Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu hiệu ứng sai hình nhiễm sắc thể ở tế bào LYMPHO người dưới tác động của bức xạ ION hoá và một số hoá chất dùng trong nông nghiệp

MỤC LỤC

671170125 |

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIỆU -©++E+++S+v2cc+++++tttrrt 3

1.1 NHIÊM SAC THE, BỘ NHIEM SAC THỂ NGƯỜI -2 31.2 SAI HÌNH NHIỄM SAC THỂ -©2++v+c+++ertrre 5

1.2.1 Phân loại tác nhân đột biến theo cơ chế gay tổn thương phan tử ADN 51.2.2 Phân loại sai hình NST và cơ chế hình thành + i

1.2.2.1 Sai hình kiểu nhiễm sắc thé - - 2 2+ 221 E1 SE v3 SE re 7

1 Saisie HH 0 eereeceeeeeeeseseeacearm Đ

1.2.3 sai hình NST ở tế bao lympho máu ngoại Vi ng ười «-s=<«=sss 14

1.3 NGHIÊN CỨU SAI HÌNH NST IN VITRO Ở TE BAO LYMPHO DƯỚITÁC DONG CUA BUC XA ION HOA crssssssssssssssssscssscssssssssesesnnssesnsessnunensnceeeee lỗ

1.3.1 Sai hình nhiễm sắc thể in vitro ở tế bào lympho phản ánh qui luật tác động

của bức xạ ion HOA - 5 << << 2< S999 99195 93.0483.6581 858488 83.530 16

1.3.2 Các mối quan hệ định lượng của sai hình nhiễm sác thể in vitro ở tế bào

lympho dưới tíc động của bức xg lon LOA sseeseeeeseseioaroondsndndiioslasoiaossdssog 17

1.3.2.1 Mối liên quan liều-hiệu ting - - ceeeceeeeeeceeecaceceeeeesscsceaeetaeeees Ly

1.3.2.2 Hiệu quả tạo sai Hình NST của bức xạ ion ROA « csvsessssvivesennsessssessvvvesarsasens 181.4 NGHIÊN CUU SAI HÌNH NST IN VITRO DƯỚI TÁC DONG CUA

1.5 SAI HINH NHIEM SAC THE TRONG TỰ NHIÊN VA Ở CÁC QUẦN

THE NGƯỜI LIEN QUAN DEN PHONG XA, HOA CHẤT 20

1.5.1, Sal hình NST trong tự nhÌẾNH: sàseseeeeeeeeeentreisnnnnsdeedeiorspsoisseslitgvnsggse 201.5.2 Sai hình NST ở các cộng đồng dân cư liên quan đến phóng xạ 20

1.5.3 Sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho trong định

lige PHONG Ng aaageaggẽgadadugisgrryoasodgttiioattstooiaggslosiui0G1040000030030001461010á80619039013iG 21

1.5.4 Sử dụng sai hình NST ở tế bao lympho làm chỉ thi phát hiện vùng

nhiệm chất Negi lNaaaaaaaoaeaaagagitgtdorottiigtiiitsisggiã408506Á4:45538S03488/448284xmaogadauã 22

1.6 MOT SỐ NGUY CƠ NHIEM ĐỘC MOI TRUONG Ở VIỆT NAM 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 252.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2- «+ €E+£#€E++e222es£+222czee 25

5.2.1 Tế bào lympho mầu neal vi Weil sesssssessecsarcssesncsosnannsvvanscssicsssesnosnseescerernnnvese 25

2.1.2 Cac nguồn bức xa sử dung trong nghiên CỨU s2 2s s<=ses+ 26

2.1.3 Các hoá chất sử dụng trong nghiên CỨU -< «<< ss ss se ssesee 26

2.1.4 Các hiết bị nuôi cấy tế bào và phân tích số liệu < s< << «s< se 27

33.,PHƯƠNG PHAP NGIHHÊN CU eeenerseenemsentsedtinrriitsogtttgseotesrttinh 27

2.2.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào và làm tiêu bản hiển Vi -. «- 27

2.2.2 Phuong pháp phan tích đặc điểm karyotype người -s<«ss<<s 29

ood Pong pháp phan tich sai HÌNH NST sao daaaaddadddndqdiddddobioaiasodaasesal 29

2.2.3.1 Phuong pháp nghiên cứu sai hình NST in vitro ở tế bao lympho dưới tác động

ch Gites Tet NU cong su NHáNGGIIG.GIGESRHGHIGIIGRGIGGHIMGGIGENSRERQHSNGGSIGEEIRSGNISSHGG 301 Sơ đồ chung và các bước nghiên cứu -+- ¿+ + xxx ekeeretrvrrkrerrrree 30

2 Xác định phân bố các tổn thương đứt gãy đôi giữa các NST 30

5 Xác định phan bổ sai Hình NST giữa các 18 DÃO sa oeeieaeaoaadaeeaiatosaeeestise 30

4 Xác định số lượng mảng dư trong tế bào có sai hình -.-‹-:-‹- 31

5 Xác định quan hệ liều-hiệu ứng va đường cong chuẩn thực nghiệm 31

6 Adc-dinh Hiệu qua sink học tương đổi seccaeedaaddoeostdeebsdieoibiisGHEEES0GG46IGRA5864833405 322.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu sai hình NST in vitro ở tế bào xử lý hoá chất 32

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm biểu hiện sai hình NST in vivo a2

2.2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm sai hình NST tu nhiên - - 2252222 +2 £zz<z£zzzzc<2 32

2.2.4.2 Nghiên cứu sai hình NST ở các đối tượng nghi vấn liên quan đến hoá chat 332.2.4.3 Nghiên cứu sai hình NST in vivo ở các đối tượng có tiếp xúc phóng xạ 33

2.2.5 Phuong pháp toán hoc sử dung trong nfghiên cứu - «<< «<< «ss 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUA VÀ BAN LUẬN 2- se ©+££+s£+vxee2xseeee 35

3.1 NGHIEN CỨU MỘT SỐ DAC ĐIỂM KARYOTYPE NGƯỜI 35

3.1.1 Kích thước tương đối và vị trí tâm động của các NST trong karyotype 35

3.1.2 Tính biến động của kích thước tương đối và chỉ số tâm động 40

3.2 NGHIÊN CỨU HIỆU UNG SAI HÌNH NST IN VITRO Ở TE BAO

LYMPHO DƯỚI TÁC DONG CUA BUC XA ION HÓA 2- <2 43

3.2.1 Các kiểu sai hình NST in vitro gay ra bởi bức xạ ion hoá - - 43

3.2.2 Tan số các kiểu sai hình NST in vitro ở tế bao lympho dưới tac động của bức

ý 5Ì, i 49

3.2.2.1 Phân bố tổn thương đứt gãy đôi gữa các NST trong tế bào lympho dưới

tác động của bức xa gamma và bỨc Xa n€utrOI ¿-¿- + + +5 S+*+*s*+++xzseeerxeee 493.2.2 2 Phân bố số lượng sai hình NST hai tâm giữa các tế bào lympho dưới tác động

của bức xa gamma và ĐỨC Xa HEUON suadesasgiedeioitiisszoG0ianoast0di3005505145E23058383860500 52

