Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện phá vỡ tế bào với acid hữu cơ kết hợp sóng siêu âm; loại dung môi tách chiết và
TỔNG QUAN
Tổng quan về chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa
Nấm men Rhodotorula mucilaginosa thuộc chi Rhodotorula, họ Sporidiobolaceae, bộ
Sporidiales, lớp Pucciniomycotina, ngành Basidiomycota và giới Fungi (Jack W Fell và cộng sự, 2000; Mycobank, 2022) Vào năm 1928, R mucilaginosa đã được F.C Harison đã phân lập thành công và đặt tên
2.1.1 Đặc điểm về hình thái và sinh học
Hầu hết các loài Rhodotorula tạo ra các khuẩn lạc có màu từ hồng đến san hô nhưng cũng có thể có màu cam đến đỏ trên thạch Sabouraud do có sự hiện diện của sắc tố carotenoid Kích thước khuẩn lạc khoảng 2 - 3 mm, bề mặt khuẩn lạc mịn, ẩm và đôi khi nhầy, chúng không có khả năng sinh bào tử Chúng có dạng tế bào hình tròn hoặc hình bầu và sợi giả hiếm khi xuất hiện (Lanzafame M và cộng sự, 2001)
Thuật ngữ “men đỏ” được sử dụng cho những loài có thể tạo ra một lượng sắc tố carotenoid đáng kể và lipid nội bào, làm cho khuẩn lạc của chúng có màu cam, hơi hồng hoặc đỏ (Mannazzu và cộng sự, 2015) Rhodotorula mucilaginosa là một trong những loài thuộc “men đỏ”, là loại nấm men có triển vọng trong ứng dụng công nghiệp cho những năm gần đây (Li và cộng sự, 2022)
Hình 2.1: Khuẩn lạc nấm men R.mucilaginosa (Li và cộng sự, 2022)
R mucilaginosa thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn hoại sinh, chúng tồn tại ở trạng thái đơn bào và không có sợi nấm, có hầu hết các đặc điểm của nấm men (Li và cộng sự, 2022)
Tế bào R mucilaginosa không chỉ giàu chất dinh dưỡng thông thường như carotenoid, protein và polysaccharides mà còn chứa các acid amin, acid béo không bão hòa, vitamin E, nucleotide và astaxanthin (Gupta, 2012)
Các loài Rhodotorula phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm không khí, đất, nước biển, thực vật, các sản phẩm từ sữa và môi trường gia đình, thậm chí có thể được tách ra khỏi khu vực bị ô nhiễm hoặc các vi sinh vật nội sinh trong đất vùng rễ của thực vật (Ahearn DG và cộng sự, 1962; Saha và Seal, 2015)
2.1.2.1 Sinh tổng hợp sắc tố
Các thành phần carotenoid chính được R.mucilaginosa tổng hợp thường bao gồm β- carotene, torulene và torularhodin (Sharma và Ghoshal, 2021)
Hình 2.2: Cấu trúc của các loại carotenoid đặc trưng tổng hợp bởi R.mucilaginosa
Tuy nhiên, các carotenoid (chủ yếu là lycopene và β-carotene) dùng cho thực phẩm hiện nay chủ yếu được sản xuất công nghiệp bởi nấm mốc Blakeslea trispora (Shi và cộng sự, 2012; He và cộng sự, 2017) Mặc dù sản lượng carotenoid tổng hợp bởi R mucilaginosa tương đối thấp so với B trispora, nhưng việc sản xuất carotenoid cũng có nhiều ưu điểm hơn Ví dụ, tốc độ tăng trưởng cụ thể của R mucilaginosa cao và dễ dàng thu được một lượng sinh khối tế bào đáng kể ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô thí điểm (Dias Rodrigues và cộng sự, 2019; Banerjee và cộng sự, 2020)
2.1.2.2.Sinh tổng hợp chất béo
Sinh tổng hợp lipid diễn ra chủ yếu trong tế bào chất của tế bào nấm men, thông qua một chuỗi các quá trình enzyme chuyển đổi các cơ chất saccharide, glycerol hoặc acetyl- CoA thành acid béo chuỗi dài Hầu hết các acid béo được R mucilaginosa tổng hợp là acid oleic, acid palmitic và acid stearic (Liang và cộng sự, 2021)
Năng suất và hàm lượng lipid sinh tổng hợp từ R mucilaginosa bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tỷ lệ Carbon/Nitrogen cao - yếu tố quan trọng giúp nấm men tích lũy lipid; độ pH; độ acid; thời gian nuôi cấy; nhiệt độ;… (Li và cộng sự, 2022) Hiệu suất lipid cao nhất ở tỷ lệ Carbon/Nitrogen là 65 (6.0 g/L, 46.7 %) (Liang và cộng sự, 2022) Acid béo không bão hòa cao nhất (63.4 %) thu được ở 15 °C với acid béo không bão hòa đơn là 31.38 % và acid béo không bão hòa đa là 32.02 % (Adel và cộng sự, 2021) Hàm lượng lipid tối đa là 69.5 % (trên trọng lượng tế bào khô) ở pH = 5.0 (Karatay và Donmez, 2010)
Enzyme là chất xúc tác cực kỳ hiệu quả, ứng dụng của chúng có thể làm tăng đáng kể hiệu quả và năng suất trong sản xuất quy mô công nghiệp (Hames-Schiffer, 2013)
R mucilaginosa rất được quan tâm vì khả năng tổng hợp enzyme tự nhiên, có thể ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau, đặc biệt là trong sản xuất phenylalanine amoniac lyase, endo-1,4-glucanase và lipase (Li và cộng sự, 2022)
L-phenylalanine amoniac-lyase (PAL; EC 4.3.1.24) là enzyme xúc tác quá trình khử amin L-phenylalanine thành các acid trans-cinnamic và amoniac Loại enzyme này có mặt rộng rãi trong thực vật bậc cao và nấm men, đóng vai trò quan trọng trong chuyển hoá phenylpropanoid Nó là một con đường trao đổi chất thứ cấp hoạt động ở thực vật bậc cao và nấm men, chủ yếu liên quan đến các cơ chế bảo vệ (Koukol và Conn, 1961; Barros và Dixov, 2020) L-phenylalanine amoniac-lyase có thể được sử dụng để sản xuất chất làm ngọt không calo như aspartame (MacDonald và D'Cunha, 2007)
Endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4, EGase), cellobiohydrolase, cellodextrinase và β- glucosi-dase xúc tác quá trình thủy phân cellulose thành cello-oligosaccharide hoặc glucose, cho phép sinh vật sử dụng cellulose làm nguồn carbon (Béguin và Aubert, 1994; Oikawa và cộng sự, 1998; Boyce và Walsh, 2007) Chuyển hóa cellobiose bằng EGase là yếu tố quan trọng giúp làm giảm sự tích lũy cellobiose và nâng cao hiệu quả của enzyme phân giải cellulose để sản xuất năng lượng sinh học (Li và cộng sự, 2022)
