(Luận án tiến sĩ) Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Phân Tích Một Số Vi Rút Có Nguy Cơ Cao Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ Và Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O

Đ¾I HâC BÁCH KHOA HÀ NÞI

NG¯äI H¯âNG DÀN KHOA HàC: 1 TS Lê Quang Hòa

2 PGS TS Tr°¡ng Tuyết Mai

Hà Nái - 2024

LàI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cāu cÿa riêng tôi d°ãi sự h°ãng

trong luận án là trung thực và ch°a từng đ°ÿc các tác giÁ khác công bá

Hà Nội, ngày tháng năm

TÁp thá h°ßng d¿n

TS Lê Quang Hòa PGS.TS.Tr°¢ng Tuy¿t Mai

Nghiên cąu sinh

LàI CÀM ¡N

Từ năm 2005 đến nay, trong những năm hác Đ¿i hác, làm luận văn Th¿c sĩ và luận án Tiến sĩ t¿i Đ¿i hác Bách khoa Hà Nái thân yêu, tôi đã thu nhận đ°ÿc rÃt nhiều kiến thāc quý báu về lý thuyết cũng nh° thực hành nghiên cāu thuác lĩnh vực công nghệ Sinh hác – công nghệ Thực ph¿m Tôi vô cùng biết ¡n các Thầy

tôi về mái mặt

Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tß lòng biết ¡n sâu sắc tãi TS Lê Quang Hòa và PGS.TS Tr°¡ng Tuyết Mai đã tận tình h°ãng dÁn, chỉ bÁo, dành nhiều thåi gian trao đổi, đßnh h°ãng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cāu cũng nh° viết Luận án Xin chân thành cÁm ¡n các Thầy Cô, các cán bá cÿa Trung tâm nghiên cāu và phát triển Công nghệ sinh hác, Ban lãnh đ¿o Tr°ång Hóa và Khoa hác sự sáng đã nhiệt tình giúp đỡ, t¿o mái điều kiện thuận lÿi trong quá trình thực hiện và báo Luận án

Tôi xin chân thành cÁm ¡n Ban Giám đác Viện Dinh d°ỡng, lãnh đ¿o và các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực ph¿m và Sinh hác phân tử đã t¿o điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn đ°ÿc phân công

Låi cÁm ¡n sâu sắc xin gửi tãi Gia đình, B¿n bè luôn chia sẻ khó khăn, đáng viên khích lệ tôi v°ÿt qua mái trç ng¿i để hoàn thành nhiệm vā nghiên cāu và hác tập!

Hà Nái ngày tháng năm 20 Nghiên cāu sinh

Phan Thß Thanh Hà

1 Tính cÃp thiết cÿa đề tài 1

2 Māc tiêu nghiên cāu 2

3 Nái dung nghiên cāu 2

4 Ý nghĩa khoa hác và thực tiễn cÿa đề tài 4

5 Tính mãi cÿa đề tài 4

1 TàNG QUAN 5

1.1 Tình hình sÁn xuÃt, tiêu thā nhuyễn thể hai mÁnh vß và thách thāc về an toàn thực ph¿m 5

1.1.1 Tình hình sÁn xuÃt và tiêu thā nhuyễn thể hai mÁnh vß 5

1.1.2 Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß 6

1.2 Đặc điểm sinh hác các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß 8

1.5.1 Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) 28

1.5.2 Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) 29

1.6 Ph°¡ng pháp xác đßnh kiểu gen vi rút 30

1.7 Tình hình nghiên cāu sự l°u hành các kiểu gen cÿa NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giãi và t¿i Việt Nam 31

1.7.1 Tình hình nghiên cāu trên thế giãi 31

1.7.2 Tình hình nghiên cāu t¿i Việt Nam 35

2 VÀT LIäU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 38

2.1 Vật liệu nghiên cāu 38

2.1.1 Vật liệu kiểm soát 38

2.1.2 MÁu nhuyễn thể hai mÁnh vß 38

3.2.2 Tình tr¿ng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể

DANH MĀC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG Bæ CĂA LUÀN ÁN 128

TÀI LIäU THAM KHÀO 129

DANH MĀC CÁC HÌNH

Hình 1.1 XuÃt kh¿u NTHMV Việt Nam 2020-2021 6

Hình 1.2 CÃu trúc Norovirus 9

Hình 1.3 CÃu trúc Hepatitis A virus 10

Hình 1.4 CÃu trúc Hepatitis E virus 11

Hình 1.5 CÃu trúc Human Astrovirus 12

Hình 1.6 Bá 4 mồi chính cÿa phÁn āng LAMP 18

Hình 1.7 Nguyên tắc phÁn āng Real-time PCR 20

Hình 1.8 Vß trí gắn cÿa MGB trên mÁu dò và cÃu trúc hóa hác cÿa MGB 28

Hình 1.9 CÃu trúc cÿa nucleotide thông th°ång và cÿa nucleotidd LNA 29

Hình 2.1 Quy trình lựa chán, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mÁu dò cho phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV và HAstV 44

Hình 2.2 Quy trình tách dòng trình tự gen đ¿i diện cÿa HEV và HAstV 45

Hình 2.3 Quy trình phiên mã in vitro t¿o chāng d°¡ng RNA 47

Hình 2.4 Tái °u phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện, đßnh l°ÿng HEV và HAstV 48

Hình 2.5 Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện, đßnh l°ÿng HEV và HAstV 49

Hình 2.6 Tóm tắt quy trình phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV 52

Hình 2.7 Chu trình nhiệt phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 54

Hình 2.8 Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng RT-PCR vãi mồi ngoài khuếch đ¿i RNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 2.9 Chu trình nhiệt cÿa phÁn āng PCR vãi mồi trong để khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 3.1 Đặc điểm bá mồi cÿa Schlosser và cÿa Jothikumar trên trình tự gen HEV chu¿n cÿa WHO 59

Hình 3.2 Đá bao phÿ cÿa tổ hÿp mồi, mÁu dò trong nghiên cāu cÿa Schlosser và Jothikumar vãi các hệ gen HEV công bá trên GenBank 61

Hình 3.3 SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HEV-A 65

Hình 3.4 Kết quÁ sàng lác PCR khu¿n l¿c E coli DH5α mang đo¿n gen đích

HEV.A sau biến n¿p vào vector pJET1.2 65Hình 3.5 Kết quÁ giÁi trình tự mát dòng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HEV.A 66Hình 3.6 SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HEV.B 66Hình 3.7 Kết quÁ sàng lác PCR khu¿n l¿c E coli DH5α mang đo¿n gen đích HEV.B sau biến n¿p vào vector pJET1.2 67Hình 3.8 Kết quÁ giÁi trình tự mát dòng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HEV.B67Hình 3.9 Chu trình nhiệt rút gán cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV 74Hình 3.10 Kết quÁ xác đßnh giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV 76Hình 3.11 Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV 80Hình 3.12 Các đ°ång chu¿n đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV 80Hình 3.13 Đá bao phÿ cÿa tổ hÿp mồi, mÁu dò trong nghiên cāu cÿa Cann và cáng sự 84Hình 3.14 SÁn ph¿m PCR khuếch đ¿i đo¿n gen đích HAstV 87Hình 3.15 Kết quÁ sàng lác PCR khu¿n l¿c E coli DH5α mang đo¿n gen đích HAstV sau biến n¿p vào vector pJET1.2 87Hình 3.16 Kết quÁ giÁi trình tự mát dòng plasmid pJET1.2 mang đo¿n gen HAstV 88Hình 3.17 Kết quÁ xác đßnh giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV 94Hình 3.18 Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV 97Hình 3.19 Các đ°ång chu¿n đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV 97Hình 3.20 Phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính năm 2016 103Hình 3.21 Tỉ lệ nhiễm t¿p đồng thåi nhiều lo¿i vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i chÿ và siêu thß năm 2016 104