3.2.2 3 Số lượng mảnh dư trong tế bào chứa sai hình NST gây ra bởi bức xa gamma vàĐỨC XA n€UfTOII - 2c 2 101318911 11v TT Tu TH nọ vờ 54

3.2.2.4 Nghiên cứu các mối quan hệ định lượng giữa liều hấp thụ của bức xạ ion

hoá với tần số sai hình NST 2 tâm ở tế bào lympho - +5 ++++x+xvesexsesea 57

3.2.2.5 Hiệu quả tạo sai hình NST in vitro của các nguồn bức xạ - 67

3.3 NGHIÊN CỨU HIỆU UNG SAI HÌNH NHIEM SAC THE IN VITRO Ở TẾ

BÀO LYMPHO DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ HOÁ CHẤT SỬ DỤNG

TRONG NÔNG NGHIỆP - 5-2 5 S69 2 3x £teEEEEsxevetersrseree 73

3.3.1 Các kiểu sai hình NST in vitro gây ra bởi Bai58, Dimenat, Supracid va

TIIH HH HN x«kxeesiedbdidikaiekesoeresdtlgidiobistkiisfi4gtiaiàiBioffgglgii40i4f43611061ãi0Á8tã0151314944686836 73

3.3.2 Tan số của các kiểu sai hình NST in vitro ở tế bào lympho xử lý hoá chẩttừ

3.4 NGHIÊN CỨU SAI HÌNH NST IN VIVO Ở CÁC ĐỐI TƯỢNG SỐNG

TRONG CAC VUNG DẪN CƯ KHÁC NHÀU ¡eeSeessseeesereenrnre 81

3.4.1 Sa[Hình NST ô nhêm din cư Dink KH accuses 81

3.4.1.1 Các kiểu sai hình NST ngẫu nhiên -¿ 5-5552 S2xsxreerererrrree 81Badges Tre Tnhh NT no nh HH GeeeeiijiieiỲiaiiiiieiriinysnoasanrnnueenhoueveneoeose 82

3.4.2 Sai hình NST ở các đối tượng tiếp xúc với phóng xạ -««-««-s<« 85

3.4.2.1 Các kiểu sai hình NST được phát hiện -.- ¿+ ¿+25 S2svxvxexexexexeee 863.4.2.2 Tan số các kiểu sai hình NST o ccccccccecsesesesescescscsesensescseseeeeseeseseeeeseeceeeeeeees 873.4.2 3 Giải pháp định liều tích luy cho các nhân viên bức xạ - - 90

3.4.3 Nghiên cứu sai hình NST ở một số vùng dân cư có liên quan đến việc

sử dụng hoá chất trừ sâu Bai58, Dimenat, SuprracÌ «<< =<s=«seses 92

3.4.3.1 Các kiểu sai hình NST được phát hiện 2222+++222222222222222zzze 92

ce ee || ne 99

KẾT DU qaongitoiaaniooidictitbztgtt0000i000000000060/80003101450319510040903015000199000300 105

TT KH L THIT A eee 109

PHẦN PHỤ LỤC

Pit 106 Í ga uy gg tua gg00(G23010000035001001010305001016831932000369993993S850103104606312M90QNMI9RORARGSSVIEGE20SE 132

Tan ee hhrhooaaanaagaaaaaaa 148TU HT ca eieessesrenosdirreeseksrteeesoersrsemsereoivlsiSSïSGSEBSaGSRSSSESiGABcuSsSIBSSEGEĐRNES.Medibpmiis 158PHU LUC Am - 159Phu BGS vsciss cecsicacscvnpessirrnermnmenecneqynernassernavecsesereencesneccanvaerssecresnnsasqercersnenmneesnscunemanecyss 163

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Axít deoxyribonucleic

Enzim Cytosine Arabinoza (Cytosine Arabinose Enzyme)

Tổn thương bazơ nitơ

Tần số sai hình NST ngẫu nhiên trong phương trình chuẩn liều-hiệu

Chỉ số tâm động

Đại lượng chỉ liều hấp thụ của bức xạ trong phương trình chuẩn

liều-hiệu ứng, đơn vị Gy

Dit gãy đôi phân tử ADN (double strand break)

Thuật ngữ dùng để chỉ các đầu mút được hình thành do đứt gãy đôi,

đứt gãy đơn phân tử ADN.

Ký hiệu pha nghỉ trong chu trình phân bào

Don vị đo liều hấp thu của bức xa (1Gy = 100 rad)

Đại lượng chỉ liều tương đương của bức xa ion hóa, don vi Sv

Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (International Atomic

Energy Agentcy)

Kích thước tương đối (relative length distance)

Sự truyền năng lượng tuyến tính của bức xa ion hóa (Linear Energy

Hiệu quả sinh học tương đối (Relative Biological Effectiveness)

Hiệu quả sinh học tương đối cực đại (Max Relative BiologicalEffectiveness)

Tổn thương chuỗi đơn phân tử ADN (Single Strand Break)

Dung dịch đệm citrat nat tri

Don vi đo liều tương đương của bức xa (1Sv = 100 rem)

Bức xa tử ngoại (Untra Violet Light)

Tần số sai hình nhiễm sắc thể trong phương trình chuẩn liéu-hiéu ứng

Trọng số bức xạ (khả năng gây tổn thương sinh học của từng nguồn

phóng xa)

Hệ số tuyến tính của phương trình chuẩn liều-hiệu ứng

Hệ số bình phương của phương trình chuẩn liều-hiệu ứng

MỞ ĐẦU

Sự ra đời của Ủy ban bảo vệ chống các chất gây đột biến và các chất gây ung thư môi

trường Quốc tế (ICPEMC) tháng giéng năm 1977 đánh dấu sự quan tam của Thế giới

đến an toàn môi trường Dư lượng các yếu tố độc và hiệu ứng sinh học do chúng gây ra

là hai tham số phản ánh mức độ nhiêm độc Bằng các phương pháp vật lý và hóa học.

khoa học hiện đại cho phép xác định dư lượng các chất trong môi trường cũng như trong

cơ thể sinh vật với độ chính xác cao, song bản thân các số liệu đó tự nó không đủ cho

việc đánh giá hậu quả độc hại Các hiệu ứng sinh học mới chính là thước đo đánh giá

giới hạn gây độc của các yếu tố độc trong môi trường sống.

Xu thế phát triển năng lượng hạt nhân và thiết bị phóng xạ trong đời sống kinh tế xã

hội ngày một gia tăng đòi hỏi phải có sự phát triển của các kỹ thuật an toàn phóng xạ.

