nghiên cứu phân lập hợp chất từ ethyl acetat cây ngải cứu và tác dụng ức chế tnf alfa định hướng điều trị bệnh viêm khớp

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG Sinh viên thực hiện :HỒ THỊ LAN Lớp:DHHC14B MSSV:18085361 Khóa:2018-2022 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022 862410065

Trang 1

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022

Nghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khop

Nghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khop

86Monday, June 10, 20245:53:54 PM5:53:54 PM86Monday, June 10, 20245:53:54 PM5:53:54 PM86Monday, June 10, 20245:53:54 PM5:53:54 PM

86Nghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopMonday, June 10, 2024

Trang 2

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG

Sinh viên thực hiện :HỒ THỊ LAN Lớp:DHHC14B

MSSV:18085361 Khóa:2018-2022

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Nghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khopNghien cuu phan lap hop chat tu ethyl acetat cay ngai cuu va tac dung uc che TNF alfa dinh huong dieu tri benh viem khop

Trang 3

- Tìm hiểu về cây ngải cứu, bệnh viêm khớp

- Tìm hiểu về quá trình tách chiết các hợp chất ,các kỹ thuật sắc ký (SKC, SKLM, SK gel, nhựa trao đổi ion) để phân lập chất tinh khiết

- Đánh giá hoạt tính sinh học kháng viêm trên mô hình tế bào gây viêm, và đại lượng theo dõi ở dây là TNF-alfa

- Tìm hiểu các kỹ thuật phổ để xác định cấu trúc NMR,MS

- Tìm hiểu về phương pháp molecular docking model và pharmacokinetic 3 Ngày giao nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp: 9/2021

4 Ngày hoàn thành đồ án tốt nghiệp: 7/2022

5 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS.TS LÊ TIẾN DŨNG

Tp Hồ Chí Minh, ngày… tháng… năm 2022

Chủ nhiệm bộ môn chuyên ngành

Giáo viên hướng dẫn

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Trong cuộc sống chúng ta đã trải qua muôn vàng những khó khăn trở ngại: vấp ngã có ,thành công có,thất bại có… Và trên thực tế không có sự thành công nào là không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô ở Khoa Công nghệ Hóa học – Trường Đại học Công nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường Và đặc biệt, trong học kỳ này nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài khóa luận này của em rất khó có thể hoàn thiện được

Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy PGS.TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN, PGS.TS.LÊ TIẾN DŨNG đã tận tâm chỉ dạy và hướng dẫn cũng như hỗ trợ cho em rất nhiều trong thời gian làm đồ án Những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu mà thầy truyền đạt đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình tiến hành thực nghiệm đồ án và cũng như trong công việc sau này Giúp bản thân em có thể thích nghi và một phần nào đó đỡ bỡ ngỡ hơn với công việc trong tương lai

Trong quá trình thực hiện đồ án, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo khóa luận, khó tránh khỏi sai sót, rất mong các thầy (cô) bỏ qua Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp thầy (cô) để em học hỏi thêm được nhiều kinh nghiệm hơn và có thể hoàn thành một cách tốt nhất bài luận của mình

Em xin chân thành cảm ơn!Và kính chúc quý thầy (cô) sức khỏe và bình an!

TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2022

Sinh viên thực hiện

(Ghi họ và tên)

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 5

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 09 năm 2022

Giáo viên hướng dẫn

Trang 6

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢNBIỆN

Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2022

Giáo viên phản biện

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 7

1.2 Về phân loại khoa học 1

2 Đặc điểm thực vật học 1

3 Nguồn gốc 2

4 Công dụng của cây ngải cứu 2

4.1 Trong y học dân gian 2

4.2 Dược tính của ngải cứu 3

4.3 Một số chế phẩm có chiết xuất từ ngải cứu 3

4.4 Một số món ăn được chế biến từ lá ngải cứu 4

5 Về thành phần hóa học và thành phần dinh dưỡng 5

5.1 Về thành phần hóa học 5

5.2 Về thành phần dinh dưỡng trong cây ngải cứu 6

II Tổng quan về viêm xương khớp 6

3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 9

III Tổng quan về quá trình tách chiết các hợp chất 9

1 Lịch sử hình thành và khái niệm quá trình tách chiết 9

2 Ưu và nhược điểm của quá trình tách chiết 10

2.1 Các phương pháp tách chiết 10

2.1.1 Phương pháp chiết lỏng – rắn 10

2.1.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 12

IV Tổng quan về các phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất tinh khiết 12

Trang 8

1 Sắc ký lớp mỏng 12

2 Sắc ký cột 13

3 Sắc ký Gel 14

4 Sắc ký trao đổi ion 14

V Tổng quan về phương pháp Docking phân tử 14

3 Mục tiêu nghiên cứu 18

4 Nội dung nghiên cứu 18

5 Phương pháp nghiên cứu 18

5.1 Phương pháp điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ cây ngải cứu 18

6 Quy trình điều chế các loại cao chiết 19

6.1 Thuyết minh quy trình 21

7 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 24

7.1 Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw 264.7 24

7.2 Thử hoạt tính kháng viêm 26

7.2.1 Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO 26

7.2.2 Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định cytokine TNF-α 268 Phương pháp docking phân tử trên phần mềm Autodock 27

9 Phương pháp xác định dược động học pharmacokinetic (hay còn gọi là ADMET) 29

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

I Kết quả 30

1 Kết quả điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ cây ngải cứu 30

2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm 31

2.1 Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw 862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 9

4.1 Kết quả docking của cấu dạng của ligand AV9 40

4.2 Kết quả docking của Ligand AV9 với chuỗi C của phân tử protein 4WCU 42

4.3 Kết quả docking của Ligand AV8 với chuỗi C của phân tử protein 4WCU 43

5 Kết quả phương pháp Pharmacokinetic (ADMET) 46

5.8 Quy tắc độc tính trong điều chế 54

CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

I Kết luận 55

1 Điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất 55

2 Về đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp của cao chiết và các hợp chất phân lập từ dược liệu ngải cứu 55