Hình 3.22 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo thåi điểm lÃy mÁu năm 2016 104Hình 3.23 Phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính năm 2022 109Hình 3.24 Tỉ lệ nhiễm t¿p đồng thåi nhiều lo¿i vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i chÿ và siêu thß năm 2022 109Hình 3.25 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV theo thåi điểm lÃy mÁu năm 2022 110Hình 3.26 So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMVnăm 2016 và năm 2022 111Hình 3.27 So sánh sự phân bá nồng đá vi rút trong các mÁu d°¡ng tính 111năm 2016 và năm 2022 111Hình 3.30 SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i vùng gen ORF1-ORF2cÿa NoV GI và NoV GII 114Hình 3.31 Cây phát sinh loài cÿa các mÁu NoV GI phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank 116Hình 3.32 Phân bá kiểu gen Norovirus GI cÿa các mÁu phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu 117Hình 3.33 Cây phát sinh loài cÿa các mÁu NoV GII phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank 118Hình 3.34 Phân bá kiểu gen Norovirus GII cÿa các mÁu phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu 119Hình 3.35 SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i HEV 121Hình 3.36 Cây phát sinh loài cÿa các mÁu HEV phát hiện đ°ÿc trong nghiên cāu vãi các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank 122Hình 3.37 SÁn ph¿m phÁn āng Nested RT-PCR khuếch đ¿i HAstV 123

cāu 124

DANH MĀC CÁC BÀNG

BÁng 1.1 Tổng hÿp các nghiên cāu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV 17

BÁng 1.2 Nhận xét các ph°¡ng pháp xác đßnh vi rút gây bệnh thực ph¿m 21

BÁng 1.3 Tổng hÿp các bá mồi và mÁu dò sử dāng trong nghiên cāu 23

BÁng 1.4 Chu trình nhiệt cÿa các phÁn āng Real-time RT-PCR 25

BÁng 1.5 Tổng hÿp mát sá nghiên cāu về vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m t¿iViệt Nam 35

BÁng 2.1 Thông tin mÁu nhuyễn thể hai mÁnh vß thu thập trên thß tr°ång 39

BÁng 2.2 Trình tự mồi, mÁu dò sử dāng trong nghiên cāu xây dựng quy trình time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng RNA vi rút từ NTHMV 39

Real-BÁng 2.3 Tổng hÿp các bá mồi sử dāng trong phÁn āng Nested RT-PCR xác đßnh kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV 41

BÁng 2.4 Thành phần phÁn āng Real-time RT-PCR đßnh l°ÿng RNA vi rút sử dāng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit 49

BÁng 2.5 Thông tin các biến đ°ÿc phân tích bằng phần mềm SPSS 55

BÁng 2.6 Thành phần phÁn āng PCR khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 56

BÁng 2.7 Thành phần phÁn āng PCR vãi mồi trong để khuếch đ¿i cDNA cÿa NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

BÁng 3.1 Đặc điểm kỹ thuật cÿa tổ hÿp mồi Schlosser và Jothikumar 60

BÁng 3.2 Đặc điểm kỹ thuật cÿa các tổ hÿp mồi sau khi hiệu chỉnh và āng dāng công nghệ MGB, LNA 63

BÁng 3.3 Kết quÁ tái °u nồng đá ion Mg2+đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B 68

BÁng 3.4 Kết quÁ tái °u nồng đá mồi đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B 70

BÁng 3.5 Kết quÁ tái °u nồng đá mÁu dò đái vãi hai tổ hÿp mồi A và B 71

BÁng 3.6 Thành phần tái °u cÿa phÁn āng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV 72

BÁng 3.7 Kết quÁ khÁo sát nhiệt đá gắn mồi cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán 73

BÁng 3.8 Tái °u hóa thåi gian gắn mồi và kéo dài m¿ch cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán 74

BÁng 3.9 Giãi h¿n phát hiện cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV trong NTHMV 75BÁng 3.10 Giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HEV 77BÁng 3.11 Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HEV trong NTHMV 78BÁng 3.12 Kết quÁ phÁn āng chéo cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV trong NTHMV 82BÁng 3.13 Vß trí trình tự gen HAstV tham chiếu và giá trß nhiệt đá nóng chÁy (Tm) cÿa cÿa bá mồi, mÁu dò cÿa Cann 83BÁng 3.14 Đặc điểm kỹ thuật cÿa trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh và āng dāng công nghệ LNA 86

hiện HAstV 89BÁng 3.16 Kết quÁ tái °u nồng đá mồi HAstV 90BÁng 3.17 Kết quÁ tái °u nồng đá mÁu dò HAstV 91BÁng 3.18 Thành phần tái °u cÿa phÁn āng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV 91BÁng 3.19 Kết quÁ khÁo sát nhiệt đá gắn mồi cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán 92BÁng 3.20 Tái °u hóa thåi gian gắn mồi và kéo dài m¿ch cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gán 93BÁng 3.21 Giãi h¿n phát hiện cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV trong NTHMV 94BÁng 3.22 Giãi h¿n phát hiện vãi xác suÃt 95% cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR xác đßnh HAstV 95BÁng 3.23 Kết quÁ xác đßnh khoÁng đßnh l°ÿng cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện và đßnh l°ÿng HAstV trong NTHMV 96BÁng 3.24 Kết quÁ phÁn āng chéo cÿa quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV trong NTHMV 99BÁng 3.25 Tổng hÿp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2016 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu 100

BÁng 3.26 Tổng hÿp māc nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2016 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu 101BÁng 3.27 Tổng hÿp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2022 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu 106BÁng 3.28 Tổng hÿp māc nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV năm 2022 theo lo¿i mÁu và đßa điểm lÃy mÁu 107

DANH MĀC KÝ HIäU VÀ CHĀ VI¾T TÄT

enzyme

the Unated Nation

Tổ chāc L°¡ng thực và Nông nghiệp

Liên hÿp Quác

ph¿m Mỹ

Quality Assurance Department

Cāc QuÁn lý ChÃt l°ÿng Nông lâm

và Phát triển nông thôn

Biotechnology Information

NoV Norovirus

Product Safety Authority

C¡ quan An toàn SÁn ph¿m Tiêu dùng và Thực ph¿m Hà Lan

RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

Ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt thông qua cÃu trúc vòng phiên mã

ph¿m và thāc ăn chăn nuôi

Exporters and Producers

Hiệp hái Chế biến và XuÃt kh¿u thuỷ

sÁn Việt Nam

MỞ ĐÀU 1 Tính c¿p thi¿t căa đß tài

Báo cáo tháng kê ngành thÿy sÁn toàn cầu cÿa Tổ chāc L°¡ng thực và Nông nghiệp Liên hÿp Quác (FAO) cho thÃy nhu cầu đái vãi các mặt hàng nhuyễn thể hai mÁnh vß (NTHMV) tăng m¿nh vào năm 2021 so vãi 2020 [1] Theo tháng kê cÿa