Để đánh giá mức độ an toàn phóng xa, bên cạnh các thông số vat lý và hoá hoc thì việc

sử dụng hiệu ứng sinh học là rất cần thiết Sai hình NST ở tế bào lympho máu ngoại vi

người có khả năng phản ánh khách quan nhất và chính xác nhất được IAEA khuyến cáosử dụng trong an toàn phóng xạ từ năm 1982 Không những thế, sai hình NST còn được

sử dụng như một chỉ thị để phát hiện nhiễm độc môi trường.

Đề tài: “Nghiên cứu hiệu ứng sai hình NST ở tế bào lympho người dưới tác động

của bức xa ion hoá và một số hoá chất dùng trong nông nghiệp” có nhiệm vụ nghiên cứuban chất tac động của các nguồn bức xạ khác nhau lên sự hình thành sai hình NST invitro ở tế bào lympho người làm cơ sở cho việc sử dụng sai hình NST ở tế bào lympho

trong định liều phóng xạ như một tham số vật lý Các nghiên cứu sai hình NST in vitro

dưới tác động của một số hoá chất được đặt ra nhằm hoàn thiện các dữ kiện liên quan

đến công tác định liều phóng xa và công tác cảnh báo nhiễm độc môi trường.

Mục tiêu của luận án

1 Đánh giá các qui luật phân bố và các mối quan hệ định lượng giữa tần số sai hình NST

in vitro ở tế bào lympho với liều lượng, suất liều, bản chất và sự truyền năng lượng tuyến

tính của bức xa ion hoá.

2 Khảo sat đặc điểm biểu hiện kiểu sai hình NST in vitro ở tế bào lympho được chiếu

bức xạ ion hoá và xử lý hoá nông dược để phân biệt dấu hiệu nhiễm phóng xạ với các tác

nhàn khác trong khảo sát định liêu mở ra kha nang sử dụng sai hình NST như một chi

thị cảnh báo và định hướng xác định nguyên nhân nhiễm độc môi trường.

3 Xây dựng các phương trình chuẩn liều-hiệu ứng đặc trưng cho các nguồn phóng xa tại

Lò Phản ứng Hạt nhân Đà lạt phục vụ công tác định liều sinh học.

4 Khảo sát đặc điểm biểu hiện sai hình NST in vivo ở tế bào lympho ở các cộng đồng

dân cư có hoặc không chịu ảnh hưởng các yếu tố độc môi trường như phóng xa, hoá

nông dược làm chỉ thị cảnh báo nguy cơ nhiễm độc môi trường và triển khai công tác

định liều.

Những kết quả nghiên cứu mới của luận án

1 Da phát hiện được một số qui luật phân bố và mối quan hệ định lượng giữa tần số sai

hình NST in vitro ở tế bào lympho với liều lượng, suất liều, ban chất và sự truyền nang

lượng tuyến tinh của bức xa ion hoá ở Lò Phản ứng Hạt nhân Đà Lat.

2 Xây dựng được 5 phương trình chuẩn liều-hiệu ứng đặc trưng cho các nguồn phóng xạ

tại Lò Phản ứng Hạt nhân Đà Lạt phục vụ công tác định liều sinh học.

3 Phát hiện được một số đặc điểm sai hình NST gây nên bởi bức xạ ion hóa và một số

hóa chất trừ sâu được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam.

4 Thu thập được bằng chứng dịch té hoc sai hình NST ở một số cộng đồng dân cư có

hoặc không chịu ảnh hưởng của phóng xạ và hoá nông dược nhằm phục vụ công tác

cảnh báo nhiễm độc môi trường.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NHIEM SAC THỂ, BỘ NHIÊM SAC THỂ NGƯỜI

Các nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy toàn bộ chiều dài các phân tử ADN của

bộ gen người được qui định bởi ~3 tỷ cặp nucleotid, sắp xếp trong 22 cặp NST tương

đồng và 1 cap NST giới tính [30, 48, 64] Theo Adolph, Dupraw, Evans, Paulson, va

Stubblefield thì mỗi NST do một phân tử ADN kết hợp với các phân tử protein histon và

protein phihiston xoắn lại ở các mức độ khác nhau [55, 56, 64, 131] Quá trình xoắn có

thể được giải thích theo mô hình Alberts.Chuỗi xoắn kép phân tử ADN

Nhiễm sắc thể ở metaphase | _- ISEE04)0YSS960SG00 | 1400 nm

Hình 1.1 Mô hình mô tả cấu trúc nhiễm sắc thể của Alberts.

Môi NST gồm | tam dong, 2 vai (q-vai dài, p-vai ngắn), cuối mỗi vai là phân ADN

lặp cấu tạo nên ving vùng đầu mút (telomere) có trình tự nucleotit TTAGGG được lặplại nhiều lần [6, 10, 131 164] Khi bi mất phần vùng đầu mút thì các NST có khả nangliên kết với nhau tạo nên các sai hình NST Cuối các NST tâm mút còn quan sát thấy

các cấu trúc độc lập gắn với NST qua eo thứ cấp, cấu trúc này được gọi là thể kèm

(satellite) Hội nghị Denve, Colorado Mỹ, 1960, Hội nghị Paris, 1971, Hội nghị Basel,

1985 thống nhất sắp xếp bộ NST người thành 7 nhóm theo đặc điểm kích thước tương

đối và vị trí tam động (hình 1.2) [18, 48, 188] Nhiễm sắc thể là một cấu trúc không

đồng nhất, sử dụng kỹ thuật nhuộm băng giemsa cho thấy số lượng và độ lớn các vạch

bát màu có khác nhau ở các cap NST khác nhau Ngoài kích thước tương đối và vị trítâm động thì số lượng và độ lớn các vạch bắt màu cũng được sử dụng để phân loại cácBy: NST heii mee NHHẬN ke) biểu 98, F*;

HH) |

GÀIan tb ree

FSO Sp j5 | fay get aa;

Hình 1.2: Hình thái các = NST 6 Hình 1.3: Hinh thái các

tiêu bản nhuộm giemsa thường[ 1§].

Để nhận biết các cap NST khác nhau người ta còn sử dung phương pháp nhuộm

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) [72, 139, 140, 191] Kỹ thuật nhuộm FISH

được thực hiện trên nguyên tắc lai in situ giữa NST với một phan tử ARN nhân tạo gan

chất phát quang có trình tự bổ sung cho NST đó, như vậy muốn quan sát được toàn bộbộ NST người thì phải có 24 phân tử ARN đặc hiệu gắn các chất phát quang khác nhau

[196] Các nghiên cứu phân loại bộ NST người bằng kỹ thuật nhuộm bang và nhuộm

FISH của Awa, Ontaki, Kodama đều sắp xếp bộ NST người thành 7 nhóm, có tính đặc

trưng phân loại của loài Homo safiens và không khác nhau ở các cộng đồng dân cư trên

Thế giới, kết quả giống với Hội nghị Denve, Colorado Mỹ, 1960, Hội nghị Paris, 1971

và Hội nghị Basel, 1985 [36, 140, 142, 154, 164, 122].