2.1 Thử độc tính của cao chiết và các chất phân lập từ ngải cứu trên tế bào Raw 264.7 55

Trang 10

2.2 Thử hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO 552.3 Thử Hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp xác định cytokine TNF-α 56

II Đề nghị 56

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 11

Bảng 2 2: Tên thiết bị 17

Bảng 2 3: Tên dụng cụ 17

Bảng 3 1: Kết quả điều chế cao chiết và phân lập hợp chất từ dược liệu ngải cứu 30

Bảng 3 2: Kết quả khảo sát độc tính với nồng độ khác nhau trên tế báo Raw 264.7 của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu 31

Bảng 3 3: Kết quả khảo sát sản sinh NO với nồng độ khác nhau trên tế báo Raw 264.7 của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu 32

Bảng 3 4: Đánh giá mức độ tiết TNF-α của các phân đoạn cao chiết 33

Bảng 3 5: Dữ liệu phổ và (+)-medioresinol 37

Bảng 3 6: Dữ liệu phổ và (+)-syringaresinol 39

Bảng 3 7: Các giá trị quan trọng tính toán từ mô hình mô phỏng, in silico docking model giữa ligand cấu dạng bền nhất và cấu trúc tinh thể của enzyme đích, 4CWU: PDB 40

Bảng 3 8: Đặc tính hóa lý của AV8 và AV9 47

Bảng 3 9: Dược tính của AV8 và AV9 48

Bảng 3 10: Sự hấp thụ của AV8 và AV9 49

Bảng 3 11: Sự phân bổ của AV8 và AV9 50

Bảng 3 12: Sự trao đổi chất của AV8 và AV9 51

Bảng 3 13: Sự bài tiết của AV8 và AV9 52

Bảng 3 14: Độc tính của AV8 và AV9 53

Bảng 3 15: Các quy tắc về độc tính của AV8 và AV9 54

Trang 12

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1: Các bộ phận cây ngải cứu 1

Hình 1 2: Một số hình ảnh về cây ngải cứu 2

Hình 1 3: Hoa và lá cây ngải cứu 2

Hình 1 4: Mặt nạ làm từ cây ngải cứu 3

Hình 1 5: Dược phẩm hỗ trợ bổ huyết,điều kinh và nhang làm từ ngải cứu 4

Hình 1 6: Gà hầm ngải cứu 4

Hình 1 7: Nước nấu ngải cứu 4

Hình 1 8: Cá hấp ngải cứu 4

Hình 1 9: Cháo gà ác hầm ngải cứu 5

Hình 1 10: Cấu trúc phân tử hợp chất flavonoid 5

Hình 1 11: Hợp chất của cumarine 5

Hình 1 12: Một số hợp chất trong tinh dầu cây ngải cứu 6

Hình 1 13: So sánh khớp thường và VKDT 8

Hình 1 14: Cơ chế bệnh sinh của VKDT 8

Hình 1 15: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng 9

Hình 1 16: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng 11

Hình 1 17: Sơ đồ mô tả quá trình chiết bằng lôi cuốn hơi nước 12

Hình 2 1: Quy trình phân lập các hợp chất 19

Hình 2 2: Sơ đồ tổng quát quy trình phân lập hợp chất mới 20

Hình 2 3: Sơ đồ quy trình phân lập hợp chất mới 21

Hình 2 4: Các cao phân đoạn sau khi chạy SKC 22

Hình 2 5: Chấm TLC phân đoạn AVEA1,2,3,4,5 22

Hình 2 6: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.1,3.2,3.3 so với mẫu AVEA3 22

Hình 2 7: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1 22

Hình 2 8: Chấm TLC phân đoạn AVEA 3.3.1so với mẫu 23

Hình 2 9: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1 trên bản đảo 23

Hình 2 10: Chạy SKC đảo 23

Hình 2 11: Hiện hình phân đoạn AVEA3.3.1.1 trong acid và cạo bản 24

Hình 2 12: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.2.3 24

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 13

viêm 28

Hình 3 1: Cấu trúc của hợp chất AV8 30

Hình 3 2: Cấu trúc của hợp chất AV9 30

Hình 3 3: Đồ thị biểu diễn khả năng gây độc trên tế bào Raw 264.7 của cao chiết từ dược liệu ngải cứu so với Neg 32

Hình 3 4: Đồ thị biễu diễn khảo sát sản sinh NO với nồng độ khác nhau trên tế báo Raw 264.7 của cao tổng và các cao chiết phân đoạn của dược liệu ngải cứu 32

Hình 3 5: Đồ thị biễu diễn mức tiết TNF-α trên tế bào Raw 264.7 của cao chiết từ dược liệu ngải cứu 33

Hình 3 6: Cấu trúc hóa học của Medioresinol 33

Hình 3 7: Cấu trúc 7,9′:7′,9 diepoxylignan 34

Hình 3 8: Cấu trúc hóa học của hợp chất COGE6: (+)-medioresinol 35

Hình 3 9: Cấu trúc hóa học của hợp chất AV9: (+)-Syringaresinol 37

Hình 3 10: Cấu dạng của Hydrogen hình thành xung quanh ligand AV9 40

Hình 3 11: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 312 của Ligand AV9 và enzyme ,4WCU 41

Hình 3 12: Bản đồ Ligand trình bày các tương tác bậc hai giữa các amino acid của protein và pose 312 của Ligand AV9 41

Hình 3 13: Cấu dạng Hydrogen của Ligand AV9 với chuỗi C của 4WCU 42

Hình 3 14: Trình bày các tương tác quan trọng giữa pose 420 của Ligand AV9 và enzyme trên chuỗi C của 4WCU 42

Hình 3 16: Biểu diễn lực tương tác trên cấu trúc của AV9 43

Hình 3 17: Cấu dạng Hydrogen của Ligand AV8 với chuỗi C của 4WCU 44

Trang 14

Hình 3 19: Bản đồ Ligand trình bày các tương tác bậc hai giữa các amino acid của

protein và pose 237 của Ligand AV8 45

Hình 3 20: Biểu diễn lực tương tác trên cấu trúc của AV8 45

Phụ lục Hình S 1: Phổ 1H-NMR của L-AV-8 60

Trang 15

EtOH Ethanol Cồn NO3- Nitrate

NO2- Nitrite NO nitric oxide

MTT

(3-(4, 2,5-diphenyltetrazolium bromide)