NTHMV cÿa Việt Nam đ¿t 141,6 triệu USD, tăng 35% so vãi năm 2020; trong đó, ngao là sÁn ph¿m chÿ lực, chiếm 73% vãi 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2] Nhuyễn thể cÿa Việt Nam đã đ°ÿc xuÃt kh¿u đến 42 n°ãc; trong đó, Liên minh

EU cũng là thß tr°ång có quy đßnh chặt chẽ nhÃt đái vãi các sÁn ph¿m nhập kh¿u, gây nhiều thách thāc đái vãi ngành nuôi trồng NTHMV ç Việt Nam Tháng 4 năm 2022, trong <Diễn đàn phát triển thÿy sÁn bền vững=, lãnh đ¿o Bá Nông nghiệp và

trong đó việc bÁo đÁm kiểm soát chÃt l°ÿng An toàn thực ph¿m từ khâu sÁn xuÃt ban đầu đến s¡ chế, chế biến là hết sāc cần thiết [4]

Trong những năm qua, tình tr¿ng viêm d¿ dày ruát, viêm gan do tiêu thā

đßnh đ°ÿc h¡n 100 lo¿i vi rút đ°ång ruát có mặt trong thực ph¿m bß ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ç ng°åi (HAstV) là các vi rút gây bệnh th°ång gặp trong NTHMV [5] Đáng chú ý, mát sá nghiên cāu về các vi rút này t¿i Việt Nam đã cho thÃy tình tr¿ng

Tr°ãc tình hình ô nhiễm thực ph¿m do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao, cùng vãi những kết quÁ về tình tr¿ng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển quy trình phát hiện và đßnh l°ÿng bán tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m th°ång gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sāc cần thiết [7] Hiện nay,

HAV trong thực ph¿m thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và

vậy, việc xây dựng quy trình xác đßnh HAstV và HEV vãi bá mồi, mÁu dò đÁm bÁo

đá bao phÿ trên các biến chÿng hiện có, đồng thåi tái °u các điều kiện cÿa phÁn āng

gian phân tích, hß trÿ kßp thåi cho công tác điều trß

Bên c¿nh đó, các sá liệu về đặc điểm sinh hác phân tử cÿa các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong NTHMV t¿i Việt Nam còn rÃt h¿n chế Vì vậy, việc xác đßnh đặc điểm sinh hác phân tử cÿa vi rút thông qua xác đßnh kiểu gen (genotype) là công đo¿n cần thiết để đánh giá chính xác nguy c¡ bùng phát dßch bệnh gây ra bçi

khße, kinh tế và xã hái Do vậy, luận án <Nghiên cứu xây dựng phương pháp

phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử= đã đ°ÿc thực hiện

2 Māc tiêu nghiên cąu

15216-1:2013

- Áp dāng quy trình đã xây dựng phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß trên thß tr°ång

ph¿m trong nhuyễn thể hai mÁnh vß

3 Nội dung nghiên cąu

3.1 Xây dÿng quy trình Real-time RT-PCR phát hiån và đßnh l°ÿng RNA căa HEV và HAstV trong nhuyãn thá hai mÁnh vá

3.1.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

- Xây dựng chu trình nhiệt rút gán cho phÁn āng Real-time RT-PCR phát hiện RNA cÿa HEV phāc vā xét nghiệm nhanh vi rút này

l°ÿng HEV trong nhuyễn thể hai mÁnh vß theo chu trình nhiệt rút gán và chu trình nhiệt cÿa ISO 15216-1:2013

3.1.2 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

phát hiện HAstV

mã in vitro

theo tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013

RNA cÿa HAstV phāc vā xét nghiệm nhanh vi rút này

l°ÿng HAstV trong nhuyễn thể hai mÁnh vß theo chu trình nhiệt rút gán và chu trình nhiệt cÿa ISO 15216-1:2013

3.2 Áp dāng quy trình đã xây dÿng phát hiån vi rút gây bånh truyßn

4 Ý nghĩa khoa hßc và thÿc tiãn căa đß tài

4.1 Ý nghĩa khoa hßc

và HAstV theo chu trình nhiệt đ°ÿc miêu tÁ trong ISO 15216-1:2013; từ đó mç ra khÁ năng phát hiện và đßnh l°ÿng đ°ÿc 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV trong mát lần ch¿y Real-time RT-PCR

RNA cÿa HEV và HAstV phāc vā xét nghiệm nhanh các vi rút này

4.2 Ý nghĩa thÿc tiãn

vãi tính chính xác cao (4 phÁn āng Real-time RT-PCR riêng rẽ ch¿y cùng mát chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mÁu thực ph¿m, bệnh ph¿m, môi tr°ång nói chung để các c¡ sç xét nghiệm có thể āng dāng trong phân tích

- Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực ph¿m, tăng tính c¿nh tranh cÿa NTHMV và các mặt hàng thÿy sÁn xuÃt kh¿u trên thß tr°ång quác tế

5 Tính mßi căa đß tài

cÿa HEV và HAstV có đá bao phÿ cao vãi các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ liệu Genbank

HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mÁnh vß vãi chu trình nhiệt theo tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013

trong năm 2016 t¿i Việt Nam

1 TàNG QUAN

1.1 Tình hình sÁn xu¿t, tiêu thā nhuyãn thá hai mÁnh vá và thách thąc vß an toàn thÿc ph¿m

1.1.1 Tình hình sÁn xu¿t và tiêu thā nhuyãn thá hai mÁnh vá

vào năm 2021 so vãi 2020 do các h¿n chế về COVID-19 đã giÁm bãt ç các quác gia tiêu thā chính những mặt hàng này Trong năm 2021, khoÁng 71.000 tÃn hàu đã đ°ÿc nhập kh¿u trên toàn thế giãi, cao h¡n 15.000 tÃn so vãi năm 2020 và thậm chí cao h¡n 6.000 tÃn so vãi năm 2019 Cũng trong năm 2021, tổng th°¡ng m¿i ngao trên toàn thế giãi tăng, khoÁng 287.000 tÃn đã đ°ÿc nhập kh¿u, nhiều h¡n 20.000 tÃn so vãi năm 2020 [1]

Việt Nam có đặc điểm đßa lý thuận lÿi để phát triển ho¿t đáng khai thác và

bên bå Tây cÿa Biển Đông - là mát biển lãn cÿa Thái Bình D°¡ng, vùng biển đặc quyền kinh tế ráng h¡n 1 triệu km2 cùng h¡n 4.000 hòn đÁo, t¿o nên 12 vßnh, đầm phá vãi tổng diện tích 1.160km2 đ°ÿc che chắn tát dễ trú đậu tàu thuyền [9] Năm 2021, diện tích nhuyễn thể cÿa Việt Nam đ¿t trên 35.000 ha, sÁn l°ÿng 471.000 tÃn; trong đó, diện tích và sÁn l°ÿng nuôi ngao chiếm khoÁng 50%; cā thể, năm 2021,

cÿa Việt Nam đã đ°ÿc xuÃt kh¿u đến 42 n°ãc Theo tháng kê cÿa Hiệp hái Chế biến và XuÃt kh¿u thuỷ sÁn Việt Nam (VASEP), xuÃt kh¿u NTHMV cÿa Việt Nam năm 2021 đ¿t 141,6 triệu USD, tăng 35% so vãi năm 2020 Trong đó, ngao là sÁn ph¿m chÿ lực, chiếm 73% vãi gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2] Sá liệu cÿa Trung tâm Th°¡ng m¿i Thế giãi (ITC) cho thÃy các thß tr°ång nhập kh¿u chính NTHMV cÿa Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Italy), Mỹ, Nhật BÁn, Đài Loan, Hàn Quác Trong đó, EU là thß tr°ång nhập kh¿u