1.2 SAI HÌNH NHIEM SAC THỂ

1.2.1 Phan loai tac nhan dot bién theo co ché gay ton thuong phan tir ADN

Có thể chia tổn thương phân tử ADN ra làm 2 loại: đứt gay chuỗi và các tổn thương

tạo cầu liên kết Dit gãy chuỗi là các tổn thương đặc trưng do bức xa ion hoá gây nêncòn tạo cầu liên kết là các tổn thương đặc trưng do tia tử ngoại gây nên [30, 117, 128,

130, 131, 153] Bức xạ ion hóa gây nên các đứt gãy cấu trúc của phân tử ADN ở mọi

mối liên kết: giữa các nucleotit hoặc ngay trong một nucleotit, khung phân tử bazơ nitơ

hoặc đường 5 carbon hoặc liên kết các thành phần trong nucleotit (30, 52, 54, 97, 118,

131] Dit gãy chuỗi bao gồm đứt gãy 1 chuỗi polinucleotit (đứt gãy đơn - SSB) va đứt

gãy cả 2 chuỗi polinucleotit (đứt gãy đôi - DSB), ngoài ra bức xạ ion hoá cũng tạo nên

các tổn thương bazơ nitơ (BD) [30, 117, 130, 153, 173] Dạng tổn thương ADN quan

trọng do UV gây ra là tạo cầu liên kết đôi pyrimidine trong các vòng cyclobutane như

vòng thymidine, vòng cytosine và vòng thymidine-cytosine [60] Lippke và Franklin

phát hiện thấy UV gây tổn thương phân tử pyrimidine-pyrimidone ở vị trí 6-4 của các

liên kết T-C, C-C [12, 70] Peak phát hiện thấy UV có khả năng tạo liên kết giữa ADN

và protein tạo nên cầu nối ADN-protein trong tế bào [144] UV cũng gây tổn thương

các phân tử emzym phục hồi làm sai lệch chức năng phục hồi tốn thương phân tử ADN[60] Các kiểu ton thương phân tử ADN do tác động của các tác nhân dot biến được

Muller, Natarajan, Obe [130, 131, 138] mô tả trên hình 1.4.

- Mat purin (do alky! hóa)

- Thêm bớt nucleotid (do acridine)

Alkyl hóa (do alkyl hóa) - m)- - Tạo liên kết phức tạp (Asen tia X)

Mất pyrimidin (do alkyl hóa)- - - Đứt chuỗi đơn (do phóng xạ)

- Tạo phân tử hình khối (do benzen)

- Tạo cầu pyrimidin (do UV)

- Tổn thương bazơ (do phóng xa)

- Đứt chuỗi đôi (do phóng xa)

Phosphoester (do alkyl hoá)

Liên kết 2 chuỗi đơn (do alkyl)

- Liên kết trong chuỗi đơn (do alkyl

Liên kết ADN-Protein (do phóng

xa va alkyl hóa)

-Hình 1.4: Các kiểu tổn thương phan tử ADN do tác động của các tác nhân đột biến

Khác với bức xa ion hóa, các tác nhân đột biến hóa học gây tổn thương phan tử ADNbang các phản ứng alkyl hóa, oxi hóa, methyl hóa, khử amin hóa và khử purin hóa [13,

78, 79, 202, 203] Bên cạnh đó một số hoá chất có khả năng gây đứt gãy đôi và đứt gãy

đơn Lawrence, Nakayama, Natarajan, Povirk gọi các hoá chất có kha năng gây đứt gay

chuỗi phân tử ADN là “hoá chất bắt chước phóng xạ - radiomimetic chemical agents”.

Các nghiên cứu cua Lawrence, Nakayama, Natarajan, Povirk đã phát hiện rableomicine, phleomicine, neocarzinostatin là những hoá chất có kha nang gây ra các

đứt gãy đôi, đứt gãy đơn [125, 130, 147, 193] Tác nhân đột biến hóa học được chia

thành 2 loại: theo cơ chế tác động kiểu bức xa ion hóa và theo cơ chế tác động kiểu bức

Xa tử ngoại.

1.2.2 Phân loại sai hình nhiễm sắc thể và cơ chế hình thành

Các đứt gãy đơn và đứt gãy đôi tạo ra các đầu mút có khả năng tái liên kết với nhau

(chúng tôi gọi các đầu này là “đầu dính”) Mọi kiểu sai hình nhiễm sắc thể đều được

hình thành từ sự tái liên kết giữa các “đầu dính” Sự tái liên kết giữa các mảnh NŠT có

“đầu dính” do đứt gãy đôi trước pha S tạo nên các kiểu sai hình NST, sự tái liên kết các

“đầu dính” do đứt gãy đơn trước pha S tạo nên các kiểu sai hình nhiễm sắc tử.

Trong khuôn khổ nghiên cứu biểu hiện sai hình NST ở metapha thứ nhất ngay sau

khi tế bào bị tổn thương phân tử ADN nên chúng tôi sử dụng nguyên tắc phân loại củaSavage để nghiên cứu các kiểu sai hình và giải thích cơ chế hình thành chúng.

1.2.2.1 Sai hình kiểu nhiễm sắc thể (chromosome types)

Sai hình NST là các kiểu sai hình xảy ra trên cả 2 nhiễm sắc tử của NST, chúng gồmcác kiểu đa tâm, mảnh không tâm, vòng có tâm và không tâm, chuyển đoạn, đảo đoạn.

Cơ chế tạo nên sai hình NST được giải thích trên cơ sở thuyết tái hợp (reunion

theory) và thuyết trao đổi (exchange theory) các mảnh có “đầu dính” của Evans,

Natarajan, Revell, Sax [130, 162, 174, 175] Các nghiên cứu phân loại sai hình NST củaBender, Chadwick, Leendhout, Savage cũng sử dụng cơ chế tái liên kết giữa các mảnh

có “đầu dính” để giải thích cơ chế hình thành các kiểu sai hình NST [30, 126, 127, 128.

173, 175] Sự hình thành các kiểu sai hình NST trong tế bào có các “đầu dính” không

những phụ thuộc vào số lượng các đứt gãy đôi mà còn phụ thuộc vào cơ hội gặp nhau

của các “đầu dính” Ames, Bender, Natarajan, Savage, Shigenaga cho rằng vị trí các đứt

gãy đôi trên NST số lượng đứt gãy đôi trong tế bào và xác suất xảy ra các liên kết

tương hỗ giữa các mảnh có “đầu dính” có liên quan chặt chẽ với các kiểu phân loại saihình NST [13, 30, 45, 131, 173] Cơ chế hình thành các kiểu sai hình đa tâm, mảnh

không tâm, vòng có tâm, vòng không tâm, chuyển đoạn, đảo đoạn là quá trình tái liên

kết giữa các mảnh có “đầu dính” va được thực hiện theo các gia thiết đổi chỗ và nội

trao đổi Gia thiết đổi chỗ (interchange): trao đổi xảy ra theo nguyên tắc hoán vi “đầudính” do các đứt gãy đôi trên các vai của 2 NST Giả thiết nội trao đổi (interachange):

trao đổi xảy ra theo nguyên tắc hoán vị “đầu dính” do các đứt gãy đôi trong | NST, nội

trao đổi có thể xảy ra do các tổn thương cùng vai (intra-arm intrachange) hoặc giữa cáctổn thương ở 2 vai của NST (inter-arm intrachange) Trường hợp trao đổi xảy ra do các

tổn thương cùng vai của 1 NST có thể là nội trao đổi giữa các tổn thương ở 2 nhiễm sắctử hoặc giữa các tổn thương ở cùng nhiễm sắc tử của NST [173] Cơ chế hình thành cáckiểu sai hình NST theo các giả thiết Savage là: quá trình tái liên kết các “đầu dính” do |

tổn thương đứt gãy đôi đơn không xảy ra sẽ tạo nên sai hình mảnh không tâm va I NSTngắn hơn, sự tái liên kết các mảnh có “đầu dính” do nhiều tổn thương đứt gãy đôi để

hình thành các kiểu sai hình NST khác nhau được giải thích trên các hình 1.5 và 1.6.