LPS lipopolysaccharide Tác nhân gây viêm DMSO Dimethyl sulfoxide

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13)

1H-NMR Hydro (1) Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)

Trang 16

Multiple Bond Cohenrence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

dd Doublet of doublet Mũi đôi đôi

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 17

Trong những thống kê gần đây ở Việt Nam nói chung và các nước trên thế giới nói riêng có thể nói bệnh xương khớp là một trong những loại bệnh phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng trẻ hóa

Theo các chuyên gia xương khớp, các bệnh về cơ xương khớp nếu không được chữa trị kịp thời sẽ gây biến chứng nguy hiểm, ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe Người bệnh có thể bị giảm khả năng vận động, tăng nguy cơ mắc bệnh về tim, thận, biến dạng khớp, teo cơ… nghiêm trọng hơn là bại liệt suốt đời Hiểu được tính cấp bách và tầm nghiêm trọng của

nó ,chúng tôi đã quyết định chọn cây ngải cứu (Artemisia VulgarisL )có nguồn gốc từ thiên

nhiên với nhiều tính năng ,công dụng đa dạng cùng với phương pháp kỹ thuật sắc ký trong hóa hoc để phân lập các hợp chất có khả năng kháng viêm trên mô tế bào gây viêm Theo như các nghiên cứu từ các tài liệu nước ngoài cho thấy lá ngải cứu có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học như: Aesculetine(6,7-dihydroxycoumarin), Scopoletine (7-hydroxy-6- methoxycoumarin), Jaceosidine (4,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyflavone), Eupafoline (6-methoxy-5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavone), Leuteolin(3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone), Apigenin(4’,5,7trihydroxyflavone), Tricine(5,7,4’-trioxy-3’,5’-dimethoxylflavone),… Các chất này có khả năng ức chế rất tốt sự tăng trưởng của các tế bào ung thư vú và ung thư cổ tử cung, kháng khuẩn, kháng viêm Ngoài ra các thành phần trong cây ngải cứu còn có rất

nhiều công dụng hữu ích cho sức khỏe con người Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu phân lập hợp chất từ ethyl acetat cây ngải cứu và tác dụng ức chế TNF-alfa định hướng điều trị bệnh viêm khớp” hi vọng sẽ giải quyết được một phần nào đó những vấn đề cấp thiết về

căn bệnh này ,bên cạnh đó giảm giá thành sản xuất và góp phần đưa quy trình nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn nhằm phục vụ cho ngành y tế và đời sống con người

Trang 18

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

I Tổng quan về cây ngải cứu 1 Đặc tính sinh thái [1] 1.1 Về tên gọi

- Tên khoa học: Artemisia VulgarisL

- Tên thường gọi: ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh ti …

- Tên gọi khác: Mugwort (Anh), sagebrush, Wormwood, AbsinthArmoise commune (Pháp),

1.2 Về phân loại khoa học

Giới : Plantae

Ngành : Angiospermae Lớp : Asterids Bộ : Asterales Họ : Asteraceae Chi : Artemisia Loài : A vulgaris

Hoa Mọc thành cụm ,bông hoa nhỏ (dài ~ 5 mm), hoa có màu vàng hoặc màu hồng hoa trổ từ tháng 7 – tháng 10

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 19

Loài cây này được trồng trên các loại đất không chứa nhiều đạm.Hầu hết các hộ gia đình trồng ngải cứu xung quanh nhà với quy mô nhỏ, chủ yếu làm rau ăn, chưa thấy trồng và thu hoạch ở quy mô lớn

4 Công dụng của cây ngải cứu 4.1 Trong y học dân gian

Loại cây này được biết đến không chỉ như một loại thực vật mà còn dùng làm thực phẩm (hầu hết là gia vị) ,dùng để làm rau ăn tốt cho cơ thể ,giúp giải nhiệt và thanh mát

Còn là nguồn dược liệu Cây ngải cứu được ví như một vị thuốc chữa được rất nhiều bệnh như: trị mụn, trị mẩn ngứa,trị cảm cúm ,ho,đau họng,đau xương khớp,giảm đau đầu và cầm máu tốt do trong ngải cứu có tính kháng viêm…Không những thế còn dùng phổ biến trong ngành châm cứu có tác dụng lưu thông mạch máu, khôi phục sức khỏe

Có tác dụng rất tốt đối với phụ nữa mang thai : giúp an thai, trị các bệnh đau bụng ra máu.Ngoài ra khi uống ngải cứu với nước ấm giúp điều hòa kinh nguyệt,không gây đau bung hay mệt mỏi

Trang 20

Trong thành phần ngải cứu có chứa viamin B6 và vitamin C glucose, absinthine, tannin, axit malic, azulene và cadinene vì vậy giúp tăng cường đề kháng ,giảm đau hạ sốt …

4.2 Dược tính của ngải cứu [1] [2]

Ngải cứu còn được biết đến là một loại thuốc thảo dược rất tốt.Đặc biệt là bộ phận lá cây được sử dụng với nhiều dược tính quan trọng:Giusp giảm thiếu máu, phòng chống bệnh dạ dày ,chống giun sán chống co thoắt phế quản,hỗ trợ miễn dịch và cân bằng hocmon Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy ngải cứu có khả năng giúp điều trị bệnh trĩ và viêm âm đạo

Trên thế giới, một nghiên cứu đã phân lập được trong lá ngải cứu hơn hai mươi flavonoid, nhiều nhất là Jaceosidine, Leuteolin, Quercetin và Eupafoline, Kaempferol Các chất này là những flavonoid có hoạt tính mạnh, có tác dụng chống viêm, làm giảm sự tăng sinh các tế bào gây hại Chúng có tác dụng điều trị ung thư tiazofurin trên các tế bào ung thư biểu mô buồng trứng của người và trị ung thư carboxytriazol trên tếbào ung thư biểu mô vú