Lipase (triacylglycerol acyl hydrolase, EC 3.1.1.3) thuộc nhóm hydrolase, là các enzyme thủy phân triacylglycerol để giải phóng acid béo tự do và glycerol; có trong động vật, thực vật và vi sinh vật (Jensen, 1982; Ejedegba và cộng sự, 2007; Abolemonaem và cộng sự, 2011) được sử dụng phổ biến và nằm trong số các loại enzyme công nghiệp quan trọng nhất (Singh và Mukhopadhyay, 2012) Nhiều ứng dụng công nghệ sinh học của lipase đã được được mô tả trong các ngành công nghiệp thực phẩm, chất tẩy rửa, dược phẩm, dầu và mỡ (Barros và cộng sự, 2010) Các loài Rhodotorula được xem như là nguồn sản xuất lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã có báo cáo cho rằng R mucilaginosa tạo ra lipase có hoạt tính tối đa ở pH 4.0 và 5.0 (Li và cộng sự, 2022) Mặc dù lipase được sản xuất rộng rãi bằng nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật, nhưng chỉ lipase có nguồn gốc vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn và nấm có ý nghĩa về mặt thương mại do tính ổn định, tính chọn lọc, tính đặc hiệu cơ chất rộng cũng như tính dễ dàng khai thác và tiềm năng cung cấp không giới hạn (Hammamchi và Cihangir, 2017) Ngoài ra chúng còn có tính đa dạng trong hoạt tính xúc tác, năng suất cao và chi phí sản xuất thấp và ít sử dụng nguồn tài nguyên hơn nên vì vậy chúng được ưa chuộng hơn
2.1.2.4.Kích hích tăng trưởng và bảo vệ thực vật
Chủng R mucilaginosa JGTA-S1 là một loài nội sinh của thực vật sống ở khu vực bị ô nhiễm kim loại nặng ở Ấn Độ, nó có thể hoạt động như một loại phân bón vi sinh vật và chế phẩm sinh học, nâng cao nguồn cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng và cung cấp nitơ, amoni nhờ khả năng cố định đạm sinh học của nó (Saha và Seal, 2015; Li và cộng sự, 2022)
R mucilaginosa CAM4 có thể được sử dụng làm phân bón sinh học để sản xuất cây trồng một cách lành mạnh và an toàn hơn Tuy nhiên, việc ứng dụng R mucilaginosa trong nông nghiệp vẫn còn tương đối hiếm (Li và cộng sự, 2022)
R mucilaginosa được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống bệnh thối thân ở cây tiêu đen (Li và cộng sự, 2022)
Tổng quan về β-carotene
Carotenoids là họ sắc tố hữu cơ tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong đời sống được tìm thấy trong thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và một số cơ thể sinh vật quang hợp Carotenoids được xem là dưỡng chất màu bởi có nhiều đặc tính tương tự như vitamin tạo ra màu vàng, da cam, đỏ có cả trong giới thực vật và động vật Trong các thực vật, carotenoids được tìm thấy ở trong các lá cùng với chlorophyll trong hoa, quả và rau Trong cơ thể động vật, carotenoids được hòa tan trong mỡ hoặc hóa hợp protein ở pha nước Con người không thể tự tổng hợp carotenoid một cách tự nhiên, và do đó phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng từ chế độ ăn uống Hiện có khoảng 850 carotenoids xuất hiện tự nhiên đã được báo cáo cho đến năm 2018 và chúng được chia thành 2 nhóm chính là xanthophyll và carotene (Maoka, 2020)
2.2.1.1 Lịch sử phát triển của carotenoids
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là vào những năm đầu của thế kỷ 19: carotenoid được tìm thấy trong bột ớt (1817), nghệ tây (1818), điều (1825), cà rốt (1831) và lá rụng mùa thu (1837) Thêm nhiều phát hiện về carotenoids đã được đặt tên trong suốt những năm
1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết đến, trong đó năm 1827 thì Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong lá cây là xanthophylls Năm 1906, Zwet đã thành công trong việc tách carotene, xanthophyll và diệp lục từ lá xanh bằng sắc ký cột Sau đó, nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của β-carotene (C40H56) vào năm 1907
Và cấu trúc này đã được giải thích, làm sáng tỏ bởi Karrer và Kuhn vào những năm 1930 Hơn nữa, họ còn phát hiện ra rằng β-carotene là tiền chất của vitamin A Họ đã giành được giải thưởng Nobel về hóa học cho công trình này Sau đó, cấu trúc của lutein, zeaxanthin và astaxanthin đã được nhóm của họ công bố Những nghiên cứu về cấu trúc này dựa trên sự phân hủy oxy hóa của carotenoid bằng KMnO4 và các cấu trúc được phân tích bằng phân tích nguyên tố (Maoka, 2020) Mạch polyisopren ở nhiều sắc tố tận cùng bằng vòng ionon, một vài dạng thì mạch mở ra Sự có mặt của nhóm vòng thơm trong cấu trúc carotenoids đã được xác định vào năm 1959
Vào thập niên 1950, nhóm Zechmeister đã nghiên cứu quá trình đồng phân hóa E/Z (cis–trans) của carotenoid (Maoka, 2020) Thời gian sau đó carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như một chất màu thực phẩm Năm 1954, Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids Trong những năm 1970-1980, có rất nhiều những nghiên cứu đã được thực hiện nhằm xác định sự phù hợp của β-carotene sử dụng trong thực phẩm và hoạt động của nó trong cơ thể người Và những năm đầu thập niên 80, β-carotene được đề nghị có thể hữu ích trong việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hóa
Kể từ khi Kuhn và Karrer làm sáng tỏ cấu trúc đầu tiên của β-carotene vào năm 1928–
1930, khoảng 750 carotenoid xuất hiện tự nhiên đã được báo cáo cho đến năm 2004; khoảng
100 loại carotenoid tự nhiên đã được báo cáo từ năm 2004 đến 2018
Các hợp chất carotenoids được tiếp tục tìm thấy và thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau Chúng có thể được thu nhận từ nguồn tổng hợp hóa học (chiếm 70 – 80%) và nguồn tự nhiên (chỉ chiếm 20 – 30%) Ở thực vật, carotenoid có nhiều trong các loại trái cây, rau quả Tiêu biểu như trong cà rốt hàm lượng β-caroten đạt xấp xỉ 87 μg/g; quả gấc có chứa hàm lượng β-caroten khoảng
101.00 ± 38 μg/g và hàm lượng lycopene đạt khoảng 380.00 ± 71 μg/g; trong quả cà chua, hàm lượng β-carotene là 62.00 μg/g và hàm lượng lycopene đạt 114.40 μg/g (Aoki và cộng sự, 2002; Muùler, 1997) Ở động vật, carotenoid góp phần tạo nên màu sắc rực rỡ được quan sát thấy trong bộ lông, da, vảy hoặc lông của nhiều loài động vật như ở các loài chim hay cá, Đặc biệt là nhóm carotene có nhiều trong gan cá, nhất là gan cá thu và ở gan các loài động vật như gà, vịt, heo, và ở một số loài khác như cá, trứng, côn trùng, gia cầm, (Gross, 2012)
Các loại carotenoids còn được sản xuất bởi một số loài vi sinh vật, các loài này phổ biến từ vi tảo đến nấm men, nấm mốc hay vi khuẩn được thể hiện trong bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1: Hàm lượng carotenoid được tổng hợp từ một số loài vi sinh vật
Vi sinh vật Carotenoid Hàm lượng Nguồn TLTK