-_~ Trường hợp trong tế bào có | đứt gãy đôi kép trên 2 NST (hình 1.5a):

Từ I DSB kép tạo thành 4

“đầu dính”

Đứt gãy đôi này tạo ra 4 “đầu dính” Từ 4 “đầu dính” của 2 mảnh có tâm và 2 mảnh

không tâm sẽ xảy ra liên kết hoàn toàn theo từng cặp để tạo nên | sai hình 2 tâm kèm 1

mảnh không tâm (a) hoặc 2 chuyển đoạn thuận nghịch (b) hoặc xảy ra liên kết không

hoàn toàn tạo nên 2 mảnh có tâm (c) hoặc 2 mảnh không tâm (d) hoặc | mảnh có tam

và 1 mảnh không tâm (e) và (9).

Hình 1.5b: Các kiểu sai hình hình thành từ đứt gãy đôi kép trên 3 NST

Các đứt gãy đôi này tạo ra 8 “đầu dính” theo 2 nhóm cơ hội liên kết giữa 4 “đầu dính”

trong mỗi nhóm là tương đương nhau Vi trí khác nhau của đứt gãy đôi trên NST đã tạonên các kiểu sai hình NST khác nhau ngay cả khi các liên kết tương hỗ giữa các mảnh

có “đầu dính” xảy ra hoàn toàn Các đứt gãy đôi xảy ra trên 2 vai của 1 NST sẽ tạo nên

sai hình 3 tâm, các đứt gãy đôi xảy ra trên cùng vai sẽ tạo nên sai hình 2 tâm Biểu hiện

của các liên kết không hoàn toàn là 8 kiểu sai hình NST khác nhau bao gồm các saihình 2 tâm, chuyển đoạn, mảnh không tâm.

- Trường hợp đứt gãy đôi kép xảy ra trên 1 NST (hình 1.6a, 1.6b):

Khi xảy ra | đứt gãy đôi kép trên 2 vai của INST (hình 1.6a) sẽ tạo ra 4 “đầu dính”.

Sự liên kết hoàn toàn giữa các “đầu dính” sê tạo nên kiểu sai hình vòng có tâm kèmmảnh không tâm (a) hoặc đảo đoạn (b) Liên kết không hoàn toàn sẽ tạo nên 4 kiểu saihình hoặc vòng kèm 2 mảnh không tâm (c) hoặc 1 NST ngắn kèm 1 mảnh không tâm

(d) hoặc 1 NST ngắn kèm | mảnh không tâm (e và f).

Liên kết hoàn toàn Liên kết không hoàn toàn

Hình 1.6a Các kiểu sai hình hình thành từ 1 đứt gãy đôi kép trên 1 NST.

Khi xảy ra | đứt gãy đôi kép trên cùng vai của 1 NST (hình 1.6b) sẽ tạo ra 4 “đầu

dính” Sự liên kết giữa 2 “đâu dính” của đoạn trung tâm sẽ tạo nên vòng có tâm hoặc

minute (a), liên kết hoàn toàn giữa các “đầu dính” còn tạo ra đảo đoạn ngoài tâm (b).

Nếu chỉ có 2 “đầu dính” của mảnh trung tâm liên kết sẽ tạo nên các kiểu sai hình (c),

nếu liên kết chỉ xảy ra giữa 2 mảnh cuối sẽ tạo nên các kiểu sai hình (d), nếu liên kết

chỉ xảy ra giữa 2 mảnh không tâm sẽ có sai hình (e) và nếu liên kết xảy ra giữa mảnh

trung tâm và mảnh có tâm sẽ hình thành sai hình kiểu (f).

Các cơ chế hình thành sai hình NST theo Savage chi ra kiểu sai hình NST phụ thuộc

vào số lượng đứt gãy đôi và sự tái liên kết các mảnh có “đầu dính” Điều quan trong là

Savage đã giải thích được số lượng các đơn vị nhiễm sắc trong tế bào Số lượng đơn vị

nhiễm sắc trong tế bào luôn được đảm bảo đủ 46 khi các mảnh sinh ra được tái liên kết

hoàn chỉnh (trừ trường hợp 2 DSB trên I NST) Số lượng don vị nhiễm sac sẽ lớn hơn 46

khi các mảnh đó không được tái liên kết hoàn toàn.

Khái niệm “đầu dính” theo Natarajan, Revell, Savage và Sax có thể gồm cả các đầu

so le Bender, Lloyd, Revell và Sax phát hiện thấy 2 đứt gãy đơn thuộc 2 site gần nhaucũng có vai trò giống như một đứt gãy đôi trong việc tạo ra các “đầu dính” [30, 36, 117,

161, 175] Các liên kết chéo giữa các “đầu dính” do 1 đứt gãy đôi kép thường dễ xảy rahơn ở 2 đứt gãy đôi đơn Trong khi các đứt gãy đôi kép chỉ được gây ra do tác động trực

tiếp thì các đứt gãy đôi đơn còn được tao ra do sự khuyết phục hồi hoặc phục hồi nhầm

các tổn thương khác Heartlein và Preston đã phát hiện thấy tần số đứt gãy đôi tăng lên

khi xử lý enzym Cytoarabinoza cho tế bào lympho sau chiếu xạ [69, 89, 149], hiện

tượng đó được Evans, Van Zeeland giải thích rằng cơ chế phục hồi tổn thương BD bịkhuyết hoặc bị nhầm dẫn đến sự lạm dụng quá mức enzym cắt lọc làm cho chuỗi mang

tổn thương BD bị khoét rộng quá mức tạo nên đứt gãy đôi [64, 200].

