dọc đôi khi có màu nâu, hơi phủ lông Lá đơn, nguyên, mọc so le, hình tim, có màu xanh đậm, mặt lá bóng Lá có 5 gân chính tỏa ra từ cuống lá, cuống có bẹ ôm lấy thân Phiến lá dài 6-13 cm, rộng 5-8 cm, có 5-7 gân xuất phát từ gốc lá, cuốn lá dài 2,5 cm Hoa mọc từ nách lá, cụm hoa bông, hoa đực và hoa cái khác gốc Bông cái dài 1cm màu vàng, có lông, lá bắc tròn, bầu nhẵn hình trứng, vòi nhụy chẻ 3 Quả mọng chứa một hạt Mùa ra hoa từ tháng 8 đến tháng 10

1.2.6 Thành phần hoá học

1.2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về cây lá lốt và các loài thuộc chi Piper L Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung về thành phần hoá học, hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính kháng viêm… thông qua những nghiên cứu này tạo nên cơ sở dữ liệu to lớn để nghiên cứu và tổng hợp hoá dược Một số công trình nghiên cứu tiêu biểu:

Năm 1896 B Bruke và công sự của mình đã phân lập và công bố 4 hợp chất từ trái của hai loài Piper Aduncum and Piper Hispidum gồm, 4-methoxy-3,5-bis(3’-methyl-2’-butenyl)-benzoic acid, 1-allyl-2,3-(methylenedioxy)-4,5-dimethoxybenzene 5-hydroxy-7-methoxyflavanone và 2,6-dihydroxy-4-methoxydihydrochalcone Trong đó 1-Allyl-2,3-(methylenedioxy)-4,5-dimethoxybenzene và 4-methoxy-3,5-bis(3’-methyl-2’-butenyl)-benzoic acid là hai cấu trúc mới [9]

1-Allyl-2,3-(methylenedioxy)-4,5-dimethoxybenzene

Trang 16

4-methoxy-3,5-bis(3’-methyl-2’-butenyl)-benzoic acid

Năm 1987 Stephen A Ampofo và các cộng sự đã phân lập và công bố ba cấu trúc mới nhóm phenolic từ loài Piper Auritum Ba hợp chất được công bố gồm Piperoic acid, Piperochromanic acid, 4-Hydroxy-5-(E,E-farnesyl)benzoic acid [10]

Piperochromanic acid Piperoic acid

4-Hydroxy-5-(E,E-farnesyl)benzoic acid

Năm 1988 Sanjay J Desai cùng các cộng sự của mình đã cô lập và công bố được 9 hợp chất từ rể của loài Piper longgum, các hợp chất lần lượt là Cepharadione B, Cepharadione A, Cepharanone B, Norcepharadione B, Aristolactam AII, 2-hydroxy-1-methoxyl-4H-dibenzo [de,g]quinolone-4,5(6H)-dione, Piperadione, Piperolactam A, Piperolactam B, Trong đó 3 hợp chất gồm Piperolactam A, Piperolactam B, Piperadione là cấu trúc mới [11]

Trang 17

Piperolactam A Piperolactam B Piperadione

Năm 1988 S K Koul và các công sự của ông đã phân lập và công bố được 3 cấu trúc mới từ loài Piper Species gồm Brachyamide A, Brachyamide B, Brachystine [12]

Trang 18

cyclohexadien-1-one

4-(2-piperonyl-2-hydroxy-1-methylethyl-2,5-dimethoxy-2-(2-propenyl)-3,5-Năm 2000 Craig D Dodson và các cộng sự của ông đã phân lập và công bố 4 hợp chất từ loài Piper cenocladum gồm dihydropyridone alkaloid, cenocladamide, một dẫn xuất của piplartine, 4’-desmethylpiplartine Trong đó hai cấu trúc mới là cenocladamide và 4’-desmethylpiplartine [14]

4’-desmethylpiplartine Cenocladamide

Năm 2008 Ninoska Flores và các cộng sự của ông đã phân lập và công bố 13 hợp chất thuộc loại Benzoic acid từ loài Piper Species tròng đó có 9 cấu trúc mới chưa được công bố trước đó [15]

3,4-dihydroxy-5-(2-butenyl)benzoate

methyl-3-butenyl)benzoate

4-hydroxy-3-(2-hydroxy-3-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae4-hydroxy-3-(2-hydroxy-3-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae4-hydroxy-3-(2-hydroxy-3-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae4-hydroxy-3-(2-hydroxy-3-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae

Trang 19

3-[2-(acetoxy)-3-methyl-3-dihydroxybenzoate

methyl-2-butenyl)benzoate

4-Hydroxy-3-(2-hydroxy-3-methyl-2- butenyl)benzoic acid

3-(2-Hydroxy-3-methyl-3-methyl-2- butenyl)benzoic acid

methyl-1-butenyl]-4-methoxy-5-(3-methyl- 2-butenyl)benzoic acid

3-[(1E)-3-Hydroxy-3-hydroxy-3-methyl-3-butenyl)benzoic acid

4-Hydroxy-3,5-bis(2-Năm 2009 Kooi-Mow sim và các cộng sự đã phân lập và công một amide alkaloid mới từ loài Piper sarmentosum với tên gọi là N-(3’,4’,5’-trimethoxy-cis-cinnamoyl) pyrrolidine [16]

N-(3’,4’,5’-trimethoxy-cis-cinnamoyl) pyrrolidine

Năm 2011 Candy Tuiz và các cộng sự đã phân lập và công bố 4 hợp chất gồm (3’,4’,5’-trimethoxyphenyl)-2-hydroxybenzamide,2’-hydroxy-3’,4’,6’-trimethoxyphenyl-chalcon, cardamonin, Pinocembrin Từ loài Piper hispidum [17]

N-2-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeN-2-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeN-2-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeN-2-ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM742413069:47:37 PM9:47:37 PM

Trang 20

N-2-(3’,4’,5’-trimethoxyphenyl)-2-hydroxybenzamide

Năm 2013 Thanakorn Damsud và các cộng sự đã phân và công bố ba cấu trúc mới thuộc loại Phenylpropanoyl amides là chaplupyrrolidones A, chaplupyrrolidones B, deacetylsarmentamide B từ loài Piper Sarmentosum [18]

Chaplupyrrolidones A Chaplupyrrolidones B

N-(3’,4’,5’-trimethoxy-cis-cinnamoyl) pyrrolidine

1.2.6.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 1995 Nguyễn xuân Dũng và các cộng sự của mình đã chưng cất để thu được tinh dầu từ các bộ phận trên cây lá lốt Kết quả chỉ ra 𝛽-caryophyllene là thành chủ yếu của tinh dầu lá lốt Tính dầu ở thân cho hàm lượng 𝛽-caryophyllene cao nhất 30.9%, tiếp theo là 27.6% và 26.1% tương ứng với ở lá và ở rễ Ngoài thành phần chình là 𝛽-caryophyllene tinh dầu của cây lá lốt còn chứa 𝛼-muurolene, 𝛾-cadinene và caryophyllene oxide [19]

Năm 2013 Đặng Thị Thanh Nhàn tiến hành đo GC-MS cho dịch chiết cây lá lốt với dung môi n-Hexan từ cao methanol ở tỉnh Thừa Thiên Huế có 18 cấu tử Trong đó có 5 cấu tử chiếm hàm lượng cao hơn 8% [20]

Trang 21

Hình 1.2 Các hợp chất có thể có trong dịch chiết lá lốt

Tên gọi Công thức

𝛽-asaron C12H16O3

Guineesine C24H33NO3

Caryophyllene C15H24

Isobutyl metyl cacbinol (4-

pentanol)

Methyl-2-C6H14O

Metyl hidrocinamat

(Methyl phenylpropionate)

Brachystamide B C26H37NO3

Trang 22

Pellitorine C14H25NO

1.2.7 Công dụng

Bộ phận thường dùng là toàn thân và lá Lá lốt được sử dụng để ăn sống như là các loại rau mùi hoặc là dùng làm rau, gia vị nêm trong nhiều món ăn như: ốc, lươn, ếch… vì đặc tính của lá có mùi thơm, nồng cay nên dùng lá lốt trong các món ăn để khử mùi tanh và chống được dị ứng Ngoài các món có vị tanh thì lá lốt cũng dùng ăn kèm với các loại thịt nhằm tăng hương vị của món ăn [5], [6], [21]

Ngoài ra, lá lốt và thân cây đều là vị thuốc, thường dùng tươi hay phơi khô Lá lốt có vị cay thơm, tính ấm, làm tan hơi lạnh giúp tiêu hóa tốt, trị bệnh tê thấp, đau cơ, đau thắt ngực, nôn mửa, nhức đầu, bụng đầy hơi, đau bụng, đau nhức răng [21],…