Flavobacterium R1560 Zeaxanthin 0.63 μg/mL Alcantara & Sanchez,
Flavobacterium multivorum β-carotene 7.78 mg/L Bhosale và Bernstein, 2004
Nấm men và nấm mốc
Rhodotorula glutinis β-carotene 15.71 mg/L Gu và cộng sự, 2008
Rhodotorula graminis β-carotene 2.17 mg/L Buzzini và cộng sự, 2005
Phaffia rhodozyma Astaxanthin 4.7 mg/g Johnson & Carlos, 2011;
Blakeslea trispora β-carotene 139 mg/L Wửstemeyer, 2005;
Haematococcus pluvialis Astaxanthin 5% w/w dry Niizawa và cộng sự, 2021
Dunaliella salina β-carotene 12% w/w dry Masojídek & Torzillo,
Dunaliella bardawil β-carotene 51.750 mg/L Mogedas và cộng sự, 2009
Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính là nhóm Carotenes – gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid (không chứa oxy) và nhóm Xanthophylls (chứa oxy):
Nhóm Carotenes: là mạch hydrocacbon không no; trong cấu tạo phân tử không chứa oxy; không tan trong nước nhưng có khả năng tan trong lipid và các dung môi hữu cơ Carotene có trong các loại rau quả như cà rốt, ớt chuông, gấc, quả mơ, bí ngô, bắp cải, rau
12 spinach, Đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp của Blakeslea trispora, R mucilaginosa và R glutinis sinh khối tạo thành chứa rất nhiều carotene Một số carotene phổ biến như: lycopene, β-carotene, ngoài ra còn có α-carotene, γ-carotene,…(Gross, 2012)
Nhóm Xanthophylls: gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy (như hydroxy, keto, epoxy, methoxy, các nhóm acid carboxylic), phổ biến nhất trong xanthophylls là nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm keto (-C=O) Xanthophylls có màu sắc đa dạng, thường là màu vàng, cam, đỏ và nâu Xanthophylls được tìm thấy rộng rãi trong thực vật và một số vi khuẩn Một số xanthophylls phổ biến bao gồm lutein, zeaxanthin, violaxanthin, và neoxanthin (Gross, 2012)
Hình 2.3: Phân loại carotenoids (Olatunde và cộng sự, 2020)
Carotenoid là các hợp chất tetratecpen (C40H56) được hình thành bởi sự kết hợp của 8 đơn vị isoprene (Ludwiczuk và cộng sự, 2017) Carotenoid có cấu trúc là một mạch thẳng,
8 đơn vị 5-carbon isoprenoit liên kết nhau, và đối xứng qua trung tâm, có sự xen kẻ giữa các nối đôi và nối đơn Một số carotenoid trong cấu trúc có chứa các vòng sáu cạnh, hoặc chứa thêm oxy như các gốc rượu, aldehyde, ketone, carboxylic, epoxy Từ cấu trúc cơ bản này, hầu hết các carotenoid khác có thể được tạo ra thông qua quá trình hydrogenation, cyclization, oxidation hoặc bất kỳ sự kết hợp nào của những quá trình này (Gross, 2012)
Hình 2.4: Cấu trúc của một đơn vị Isoprene (Szmytkowski, C và cộng sự, 2016)
Hình 2.5: Cấu trúc của một số carotenoids phổ biến thuộc nhóm Carotenes
Hình 2.6: Cấu trúc của một số carotenoids phổ biến thuộc nhóm Xanthophylls
Bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, người ta đã xác định được vị trí nhóm -
CH3 và -CH2- trong phân tử Nhóm –CH3 có quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác biệt với nhóm –CH2- được quyết định bởi sprin và prin của các proton trong hệ thống liên kết đôi xen kẽ Phương pháp này đã cho phép xác định được cấu trúc của các nhóm tận cùng ở các carotenoid
Carotenoids thường kết tinh ở dạng tinh thể Tinh thể carotenoids có nhiều dạng khác nhau và kích thước của chúng cũng rất khác nhau: dạng hình kim dài (lycopen, 𝛿-carotene), hình khối lăng trụ đa diện (𝛼-carotene), dạng hình thoi (β-carotene), kết tinh vô định hình (𝛾-carotene)
Nhiệt độ nóng chảy cao: carotenoids nóng chảy ở khoảng 130 – 220 o C
Carotenoids rất nhạy cảm với acid và chất chống oxy hóa, tuy nhiên thì chúng bền vững với kiềm
Tính tan: Độ hòa tan thay đổi theo từng loại dung môi Carotenoids là những chất béo và do đó chúng tan trong các chất béo khác và trong các dung môi như aceton, ethanol, diethylether và chloroform, (Gross, 2012)
Tình hình nghiên cứu
2.3.1 Các nghiên cứu trong nước Đối với tình hình nghiên cứu hiện nay trong nước, carotenoids chủ yếu được tách chiết từ các nguồn thực vật thiên nhiên như rau củ, trái cây, cây, …giàu carotenoid Một số nghiên cứu như Trần Thị Huyền Nga đã nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác định hoạt tính sinh
23 học của một vài carotenoid từ cây cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng (Trần T.H.N, 2010) Nguyễn Thị Mỹ Nhiên đã nghiên cứu chiết xuất chất màu carotenoid từ một số giống bí đỏ tại Việt Nam (Nguyễn T.M.N và cộng sự, 2017) Còn có Nguyễn Thị Hoàng Lan đã nghiên cứu phát triển sản phẩm bột giàu beta-carotene từ quả trứng gà (Pouteria lucuma) (Nguyễn T.H.L và cộng sự, 2019) Ngoài ra còn có Nguyễn Thị Minh Nguyệt từ Trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng làm tăng sức đề kháng cho gà, tăng tỷ lệ đẻ trứng, chất lượng của trứng được cải thiệt nhằm cung cấp nguồn thức ăn sạch cho con người (Nguyễn T.M.N, 2011)
Tuy nhiên, việc trích ly các carotenoids cũng như β-carotene từ nguồn vi sinh vật vẫn chưa phổ biến như nguồn thực vật Gần đây, Nguyễn Minh Lý và Lê Thị Mai đã khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tổng hợp carotenoid của Rhodosporidium paludigenum được nuôi cấy trong môi trường có dịch chiết từ vỏ dứa, kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ vỏ dứa có thể được sử dụng như chất nền để tăng cường khả năng tổng hợp carotenoid từ nấm men R paludigenum Điều kiện nuôi cấy tối ưu để tổng hợp carotenoid là 25 °C, sau 6 ngày ở pH môi trường là 6.0 Hàm lượng carotenoid đạt giá trị cao nhất là.1.33 ± 0.07 mg/g và 6.36 ± 0.54 mg/L (Nguyễn M.L và Lê T.M, 2023)
2.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước
Vào năm 1994, Sandmann G và cộng sự đã nghiên cứu về sự sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật và thực vật, kết quả cho thấy ngoài việc sản xuất hàng loạt carotenoid bằng cách lên men, các carotenoid mới có thể thu được bằng cách kết hợp các gen khác nhau từ các sinh vật khác nhau, ví dụ ứng dụng trong phòng chống ung thư và khối u (Sandmann và cộng sự, 1994)