1.2.2.2 Sai hình kiểu nhiễm sắc tử (chromatid types)

Sai hình nhiễm sắc tử là các kiểu sai hình chỉ làm thay đổi cấu trúc của 1 trong 2nhiễm sắc tử của NST Về nguyên tắc sai hình nhiễm sắc tử có thể do các đứt gãy đôisau phase S hoặc đứt gãy đơn trước phase S của chu trình phân bào, trong khuôn khổnghiên cứu các sai hình nhiễm sắc tử do tổn thương phân tử ADN trước pha S nên chỉ

dé cập đến cơ chế hình thành sai hình từ các tổn thương đứt gãy đơn Sai hình nhiễm

sắc tử rất phức tạp về hình thái, hình thái đó không những được quyết định bởi số lượng

tổn thương tham gia tạo nên các “đầu dính”, hình thức liên kết mà còn cả mối quan hệtương đồng hoặc không tương đồng của các NST tham gia vào qua trình.

Kiểu sai hình nhiễm sắc tử đơn giản nhất là kiểu đứt gãy nhiễm sắc tử được hình

thành do | đứt gãy đơn của NST trước phase S [30, 130, 131, 173] Sự tham gia của 2

đứt gãy đơn trở lên sẽ tạo nên các kiểu sai hình nhiễm sác tử rất phức tạp, cơ chế hình

thành thành mot số kiểu sai hình nhiễm sắc tử được minh hoa trên hình 1.7, 1.8 và 1.9.

- Trường hợp tổn thương đứt gãy đơn kép trên 2 NST (hình 1.7a) trước pha S:

Tổn thương đứt gãy đơn kép trên

a b v d e f g h i j k m

Lién két hoan toan Liên kết không hoàn toàn

Hình 1.7a Các kiểu radical hình thành do tổn thương đứt gãy đơn kép trên 2 NST.

Sự tái liên kết hoàn toàn của 4 “đầu dính” tạo nên các kiểu sai hình radical a, b, c, d,trong đó a và c được gọi là radical kiểu chữ U, b và d được gọi là radical kiểu chữ X.Khi không có sự tái liên kết hoàn toàn thì tạo nên các kiểu radical kiểu U hở e, g, i, k,

và các radical X hở f, h, j, m.

- Trường hợp có 2 đứt gãy đơn kép trên 3 NST thi sự tái liên kết hoàn toàn sẽ tạo nên 6

kiểu sai hình radical trên hình 1.7b và sự tái liên kết không hoàn toàn sẽ tạo nên nhiềukiểu sai hình radical phức tạp.

MÔ Mr

Hình 1.7b Các kiểu radical do 2 đứt gãy đơn kép ở 3 NST

- Trường hợp đứt gay đơn kép khác vai của 1 NST:

Kiểu tổn thương này có thể xảy ra giữa 2 sợi đơn khác nhau (hình I.8a) hoặc xảy ra

trên cùng | sợi đơn (hình 1.8b), các liên kết hoàn toàn giữa 4 đầu tự do sẽ tạo nên các

kiểu sai hình với hình dạng được quyết định bởi tính tương đồng của các đoạn liên kết.

| |

Hình 1.8a Các kiểu sai hình NST do đứt Hình 1.8a Các kiểu sai hình NST do đứt

gãy đơn kép giữa 2 sợi đơn khác vai gay đơn kép trên l sợi đơn khác vai

- Trường hợp đứt gãy đơn kép trên cùng vai của 1 NST:

Kiểu tổn thương này có thể xảy ra giữa 2 sợi đơn khác nhau (hình 1.9a) hoặc trên

cùng | sợi đơn (hình 1.9b).

Hoàn toàn Liên kết không hoàn toàn Hoàn toàn Liên kết không hoàn toàn

Hình 1.9a Các kiểu sai hình do đứt gãy Hình 1.9a Các kiểu sai hình do đứt gãy

đơn kép trên 2 sợi đơn đơn kép trên | sợi đơn

Cả 4 đầu tự do đều có khả năng liên kết tương hỗ với nhau, các trường hợp tái liên kết

hoàn toàn sẽ tạo nên các sai hình a, b, các tái liên kết không hoàn toàn sẽ tạo nên cácsai hình c, d, e, f.

Cơ chế hình thành sai hình NST mà chúng ta đang xét đến chi đúng trong trường

hợp các tổn thương ADN không được phục hồi Haseltine, Rupp, Sancar, Seawell, Van

Zeeland đã phát hiện sự có mặt của 4 enzym hoạt hóa đặc trưng cho cơ chế phục hồi cat

lọc ớ vi khuẩn cũng như ở tế bao động vat [54, 60, 121] Hanawalt, Painter, Van

Zeeland cũng phát hiện thấy một loại cơ chế phục hồi tổn thương UV mới đó là cơ chế

chống chịu hay phục hồi sau sao chép, theo cơ chế này thì phân tử ADN có tổn thương

vẫn được tổng hợp mới mà không làm mất tổn thương [81, 82 200, 2001) Các thí

nghiệm của Bachetti, Bender, Johansen, Natarajan, Preston, Sperling, Van Zeeland,

Yoakum, Ward xác nhận các đứt gay đơn do bức xa ion hoá gây nên ở tế bào sinh vật

nhân sơ cũng như sinh vật nhân chuẩn được phục hồi một cách nhanh chóng ngay sau

khi tổn thương được hình thành [19, 30, 97, 130, 132, 153, 185, 200, 210, 213] Phát

hiện của Bachetti, Bender, Johansen, Natarajan, Preston, Sperling, Van Zeeland,Yoakum, Ward là cơ sở giải thích su hiếm gặp các sai hình nhiễm sac tử ở tế bào

lympho chiếu bức xa ion hoá.

1.2.3 SAI HÌNH NHIEM SẮC THE Ở TẾ BAO LYMPHO MAU NGOẠI VI NGƯỜI

Phát minh kỹ thuật nuôi cấy tế bao lympho in vitro của Moorehead, 1960, Nowell,

1960 được đánh giá là | trong 3 thành tựu thúc đẩy sự phát triển vượt bac của các

nghiên cứu di truyền học tế bào và những ứng dụng của nó trong y học, trong môi

trường của thế kỷ XX Năm 1982 kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho máu

ngoại vi người được Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (IAEA) khuyến cáo sử

dung trong đo liều phóng xa Sở di như vậy là vì sai hình NST ở tế bao lympho có

những đặc điểm đặc biệt làm cho nó có khả năng phản ánh được một cách khách quan

và chính xác tác động của môi trường lên con người [30, 48, 131, 138, 180, 186, 209].

- Do không phân chia, luôn tồn tại ở pha Go trong cơ thể nên các đứt gãy đôi do tác

động in vivo cũng như tác động in vitro đều xảy ra trước pha S, đều không được phục

hồi do đó sai hình NST có sự giống nhau giữa in vivo và in vitro Các kết quả nghiên

cứu của Bazerska, Bender, Breman, Clemenger, Dolphin, Evans, McFee, Natarajan va

Preston đã chứng minh tần số sai hình NST giống nhau giữa các tế bao lympho bị chiếu

xa in vitro và từ mẫu máu bệnh nhân xa trị cùng liều [30, 72, 115, 117, 133, 151, 172].