1.3 Hoạt tính sinh học

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2011 Huỳnh Kim Diệu và Nguyễn Thành Văn đã thu thập 30 mẫu là lốt từ các tỉnh Đồng Tháp, Cần Thơ để thực hiện thử hoạt tính kháng khuẩn trên 8 chủng vi khuẩn gồm Salmonella spp, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri tarda và Edwardsiella ictaluri Kết quả là khả năng kháng khuẩn trên hầu hết các dòng vi khuẩn trên đều giống nhau và cho kết quả kháng khuẩn yếu chỉ duy nhất tác động rất mạnh trên chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [22]

1.3.2 Hoạt tính kháng viêm

Năm 2007 Wibool Ridtitid và các cộng sự chiết xuất cao methanol từ lá của cây lá lốt và nghiên cứu về hoạt động chống viêm và hạ sốt đối với chứng phù chân do carrageenan gây ra và chứng nhiệt miệt do men bia ở chuột Kết quả cho thấy chiết xuất ở liều thử nghiệm tạo ra hoạt tính chống viêm đáng kể sau 3 giờ với khả năng ức chế phù chân là 8,6% (P <0,05), 18,6% (P <0,01) và 24,7% (P <0,01) tương ứng, so với thuốc tham chiếu aspirin 200 mg / kg p.o với mức ức chế là 33,3% (P <0,01) Chỉ chiết xuất ở liều 200 mg / kg p.o cho thấy sự ức chế đáng kể chứng phù chân chuột do carrageenan gây ra bắt đầu từ 2 giờ là 11,8% (P <0,01) và ở 3, 4 và 5 giờ là 24,7% (P <0,01), 14,1% (P <0,01) và 11,9% (P <0,01), tương ứng, trong khi thuốc tham chiếu aspirin 200 mg / kg p.o thể hiện sự ức chế phù nề

đáng kể bắt đầu từ 1 giờ là 15,6% (P <0,05) và ở 2, 3, 4 và 5 giờ là 31,8% [23] ket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg baeket pua eohg tae gico dat gico ruhg tai eohg ty traeh hhiem huu hah mot thahh vieh lam hghieu dohg bae

Trang 23

1.3.3 Hoạt tính kháng oxi hoá

Trong nghiên cứu của Hồ Bá Vương trong và Nguyễn Xuân Duy “Hoạt tính chống oxi hóa và ức chế enzyme polyphenoloxidase của một số loại thực vật ăn được ở Việt Nam’” đã xác định được dịch chiết của lá lốt với dung môi là nước có hàm lượng polyphenol là 39.3 mg GAE/g chất khô Phân tích chỉ ra rằng khả năng khử gốc tự do DPPH của lá lốt thấp hơn so với lá khoai lang và cao hơn lá nhàu với giá trị IC50 lần lượt là 13.52, 10.08 và 14.08 µg chất khô/ml Năng lực khử cũng là một phép phân tích nhằm đánh giá khả năng chống oxi hóa trong vitro Kết quả cho thấy lá lốt (IC50 = 16,45 µg chất khô/ml) có hoạt tính chống oxi hóa cao hơn lá nhàu (IC50 = 43,84 µg chất khô/ml) và lá khoai lang (IC50 = 112,99 µg chất khô/ml) [24]

1.4 Sàng lọc ảo in silico

Hiện nay, với những thành tựu vượt bậc trong khoa học máy tính và những hiểu biết sâu hơn trong lĩnh vực sinh học phân tử, nhiều lĩnh vực nghiên cứu dựa trên sự trợ giúp của máy tính đã được hình thành và cho kết quả ứng dụng cao Có một phương pháp được nhiều khoa học áp dụng cho quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc trong những năn gần đây là

phương pháp sàng lọc ảo in silico Phương pháp này với sự hỗ trợ bởi máy tính được ứng

dụng vào nhiều khâu của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc, từ khâu tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng

So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống, sàng lọc ảo có ưu thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội, giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà không một thí nghiệm nào có khả năng làm được Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng các mô hình toán học, nghiên cứu dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất Các phương pháp này giúp tiết kiệm đáng kể cả thời gian và tiền bạc trong việc phát triển một thuốc mới