Nam ra các thß tr°ång trên thế giãi [3]

Hình 1.1 Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 [2]

Đáng chú ý, EU cũng là thß tr°ång có quy đßnh chặt chẽ nhÃt đái vãi các sÁn ph¿m nhập kh¿u, đây cũng chính là thách thāc lãn đái vãi ngành nuôi trồng

lô hàng hàu t°¡i °ãp đá từ Vân Đồn QuÁng Ninh bß cÁnh báo phát hiện NoV: 10 lô hàng năm 2020 và 2 lô hàng năm 2021 Tháng 4 năm 2022, trong Diễn đàn về phát triển thÿy sÁn bền vững, Thā tr°çng Bá Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Phùng Đāc Tiến đã khẳng đßnh, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trò quan tráng trong việc hoàn thành māc tiêu phát triển kinh tế thÿy sÁn đã đề ra; trong đó việc bÁo đÁm kiểm soát chÃt l°ÿng An toàn thực ph¿m từ khâu sÁn xuÃt ban đầu đến s¡ chế, chế biến là hết sāc cần thiết [4]

1.1.2 Tình hình nhiãm vi rút gây bånh truyßn qua thÿc ph¿m trong nhuyãn thá hai mÁnh vå

Vãi đặc điểm sinh sáng theo hình thāc lác n°ãc để lÃy thāc ăn, NTHMV là đái t°ÿng thực ph¿m có nguy c¡ ô nhiễm cao bçi các vi rút và các tác nhân gây bệnh khác có trong môi tr°ång n°ãc Theo các nghiên cāu trên thế giãi về nhóm vi

100 lo¿i vi rút đ°ÿc tìm thÃy trong đ°ång ruát ng°åi Các vi rút này đ°ÿc phân làm 3 nhóm chính theo hái chāng lâm sàng: nhóm vi rút gây viêm d¿ dày ruát, vi rút gây

ngá đác thực ph¿m trong NTHMV từ năm 1980 đến năm 2012 trên thế giãi đã chỉ

12,8% [10]

Theo các sá liệu tháng kê dßch tễ gần đây, NoV đ°ÿc coi là mát trong những

nguyên nhân cÿa trung bình 570–800 ca tử vong, 56.000–71.000 ca nhập viện, 400.000 ca cÃp cāu và 19–21 triệu ca bệnh mßi năm [11] NoV là vi rút gây bệnh xuÃt hiện nhiều nhÃt trong các lo¿i NTHMV, chiếm 83,7% Mát nghiên cāu giám sát māc đá nhiễm NoV trong NTHMV đ°ÿc thực hiện bçi C¡ quan An toàn SÁn ph¿m Tiêu dùng và Thực ph¿m Hà Lan (NVWA) trên 756 mÁu trong khoÁng thåi gian từ năm 2013 đến năm 2017 đã phát hiện 45,5% mÁu d°¡ng tính vãi NoV [12] T¿i Nhật BÁn, nghiên cāu về tình hình nhiễm vi rút đ°ång ruát trong NTHMV trên 732 mÁu đ°ÿc thu thập trong 5 năm, từ 2014 đến 2018 đã chỉ ra tồn t¿i mái liên hệ giữa tỉ lệ nhiễm NoV trong NTHMV vãi sá ca tiêu chÁy diễn ra trong cáng đồng T¿i Đông Nam Á, nghiên cāu đ°ÿc thực hiện trên 300 mÁu NTHMV thu thập từ các chÿ t¿i Thái Lan đã phát hiện NoV trong 12,3% mÁu; trong đó tỉ lệ nhiễm trên hàu là 14%, ngao là 6% [13]

Hàng năm trên thế giãi có khoÁng 1,4 triệu ng°åi mắc HAV và khoÁng 200 triệu ng°åi mang bệnh nh°ng không thể hiện triệu chāng HAV có thể lây truyền từ ng°åi sang ng°åi hoặc thông qua n°ãc và thực ph¿m bß ô nhiễm, đặc biệt ç NTHMV không xử lý nhiệt đÿ yêu cầu Lßch sử đã ghi nhận vā dßch lan truyền ráng rãi nhÃt t¿i Th°ÿng HÁi, Trung Quác vào năm 1988 vãi gần 300.000 tr°ång hÿp do tiêu thā ngao đánh bắt t¿i vùng n°ãc bß ô nhiễm n°ãc thÁi [14] T¿i Tây Ban Nha, hai vā dßch lãn do tiêu thā ngao nhiễm HAV đ°ÿc nhập kh¿u từ Peru đã đ°ÿc ghi nhận vãi sá ca nhiễm lên tãi 184 ng°åi năm 1999 và 100 ng°åi năm 2008 Liên quan đến hai vā dßch này, Bá Y tế Tây Ban Nha đã kích ho¿t Hệ tháng cÁnh báo nhanh về thực ph¿m và thāc ăn chăn nuôi (RASFF) cÿa châu Âu; hàng lo¿t hô hàng NTHMV từ Peru vào thåi điểm đó đã đ°ÿc cÁnh báo và cÃm nhập kh¿u vào châu

vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m thực hiện trên 50 mÁu NTHMV đ°ÿc nhập kh¿u từ Ma rác, Peru, Hàn Quác và Việt Nam đã phát hiện tỉ lệ nhiễm HAV lên tãi 50% trên các mÁu NTHMV đến từ Việt Nam [16]

Theo tháng kê cÿa Tổ chāc Y tế Thế giãi, có trên 2,3 triệu ng°åi nhiễm HEV mßi năm vãi khoÁng 70.000 ca tử vong, chÿ yếu liên quan đến việc sử dāng thực ph¿m đ°ÿc thu ho¿ch từ các vùng có nguồn n°ãc bß ô nhiễm vãi tỷ lệ cao nhÃt ç

Đông và Nam Á [17] T¿i Trung Quác, nghiên cāu đánh giá Ánh h°çng cÿa ô nhiễm nguồn n°ãc đến sāc khße cáng đồng thông qua tiêu thā NTHMV t¿i vßnh Bát HÁi đã tìm thÃy HEV trong 17,5% sá mÁu thu thập [18] T¿i châu Âu, mát cuác điều tra năm 2008 trên 789 du khách trç về từ chuyến du thuyền sang Anh cho thÃy có đến 195 ng°åi d°¡ng tính vãi vi rút HEV, trong đó 33 ng°åi có triệu chāng nhiễm trùng cÃp tính Phân tích nguyên nhân cho thÃy có mái liên hệ chặt chẽ vãi việc tiêu thā sò và trai đến từ vùng n°ãc ô nhiễm t¿i Southampton [19] Nghiên cāu cÿa Rivadulla thực hiện trên 168 mÁu NTHMV t¿i hai vùng nuôi trồng thÿy sÁn t¿i Tây Ban Nha đã phát hiện 24,4% mÁu nhiễn HEV [20]