Việc sản xuất carotenoids bằng các chủng R glutinis trên các nguyên liệu thô khác nhau có nguồn gốc nông nghiệp (nho, syrup glucose, mật củ cải đường, chiết xuất bột đậu nành, chiết xuất bột ngô) đã được nghiên cứu bởi Pietro Buzzini và Alessandro Martini vào năm
2000 Năng suất tối đa (5.95 mg/l tổng lượng dịch nuôi cấy carotenoids, 630 μg/g trọng lượng tế bào khô) sau khi nuôi cấy một mẻ 120 giờ trong chất nền chứa hèm nho đã được tinh chế đậm đặc làm nguồn carbohydrate duy nhất (Pietro Buzzini và Alessandro Martini, 2000)
Yu và Chu năm 2016 đã sử dụng chủng R mucilaginosa để sản xuất carotenoid từ rác thải thực phẩm, kết quả cho thấy độ pH và nhiệt độ tối ưu để tổng hợp carotenoid lần lượt là
5 và 25 °C Tỷ lệ β-carotene, torulene và torularhodin lần lượt là 28.8 %, 48.0 % và 23.2 % trong điều kiện tăng trưởng tối ưu (pH = 5.0 và 25 o C) Sau khi bổ sung các ion kim loại, tổng lượng carotenoid và tăng trưởng sinh khối được cải thiện (Yu và Chu, 2016)
Từ nghiên cứu về sản xuất carotenoid bằng R mucilaginosa trong quá trình lên men nuôi cấy mẻ và nuôi cấy bán liên tục bằng các phụ phẩm công-nông nghiệp của Roudrigues và cộng sự năm 2019 cho thấy R mucilaginosa có khả năng sinh ra carotenoid trong môi trường đó Trong sản xuất hàng loạt, nồng độ cao nhất của tổng carotenoid (1248.50 μg/L) và sinh khối (7.90 g/L) thu được trong môi trường chứa 70 g/L mật mía và 3.40 g/L rượu ngâm ngô ở 25 °C và 180 °C Vòng/ phút trong 168 giờ Trong sản xuất theo mẻ, đạt tổng sản lượng carotenoid là 3726 μg/L và nồng độ sinh khối là 16 g/L (Roudrigues và cộng sự, 2019)
Năm 2022, Li và cộng sự đã nghiên cứu về sự sinh tổng hợp carotenoid, lipid và enzyme của R mucilaginosa, qua đó cho thấy chúng có khả năng sản xuất và tích lũy hơn 40% lipid trong trọng lượng tế bào khô Những lipid này đáp ứng nhu cầu cũng như tiêu chuẩn của dầu diesel sinh học; việc tạo ra dầu diesel sinh học từ nấm men sẽ làm giảm bớt sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch không thể tái tạo Nói chung, chất thải chứa một lượng lớn nguồn carbon, nitơ và một số thành phần muối hữu ích khác cho quá trình xử lý sinh học lên men, có thể cải thiện tính khả thi về mặt kinh tế và giảm thiểu tác động môi trường Hơn nữa, sử dụng cơ chất có chi phí thấp làm nguồn tài nguyên thiên nhiên thay thế sẽ giúp giảm chi phí trong sản xuất công nghiệp Để đáp ứng nhu cầu của các ngành công nghiệp về chế phẩm vi sinh có đặc tính công nghệ sinh học, việc nghiên cứu trực tiếp việc tận dụng chất thải nông nghiệp là rấ cần thiết (Li và cộng sự, 2022)
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nhóm chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài bằng các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm tại trường Đại học Sư phạm Kỹ Thuật TP HCM trong khoảng thời gian từ tháng 08 năm 2023 đến tháng 01 năm 2024.
Nguyên liệu
Nghiên cứu sử dụng chủng giống nấm men R mucilaginosa ATCC® 66034™ được mua từ Microbiologics, Hòa Kỳ và được cấy trên môi trường thạch SDA, sau đó ủ ở nhiệt độ 30 o C trong 72 giờ (3 ngày) đến khi tạo sắc tố màu hồng đến đỏ cam trên bề mặt thạch Chủng giống trên đĩa thạch được bảo quản ở nhiệt độ (-4) ÷ (-6) o C và được cấy chuyển hàng tháng Chủng giống được giữ trong Glycerol ở -40 o C
3.2.2 Hóa chất và môi trường
Bảng 3.1: Danh sách các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Mã code Xuất xứ
Chất chuẩn β-carotene 7235-40-7 Macklin, Trung Quốc
Yeast Extract 8013-01-2 Angelyeast, Trung Quốc
Bảng 3.2: Thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường SDA Môi trường YPD2 Môi trường YPD10
Trong đó môi trường SDA dùng để nuôi cấy giữ giống Môi trường YPD2 dùng để nuôi tăng sinh tế bào nấm men Môi trường YPD10 dùng để nuôi sinh tổng hợp β-carotene
3.2.3 Dụng cụ và thiết bị
❖ Dụng cụ: Đĩa petri, que cấy vòng, bình tam giác, ống đong, cốc thủy tinh, đũa khuấy thủy tinh, bình định mức, bình tia, bông gòn không hút ẩm, giấy bạc, giấy báo, đèn cồn, ống nghiệm, ống falcon, pipet, micropipet,…
Bảng 3.3: Danh sách các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Xuất xứ
Máy tiệt trùng 62L APL, Nhật Bản
Tủ cấy vô trùng BSC Esco, Singapore Máy ly tâm Z366 Hermle, Đức Máy sấy thăng hoa DC401 Yamato, Nhật bản
Tủ lắc ổn nhiệt ISS-3075R Jeio Tech, Hàn Quốc
Bể siêu âm S100H Elma, Đức Cân kĩ thuật LS 2200C Precisa, Thụy Sĩ Cân phân tích LS 220A Precisa, Thụy Sĩ
Tủ lạnh Toshiba, Nhật Bản
Máy lắc vortex ZX3 Italia
Bộ thổi khí làm khô USA Máy UV-Vis UH-3500 Hitachi, Nhật Bản
Phương pháp nghiên cứu
Quy trình thực hiện nuôi thu sinh khối tế bào nấm men và trích ly β-carotene từ tế bào khô được trình bày ở hình 3.1 dưới đây:
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình thu nhận β-carotene từ nấm mem R mucilaginosa
3.3.1.1 Nuôi cấy và giữ chủng nấm men trên môi trường thạch
Chuẩn bị môi trường SDA (mô tả ở mục 3.1.2) đã được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút, sau đó để nguội đến 55-60 o C trước khi đổ đĩa thạch Đĩa petri và các dụng cụ cần thiết cho việc đổ thạch đều được tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút và sấy khô trước khi sử dụng Các đĩa thạch được để ít nhất 24 giờ trước khi sử dụng nhằm loại trừ các đĩa nhiễm mốc và đảm bảo mặt thạch, mặt nắp đĩa khô hoàn toàn
Dùng que cấy vòng, lấy khuẩn lạc nấm men từ đĩa thạch cũ cấy ria lên đĩa thạch mới Sau đó, ủ đĩa thạch ở 30 o C trong 3 ngày và bảo quản ở 4 o C
Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm men R mucilaginosa cấy trên đĩa thạch SDA
3.3.1.2 Nuôi tăng sinh tế bào nấm men
Dùng que cấy vòng, lấy 4 vòng khuẩn lạc từ đĩa thạch chuyển vào môi trường YPD2 đã chuẩn bị phía trên (môi trường đã được tiệt trùng) Nuôi lắc ở 30 o C, lắc 125 vòng/phút và có ánh sáng trong 24 giờ
Hình 3.2: Nuôi tăng sinh tế bào nấm men trong môi trường YPD2
3.3.1.3 Nuối cấy nấm men sinh tổng hợp β-carotene
Dùng micropipet chuyển 1000 𝜇𝐿 dịch nuôi cấy nấm men sau 24 giờ trong YPD2 sang bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường YPD10 để nấm men sinh tổng hợp β- carotene ở 30 o C, lắc 125 vòng/phút và có ánh sáng trong 5 ngày