1.5 Phương pháp docking phân tử

Docking phân tử (Molecular Docking Model) là kĩ thuật mô hình hóa nhằm dự đoán vị trí và cấu hình thuận lợi mà phân tử cơ chất có thể gắn kết trên phân tử protein Phân tử cơ chất được cho dịch chuyển trong không gian bao quanh phân tử protein để tìm vị trí có năng lượng gắn kết âm nhất sử dụng các hàm đánh giá và phương pháp tìm kiếm cực trị toàn cục khác nhau Docking có vai trò rất quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của các nguyên tử trong công thức của thuốc đối với protein, từ đó dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế một protein chức năng Bên cạnh đó docking cũng giúp dự đoán tâm hoạt động và vị trí, cấu hình thuận lợi của cơ chất tham gia phản ứng khi xem xét cơ chế xúc tác của enzyme (cũng là một loại protein chức năng) Docking trở thành bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một cơ chất gắn kết lên protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất cần phải liên hệ không gian cấu hình với các giá trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein rồi mới áp dụng được các thuật toán tìm kiếm

AutoDock 4 là hỗ trợ docking đối với các hợp chất cần phân tích

Trang 24

Trang 25

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu đề tài

− Phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất có trong cây lá lốt; − Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây lá lốt

2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

− Cây lá lốt được thu hái từ huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang

2.3 Nội dung nghiên cứu

− Thu hái cây lá lốt và chiết với dung môi cồn 96o thu được cao tổng; − Phân bố cao tổng thành các cao phân đoạn: Hexan, Ety axetat, Methanol; − Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết cây lá lốt;

− Phân lập hợp chất của các cao phân đoạn có hoạt tính tốt; − Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được;

− Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất đã phân lập được − Docking phân tử hai hợp chất phân lập được với tế bào 2VF5:PDB − ADMET của hai hợp chất phân lập được

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết

− Thu thập tài liều trong và ngoài nước liên quan đến đề tài − Trao đổi với giảng viên hướng dẫn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp cô lập và tinh chế hợp chất hữu cơ

2.4.1.1 Phương pháp chiết ngấm dầm

Ngâm bột cây trong bình chứa có nắp đậy Rót dung môi vào bình chứa sao cho dung môi ngập trên bề mặt bột cậy , khuấy đều đểu tăng hiệu quả tiếp xúc, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng, dung môi sẽ ngấm dần vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên Sau 1 hoặc 2 ngày , dung môi trong bình được lấy ra và cho thêm dung môi mới vào Đây được gọi là phương pháp chiết ngấm dầm

Trang 26

Hình 2.1 Ngâm dầm cây lá lốt với dung môi ethanol 96o

2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là kỹ thuật phân bố rắn-lỏng: trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một chất hấp phụ trơ như silicagel hoặc oxyd alumin Chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp phụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là SKLM

Muốn thực hiện sắc ký, người ta cho mẫu phân tích hòa tan hoàn toàn vào trong một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1 vết nhỏ gọn lên lớp mỏng Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẩu, như vậy mẫu chỉ còn là dạng bột khô bám trên lớp mỏng Đặt lớp mỏng theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có dung môi thích hợp, dung môi sẽ bị lực mao quản hút lên phía trên, mẫu chất sẽ được phân chia thành những vết riêng biệt Các vết sẽ được phát hiện bằng phương pháp vật lý như nhìn bằng mắt, soi dưới đèn tử ngoại…hoặc bằng phương pháp hóa học (phun lên bảng mỏng các loại dung môi hay thuốc thử )

Hình 2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Mục tiêu của việc sử dụng sắc kí lớp mỏng giúp ta tham dò hệ dung môi Từ đó chọn được hệ dung môi thích hợp Đồng thơi cũng là phương pháp để đối chưng với chất ban đầu

Trang 27

2.4.1.3 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là phương pháp tách chất dựa vào sự hấp phụ của chất phân tích với chất hấp phụ và được thực hiện trên cột với chất hấp phụ là pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp phụ

Tuỳ theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của hợp chất đối với dung môi rửa cột mà các hợp chất trong hỗn hợp được lấy ra lần lượt trước hoặc sau

Pha tĩnh thường dùng trong sắc ký cột là silicagel, CaCO3 , than hoạt tính,, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa theo quy định

• Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị cột

• Rửa sạch cột, tráng với Axeton và sấy khô • Cho một miếng bông gòn vừa đủ vào cột • Kẹp cột trên giá thẳng đứng

Nhồi cột: Sử dụng dung môi thích hợp silicagel và cho vào cột Đưa chất phân tích vào cột:

• Cho chất phân tích hoà tan vào dung môi và đưa vào cột

• Trộn hỗn chất cần phần tách với một lượng chất hấp phụ và đưa vào cột

Rửa cột: cho hệ dung môi giải ly chạy qua cột 2.4.1.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế là phương pháp được sử dụng tương tác giữ hợp chất với TLC thông qua dung môi để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 - 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản chỉ gồm một vài chất

❖ Các bước tiến hành sắc kí lớp mỏng điều chế − Đưa hỗn hợp cấu tứ đơn giản lên TLC − Chuẩn bị hệ dung môi phù hợp

− Tiến hành sắc ký lớp mỏng

− Tiến hành cạo phần silicagel mà tại đó đó tồn tại duy nhất chất cần phân tách

− Sử dụng sắc kí côt thường để giải hấp chất cần phân tách trên silicagel

Trang 28

Hình 2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế 2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

2.4.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Theo thuyết cấu tạo nguyên tử, nguyên tử gồm có hạt nhân và lớp vỏ điện tử Giả thiết rằng hạt nhân có đạng hình cầu có điện tích dương và mật độ điện tích phân bố đồng đều trên mặt cầu Một số loại hạt nhân hoạt động bằng cách tự quay quanh trục của nó và vì hạt nhân mang điện tích dương nên chúng sẽ giống như những thanh nam châm nhỏ, vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường bên ngoài Không phải tất cả các hạt nhân mà chỉ các hạt nhân có số spin lẻ (1H, 13C, ) mới có đặc trưng này

Khi mẫu chất khảo sát có chứa những hạt nhận này và được được đặt trong từ trường, Các hạt nhân này sẽ định hướng theo hướng của từ trường Khi đó ta chiếu bức xạ điện từ có tần số thích hợp, lúc này sự hấp thụ năng lượng xảy ra và spin ở trang thái năng lượng thấp sẽ nhảy lên spin trạng thái năng lượng cao hiện tượng nhảy chuyển spin như thế gọi là cộng hưởng từ hạt nhân

Do độ dịch chuyền hóa học của mỗi hạt nhân phụ thuộc vào cầu tạo hóa học và vào vị trí không gian của nó trong phân tử nên mỗi hạt nhân có hiệu ứng chắn khác nhau chúng cho các tín hiệu khác nhau trên phổ 1H-NMR Dựa vào các tín hiệu trên phổ đồ cùng với các kĩ thuậtt DEPT, COSY, HMBC, HSQC có thể xác định được số lượng proton và carbon và vị trí của chúng trong phân tử

2.4.2.2 Thiết bị phân tích

Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) với các kỹ thuật DEPT, COSY, HMBC, HSQC được ghi trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội

Trang 29

Phổ khối được ghi trên máy Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.3 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng

Kỹ thuật kháng sinh đồ pha loãng là kỹ thuật kháng sinh đồ định lượng Nó không chỉ trả lời được câu hỏi chủng vi khuẩn thử nghiệm nhạy cảm, đề kháng trung gian hay đề kháng với kháng sinh mà nó còn cho biết chủng vi khuẩn nhạy cảm, đề kháng trung gian hay đề kháng với kháng sinh ở nồng độ kháng sinh nào

− Bước 1: Chuẩn bị và bảo quản dung dịch kháng sinh − Bước 2: Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

− Bước 3: Tiến hành thử nghiệm

Chuẩn bị đủ số lượng ống canh thang Mueller-Hinton 0,5 ml theo các nồng độ kháng sinh cần thử nghiệm Thêm một ống canh thang không cấy vi khuẩn và không có kháng sinh để làm chứng vô trùng cho môi trường và một ống canh thang cấy vi khuẩn nhưng không chứa kháng sinh để làm chứng cho sự phát triển của vi khuẩn