T°¡ng tự nh° NoV, HAstV th°ång đ°ÿc tìm thÃy trong NTHMV đ°ÿc nuôi ç vùng n°ãc ô nhiễm Trẻ em là đái t°ÿng có nguy c¡ mắc HAstV cao nhÃt, theo mát nghiên cāu năm 2013, có đến 3% trẻ em d°ãi năm tuổi mắc vi rút này nhập viện mßi năm [21] Mát nghiên cāu khác thực hiện t¿i Nhật BÁn, n¡i có 4700 trẻ em trong đá tuổi đi hác bß Ánh h°çng bçi bệnh viêm d¿ dày ruát cÃp tính, HAstV đã đ°ÿc tìm thÃy trong 26% mÁu phân Năm 2019, nghiên cāu cÿa Diem Lan Vu và cáng sự thực hiện trên 384 mÁu bệnh ph¿m t¿i Tây Ban Nha cho thÃy tỷ lệ nhiễm HAstV chiếm 13,3% và đ°ÿc tìm thÃy trong 66% các mÁu đồng nhiễm vãi các lo¿i vi rút khác [22] Mát sá nghiên cāu trên thế giãi đã chỉ ra ph°¡ng thāc lây truyền chính cÿa HAstV là do thực ph¿m bß ô nhiễm, điển hình là NTHMV t¿i các vùng n°ãc bß ô nhiễm Nghiên cāu cÿa Vilarino và cáng sự thực hiện t¿i Tây Ban Nha trên 41 mÁu NTHMV đã phát hiện 12,2% mÁu nhiễm HAstV [23] Nghiên cāu cÿa David Polo và cáng sự trên 50 mÁu NTHMV nhập kh¿u từ Ma rác, Peru, Hàn Quác và Việt Nam đã phát hiện HAstV trong 18% sá mÁu; đáng chú ý, mÁu NTHMV nhập kh¿u từ Việt Nam nhiễm HAstV cũng đồng nhiễm vãi HAV và NoV nhóm GI [16]

Từ các sá liệu về tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m kể trên, có thể thÃy tồn t¿i nguy c¡ nhiễm NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV Đặc biệt, mát sá nghiên cāu đã chỉ ra tình tr¿ng đồng nhiễm nhiều vi rút trên cùng mát mÁu, cho thÃy tính phāc t¿p trong ch¿n đoán và điều trß Vì vậy, việc nghiên cāu mát ph°¡ng pháp phù hÿp cho xác đßnh cÁ bán vi rút sẽ là đóng góp hiệu quÁ

1.2 Đặc điám sinh hßc các vi rút gây bånh truyßn qua thÿc ph¿m trong nhuyãn thá hai mÁnh vá

1.2.1 Norovirus

NoV là mát vi rút thuác há Caliciviridae, có cÃu t¿o là mát vi rút RNA sÿi đ¡n d°¡ng, có kích th°ãc gần 7,6kb H¿t vi rút cÿa NoV rÃt nhß vãi đ°ång kính

khoÁng 27-35 nm Trong cùng genocluster, vß capsid cÿa vi rút th°ång rÃt giáng

thể tồn t¿i trong môi tr°ång vãi pH dao đáng từ 2 đến 10; nhiệt đá từ đông l¿nh đến nhiệt đá cao tãi 60℃ Đặc biệt, vi rút này có thể tồn t¿i thåi gian dài trên các bề mặt khác nhau; ngay cÁ khi tiếp xúc vãi nồng đá clo lên tãi 10 ppm [25]

A

B

Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus [26, 27].Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

Phân tích về trình tự chiều dài hệ gen cÿa NoV chỉ ra các chÿng vi rút trong mát nhóm gen th°ång có trên 69% t°¡ng đồng về nucleotide Hệ gen cÿa NoV đ°ÿc chia thành 3 khung đác mç (ORF1, ORF2, và ORF3) (Hình 1.2) Khung đác mç thā nhÃt ORF1 (~5 kb) mã hóa mát phân tử polyprotein có kích th°ãc 194kDa, phân tử polyprotein này bß phân cắt bçi chính protease cÿa NoV để t¿o thành 6 phân tử protein gồm (1) N-Term, protein ch°a rõ chāc năng (~48 kDa); (2) NTP nucleoside triphosphatase (~40 kDa) có khÁ năng liên kết và thÿy phân toàn bá NTP; (3) p22 t°¡ng tự nh° vùng N-Term, ch°a rõ chāc năng (~22kDa); (4) VPg, protein đóng vai trò quan tráng trong quá trình nhân bÁn và dßch mã RNA (~16 kDa); (5) 3C, 3C-like protease (~19 kDa), có vai trò phân cắt ORF1 polyprotein thành các phân tử protein và (6) RdRp, RNA polymerase phā thuác RNA (RdRp) (~57 kDa) ORF2 chÿ yếu mã hóa protein VP1 có tính biến đổi cao ORF3 mã hóa mát protein VP2 c¡ bÁn nhß nằm bên trong h¿t vi rút, có vai trò tham gia vào quá trình tổng hÿp capsid và hình thành hệ gen Trong đó, vùng RdRp t¿i khu vực giao giữa ORF1-ORF2 và vùng VP1 là hai vùng chính th°ång đ°ÿc sử dāng để phân lo¿i đặc điểm di truyền cÿa NoV hiện nay; còn vùng C t°¡ng āng vãi vùng trình tự

nhß ç đầu 5′ cÿa VP1 th°ång đ°ÿc sử dāng để xác đßnh kiểu gen (genotype) cÿa

GI, GII, GIV là những kiểu gen th°ång gặp ç ng°åi; trong đó, NoV GI và NoV GII là hai kiểu gen gây bệnh phổ biến [29, 30]

1.2.2 Hepatitis A virus

xāng 20 mặt (Hình 1.3) Về đặc điểm vật lý, HAV có khÁ năng tồn t¿i trong môi tr°ång pH từ 3 đến 11 và có thể chßu đ°ÿc nhiệt đá đến 60℃ Hệ gen cÿa HAV gồm mát phân tử RNA m¿ch đ¡n, d°¡ng, có kích th°ãc 7.5 kb HAV có hệ gen t°¡ng tự vãi các Picornavirus khác vãi cÃu trúc đ°ÿc chia làm 3 vùng: vùng 5' không dßch mã (5'UTR) chiếm xÃp xỉ 10% hệ gen, mát khung đác mç (ORF), và

đá dài khoÁng 735 đến 745 nucleotid, có liên kết đồng hóa trß vãi protein 3B đ°ÿc mã hóa bçi chính hệ gen (protein VPg) và có chāa mát vß trí đi vào ribosom

các protein cÿa vi rút, vãi các vùng nh° P1 mã hóa cho các protein cÿa lãp vß và

vùng P2, P3 cho các protein không cÃu trúc, ván tham gia vào quá trình tổng hÿp,

cÃu trúc bao gồm khoÁng 2225 đến 2227 nucleotide và mã hóa cho 4 lo¿i protein chÿ yếu cÿa lãp vß vi rút là VP1, VP2, VP3 và VP4 Vùng 2BC và P3 chāa bÁy protein phi cÃu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D) Vùng 3'UTR có khoÁng 40 đến 80 nucleotide chāa trình tự kết thúc dßch mã bao gồm mát chußi poly(A) có đá biến đổi cao (tãi 20%) giữa các chÿng và các d¿ng đát biến HAV có mát kiểu huyết thanh vãi sáu kiểu gen dựa trên việc kiểm tra mát đo¿n 168-nucleotide cÿa vùng