Mặc khác trong ngải cứu có thành phần tinh dầu (chủ yếu là monoterpenoid) giúp xua đuổi côn trùng và khử khuẩn rất tốt Tuy nhiên, vì tinh dầu chứa hàm lượng thuyone đáng kể, nên dùng quá liều có thể dẫn tới ngộ độc cấp, gây nên tình trạng ảo giác, hoang tưởng… Tóm lại ngải cứu có công dụng đa năng , có giá trị rất hữu ích cho nền y học cổ truyền và y học hiện đại

4.3 Một số chế phẩm có chiết xuất từ ngải cứu

Trang 21

Trang 22

Hình 1 9: Cháo gà ác hầm ngải cứu 5 Về thành phần hóa học và thành phần dinh dưỡng

5.1 Về thành phần hóa học [1], [2]

Theo một số nghiên cứu về thành phần hóa học đã được công bố trong cây ngải cứu, có thành phần chủ yếu là flavonoid (loại trihydroxyflavone và tetra hydroxyflavone, dẫn xu ất coumarine ) và tinh dầu với hàm lượng từ 0,20 –0,34%(trong đó chiếm đến 90% là 1,8–cineole, thujonevà germacrene D (41,46%), -caryophyllene (11,94%) là 2 chất này có thể đảm bảo mùi đặc trưng của tinh dầu trong một thời gian dài hơn) [1]

Dịch chiết từ thân và rễ ngải cứu chứa lactone sesquiterpen như artevulgarin và dehydromatricarin,… trong đó artevulgarin là một chất mới chưa được tìm thấy trong tự nhiên

Ngoài ra trong ngải cứu còn có hợp chất của indole, xeton, matricaria este dehydro, tetradecatrilin, tricosanol, arachyl alcol, chất màu, vulgarin, profilin, các acid amin như adenin, cholin,

Hình 1 10: Cấu trúc phân tử hợp chất flavonoid

Hình 1 11: Hợp chất của cumarine

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 23

Hình 1 12: Một số hợp chất trong tinh dầu cây ngải cứu [1]

5.2 Về thành phần dinh dưỡng trong cây ngải cứu

Trong 100 g lá ngải cứu tươi thì có thành phần dinh dưỡng như sau:

Vị trí tổn thương chủ yếu là sụn khớp-sụn là mô bao bọc các đầu xương có vai trò làm giảm ma sát và đảm bảo các đầu xương có thể dễ dàng trượt lên nhau khi vận động khớp Vì vậy khi bị viêm xương khớp làm các khớp khó chuyển động, biến dạng thậm chí các xương lệch khỏi vị trí bình thường Các khớp thường bị viêm đó là các khớp bàn tay, cột sống, đầu gối, hông Bệnh này thường xuất hiện ở lứa tuổi trung niên, đặc biệt từ 40 tuổi trở lên Tuy nhiên viêm xương khớp cũng có thể gặp ở người trẻ đặc biệt là sau các chấn thương tại khớp

Trang 24

1.1 Nguyên nhân gây bệnh:

Có rất nhiều nguyên nhân nhưng thường gặp nhất là viêm sụn và bào mòn sụn khớp, thoái hóa khớp, nhiễm khuẩn tại khớp, chấn thương khớp do

Ngoài ra còn có các nguyên nhân khác như do các rối loạn chuyển hóa (tăng acid uric trong bệnh gút), do hệ thống miễn dịch gây tổn thương các thành phần trong khớp ( nguyên nhân gấy ra bệnh viêm khớp dạng thấp)

1.3 Đối tượng nguy cơ bệnh Viêm khớp

Viêm khớp có thể xảy ra ở hầu hết mọi lứa tuổi kể cả trẻ em nhưng tỷ lệ mắc các bệnh viêm khớp cao ở độ tuổi trung niên do ảnh hưởng của các rối loạn chuyển hóa và tích tụ các chấn thương kéo dài Phụ nữ có tỷ lệ măc cao hơn là nam giới

Do tính chất công việc lao động nặng, tư thế ngồi lâu hoặc sai gây chấn thương tại khớp ,viêm khớp cấp tính và về lâu gây mãn tính

Người béo phì ,thừa cân cũng gây ra bệnh viêm khớp vì bị sức ép tác động lên sụn khớp

Bị ảnh hưởng bởi các rối loạn trao đổi chất lên quá trình nuôi dưỡng các thành phần bình thường và bất thường xuất hiện trong khớp

Các bệnh hệ thống miễn dịch và một số rối loạn di truyền cũng có thể tăng nguy cơ bệnh khớp

 Tìm hiểu sâu hơn và kỹ hơn về loại bệnh này thì có hai loại viêm khớp phổ biến nhất hiện nay là: thoái hóa khớp (Osteoarthritis - OA) và viêm khớp dạng thấp (Rheumatoid arthritis - RA) Nguyên nhân chính gây tàn phế trong 10 loại bệnh gây tàn phế phổ biến và chiếm tỷ lệ cao là bênh VKDT

2 Viêm khớp dạng thấp

VKDT là một bệnh tự miễn do sự hình thành các phức hợp miễn dịch tại màng hoạt dịch khớp gây viêm tại khớp với sự hoạt hóa hàng loạt tế bào gây tăng sinh màng hoạt dịch khớp, hoạt hóa hủy cốt bào, gây phá hủy sụn khớp, đầu xương dưới sụn, dẫn đến xơ hoá, dính và biến dạng khớp

Theo thống kê ở Việt Nam chúng ta, tỉ lệ mắc VKDT chiếm khoảng 0,5 % dân số trong đó nữ giới trên 40 tuổi chiếm 70 – 80% [1] [2]

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 25

Trang 26

- Hướng nội khoa: Dùng thuốc giảm đau, chống viêm nằm trong nhóm kháng viêm steroid ( NSAIDs), thuốc chống thấp khớp thay đổi được bệnh (DMARD), Thuốc tác nhân sinh học

- Hướng ngoại khoa: tiến hành các phẫu thuật khi cần thiết

3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Có rất nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm nhưng chúng tôi chọn tiến hành đánh giá kháng viêm từ các chất phân lập được theo hai phương pháp:

- Cho ức chế sản sinh NO: Gốc tự do •NO được sản sinh ra trong ty thể- một cơ quan hấp thụ chất dinh dưỡng để cung cấp cho tế bào Gốc tự do này khiến cấu trúc tế bào bị hư hại, đứt gãy, mất đi chức năng khiến ty thể hoạt động nhiều hơn đẩy nhanh quá trình tổn thương tế bào gây nên viêm Vì vậy, cần phải ức chế sự sản sinh NO để hạn chế các tổn thương tế bào

- Xác định cytokine TNF-α: Các tế bào lympho T được hoạt hóa trong màng hoạt dịch khớp đã sản xuất nhiều cytokine khác nhau, trong đó có cytokine TNF-α gây viêm màng hoạt dịch kéo dài và làm phức tạp thêm tình trạng viêm

Nhìn chung hai phương pháp này có thể đánh giá nhanh và sàng lọc được nhiều mẫu Sau khi có kết quả các mẫu có khả năng ức chế sản sinh NO tốt thì tiếp tục đem đi đánh giá xác định yếu tố và tiến hành định khung kháng viêm khớp cho cao chiết và các chất phân lập được từ dược liệu ngải cứu Cả 2 phương pháp này được thực hiện trên dòng tế bào đại thực bào Raw 264.7 ( được cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh ) Tế bào đại thực bào chuột Raw 264.7 được nuôi cấy trong môi trường RPMI chứa 10% FBS, được nuôi trong tủ ủ ở 37oC, 5% CO2

III Tổng quan về quá trình tách chiết các hợp chất 1 Lịch sử hình thành và khái niệm quá trình tách chiết

Để tách các chất hữu cơ hầu hết sử dụng phương pháp chiết, còn áp dụng cho các chất vô cơ thì nó mới phát triển từ những năm 40 của thế kỷ Trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây chiết lỏng phát triển vô cùng mạnh mẽ, xâm nhập vào các lĩnh vực nghiên cứu khoa học, kỹ thuật và trở thành một trong những tiến bộ khoa học quan trọng

Hình 1 15: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 27

- Có thể tách riêng những chất có tính chất giống nhau ra khỏi nhau với độ chọn lọc cao

- Thiết lập quá trình chiết rất nhanh và tiến hành một cách liên tục dễ dàng với với số lượng lớn hay nhỏ đều được

- Sử dụng nhiều phương pháp phân tích để phân tích sản phẩm sau chiết - Chất vô cơ và hữu cơ đều có thể chiết được

- Chiết phân tích và sản xuất tách chiết lượng lớn đều có thể áp dụng được Song song với những ưu điểm của nó thì bên cạnh đó nó có 1 số nhược điểm như:

- Trong dung dịch chiết có tạp chất

- Hầu hết chỉ thích hợp ở không gian và quy mô phòng thí nghiệm

2.1 Các phương pháp tách chiết

Qúa trình chiết hợp chất hữu cơ ra khỏi cây, lá, quả có nhiều cách làm tuy nhiên hầu hết xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng- lỏng và chiết lỏng- rắn

2.1.1 Phương pháp chiết lỏng – rắn 2.1.1.1 Phương pháp chiết ngâm dầm

Phương pháp này với ưu điểm thiết bị không quá tốn kém, dễ lắp đặt và sử dụng, không gây quá nhiệt khi đun vì gia nhiệt gián tiếp bằng hơi nước,thực hiện dễ dàng trên lượng mẫu lá hoặc cây lớn nên còn được gọi là đun cách thủy

Tiến hành làm bằng cách: Cho lượng mẫu cây hoặc lá vào bình thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, có nắp đậy để ngâm Vì dung môi hữu cơ có thể hào tan một lượng nhỏ nhựa, gây tạp chất lẫn trong hợp chất có trong mẫu nên trách dùng bình nhựa Ngâm trong một thời gian cố định mẫu được dung môi hòa tan đến khi đạt bão hòa, và không thể hòa tan thêm được nữa, thường được tiến hành ở nhiệt được dưới 100°C, và áp suất 1 atm

2.1.1.2 Phương pháp chiết ngấm kiệt

Đây là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất vì không quá phức tạp ,không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian,chi phí lại rẻ

Phương pháp tiến hành: Ngâm mẫu cây với dung môi trong bình hình trụ thủy tinh có vòi xả dưới đáy trong một thời gian nhất định, hứng erlen hứng ở dưới, ở trên có một bình lóng chứa dung môi chảy vào bình ngấm kiệt này, quá trình này diễn ra liên tục, cần thay thế dung môi mới khi dung môi đã bão hòa hoạt chất Không cần thực hiện liên tục mà ngâm

Trang 28

trong dung môi khoảng 1-2 ngày, rồi thay dung môi mới vào tiếp tục thực hiện quá trình trích ly

2.1.1.3 Phương pháp chiết bằng máy chiết Soxhlet

Ưu điểm của phương pháp này là dù ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất Qúa trình nhanh chóng không phải tốn công lọc và châm dung môi mới, chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện sự chiết

Nhược điểm là chỉ thích hợp cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm vì chiết lượng mẫu lớn cần lặp lại nhiều lần Và đặc biệt trong suốt quá trình chiết, những hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị thủy giải, phân giải hoặc tạo các hợp chất artefact Do đó luôn giữ nhiệt độ sôi mẫu cây giống nhiệt độ sôi dung môi

Hình 1 16: Sự phân bố của một chất tan giữa hai pha lỏng 2.1.1.4 Phương chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước

Phương pháp này chiết các loại hợp chất phải có tính chất bay hơi như tinh dầu ra khỏi cây Ta dùng một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước nó được dẫn sục vào bình khác có chứa mẫu cây, mấu cây có hơi nước thấm qua lôi kéo theo những cấu tử dễ bay hơi,sau đó bay hơi tiếp tục và ngưng tục ở ống sinh hàn Dùng bình lóng để thu được hỗn hợp nước-tinh dầu và lóng lại thời gian sau đó tách giữa 2 pha tinh dầu – nước ra thu được dung dịch cần thiết

Ưu điểm: khá đơn giản dễ làm, thiết bị gọn nhẹ dễ lắp đặt và tháo gỡ với khoảng thời gian tương đối nhanh