Hình 3.3: Nuối cấy nấm men sinh tổng hợp β-carotene
Hình 3.4: Môi trường nuôi cấy YPD10 sau 5 ngày
3.3.2 Phương pháp phá vỡ tế bào và trích ly nhằm thu nhận β-carotene từ sinh khối nấm men
3.3.2.1 Phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật
Ly tâm phần môi trường lên men sau 5 ngày ở 3500 vòng/phút trong 15 phút bằng ống falcon 50 mL để thu phần sinh khối nấm men Sau đó rửa lại với nước cất 4 lần để loại bỏ môi trường dư Thêm 2 mL nước cất, vortex, sau đó để ở -60 o C trong ít nhất 24 giờ, sau đó tiến hành sấy thăng hoa ở nhiệt độ 40 o C trong 16 tiếng
Hình 3.5: Sinh khối khô nấm men R mucilaginosa thu được sau khi sấy thăng hoa 3.3.2.2 Phương pháp phá vỡ tế bào nấm men và trích ly thu β-carotene
Phá vỡ tế bào nấm men: Cân chính xác 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích Cho vào các ống 1.5 mL acid Lắc đều bằng máy vortex ở
1000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó cho vào bể siêu âm trong 30 phút ở 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 20 phút và loại bỏ acid
Hình 3.6: Quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng acid và sóng siêu âm
Trích ly thu β-carotene: Thêm 5 mL dung môi vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-carotene Sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 5 phút Sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 20 phút để loại bỏ xác tế bào nhằm thu phần dung môi chứa β- carotene
Hình 3.7: Quá trình trích ly thu dung môi chứa β-carotene Đuổi dung môi thu β-carotene dạng bột/tinh thể: Sử dụng bộ thổi khí làm khô với tác nhân đuổi là khí nén bằng bơm puma và lưu lượng khí đạt 37.5 L khí/phút; đuổi trong điều kiện hạn chế ánh sáng, nhiệt độ 28 o C trong 20 giờ để đuổi dung môi Sau cùng đem nghiền mẫu thu β-carotene dạng bột/ tinh thể
Hình 3.8: Quá trình đuổi dung môi thu β-carotene dạng bột bằng bộ thổi khí làm khô
32 Áp dụng các phương pháp nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát điều kiện trích ly β-carotene từ chủng nấm men R mucilaginosa Các thí nghiệm nghiên cứu được bố trí như trong bảng 3.4 dưới đây:
Bảng 3.4: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại acid hữu cơ, nồng độ aicd, thời gian siêu âm, loại dung môi và tỉ lệ dung môi đến quá trình trích ly, thu β-carotene từ nấm men R mucilaginosa
Thời gian siêu âm (phút)
Tỉ lệ sinh khối/ dung môi (g/mL)
TN 1 Acid citric; acid lactic; acid ascorbic
TN 4 Acid citric 3 30 Acetone; Ethanol;
3.3.3 Phương pháp quang phổ xác định hàm lượng β-carotene
3.3.3.1 Xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Lấy phần dung môi chứa β-carotene thu được tiến hành quét ở bước sóng 380 - 600 nm (trong vùng khả kiến) trên thiết bị quang phổ UV-Vis Hitachi UH-3500 Từ kết quả thu được, xác định được độ hấp thụ cực đại (𝜆 𝑚𝑎𝑥 ) của mẫu β-carotene cần đo
3.3.3.2 Xây dựng đường chuẩn β-carotene
Tiến hành pha dung dịch chuẩn β-carotene: cân 0.01 g chất chuẩn pha thành 10 mL bằng dung môi (các loại dung môi khảo sát: acetone, ethanol, petroleum ether và ethanol: petroleum tỷ lệ 1:1) được dung dịch chất chuẩn có nồng độ 1 mg/ml
Tiếp theo, pha loãng dung dịch chuẩn β-carotene trong dung môi dùng pha dung dịch chuẩn, nồng độ tăng dần: 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL, 10 μg/mL
Sau đó, tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy chuẩn ở bước sóng 𝜆 𝑚𝑎𝑥 đã xác định được Dựng đồ thị đường chuẩn A = f(X) Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn y = ax + b
3.3.3.3 Xác định hàm lượng β-carotene trong dung môi
Lấy phần dung môi thu được từ thí nghiệm trên (mục 3.3.2.2) đo ở bước sóng cực đại (𝜆 𝑚𝑎𝑥 ) tìm được trên thiết bị quang phổ UV-Vis Hitachi UH-5300 Hàm lượng β- carotene trong dung môi được xác định dựa trên đường chuẩn đã dựng trước đó (phụ lục 2): căn cứ vào phương trình hồi quy tuyến tính của dãy chuẩn mà ta xác định hàm lượng β- carotene (μg β-carotene/mL dung dịch và μg β- carotene/g tế bào khô) có trong dung môi
Các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel
2023 và được phân tích phương sai ANOVA bằng công cụ phân tích dữ liệu khoa học Minitab 2023 để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa p = 0.05
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Ảnh hưởng của các loại acid hữu cơ đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm
Để khảo sát ảnh hưởng của quá trình phá vỡ tế bào bằng acid hữu cơ đến khả năng tách chiết β-carotene từ nấm men, 3 loại acid được lựa chọn là acid citric, acid ascorbic, acid lactic và mẫu đối chứng không sử dụng acid Các bước thí nghiệm thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-carotene có màu từ hồng nhạt đến màu phớt hồng tùy vào loại acid được trình bày ở hình 4.1 Tổng lượng β-carotene thu được với các loại acid khác nhau được trình bày như hình 4.2 dưới đây (hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng là ethanol được trình bày ở phụ lục 2)
Hình 4.1: β-carotene thu được sau khi phá vỡ tế bào bằng các loại acid khác nhau
Từ hình 4.1 thấy được ở mẫu không sử dụng acid dung môi trích ly có màu phớt hồng, từ acid ascorbic, acid lactic, acid citric thì màu hồng càng đậm hơn và acid citric cho ra mẫu dung môi có màu đậm nhất Sự thay đổi màu sắc trên cho thấy trong các mẫu trích ly, hàm lượng β-carotene tăng dần Kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene được tính toán ở hình 4.2
Hình 4.2: Ảnh hưởng của các loại acid đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.2 cho thấy mẫu sử dụng acid citric cho hàm lượng β-carotene/tế bào khô cao hơn gấp 3 lần khi so với mẫu đối chứng không sử dụng acid (334.01 ± 5.78 μg/g so với 98.86 ± 4.86 μg/g) Hai loại acid còn lại cũng cho hàm lượng β-carotene cao hơn mẫu đối chứng nhưng không đạt hiệu quả như acid citric, hàm lượng β-carotene đạt 210.79 ± 7.58 μg/g tế bào khô và 184.39 ± 7.74 μg/g tương ứng với mẫu sử dụng acid lactic và acid ascorbic