HAV những năm gần đây [32]

1.2.3 Hepatitis E virus

HEV là vi rút thuác há Hepeviridae, vß capsid là khái gồm 20 mặt đái xāng

hệ gen cÿa HEV ç đáng vật có vú và các loài cá khoÁng 7,2kb; ç gia cầm khoÁng

khÁ năng chßu nhiệt từ 4℃ đến 56℃ [33]

660 amino acid; ORF3 có đá dài khoÁng 113 amino acid, mã hóa cho mát protein chāc năng (Hình 1.4) Vùng tiếp giáp (JR) cÿa HEV nằm giữa 2 khung đác mç ORF1 và ORF3 Vì thế, vùng mã hóa cho ORF2 đ°ÿc bao phÿ lên khung đác mç

ORF3 nh°ng không tiếp giáp vãi ORF1 Ngoài ra, vùng CRE (cis-reactive element) là vùng thiết yếu cần thiết cho quá trình nhân lên cÿa HEV, vùng CRE thā nhÃt phÿ

trúc vòng (SL) ç vùng JR cũng đóng vai trò quan tráng đái vãi quá trình nhân bÁn cÿa HEV Vùng bÁo thÿ nhÃt cÿa hệ gen HEV là vùng giao ORF2-ORF3, th°ång đ°ÿc sử dāng làm vùng gen māc tiêu trong xác đßnh HEV bằng ph°¡ng pháp PCR Trong khi đó, vùng MeT ç đầu 5’ và vùng ORF2 l¿i là hai vùng gen đ°ÿc nhắm đến trong các nghiên cāu đßnh typ HEV HEV gồm 7 kiểu gen từ HEV-1 đến HEV-7; trong đó năm kiểu gen đã đ°ÿc tìm thÃy ç ng°åi gồm HEV-1, HEV-2, HEV-3,

gen phā thuác HEV-1 (1a đến 1e), hai kiểu gen phā thuác HEV-2 (2a và 2b), m°åi kiểu gen phā thuác HEV-3 (3a đến 3j), bÁy kiểu gen phā thuác HEV-4 (4a đến 4g) và hai kiểu gen phā thuác HEV-7 (7a và 7b) [35].

1.2.4 Astrovirus

cắt hình lāc giác, đ°ång kính 28-35 nm, chāa mát sÿi RNA m¿ch đ¡n, d°¡ng vãi đá dài khoÁng 6.800 nucleotides [36] Về đặc điểm vật lý, HAstV t°¡ng đái bền vững; có khÁ năng tồn t¿i ngay cÁ trong môi tr°ång chāa các chÃt t¿y rửa, clo hay dung môi acid vãi pH d°ãi 3; ç nhiệt đá từ 4℃ đến 60℃, nồng đá HAstV có dao đáng không đáng kể và vÁn duy trì khÁ năng lây nhiễm [37] Hệ gen cÿa HAstV gồm ba khung đác mç: ORF1a, ORF1b và ORF 2 (Hình 1.5)

A

B

Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus [36] [38] Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

ORF1a và ORF1b mã hóa các protein phi cÃu trúc, gồm hai enzyme serine protease (Pro) và RNA dependent RNA polymerase (Pol), ORF2 mã hóa protein

ç tÃt cÁ các chÿng HAstV giúp phân biệt há Astroviridae vãi các há vi rút khác nh°

Picornaviridae và Caliciviridae gồm vùng tín hiệu dßch khung (frameshift signal)

ORF2; các vùng nãi trên là các vùng gen th°ång đ°ÿc sử dāng làm vùng gen māc tiêu để xác đßnh HAstV cũng nh° phân biệt các kiểu gen cÿa HAstV HAstV đ°ÿc

°u thế vãi tỉ lệ phát hiện ç các n°ãc châu Á lên đến trên 80% [39]

1.3 Quy trình phát hiån và đßnh l°ÿng vi rút trong nhuyãn thá hai mÁnh vá

NoV, HAV, HEV và HAstV đều là các vi rút có khÁ năng cháng chßu cao vãi

cực tím cao [40] Vì vậy, các vi rút này có thể phát triển ổn đßnh và l°u l¿i trong môi tr°ång vãi thåi gian từ 2 ngày đến 4 tuần Đáng chú ý, các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m này có liều lây nhiễm thÃp, chỉ từ 10 đến 100 phần tử vi rút [41]; do đó, để

phát hiện và đßnh l°ÿng vi rút trong thực ph¿m gồm hai b°ãc chính: (1) Tách chiết RNA vi rút và (2) Xác đßnh vi rút

1.3.1 Các ph°¢ng pháp tách chi¿t RNA vi rút

NTHMV là nhóm thực ph¿m tồn t¿i nhiều thành phần āc chế phÁn āng xác đßnh vi rút ç giai đo¿n sau tách chiết nh° các polysacarit, protein và axit béo [42,

thực ph¿m, cô đặc vi rút và lo¿i bß các thành phần āc chế nói trên Các ph°¡ng

giÁi h¿t vi rút – cô đặc vi rút – tách chiết RNA vi rút ; (2) tách chiết trực tiếp RNA vi rút; (3) rửa giÁi vi rút bằng proteinase K – tách chiết RNA vi rút.

1.3.1.1 Phương pháp rửa giải hạt vi rút - cô đặc vi rút - tách chiết RNA vi rút

rút Ph°¡ng pháp này đã đ°ÿc áp dāng từ những năm 70 cÿa thế kỷ tr°ãc để tách chiết các vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m trong hàu [44, 45] æ giai đo¿n rửa

nguyên tắc trao đổi ion hoặc siêu ly tâm, môi tr°ång đệm trung tính th°ång đ°ÿc °u tiên sử dāng Tiếp theo, việc cô đặc bằng kết tÿa vi rút sau quá trình rửa giÁi đ°ÿc

th°ång đ°ÿc sử dāng gồm: kết tÿa bằng polyethylene glycol (PEG) hay các kỹ thuật nh° siêu ly tâm, sử dāng màng vi lác, cô đặc bằng ph°¡ng pháp miễn dßch hay phân tách cation Cuái cùng, giai đo¿n tách chiết RNA đóng vai trò quyết đßnh đến sự

do enzyme phiên mã ng°ÿc có tính nh¿y cÁm cao vãi các chÃt āc chế Māc tiêu chung cÿa các ph°¡ng pháp tách chiết RNA là thu đ°ÿc sÁn ph¿m RNA tinh khiết,

nền mÁu thực ph¿m, các ph°¡ng pháp sử dāng hÿp chÃt hóa hác nh° cetrimonium

dāng h¿t từ silica th°ång đ°ÿc sử dāng Nhìn chung, các ph°¡ng pháp dựa trên nguyên tắc hóa hác th°ång cho phép xử lý mát sá chÃt āc chế: chelex hoặc sephadex cho phép lo¿i muái và mát sá protein, CTAB cho phép lo¿i bß các

hóa hác là Trizol (Invitrogen, Mỹ) vãi sự kết hÿp cÿa ba thành phần guanidinium

Trizol đã đ°ÿc sử dāng ráng rãi trong nhiều nghiên cāu Tuy nhiên, mát sá nghiên cāu gần đây cũng chỉ ra việc sử dāng Trizol hay các giÁi pháp hóa hác trong tách