Hút 0,5 ml dung dịch kháng sinh thử nghiệm chuyển vào ống chứa 0,5 ml canh thanh Mueller-Hinton, trộn đều rồi chuyển 0,5 ml hỗn dịch sang ống 0,5 ml canh thanh thứ 2, trộn đều rồi tiếp tục chuyển 0,5 ml hỗn dịch sang ống 0,5 ml canh thanh thứ 3 Cứ tiếp tục như vậy cho đến ống canh thanh cuối cùng thì hút bỏ 0,5 ml hỗn dịch của ống cuối cùng đi Như vậy, nồng độ kháng sinh trong các ống canh thang được pha loãng giảm dần theo bậc 2

Cho vào mỗi ống canh thang chứa kháng sinh 0,5 ml canh khuẩn 106 CFU/ml, một ống canh thang chỉ có 0,5 ml canh khuẩn 106 CFU/ml và một ống canh thang không bổ sung canh khuẩn Nồng độ vi khuẩn trong mỗi ống còn 5 x 105 CFU/ml

Trang 30

Hình 2.4 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng

Xác định MIC: Tính từ bên phải qua, giếng chứa mẫu thử tại nồng độ nào trong (không

còn bị đục) đầu tiên chính là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), với điều kiện chứng dương phải trong (do không có môi trường nên vi khuẩn không phát triển được) và chứng âm phải đục (do không chứa chất thử ức chế vi khuẩn) Sự sai lệch giá trị MIC có thể chấp nhận được ở 2 giếng kế tiếp nhau, khi giá trị MIC đọc được ở 3 giếng kế tiếp nhau ta phải thực hiện lại thí nghiệm

Xác định MBC: lấy dịch từ những giếng trong tính từ bên phải qua xung quanh giá trị

MIC, thường sẽ lấy 1 mẫu sau giá trị MIC (mẫu không ức chế được khuẩn) và 2 mẫu trước giá trị MIC (mẫu ức chế được khuẩn), sau đó cấy lần lượt các vi khuẩn của từng giếng trên đĩa petri đã có sẵn môi trường, nuôi cấy trong vòng 18-24h Nồng độ nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn không mọc được xác định là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm Vì vậy, việc xác

Trang 31

định khả năng kháng viêm được đánh giá thông qua phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxit (NO) trên tế bào RAW264.7

Phương pháp thực hiện: Tế bào RAW 264.7 được đưa vào 96 giếng ở nồng độ 1x104 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37 ºC và 5 % CO2 trong 24 giờ Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3 giờ Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2 giờ trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 μg/mL) trong 24 giờ Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG - Methyl-Larginine acetate (L-NMMA) (Sigma) Nitrite (NO2- ), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể là 100 μl môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μl Griess reagent: 50 μl của 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μl 0,1% (w/v) N-1- naphthylethylenediamine dihydrochloride ph trong nước Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank) Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS)

Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % Ức chế = 100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] * 100

2.4.5 Phương pháp Docking phân tử trên phần mềm Autodock

Mô hình tính toán docking phân tử in silico ding model được nhóm nghiên cứu chúng

tôi tham khảo tài liệu [26-32]và mô tả thành một chương trình tổng quát trong sơ đồ Hình 3.6 Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên tài liệu [31]và thực hiện trên mục tiêu đích là receptor, một enzyme có tên 2VF5: PDB, được thu nhận từ ngân hàng dữ liệu protein Để việc tính toán có giá trị đối với chất nhận hay receptor phải xác định được tâm hoạt tính[4] Đối với chất nhận enzyme, 2VF5 này có 1 tâm hoạt tính là chuỗi X và tâm hoạt tính tương ứng là(X=26.57, Y=22.69, Z=8.11) Tính toán với một ligand đã xác định chí có tâm hoạt tính của ligand C tồn tại trong enzyme đích 2VF5 là có năng lượng tự do Gibbs, ΔGo ở 25oC của 1 ligand docking hay còn gọi là pose với 2VF5 là âm nhất tương ứng với tương tác bền nhất Để đánh giá giá trị của phương pháp phải xem xét các pose ligand có được liên kết đến cùng một túi hoạt động của enzyme hay còn gọi là liên kết đến emzyme pocket hay còn gọi

Trang 32

Hình 2.5 Quy trình docking của thuốc (ligand) đến DNA của protein

Trang 33

3.2 Xử lý nguyên liệu ban đầu

Cây lá lốt được thu hái và rửa để loại bỏ bụi bẩn, sau đó để khô trong bóng râm tránh ánh nắng mặt trời trực tiếp