- Do không phân chia nên có thể xác định được chu trình tế bào trong nuôi cấy in vitro,việc phân tích kiểu sai hình NST ở lần phân chia đầu tiên cho ta biết kiểu tổn thương

phân tử ADN được gây ra trước pha S Như vậy kiểu sai hình NST in vitro cho biết cơchế gây tổn thương phân tử ADN của tác nhân thử nghiệm, kiểu sai hình NST in vivo

cho biết cơ chế tác động của tác nhân gây ô nhiễm [129, 150, 151].

- Với số lượng ~ 10)? tế bào, chảy theo hệ thống máu ngoại vi phân bố đều khắp cơ thểnên tế bào lympho có vai trò đại diện để phản ánh tác động của ngoại cảnh lên cơ thể từ

mọi hướng, từ trong cơ thể cũng như ngoài cơ thể.

- Với sự tồn tại lâu dài không phân chia là cơ sở để tế bào lympho máu ngoại vi tồn trữ

được hầu hết các sai hình NST phát sinh do tác động của môi trường trong suốt đời

sống của nó Trong lần phân bào đầu tiên, bộ NST sẽ phản ánh các ghi nhận về sự tácđộng của môi trường lên tế bào suốt đời sống của nó trong cơ thể Buckton, Dolphin,Lloyd, Norman, Ramalho đã chứng minh được rằng thời gian bán sống của tế bào

lympho thường là 4 năm, một số tồn tại ~20 năm [30, 35, 48, 114, 134, 135].

Đặc điểm phản ánh khách quan và chính xác tác động của các tác nhân đột biến lên

sự hình thành sai hình NST ở tế bao lympho trong in vitro cũng như trong in vivo chỉđúng khi quan sát ở chu kỳ phân bào đầu tiên Với tiêu bản nhuộm Hoechst 33258,

Fabry, Kodama, Natarajan, Sasaki đã chỉ ra thời gian nuôi cấy thích hợp để số lượng tế

bào đạt metapha thứ nhất chiếm tối ưu trong quần thể là 48 gio [65, 131, 151, 172].

1.3 NGHIÊN CỨU SAI HÌNH NHIEM SAC THE IN VITRO Ở TẾ BAO

LYMPHO DUGI TAC DONG CUA BUC XA ION HOA

Sai hình NST in vitro ở tế bao lympho được Hội đồng Cố vấn về Do liều Sinh học

của IAEA đánh giá là loại hiệu ứng sinh học có khả năng phản ánh khách quan vàchính xác ban chất tác động của bức xa ion hoá.

1.3.1 SAI HINH NHIEM SAC THE IN VITRO Ở TE BAO LYMPHO PHAN ANH QUI

LUAT TAC DONG CUA BUC XA ION HOA

Khác với các đối tượng không sống, sai hình NST là một loại hiệu ứng sinh học bởi

vậy chúng cũng phụ thuộc vào sự tác động bên ngoài và sự đáp ứng của cơ thể sinh vật.

Chính sự chi phối của các cơ chế sinh học đã tạo nên sự sai lệch kết quả nghiên cứugiữa in vitro và in vivo Tính định lượng của sai hình NST càng thấp khi bi các cơ chế

sinh học chi phối càng nhiều Qui luật tác động của bức xa ion hoá là các qui luật ngẫu

nhiên Các nghiên cứu sai hình NST ở tế bào lympho dưới tác động của bức xạ ion hoácho thấy sai hình NST cũng phản ánh bản chất tác động của phóng xa theo các qui luật.Các qui luật ngẫu nhiên trước hết được phản ánh qua cơ chế tác động của phóng xạ lênsự hình thành các đứt gãy đôi trên phân tử ADN, nghiên cứu của Lloyd, Natarajan,

Preston, Sasaki [170, 171, 172] cho thấy bức xạ ion hoá thường gây ra các đứt gãy đôi

trực tiếp, sự tác động trực tiếp của bức xạ ion hoá là tác động ngẫu nhiên Buckton, Que

đã chứng minh phân bố của các đứt gãy đôi trên các NST ở tế bao lympho dưới tác

động của bức xạ gamma tuân theo qui luật phân bố đều [36] Cơ chế hình thành saihình NST là cơ chế tái liên kết giữa các “đầu dính”, đây cũng là một qui luật ngẫu

nhiên [173] Ở cấp độ quần thé, sai hình NST ở tế bào lympho dưới tác động của bức xa

ion hoá cũng tuân theo các qui luật ngẫu nhiên Bauchinger, Bender, Edwards, Fabry,

Natarajan, Sasaki xác nhận phân bố của sai hình NST 2 tâm giữa các tế bào chiếu bức

xạ Ion hoá tuân theo qui luật Poisson [25, 29, 57, 65, 117, 131, 153, 170, 171, 172].

Qui luật ngẫu nhiên là qui luật cần thiết để đảm bảo sai hình NST phản ánh được

tính khách quan tác động của bức xạ ion hoá Sự biểu hiện khách quan tác động củabức xạ ion hoá của sai hình NST là nguyên nhân cho kết quả giống nhau giữa sai hìnhNST in vivo va in vitro ở tế bào lympho Các qui luật phân bố sai hình NST ở tế bào

lympho ở cấp độ tế bào và cấp độ quần thể có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu

bản chất tác động của các nguồn bức xạ khác nhau và là cơ sở để áp dụng các số liệu

chuẩn in vitro vào nhiệm vụ đánh giá in vivo trong định liều phóng xạ.

1.3.2 CAC MỐI QUAN HỆ ĐỊNH LƯỢNG CUA SAI HÌNH NHIỄM SẮC THE IN VITRO

Ở TE BAO LYMPHO DUGI TÁC DONG CUA BUC XA ION HOA

Mối liên quan định lượng giữa sai hình NST với tác động của bức xa ion hoá được

biểu thị bởi phương trình liều-hiệu ứng và hiệu quả sinh học tương đối Cả 2 mối quanhệ này đều biểu thi sự liên quan giữa tần số sai hình NST với liều lượng, suất liều, ban

chất và sự truyền năng lượng tuyến tính (LET) của bức xạ ion hoá Suất liều là giá tri

liều lượng trên 1 đơn vị thời gian; bản chất là bức xạ điện từ (gamma, tia X) hay bức xạ

hạt, hạt mang điện (hạt e, a, B) hay hạt không mang điện (neutron); sự truyền năng

lượng tuyến tính là khả năng truyền năng lượng theo đường thẳng của bức xạ, được chia

thành 2 loại: LET thấp (gồm bức xa gamma, tia X, hạt điện tử), LET cao (gồm các hạt

neutron nhanh ở các mức năng lượng khác nhau).