Từ sự khác biệt giữa các kết quả thu được, có thể thấy rằng quá trình phá vỡ tế bào bằng acid hữu cơ có ảnh hưởng đến khả năng trích ly β-carotene của nấm men và hiệu quả trích ly của các acid cao hay thấp phụ thuộc trên tính acid của các loại acid này Loại acid có tính acid cao hơn sẽ cho hiệu quả phá vỡ tế bào nấm men và khả năng trích ly β-carotene cao hơn và ngược lại Tính acid của một acid có thể đo và so sánh bằng giá trị hằng số phân ly acid pKa, hằng số phân ly acid càng thấp thì mức độ liên kết giữa proton và phân tử acid càng mạnh, nên tính acid càng cao Acid citric có tính acid cao nhất với hằng số pKa là 3.15 ở nhóm carboxyl đầu tiên và 4.77 ở nhóm carboxyl thứ hai Trong khi đó, acid lactic có tính acid thấp hơn với hằng số pKa là 3.86 và acid ascorbic có tính acid thấp nhất với hằng số
Acid citric Acid lactic Acid ascorbic Không sử dụng acid
Tổ ng hàm lượng β -ca ro tene (μ g/ g tế bào k hô )
36 pKa là 4.10 Trong các loại acid hữu cơ thường gặp trong thực phẩm, acid citric cũng là acid có hằng số pKa thấp nhất
Từ những phân tích trên, acid citric là acid hữu cơ thích hợp cho quá trình phá vỡ tế bào nấm men Vì vậy chọn acid citric cho quy trình trích ly của các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid hữu cơ đến khả năng trích ly β-carotene của nấm men, 4 nồng độ acid được sử dụng là 2 M, 2.5 M, 3 M và 3.5 M Sau khi bổ sung acid ở các nồng độ, các bước thí nghiệm để thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-carotene có màu từ hồng nhạt đến đậm dần được trình bày ở hình 4.3 Và tổng lượng β-carotene thu được với các nồng độ acid khác nhau được trình bày như hình 4.4 dưới đây (hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng là ethanol được trình bày ở phụ lục 2)
Hình 4.3: β-carotene thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các nồng độ acid khác nhau
Từ hình 4.3 thấy được ở nồng độ 2 M mẫu dung môi trích ly có màu phớt hồng, khi tăng dần nồng độ acid thì màu hồng càng đậm hơn Và khi nồng độ quá cao (3.5 M) thì màu của dung môi trích ly nhạt lại Sự thay đổi màu sắc trên cho thấy trong các mẫu trích ly, hàm lượng β-carotene tăng dần Kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene được tính toán ở hình 4.4
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.4 cho thấy hàm lượng β-carotene/tế bào khô thu được tăng dần khi tăng nồng độ acid và đạt tối đa ở mẫu có nồng độ acid là 3 M với 344.16 ± 5.15 μg/g Khi tiếp tục tăng nồng độ acid lên 3.5 M, hàm lượng β-carotene lại có xu hướng giảm đi khi chỉ đạt 236.42 ± 6.81 μg/g Tính acid của môi trường phụ thuộc vào nồng độ acid của môi trường, càng tăng nồng độ acid thì tính acid của môi trường càng tăng, hiệu quả phá vỡ tế bào càng cao Khi nồng độ acid đạt 3 M, tính acid của môi trường đạt ngưỡng giới hạn nên hàm lượng β-carotene thu được không có sự khác biệt khi nồng độ cao hơn 3 M và có xu hướng giảm nếu tiếp tục nồng độ acid, do sự phân hủy của các sắc tố xảy ra trong môi trường acid (Gunerken và cộng sự, 2015)
Từ những phân tích ở trên, khi sử dụng acid citric với nồng độ 3M đạt hiệu quả trích ly β-carotene tốt nhất Chọn nồng độ acid là 3 M cho quy trình trích ly của các thí nghiệm tiếp theo
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô)
Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu quả tách chiết β-carotene từ nấm men, thí nghiệm khảo sát khả năng phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong dãy thời gian từ
10 đến 50 phút với các bước nhảy là 10 phút Các bước thí nghiệm thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-carotene có màu từ phớt hồng đến hồng nhạt và đậm dần tùy vào thời gian siêu âm được trình bày ở hình 4.5 Tổng lượng β-carotene thu được ở các mốc thời gian siêu âm khác nhau được trình bày trong hình 4.6 dưới đây (hàm lượng μg β-carotene/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng là ethanol được trình bày ở phụ lục 2)
Hình 4.5: Các mẫu dung môi sau trích ly trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng β-carotene
Từ hình 4.5 có thể thấy màu sắc của các mẫu dung môi sau trích ly có sự thay đổi từ phớt hồng đến hồng nhạt và đậm dần khi tăng thời gian siêu âm đến 30 phút, và có xu hướng nhạt dần khi tăng thời gian siêu âm đến 40 phút và 50 phút Sự thay đổi màu sắc trên cho thấy trong các mẫu trích ly, hàm lượng β-carotene có sự khác biệt Kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene được tính toán ở hình 4.6
Hình 4.6: β-carotene thu được sau khi phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm ở các mốc thời gian khác nhau
Từ hình 4.6 trên rút ra việc sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào nấm men có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly β-carotene Thời gian sử dụng sóng siêu âm cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly β-carotene Trong khoảng 10 phút đầu tiên siêu âm hàm lượng β- caroten/tế bào khô thu được 174.23 ± 7.62 μg/g Hàm lượng β-carotene tăng từ phút thứ 10 và đạt được tối đa sau 30 phút siêu âm, với hàm lượng thu được là 346.70 ± 4.23 μg/g Khi thời gian xử lý siêu âm kéo dài hơn 30 phút thì hàm lượng β-carotene thu được giảm đi, ở
40 phút và 50 phút lượng β-carotene thu được lần lượt là 216.62 ± 6.83 μg/g và 185.79 ± 6.07 μg/g
Theo Ye và cộng sự (2011), sóng siêu âm hiệu quả quá trình phá vỡ tế bào nhờ vào khả năng tạo ra một dòng chảy hỗn loạn bên trong chất lỏng Trong quá trình này, các hạt trong chất lỏng va chạm với nhau với tốc độ cao Tương tự, nghiên cứu của Liu và cộng sự vào năm 2022 về sóng siêu âm cũng chỉ ra những tác động đối lưu được tạo ra bởi sự sản sinh và phá hủy liên tục các bọt bong bóng, làm gia tăng thêm sự dao động của dịch lỏng gây ra bởi quá trình truyền của sóng siêu âm Như vậy, sóng siêu âm có vai trò quan trọng trong việc phá vỡ tế bào, tạo điều kiện cho các dung môi xâm nhập hòa tan β-carotene Cũng trong nghiên cứu của Ye và cộng sự vào năm 2011, thời gian siêu âm cũng là một thông số ảnh hưởng đến năng suất trích ly vì có khả năng sinh nhiệt hoặc tạo ra các gốc tự do trong dung môi