Cây lá lốt sau khi khô được xay nhỏ được đem đi ngâm với cồn 96o trong 3 ngày Sau đó dịch ngâm được lấy ra bằng phương pháp lọc Phần bã được tiếp tục ngâm với cồn 96o

trong 3 ngày Lập lại quá trình này 3 lần tính từ lần đầu tiên ta thu được dịch chiết lá lốt Cô quay dịch chiết lá lốt ở máy quay chân không ta thu được cao toàn phần (cao tổng)

− Khối lượng cây lá lốt tươi: 20kg − Khối lượng bột lá lốt khô: 3kg − Khối lượng cao tổng: 230g

Trang 34

Xay nhỏ

Lọc, cô quayNgâm tĩnhEthanol

230 g cao tổng lá lốt

Hình 3.2 Quy trình xử lý nguyên liệu ban đầu 3.3 Phân lập và tinh chế hợp chất từ cây lá lốt

3.3.1 Phân chia cao tổng thành cao phân đoạn

Cao toàn phần cây lá lốt được tiến hành chiết rắn-lỏng và được giải ly với lần lượt các dung môi Hexan, Ety axetat, Methanol Các phân đoạn ứng với các dung môi này được đem đi cô quay ở máy cô quay chân không để thu được cao phân đoạn

230 g cao tổng lá lốt

Trang 35

− Khối lượng cao là 50 g

Cao EA được tiến hành sắc kí cột pha thuận với hệ dung môi giải ly Hexan : Ety axetat : methanol với tỉ lệ lần lượt là 20:1:0.2, 16:1:0.2, 10:1:0.2, 4:1:0.2 và cuối cùng là methanol 100%

Hình 3.4 Sắc kí lớp mỏng (TLC) của cao EA với các hệ dung môi

Dung dịch giải ly được chứa trong các hũ bi thuỷ tinh Dung dịch của giải ly này được gom lại với nhau bằng cách sử dụng sắc lý lớp mỏng (TLC) Những lọ cho các vết giống nhau trên TLC được gom chung lại Sắc kí lớp mỏng TLC ở đây hiện hình bằng thuốc thử 2% H2SO4/EtOH 50% Kết quả sắc kí cột trên cao Ea của cây lá lốt thu được 18 phân đoạn kí hiệu lần lượt từ PLE A1-PLEA18

Trang 36

(0.1838 g)PLEA2(4.6853 g)

PLEA3(5.8085 g)

PLEA4(10.6518 g)

PLEA11(0.1963 g)

PLEA12(0.5861 g)

PLEA9(9.8034 g)

PLEA13(0.6176 g)

PLEA14(2.87 g)

PLEA8(4.6964 g)

PLEA7(3.4709 g)

PLEA5(1.2003 g)

PLEA6(3.1538 g)

PLEA15(0.1925 g)

PLEA16(0.8486 g)

PLEA17(0.6993 g)

PLEA18(0.4899 g)

PLEA10(0.0124 g)

Hình 3.5 Quy trình phân lập cao Ea

Hình 3.6 TLC của các phân đoạn được phân lập từ cao Ea

Trang 37

3.3.3 Khảo sát phân đoạn PLEA8

Sau khi triển khai sắc kí cột trên cao phân đoạn Ea và thu được 18 phân đoạn nhỏ Sử dụng TLC ta thấy PLEA8 có vết to, rõ, khối lượng lớn nên ta tiến hành hành khảo sát TLC để tìm hệ dung dung môi thích hợp và tiến hành sắc kí cột trên hệ dung môi thích hợp

− Khối lượng PLEA8 là 4.6964 g

Hệ dung môi giải ly là ete dầu hỏa : ethyl acetate : methanol với tỉ lệ lần lượt là 15:1:0.2, 12:1:0.2 và cuối cùng là methanol 100%

Hình 3.7 TLC của phân đoạn PLEA8 với các hệ dung môi

Dung dịch giải ly được chứa trong các hũ bi thuỷ tinh Dung dịch của giải ly này được gom lại với nhau bằng cách sử dụng sắc lý lớp mỏng (TLC) Những lọ cho các vết giống nhau trên TLC được gom chung lại Sắc kí lớp mỏng TLC ở đây hiện hình bằng thuốc thử 2% H2SO4/EtOH 50% Sau khi triển khai sắc kí cột trên phân đoạn PLEA8 của cây lá lốt thu được 17 phân đoạn kí hiệu lần lượt từ PLEA81-PLEA817