Nhược điểm: Một số tinh dầu có cấu tử dễ phân hủy sẽ ảnh hượng và hiệu quả quá trình cũng như không có lợi cho những cây có hàm lượng tinh dầu thấp

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 29

Hình 1 17: Sơ đồ mô tả quá trình chiết bằng lôi cuốn hơi nước 2.1.1.5 Phương pháp chiết bằng cách đun hoàn lưu

Lấy một bình cầu có gắn ống sinh hàn cho mẫu và dung môi vào Đun hoàn lưu cách thủy đến nhiệt độ sôi của dung môi Sau đó tháo hệ thống ra đem bình cầu đi lọc qua giấy lọc Chiết thêm 3-4 lần nữa với dung môi mới cho đến khi kiệt Trong dân gian, dùng để sắc thuốc uống,chứ hiện nay ít ai dùng với dung môi là nước mà dùng hỗn hợp Methanol-nước hoặc Ethanol-nước vì ở nhiệt độ sôi nước hòa tan một số chất có trong mẫu

2.1.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phương pháp này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Được áp dụng để phân chia cao ban đầu thành những cao phân đoạn kết hợp với dung môi có tính phân cực khác nhau Qúa trình chiết dung môi từ kém phân cực đến phân cực tốt Thực hiện cũng khá nhanh và an toàn tuy nhiên còn bắt gặp hạn chế do phải lắc bình lóng nhiều lần nên bị tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp

IV Tổng quan về các phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất tinh khiết

Phương pháp sắc ký ra đời đã giúp hóa học các hợp chất thiên nhiên có được một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh chóng nhờ những tính năng đa dạng, ứng dụng ở nhiều nơi,ở mọi hoàn cảnh và mọi điều kiện Khi chưa được trang bị các máy chuyên dùng hiện đại vẫn có thể áp dụng kỹ thuật sắc ký đơn giản như:

 Sắc ký lớp mỏng  Sắc ký cột

Trang 30

Phương pháp thực hiện:Lấy ra một ít mẫu đem đi hòa tan trong một dung môi dễ bay hơi Dùng ống mao quản được chuốt nhọn dưới ngọn lửa đèn cồn rồi chấm 1 vết nhỏ gọn lên lớp mỏng Sau đó đem đi sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẩu Đặt bản mỏng đó vào bình giải ly có dung môi tương ứng theo chiều thẳng đứng , mẫu chất sẽ kéo các vết riêng biệt ở dưới ,ở giưã hay lên trên bản tùy thuộc vào dung môi giải ly Khi dung môi chạy tới vạch bản mỏng quy định ,lấy ra sấy nhẹ cho khô dung môi ,cho hiện hình axit hoặc soi dưới đèn tử ngoại để xác định vết cần tách chiết

Giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định và được tính như sau:

yxRf 

Trong đó : x- khoảng cách từ vị trí điểm chấm đến trung tâm vết y- chiều dài triển khai của bảng mỏng

2 Sắc ký cột

Trong sắc ký cột, chất hấp phụ cố định được nhồi trong 1 ống hình trụ gọi là “cột” Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các hạt Silicagel để tách các hợp chất thiên nhiên.Tùy thuộc vào lượng chất mà có các cơ chế khác nhau như cơ chế hấp phụ, (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố) ,cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Dung môi để chạy sắc ký cột có thể là từng loại riêng hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi được pha với tỉ lệ thích hợp

Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị cột: cột được rửa thật sạch, tráng với cồn và sấy khô.Sau đó cho bông gòn được vo tròn vào đáy cột Kẹp cột trên giá sao cho nó thẳng đứng ,không bị xiên sẹo.Tiếp đến là chuẩn bị mẫu: Mẫu được đem cân ,hòa tan một ít với dung môi như: Methanol,sau đó cân lượng Silicagel theo tỷ lệ 1/3 hoặc ¼ rồi cho mấu đã hòa tan vào sấy nhẹ cho dung môi bay hơi và khô

Nhồi cột: Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô

Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel,

Sephadex … Lấy lượng Silicagel phù hợp thường là gấp 10 lần đường kính cột ngâm trong dung môi mà để chạy cột trong một khoảng thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột Khuấy đều lên sau đó rót vào cột ,quá trình rót nên gõ nhẹ để hạt Silicagel rơi xuống đều và chặt hơn ,quá trình rót đều để chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột và tránh bọt khí bị giữ trong cột Xả van nhỏ để dung môi chảy đều ra bình hứng.Cho dung môi chảy qua khoảng 5-7 lần để cân bằng cột ổn định và đặc biệt chú ý không được để khô dung môi trong cột làm nứt cột Sau khi cột ổn định cho mẫu khô vào và cho dung môi chạy hệ vào rồi hứng lấy chất cho đến khi chất cần thiết ra hết

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 31

Rửa cột: còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột.Chọn dung môi phân cực mạnh hay yếu để rửa cột phụ thuộc vào hợp chất có bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu để chọn dung môi thích hợp để rửa

3 Sắc ký Gel

Sắc ký gel được dùng để tách các hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử của chúng Trong sắc ký gel,các mạng polimer có lỗ rỗng gọi là pha tĩnh các lỗ rỗng này được phủ đầy bởi dung môi dùng làm pha động và có kích thước đồng nhất mới tách các chất theo trọng lượng phân tử Vì khi tách các phân tử có kích thước lớn hơn thì không lọt vào trong lỗ rỗng vì kích thước nó nhỏ hơn và bị cuốn ra khỏi cột do dung môi ở pha động.Còn nếu các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào trong các lỗ rỗng và bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn

4 Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion là quá trình trao đổi ion trong một dung dịch mà chất điện ly được cho tiếp xúc với nhựa (resin) trao đổi ion Trên bề mặt của nhựa được thế chỗ bằng những ion có cùng điện tích trong dung dịch chất điện ly Các nhựa trao đổi ion này là không tan trong nước nhưng mang nhóm chức có điện tích sẽ liên kết với các đối-ion (contre-ions) trong dung dịch.Nó là nhựa trao đổi anion nếu nhóm chức nhựa có điện tích dương thì đối-ion sẽ có điện tích âm và sẽ trao đổi với các ion âm, còn nếu nhóm chức nhựa có điện tích âm, đối-ion có điện tích dương, nhựa thực hiện trao đổi với các ion dương, nên gọi là nhựa trao đổi cation