10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô)
40 Ở thí nghiệm trên, nhiệt độ của mẫu trong quá trình siêu âm được kiểm soát ở nhiệt độ phòng Như vậy hàm lượng β-carotene giảm dần khi ta thực hiện siêu âm kéo dài hơn 30 phút, nguyên nhân có thể là do trong điều kiện siêu âm, dung môi có khả năng tạo ra các gốc tự do Nếu điều này xảy ra, các cấu trúc β-carotene sẽ bị phá hủy theo hai cách khác nhau: thứ nhất, các liên kết đôi trong carotenoid sẽ được cung cấp oxy để tạo ra -C=O, và thứ hai, các chuỗi phân tử β-carotene sẽ bị phá vỡ hoặc polyme hóa
Từ những phân tích ở trên, khi sử dụng thời gian siêu âm 30 phút đạt hiệu quả trích ly β-carotene tốt nhất Chọn thời gian siêu âm 30 phút sử dụng cho quy trình trích ly của thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm
Để khảo sát khả năng tách chiết β-carotene từ nấm men của các dung môi, 4 loại dung môi được lựa chọn là acetone, ethanol, petroleum ether và ethanol: petroleum tỷ lệ 1:1 Trong đó dùng mẫu dung môi acetone làm mẫu đối chứng Sau khi ly tâm loại bỏ acid, các dung môi được thêm vào với tỷ lệ 1g sinh khối khô : 50 mL dung môi Các bước thí nghiệm thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-carotene có màu từ không màu (trong) đến màu hồng sáng (phớt hồng và trong sáng) tùy vào các loại dung môi khác nhau được trình bày ở hình 4.7 dưới đây
Hình 4.7: β-carotene thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các dung môi khác nhau
Từ hình 4.7 có thể thấy màu sắc của các mẫu dung môi sau trích ly có sự thay đổi từ không màu (trong suốt) đến màu hồng sáng (phớt hồng và trong sáng) Mẫu có màu hồng sáng đậm nhất khi sử dụng dung môi ethanol cho quá trình trích ly và có màu đậm hơn mẫu
41 sử dụng dung môi acetone (mẫu đối chứng) Riêng đối với mẫu sử dụng dung môi petroleum ether thì hầu như không có màu, nó gần như trong suốt Và đối với mẫu sử dụng dung môi Ethanol:Petroleum ether tỷ lệ 1:1 lại có sự tách lớp Điều này có thể giải thích rằng β- carotene tan nhiều trong ethanol nhưng ít tan hoặc rất ít tan trong petroleum ether, ngoài ra thì ethanol có khối lượng phân tử 46.07 g/mol thấp hơn khối lượng phân tử của petroleum ether là 82.2 g/mol Do đó mà lớp màu hồng phía trên là β-carotene tan trong dung môi ethanol và lớp có màu hơi đục ở dưới là β-carotene tan rất ít trong petroleum ether Tóm lại, sự thay đổi màu sắc trên cho thấy trong các mẫu trích ly, hàm lượng β-carotene có sự khác biệt Kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene được tính toán ở hình 4.8 (hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng được trình bày ở phụ lục 2)
Hình 4.8: Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả từ hình 4.8 cho thấy hàm lượng β-carotene/tế bào khô thu được bằng dung môi ethanol là 337.82 ± 3.97 μg/g, cao nhất so với các loại dung môi dùng để trích ly Trong đó, nó cao gần gấp đôi so với dung môi ethanol:petroleum ether tỷ lệ 1:1 là 188.19 ± 2.32 μg/g; cao hơn gấp 17 lần so với dung môi acetone là 18.98 ± 0.61 μg/g; và cao hơn rất rất nhiều lần so với dung môi petroleum ether là 1.42 ± 0.93 μg/g
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô)
Các lý thuyết về độ hòa tan của carotenoids cho thấy carotenoids tan trong các chất béo và trong các dung môi như như aceton, ethanol, diethylether, và chloroform β- carotene thuộc nhóm carotene tan tốt trong các dung môi không phân cực như hexan, acetone, Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm của nhóm nghiên cứu cho thấy khả năng trích ly β-carotene của dung môi không phân cực acetone thấp hơn nhiều lần so với dung môi chỉ có một đầu không phân cực là ethanol Hiện nay, chưa có nghiên cứu so sánh về khả năng trích ly β- carotene từ nấm men bằng 4 loại dung môi được sử dụng kể trên
Tuy nhiên, đối với các đối tượng vi sinh vật, đặc biệt là nấm men các nghiên cứu hiện nay phần lớn đều sử dụng dung môi acetone Trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết tách carotenoids từ Rhodobacter sphaeroides của Zhenxin Gu và cộng sự (2007) cũng sử dụng dung môi acetone để thực hiện quy trình trích ly carotenoids Nghiên cứu của Šovljanski và cộng sự (2022) cho thấy đối với chủng R mucilaginosa hàm lượng carotenoids thu được tối đa khi sử dụng dung môi trích ly là acetone
Về nghiên cứu của nhóm chúng tôi hướng đến sử dụng dung môi trích ly có tính thân thiện với môi trường Và kết quả thu được cho thấy rằng β-carotene trích ly với hàm lượng cao nhất khi sử dụng dung môi là ethanol ở nồng độ 100% với tỉ lệ 1 g sinh khối khô tế bào nấm men/ 50 mL ethanol Kết quả có được sau nhiều lần thực hiện thí nghiệm lặp lại, vì vậy kết quả này của nhóm là mang tính khách quan, nhưng cũng cần thêm những nghiên cứu về sau để làm rõ về sự trích ly hiệu quả β- carotene trong dung môi ethanol từ nguồn nguyên liệu sinh học
Vì vậy mà chúng tôi chọn dung môi ethanol ở nồng độ 100% cho quy trình trích ly của các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/ dung môi đến hiệu quả tách chiết β- carotene của các dung môi từ nấm men Tiến hành khảo sát các tỷ lệ sinh khối khô/ dung môi lần lượt là 1/40, 1/50, 1/60 đến 1/70 g/mL Các bước thí nghiệm thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-carotene có màu từ phớt hồng đến hồng nhạt, đậm tùy vào tỉ lệ sinh khối khô/dung môi được trình bày ở hình 4.9 , tổng lượng β-carotene thu được ở các tỉ lệ sinh khối khô/ dung môi khác nhau được trình bày trong hình 4.10 dưới đây
Hình 4.9: β-carotene thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các tỉ lệ sinh khối khô/ dung môi khác nhau
Từ hình 4.9 có thể thấy khi tăng dần tỉ lệ, thì màu hồng của các mẫu nhạt dần Tuy nhiên vì thể tích của các mẫu sau trích ly là khác nhau, nên không thể kết luận hàm lượng β- carotene có sự thay đổi dựa trên màu sắc các mẫu trích ly
Hình 4.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa.