đó, việc tồn d° phenol, GuSCN hoặc các thành phần hóa hác khác từ giai đo¿n xử lý thu RNA cũng làm giÁm chÃt l°ÿng cÿa sÁn ph¿m RNA [48-51] Trong khi đó, các ph°¡ng pháp dựa trên nguyên tắc miễn dßch hay trao đổi ion th°ång mang l¿i

1.3.1.2 Phương pháp tách chiết trực tiếp RNA vi rút

Các ph°¡ng pháp tách chiết RNA trực tiếp từ thực ph¿m th°ång sử dāng

cho b°ãc tinh s¿ch tiếp theo Ph°¡ng pháp này đặc biệt đ°ÿc áp dāng đái vãi thực

pháp tách chiết RNA trực tiếp đã cho phép tách chiết 106 phiên bÁn hệ gen NoV

Husman năm 2007 đã tách chiết thành công 10 đ¡n vß RT-PCR vi rút từ 0,15g tuyến

NoV trong tuyến tiêu hóa cÿa các NTHMV cho đá nh¿y thÃp h¡n so vãi các ph°¡ng pháp tách chiết và cô đặc khác [48] Dù vậy, năm 2009, nghiên cāu cÿa Neonen đã chāng minh điều ng°ÿc l¿i khi lựa chán ph°¡ng pháp tách chiết RNA trực tiếp là ph°¡ng pháp chính để khẳng đßnh sự có mặt cÿa NoV trong các mÁu hàu trong mát vā dßch năm 2007 [56] SÁn ph¿m th°ång đ°ÿc sử dāng nhÃt trong các nghiên cāu

dßch hay trao đổi ion th°ång đ°ÿc sử dāng [57]

1.3.1.3 Rửa giải vi rút bằng proteinase K – Tách chiết RNA vi rút

dāng enzyme phân hÿy protein, d°ãi tác dāng nhiệt, ngoài các protein từ tế bào NTHMV, các RNase cũng bß biến tính, giúp bÁo toàn sá l°ÿng RNA thu đ°ÿc trong quá trình tách chiết æ giai đo¿n xử lý ban đầu này, việc băm nhß các mô tuyến tiêu

hóa cÿa NTHMV cũng góp phần làm tăng hiệu quÁ cÿa proteinase K Tiếp đến, thu vi rút và tách chiết RNA bằng việc phá hÿy lãp vß capsid cÿa vi rút, từ đó giÁi

để thu vi rút; RNA đ°ÿc tách chiết bằng việc sử dāng dung dßch muái chaotropic là GuSCN để phá vỡ lãp vß capsid cÿa virus; RNA sau đó đ°ÿc hÃp thā vào h¿t silica để thực hiện quá trình tinh s¿ch; RNA cÿa vi rút sau khi đã tinh s¿ch đ°ÿc giÁi phóng ra khßi h¿t silica vào dung dßch đệm tr°ãc khi tiến hành phÁn āng Real-time

h°ãng cho những nghiên cāu về vi rút gây bệnh trên đái t°ÿng mÁu thực ph¿m nói chung và NTHMV nói riêng

1.3.1.4 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết vi rút trong NTHMV

mßi cá thể hàu đã cho phép tăng đá nh¿y lên 100 lần [64] Việc tập trung tách chiết vi rút từ tuyến tiêu hóa đã mang l¿i nhiều °u điểm: giúp tăng đá nh¿y phát hiện,

āng RT-PCR [65] Quy trình tách chiết vi rút từ NTHMV gồm các giai đo¿n: ly giÁi

dāng cho quá trình tách chiết thông th°ång từ 1,5g đến 2g tuyến tiêu hóa Các

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV

Đệm kiềm,

Hiện nay, quy trình tách chiết NoV và HAV theo tiêu chu¿n ISO

Tây Ban Nha sử dāng bá kit NucleoSpin RNA virus (Macherey-Nagel, Dürem, Germany) đã đem l¿i hiệu quÁ phát hiện cao [68] Đáng chú ý, bằng việc sử dāng

hÿp giữa proteinase K và h¿t từ silica cũng đã đ°ÿc sử dāng trong nghiên cāu xác đßnh HAstV trong mÁu NTHMV cÿa Suffredini năm 2020 [69]

theo quy trình đ°ÿc nêu trong tiêu chu¿n ISO 15216-1:2013 là hoàn toàn khÁ thi

gây bệnh truyền qua thực ph¿m có nguy c¡ cao trong NTHMV (NoV, HAV, HEV,

quÁ kinh tế

1.3.2 Các ph°¢ng pháp xác đßnh vi rút

1.3.2.1 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng phiên mã ngược (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)

Ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt thông qua cÃu trúc vòng phiên mã ng°ÿc (RT-LAMP) là ph°¡ng pháp khuếch đ¿i đẳng nhiệt đ°ÿc sử dāng phổ biến nhÃt trong sá các kỹ thuật khuếch đ¿i đẳng nhiệt axit nucleic hiện có; vãi kỹ thuật này, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã đ°ÿc đ¡n giÁn hóa thêm mát b°ãc Ra đåi vào năm 2000, kỹ thuật RT-LAMP sử dāng đặc tính chuyển vß m¿ch cÿa

māc tiêu [71] (Hình 1.6) Nhå việc t¿o ra các cÃu trúc vòng đ¡n nhánh (loop

qua giai đo¿n biến tính nh° ç kỹ thuật PCR Ngoài ra, khÁ năng phát hiện trực tiếp sÁn ph¿m cÿa phÁn āng LAMP không cần điện di là mát trong các °u điểm nổi trái

Hình 1.6 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP [72]

Công trình đầu tiên sử dāng kỹ thuật RT-LAMP để phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực ph¿m là nghiên cāu cÿa Fukuda và các cáng sự vào năm 2006 [73] Dựa trên việc sử dāng gen māc tiêu là vùng đi từ đầu C cÿa gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase đến đầu N cÿa gen mã hóa VP1 để xác đßnh NoV, nghiên cāu đã đ¿t đ°ÿc đá nh¿y trong khoÁng 102-103 phiên bÁn/phÁn āng tùy thuác vào kiểu gen Khi đ°ÿc thử nghiệm trên các mÁu phân từ các vā dßch, đá t°¡ng đồng kết quÁ giữa ph°¡ng pháp RT-LAMP và RT-PCR đ¿t gần 100% Trong mát nghiên cāu t°¡ng tự, Yoda và các cáng sự (2007) đã thiết kế 3 tổ hÿp mồi để

GIII ít gặp Đá nh¿y cÿa ph°¡ng pháp RT-LAMP dao đáng từ 7-200 phiên

l°ÿng vi rút lãn

1.3.2.2 Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction)

dāng phổ biến nhÃt trong sá các kỹ thuật khuếch đ¿i axit nucleic để phát hiện vi rút trong NTHMV hiện nay Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai đo¿n chính: giai đo¿n thā

Reverse-transcriptase (RT) và giai đo¿n thā hai, khuếch đ¿i DNA bằng enzyme tổng hÿp DNA polymerase RNA tr°ãc tiên đ°ÿc cô đặc và tinh s¿ch để lo¿i bß các

đ¿i Các mồi đặc hiệu đ°ÿc sử dāng để khuếch đ¿i chính xác các trình tự māc tiêu, phân biệt vãi các vi rút và vi khu¿n khác có thể có mặt trong mÁu Lý t°çng nhÃt, mát cặp mồi có thể bao phÿ tÃt cÁ các biến thể cÿa chÿng vi rút, những mồi vãi