V Tổng quan về phương pháp Docking phân tử

Phương pháp này thực hiện trên mô hình sàng lọc ảo in silico [1] nghĩa là sử dụng

phần mềm máy tính để tính toán và phân tích dữ liệu về mối quan hệ giữa hoạt tính và công thức cấu tạo của một hợp chất hóa học

Mục tiêu của phương pháp này là cho phép phân tử cơ chất được dịch chuyển trong không gian xung quanh vùng hoạt động dự đoán của protein Một ligand dẫn truyền thuốc tốt là một ligand nhận diện đủ ba vùng: vùng nhận diện protein (vòng thơm, dị vòng, …) thông qua các amino acid, vùng linker là tương tác ligand thông qua các liên kết hydrocarbon hoặc van der Waals, vùng nhận diện nhóm chức gồm các tương tác ưa nước, hydrogen, … [19]

Chúng tôi tiến hành thực hiện trên mô hình sàng lọc ảo in silico - một trong những mô

hình hiện đại hóa mà được được các nhà nghiên cứu quan tâm Phương pháp này sử dụng tương tác giữ thụ thể và hợp chất để tìm ra cấu trúc ligand dự đoán khả năng liên kết với thụ thể (Receptor – ligand) tốt nhất nghĩa là nó mang mức năng lượng tự do ΔG thấp nhất Sử dụng cấu trúc không gian ba chiều để sàng lọc trên nền tảng cấu trúc chất (SBVS) để mô

Trang 32

phỏng tương tác ảo với các hợp chất có tiềm năng dẫn truyền thuốc tốt bằng phương pháp docking phân tử (Molecular Docking Model) kết hớp với phần mềm AutodockTool

Phương pháp này ưu điểm là giảm thiểu chi phí,tiết kiệm thời gian trong quá trình phát hiện và phát triển thuốc

Mô tả cách thức thực hiện: Dùng phần mềm Docking phân tử (Molecular Docking Model) để dự đoán vị trí , khả năng liên kết thụ thể với hợp chất mang cấu trúc ligand có thể gắn vào tâm hoạt động của phân tử Protein đích (được cung cấp bởi ngân hàng dữ liệu protein RCSB) Bằng phương pháp lắp ghép hàng loạt GRIP sử dụng chức năng tính điểm PLP theo hướng mới để thu nhận nhanh chóng và chính xác sự bắt nguồn từ các protein Trong phương pháp gắn kết GRIP có rất nhiều liên kết: liên kết hydro, tương tác steric, tương tác Vanderwaal, tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện Để tìm kiếm vị trí và cấu trúc đầy đủ trong một liên kết cứng thì các điểm PLP của phương pháp GRIP phải kết nối linh hoạt với các phối tử.Sau đó tiến hành gắn kết phân tử silico của đối chứng để ức chế cấu trúc tinh thể của enzyme gây viêm 4WCU: mã PDB, trên phần mềm AutoDockTools-1.5.6rc3 tiếp tục gắn phối tử vào enzyme đích Xóa bó phân tử nhỏ, phối tử và dị nguyên tử Đối với các phối tử dùng phương pháp MMFF94 và phần mềm Avogadro để tạo ra hình dạng với năng lượng tối ưu nhất Loại bỏ các phân tử nước và thêm Hydro vào cấu trúc tinh thể của protein, được tinh chế bằng cách hiệu chỉnh các phần dư chưa hoàn chỉnh và phần dư còn thiếu để dễ nhìn nhận và quan sát, hydro chuỗi bên thêm vào cấu trúc tinh thể và các vị trí của nó được tối ưu hóa bằng cách tập hợp phần còn lại của thụ thể Thụ thể được tối ưu hóa sau đó được lưu dưới dạng tệp mol và mô phỏng trên phần mềm docking Cấu trúc được xuất ra ở dạng 2D của các hợp chất thử nghiệm và sang 3D để dễ quan sát hơn 862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 33

Cây ngải cứu (Artemisia vulgris L.) Cây ngải cứu được mua ở TP.HCM vào cuối

tháng 11 năm 2021, bộ phận sử dụng bao gồm thân, lá, hoa

Tiến hành tiền xử lý : rửa sạch, hong khô tự nhiên dưới máy quạt hoặc nơi thoáng gió Cây có thể được phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc sấy ở nhiệt độ thấp hơn 60oC, không để bị ẩm hoặc mốc đến khối lượng không đổi

2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1 Hóa chất, thiết bị

6 Nước cất Viện khoa học Vật liệu ứng dụng

Bảng 2 1: Tên hóa chất

Cân kỹ thuật PB 602-S 1 Máy soi UV-VIS 1 Hệ thống cô quay 2 Tủ sấy Binder FD115 1

Trang 34

Hệ thống đun hoàn lưu 1 Lò nung nabertherm 1

Bảng 2 2: Tên thiết bị 2.2 Dụng cụ

2 Bình cầu cô quay 500 mL, 250 mL, 100 mL 3 Erlen 250 mL, 100 mL 250 mL, 100 mL 4 Cột thủy tinh đường kính từ 2 - 5.5 cm

Trang 35

tiêu:

 Phân lập một số chất mới từ cây ngải cứu

 Đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp của cao chiết từ cây ngải cứu

 Đánh giá khả năng ức chế sản sinh của NO và xác định cytokine TNF-alpha định hướng điều trị viêm khớp

 Đánh giá khả năng thích ứng của cơ thể người với các chất phân lập được bằng phương pháp ADMET để đề phòng các tác dụng phụ trước khi đưa vào điều chế và sản xuất

 Đánh giá hoạt tính kháng viêm chất phân lập được bằng mô hình sảng lọc ảo trên phương pháp docking phân tử

4 Nội dung nghiên cứu

Mẫu sau khi qua giai đoạn tiền xử lý, sử dụng kỹ thuật chiết lỏng- rắn để chiết các cao chiết phân đoạn