Kết quả từ hình 4.10 cho thấy, tỷ lệ sinh khối khô/dung môi có ảnh hưởng đế quá trình trích ly β-carotene từ nấm men (hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng là ethanol được trình bày
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô)
Tỷ lệ tế bào khô/dung môi
44 ở phụ lục 2) Khi tỷ lệ dung môi thấp thì khả năng hòa tan β-carotene vào dung môi thấp dẫn đến hàm lượng β-carotene thu được thấp hơn Tuy nhiên ở các tỷ lệ sinh khối khô/ dung môi lần lượt là 1/50, 1/60 và 1/70 g/mL, hàm lượng β-carotene thu được không có sự khác biệt quá lớn Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/ dung môi (g/mL) thể hiện qua hàm lượng β- carotene/ tế bào khô thu được ở các tỷ lệ 1/40, 1/50, 1/60 và 1/70 lần lượt là 300.71 ± 3.48 μg/g, 343.78 ± 5.35 μg/g, 339.29 ± 6.14 μg/g, 340.09 ± 4.96 μg/g, không có sự sai khác nhiều về mặt ý nghĩa thống kê (Phụ lục 4 và 9)
Bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán phân tử Khi sự chênh lệch nồng độ β-carotene trong mixen (là hỗn hợp của dung môi và β-carotene) và trong tế bào khô càng cao thì quá trình khuếch tán diễn ra mạnh, sự khuếch tán xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng thì dừng lại Khi sử dụng quá ít dung môi thì hiệu suất trích ly thấp do dung môi không đủ để hòa tan lượng β-carotene có trong tế bào khô Nhưng nếu sử dụng dư thừa dung môi thì sẽ gây lãng phí, tốn dung môi, tăng lượng tạp chất nên hiệu quả kinh tế của quá trình sản xuất không cao Do đó cần thiết phải nghiên cứu tỷ lệ tế bào khô/ dung môi thích hợp để trích ly được tối đa lượng β-carotene trong tế bào khô và đạt hiệu quả kinh tế cao nhất Để vừa tiết kiệm chi phí dung môi mà vẫn đảm bảo hiệu suất trích ly cao, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ tế bào khô/ dung môi thích hợp nhất cho quá trình trích ly β-carotene từ chủng nấm men R mucilaginosa là 1 g tế bào khô/ 50 mL dung môi Kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hàm lượng β-carotene trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Để khảo sát ảnh hưởng của số lần trích ly β-carotene từ nấm men Sử dụng acid citric 3
M, siêu âm thời gian 30 phút Sau khi ly tâm loại bỏ acid, các dung môi được thêm vào với tỷ lệ 1g sinh khối khô: 50 mL dung môi ethanol Các bước thí nghiệm thu β-carotene được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.3.2.2 Dung môi của hai lần sau khi trích ly β-carotene thể hiện ở hình 4.11 dưới đây Tổng hàm lượng β-carotene được thể hiện ở hình 4.12 (hàm lượng μg β-carotene/g tế bào khô) được tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn tương ứng với dung môi sử dụng là ethanol được trình bày ở phụ lục 2)
Hình 4.11: β-carotene thu được sau 2 lần trích ly
Từ hình 4.11 thấy được sự khác biệt rất lớn giữa màu sắc của hai mẫu trích ly lần 1 và lần 2 Mẫu trích ly lần 1 có màu hồng sáng, trong và mẫu trích ly lần 2 gần như trong suốt
Sự khác biệt về màu sắc trên cho thấy trong các mẫu trích ly, hàm lượng β-carotene có sự khác biệt Kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene/tế bào khô được tính toán ở hình 4.12
Hình 4.12: Hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) thu được sau 2 lần trích ly
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau lần trích ly thứ 2, hàm lượng β-carotene/tế bào khô thu được chỉ đạt 20.18 ± 5.18 μg/g, khoảng 5.9 % so với lần trích ly thứ nhất là 343.78 ± 5.35 μg/g Với tỷ lệ β-carotene thu được ở lần trích ly thứ 2 không đạt mức trên 10 %, chúng tôi nhận thấy rằng việc tiến hành lần trích ly thứ 2 là không cần cần thiết Quy trình trích ly chỉ cần thực hiện 1 lần sẽ đem lại hiệu quả kinh tế tốt nhất trong việc tách chiết β-carotene từ nấm men
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô)
Khảo sát khả năng tạo sản phẩm bột β-carotene để ứng dụng cho sản xuất
Để tạo sản phẩm β-carotene từ nấm men có thể sử dụng trong công nghiệp nói chung và trong công nghiệp thực phẩm nói riêng β-carotene sau khi trích ly được sử dụng các phương pháp khác nhau như sấy thăng hoa, sấy lạnh, sấy phun, cô quay chân không hoặc đuổi dung môi để thu được β-carotene dạng sệt đặc hoặc dạng bột Do điều kiện thí nghiệm còn hạn chế, quá trình tạo sản phẩm β-carotene mới chỉ được khảo sát với phương pháp đuổi dung môi Quá trình đổi dung môi được tiến hành như mục 3.3.2.2 Sản phẩm sau khi đuổi dung môi có dạng khô, không mịn, màu cam (hình 4.13) và dễ hút ẩm nên cần được bảo quản trong lọ kín, điều kiện khô ráo
Hình 4.13: Sản phẩm β-carotene sau khi đuổi dung môi
Sản phẩm sau đó được hoàn nguyên lại với dung môi ethanol (hình 4.14) và tính hiệu suất thu hồi cho kết quả thu hồi trên 60 % (bảng 4.1) Hiệu suất thu hồi của phương pháp chưa cao vì thời gian đuổi dung môi quá lâu, sản phẩm bám nhiều trên thành vật chứa, điều kiện bảo quản sản phẩm và thao tác thí nghiệm còn hạn chế dẫn đến sản phẩm dễ bị hút ẩm, từ đó có sự hao hụt β-carotene
Hình 4.14: Mẫu trích ly ban đầu và mẫu hoàn nguyên
Từ hình 4.14 thấy được màu sắc của mẫu trích ly ban đầu có màu hồng đậm hơn so với mẫu hoàn nguyên, từ đó cho biết hàm lượng β-carotene của mẫu trích ly ban đầu cao hơn, kết quả này phù hợp với hàm lượng β-carotene/tế bào khô được tính ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Hiệu suất thu hồi β-carotene
Mẫu trích ly Mẫu hoàn nguyên
Tổng hàm lượng β-carotene (μg/g tế bào khô) 2761.00 ± 84.14 1656.39 ± 51.28
Hiệu suất thu hồi β-carotene 60.04 ± 2.62 %
Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy hàm lượng β-carotene của mẫu trích ly ban đầu gần như gấp 2 lần mẫu hoàn nguyên Và dựa trên tổng khối lượng mẫu, đối với mẫu trích ly - khối lượng tế bào khô sử dụng, đối với mẫu hoàn nguyên - khối lượng bột β-carotene thu được sau khi trích ly và loại dung môi, ta tính được tổng hàm lượng β-carotene trên tổng khối lượng mẫu, từ đó cho thấy lượng β-carotene sau khi hoàn nguyên chỉ đạt 60.04 % so với mẫu trích ly ban đầu Hiệu suất thu hồi vẫn còn chưa cao, phương pháp đuổi dung môi còn chưa hiệu quả để tạo sản phẩm bột β-carotene Do đó, các nghiên cứu về sau có thể sử dụng các phương pháp khác như cô quay chân không, sấy lạnh, sấy phun, để đánh giá về khả năng tạo sản phẩm bột β-carotene nhằm ứng dụng trong sản xuất