1.3.2.3 Phương pháp RT-PCR thời gian thực (Real-time RT-PCR)

T°¡ng tự nh° kỹ thuật RT-PCR, tr°ãc tiên mRNA đ°ÿc chuyển sang cDNA nhå enzyme phiên mã ng°ÿc Reverse-transcriptase (RT); tiếp theo đó, phÁn āng

đầu tiên vào năm 1996 bçi Ken Livak và các cáng sự thuác công ty Applied

đã trç thành b°ãc tiến lãn trong công nghệ sinh hác cÿa thế kỷ 20 [79] Hình 1.7 thể hiện nguyên tắc phÁn āng Real-time PCR

Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR [79]

Khác vãi phÁn āng PCR thông th°ång, Real-time PCR có khÁ năng phát hiện và đßnh l°ÿng trực tiếp sÁn ph¿m PCR sau mßi chu kỳ cÿa phÁn āng PhÁn āng Real-time PCR đ°ÿc thực hiện trong mát thiết bß gia nhiệt có khÁ năng chiếu sáng từng mÁu vãi mát chùm ánh sáng có chiều dài b°ãc sóng nhÃt đßnh Bên

āng Nh° vậy, bên c¿nh quy trình PCR thông th°ång cÿa phÁn āng tổng hÿp

nh¿y, đá đặc hiệu, đá lặp l¿i, giÁm thåi gian phân tích và h¿n chế hiện t°ÿng

1.3.2.4 Đánh giá các phương pháp phát hiện vi rút gây bệnh

¯u điểm và nh°ÿc điểm cÿa các ph°¡ng pháp xác đßnh vi rút gây bệnh

Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm

RT-LAMP Không yêu cầu thiết bß cồng kềnh, có thể thực hiện t¿i hiện tr°ång

Thiết kế mồi phāc t¿p, không có khÁ năng đßnh l°ÿng

[74]

RT-PCR Giãi h¿n phát hiện thÃp Không có khÁ năng đßnh l°ÿng Đá nh¿y, đá đặc hiệu phā thuác vào hiệu quÁ các giai đo¿n chu¿n bß và mồi phÁn āng

[82]

Real-time RT-PCR Kết quÁ hiển thß trực tiếp, không cần khẳng đßnh sau giai đo¿n PCR

Có thể đßnh l°ÿng

Đá nh¿y, đá đặc hiệu phā thuác vào hiệu quÁ các giai đo¿n chu¿n bß và mồi phÁn āng

[82]

¯u điểm và nh°ÿc điểm cÿa các ph°¡ng pháp trình bày ç BÁng 1.2 đã đ°ÿc

ph°¡ng pháp phát hiện NoV trên 244 mÁu bệnh ph¿m cÿa Rabenau và cáng sự đã

kit và Cepheid NoV Primer&Probe Set) vãi ph°¡ng pháp ELISA trên 61 mÁu bệnh

cáng sự xác đßnh Rotavirus trên 108 mÁu bệnh ph¿m bằng năm ph°¡ng pháp: ph°¡ng pháp ELISA, ph°¡ng pháp kính hiển vi điện tử, ph°¡ng pháp RT-PCR và ph°¡ng pháp Real-time RT-PCR th°¡ng ph¿m, cho kết quÁ tỉ lệ mÁu d°¡ng tính

đá đặc hiệu và đá nh¿y cao nhÃt, đ°ÿc °u tiên sử dāng trong phát hiện và đßnh l°ÿng các vi rút từ NTHMV

Năm 2013, Tổ chāc tiêu chu¿n quác tế ISO (International Organization for Standardization) đã công bá quy trình chu¿n đßnh l°ÿng NoV và HAV trong mÁu

cầu có đßnh h°ãng hiệu quÁ h¡n trong nghiên cāu về nhóm các vi rút gây bệnh

T¿i Việt Nam, quy đßnh về việc giám sát đßnh kỳ vi rút trong NTHMV đã đ°ÿc nêu t¿i KhoÁn 3 Điều 19 Thông t° sá 33/2015/TT-BNNPTNT cÿa Bá Nông

phép tiêu thā trực tiếp làm thực ph¿m d°ãi d¿ng t°¡i sáng; đồng thåi các mÁu thu

đá nh¿y lý thuyết đ¿t đến ng°ỡng 1 bÁn sao/phÁn āng là kỹ thuật phù hÿp nhÃt đáp āng quy đßnh về giám sát vi rút trong NTHMV hiện nay [85]

1.4 Các quy trình phát hiån và đßnh l°ÿng vi rút trong nhuyãn thá hai mÁnh vá dÿa trên kÿ thuÃt Real-time RT-PCR

trong xác đßnh NoV và HAV thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện tác nhân HAstV và HEV còn riêng lẻ Các thông sá chi tiết cÿa phÁn āng Real-time

Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV, HAV, HEV và HAstV

Tác nhân vi rút

Tên mßi/

Kích th°ßc

Vá trí vùng khu¿ch đ¿i

Tác giÁ, năm

NoV GI

NoV GII

HAV

Tác nhân vi rút

Tên mßi/

Kích th°ßc

Vá trí vùng khu¿ch đ¿i

Tác giÁ, năm

HAstV

Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV

Tác nhân vi rút

Thông tin bß mßi gçc (Tác giÁ, năm công bç)

Chu trình nhiåt

TLTK Phiên mã

HEV

HAstV

BÁng 1.3 và BÁng 1.4 thể hiện thông tin về bá mồi, mÁu dò và chu trình nhiệt cÿa phÁn āng Real-time RT-PCR sử dāng trong các nghiên cāu phát hiện NoV,

và HAV đã đ°ÿc mô tÁ trong quy trình chu¿n ISO 15216-1:2013; theo đó phÁn āng

giao nhau giữa ORF1 và ORF2, trong khi bá mồi xác đßnh HAV tập trung vào vùng 5’NCR, đều là vùng bÁo thÿ cÿa các chÿng vi rút này Các b°ãc cÿa phÁn āng Real-

Đái vãi HEV, theo kết quÁ khÁo sát cÿa Tổ chāc Y tế thế giãi WHO (World

đ¿i đo¿n gen vãi kích th°ãc 69bp ç vùng ORF3 là bá mồi đ°ÿc sử dāng nhiều nhÃt trong các nghiên cāu phát hiện HEV [93] Năm 2013, trong nghiên cāu so sánh 5 bá

biệt ç nhiệt đá giai đo¿n phiên mã ng°ÿc [89] Ngoài bá mồi cÿa Jothikumar năm 2006, bá mồi cÿa Schlosser thiết kế năm 2014 [87] khuếch đ¿i 81bp ç vùng ORF3

n°ãc thÁi vãi quy trình tham khÁo quy trình chu¿n ISO 15216-1:2013 [88] æ

RT-PCR và có mát sá khác biệt so vãi quy trình chu¿n nh°: nhiệt đá và thåi gian cÿa giai đo¿n phiên mã ng°ÿc (nhiệt đá và thåi gian thÃp h¡n so vãi quy trình chu¿n); thåi gian cÿa giai đo¿n ho¿t hóa enzyme polymerase (so vãi quy trình

m¿ch cao h¡n); đặc biệt, bá mồi cÿa Jothikumar sử dāng trong nghiên cāu này đã đ°ÿc kết hÿp vãi chu trình khuếch đ¿i rút ngắn xuáng hai b°ãc thay vì ba b°ãc nh°