Xay nhỏ (200g) và đem đi chiết kiệt nguyên liệu với lần lượt Hexan, Etyl acetat, và Methanol, Ethanol tiến hành đuổi dung môi dưới máy cô quay chân không thu được cao phân đoạn Các chất tinh khiết phân lập được sẽ trích ly từ các cao này với các phương pháp sắc kí Tiến hành gửi mẫu đi đo và đánh giá hoạt tính kháng viêm, đo phổ NMR để xác định cấu trúc và định danh của nó

5 Phương pháp nghiên cứu

Trong bài nghiên cứu này có dùng phương pháp lí thuyết: Thu thập, phân tích, tổng hợp kiến thức từ các tài liệu để viết tổng quan về cây ngải cứu,bệnh viêm khớp,các phương pháp sắc ký và tách chiết

Phương pháp thực nghiệm điều chế các loại cao và phân lập các chất từ cây ngải cứu Phương pháp hóa sinh: Đánh giá hoạt tính tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO và cytokine TNF-α

Mô hình Sàng lọc ảo: Phương pháp docking phân tử

5.1 Phương pháp điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ cây ngải cứu

Mẫu ngải cứu sau khi xay nhỏ được cho vào ngâm trong các bình thủy tinh lớn có nắp đậy Rót Hexan vào bình cho đến khi được hai phần ba bình ngâm Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất thiên nhiên Sau 24 giờ, dung dịch chiết được qua giấy lọc, cô quay để thu hồi dung

Trang 36

môi Còn bã nguyên liệu đó tiếp tục lặp lại quá trình này với các dung môi Etyl acetate , Methanol và Ethanol thì sẽ thu được các cao ở dạng sệt tạo thành các cao thành phần Hexane( AVH), cao Etyl acetat (AVEA), cao Methanol (AVME), cao Ethanol (AVE) Sau khi chiết ra được một số cao chiết thành phần, để phân lập các hợp chất tinh khiết bằng một số phương pháp sắc kí

 Sắc ký lớp mỏng một chiều  Sắc ký cột áp xuất thường  Sắc ký cột đảo áp xuất thường  Kéo bảng và cạo bảng

Sau đó sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều tại phòng NMR Viện Hóa học-Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là TMS để xác định cấu trúc các hợp chất

6 Quy trình điều chế các loại cao chiết

Ngải cứu 200g

Cao HexanBã nguyên liệu

Dịch Etyl acetat

Cao Etyl acetat

Bã nguyên liệuDịch Methanol

Cao Methanol

- Chiết với hexan trong 1 ngày- V hexan: 200 ml; lọc thu dịch lọc

- Bã ngâm thêm 1 ngày với 200ml hexan; lọc

- Chiết với etyl acetat trong 1 ngày- V dung môi: 200 ml; lọc thu dịch lọc

- Bã ngâm thêm 1 ngày với 200ml etyl acetat; lọc

- Chiết với methanol trong 1 ngày- V dung môi: 200 ml; lọc thu dịch lọc

- Bã ngâm thêm 1 ngày với 200ml methanol; lọcCô quay

Trang 37

thườngSắc ký cột đảo áp

suất thường

Kéo bảng

Cạo bảng

Hợp chất mới

Hình 2 2: Sơ đồ tổng quát quy trình phân lập hợp chất mới

Trang 38

AVEA 3(m = 0.35g)AVEA 1

(m = 0.0656g)

AVEA 2(m = 0.2042g)

AVEA 5(m = 0.7136g)AVEA 4

(m = 0.7829g)

AVEA 3.2(m = 0.08g)

AVEA 3.3(m = 0.075g)AVEA 3.1

Sắc ký cột áp suất thường

Sắc ký cột đảo áp suất thường AVEA 3.3.1.1(m = 0.032g)

Kéo bảng

Cạo bảng

L-AV-1(m = 0.006g)

L-AV-2(m = 0.01g)

Hình 2 3: Sơ đồ quy trình phân lập hợp chất mới 6.1 Thuyết minh quy trình

Từ cao phân đoạn AVEA chạy SKC với 4 hệ dung môi: 8Hex:2EA ; 8Hex:1EA;15Hex:1EA ; 2Hex:1EA ta thu được 5 phân đoạn AVEA1; AVEA2; AVEA3; AVEA4; AVEA5.Tiến hành cô quay và cân khối lượng mẫu

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM

Trang 39

Hình 2 4: Các cao phân đoạn sau khi chạy SKC

 Chấm TLC :

Hình 2 5: Chấm TLC phân đoạn AVEA1,2,3,4,5

Sau khi chấm TLC ta nhận thấy rằng phân đoạn AVEA3 có vết khá rõ ràng nên từ phân đoạn AVEA3 chạy SKC với hệ dung môi :15Hex:2EA:0.1Me ta được 3 phân đoạn: AVEA 3.1; AVEA 3.2; AVEA 3.3.Tiếp tục cô quay và cân khối lượng mẫu

 Chấm TLC:

Hình 2 6: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.1,3.2,3.3 so với mẫu AVEA3

Phân đoạn AVEA3.3 tiếp tục chạy SKC với hệ dung môi: 15Hex:1EA:0.1Me ta được phân đoạn AVEA3.3.1

 Chấm TLC:

Hình 2 7: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1

Trang 40

Hình 2 8: Chấm TLC phân đoạn AVEA 3.3.1so với mẫu

 Châm TLC bản đảo phân đoạn AVEA 3.3.1:

Hình 2 9: Chấm TLC phân đoạn AVEA3.3.1 trên bản đảo

Chấm trên bản đảo vẫn còn chất dơ và tạp chất nên tiến hành chạy sắc ký cột đảo áp suất thường với hệ dung môi: 2Me-1H2O.ta được phân đoạn AVEA3.3.1.1,cô quay và cân khổi lượng

Hình 2 10: Chạy SKC đảo

Sau khi chấm TLC và nhận thấy rằng phân đoạn này tách chất ra xa và khá rõ vết với hệ dung môi 4Ch-1EA, cô quay cân khối lượng mẫu và tiến hành phương pháp kéo bảng ,cạo bảng

862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM862410065:53:53 PM5:53:53 PM