1.3.2.1 Mối liên quan liều-hiệu ứng

Mối liên quan giữa tần số sai hình NST 2 tâm với liều lượng, suất liều, bản chất và

LET của bức xạ được gọi là mối liên quan liều-hiệu ứng Các kết quả nghiên cứu trên

Thế giới đã chỉ ra các phương trình tổng quát của mối liên quan này phụ thuộc vào LET

của bức xạ, nó có dạng tuyến tính đối với bức xa LET cao (y = kD + C) và dạng bậc 2

(y = aD + BD? + C) đối với bức xạ LET thấp (30, 131, 197] Các nghiên cứu của

Bauchinger, Bender, Fabry, Natarajan phát hiện ra rằng dạng phương trình liều-hiệu

ứng tổng quát luôn được quyết định bởi LET, chúng có dạng tuyến tính với bức xa LET

cao và hàm mũ bậc 2 với bức xạ LET thấp [24, 30, 65, 131] Trên cơ sở sử dụng EnzymCyto Arabinoza (AraC) tác động vào mẫu máu ngay sau chiếu bức xạ LET cao (neutron

nhanh) và bức xạ LET thấp (gamma) mà Preston đã phát hiện ra hệ số œ phụ thuộc vào

số lượng sai hình 2 tâm do các đứt gãy đôi trực tiếp, còn hệ số B phụ thuộc số lượng sai

hình 2 tâm do các đứt gãy đôi gián tiếp (khuyết phục hồi các tổn thương BD) [153].

Trong khi phương trình tổng quát phụ thuộc vào LET của bức xạ thì các hệ số hồi

qui thực nghiệm œ và cho biết mối quan hệ chính xác giữa tần số sai hình NST với

liều lượng, suất liều ban chất va LET của riêng từng nguồn bức xa Các hệ số œ, {3 cũng

như tỷ lệ œ/B còn phản ánh thực chất mức độ gây đứt gãy đôi trực tiếp hay gián tiếp của

bức xạ đang nghiên cứu [30, 65, 69, 131, 89, 153] Nghiên cứu trên các nguồn bức xa

gamma, tia X của Baushinger, Fabry, Leonard, Lloyd, Prosser, Takahashi, Schmid,

Vulpis, Wagner, Wambersie đã xác định được mối liên quan liều-hiệu ứng là các

phương trình hàm mũ bậc 2 với các giá trị hệ số hồi qui thực nghiệm số a, j và tỷ lệ

œ/B khác nhau phụ thuộc vào suất liều của các nguồn bức xạ [25, 111, 176, 190, 206],

[208] Trên các nguồn bức xa neutron nhanh, Heartlein và Preston, 1985 đã chứng minh

hiệu suất tạo đứt gãy đôi trực tiếp của bức xạ LET cao cao hơn bức xạ LET thấp rất

nhiều và phương trình liều-hiệu ứng phù hợp với dạng tổng quát y = kD + C với giá trị

hệ số k khác nhau ở các nguồn bức xạ khác nhau [84] Nghiên cứu của Barjaktarovic,Bauchinger, Biola, Fabry, Leonard, Lloyd, Prosser, Wambersie [20, 24, 112, 156] sửdụng nguồn bức xạ đơn năng khác nhau và nguồn bức xạ gamma suất liều khác nhau đãchứng minh được giá trị các hệ số œ và B phụ thuộc vào suất liều, bản chất, và LET.

1.3.2.2 Hiệu quả tạo sai hình NST của bức xạ ion hoá

Hiệu quả tao sai hình NST của bức xa ion hoá là hiệu suất tao ra sai hình NST của

nguồn bức xạ nghiên cứu so với nguồn chuẩn Hiệu quả gây sai hình NST của bức xaion hoá được sử dung để đánh giá hiệu suất tạo ra sai hình NST ở các liều bức xạ khác

nhau của từng nguồn bức xạ (RBE) và hiệu suất tạo sai hình NST của các nguồn bức xạ

khác nhau (RBEo) |

- Hiệu quả sinh học tương đối (RBE)

Công thức xác định RBE = fi/fy (fi: tần số sai hình NST do nguồn bức xa i; fy: tan số

sai hình NST do bức xa gamma cùng liều hấp thu) [30, 131] Trong cùng 1 nguồn bứcxạ thì hiệu suất tạo ra sai hình NST không giống nhau ở các liều hấp thụ khác nhau.

Nghiên cứu trên nhiều nguồn bức xạ khác nhau của Barjaktarovic, Bender, Fabry,

Hellin, Natarajan đã chứng minh RBE giảm khi tăng liều hấp thụ [30, 65, 85, 131].

RBE được sử dụng để đánh giá hiệu suất tạo ra sai hình NST giữa các liều hấp thụ khác

nhau của cùng một nguồn bức xạ.

- Hiệu quả sinh học tương đối cực đại (RBEo).

RBEo là hiệu suất tạo ra sai hình NST từ các đứt gãy đôi trực tiếp của nguồn bức xa.

Công thức xác định RBE, = ơi/œy (ai: hệ số hồi qui tuyến tính của phương trình chuẩn

liều-hiệu ứng thực nghiệm đối với nguồn bức xa i; ay: hệ số hồi qui tuyến tính tính của

phương trình chuẩn liéu-hiéu ứng thực nghiệm đối với nguồn bức xạ gamma) [65].

Thực nghiệm của Fabry và cộng sự, 1985 đã chỉ ra RBE, đối với mẫu chiếu d(16)+Be

neutrons, d(33)+Be neutrons, d(50)+Be neutrons, 250kv tia X, tia gamma tương ứng là

14,0; 6,2; 4,7; 1,5 và 1,0 [65] Nghiên cứu trên các nguồn bức xạ neutron đơn năng

khác nhau Bender, Lloyd, Natarajan, Preston, Sasaki đã chứng minh hiệu quả sinh học

tương đối cực đại phụ thuộc suất liều, bản chất va LET của bức xa [30, 117, 131, 153].

1.4 NGHIÊN CỨU SAI HÌNH NHIEM SAC THE IN VITRO DƯỚI TAC

DONG CUA HOA CHAT

Cơ chế gây tổn thương phan tử ADN của hoá chất phức tap hon bức xa ion hoá rấtnhiều, Obe, Muler, Natarajan đã chứng minh các tổn thương phân tử ADN do hoá chất

vừa theo kiểu UV vừa theo kiểu bức xạ ion hoá [129, 137] Khả năng gây đứt gãy đôi,

đứt gãy đơn giống với bức xạ ion hoá đã được phát hiện ở Bleomicine, Phleomicine,

neocarzinostatin [125, 130, 147, 193] Gunther đã phát hiện các phân tử Dimethoat,

Methidathion có trong các loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ liên kết với phân tử ADN của

NST, quá trình khuyết phục hồi hoặc phục hồi nhầm các liên kết đó đã tạo nên các tổn

thương phân tử ADN [78, 79] Sai hình NST do hoá chất gây ra cũng được hình thành

theo nguyên tắc tái liên kết các mảnh có “đầu dính” do các đứt gãy đôi va đứt gay đơn

tạo ra Khác với bức xạ ion hoá các đứt gãy đôi do hoá chất thường là các đứt gãy đôi

gián tiếp do khuyết phục hồi các tổn thương liên kết hoặc BD nên chúng thường ở dạng

đơn, khả năng liên kết hoàn toàn của các “đầu dính” tự do thấp, tính chất bảo toàn đơn

vị nhiễm sac trong tế bào thấp Khác với bức xa ion hoá, một số hoá chat làm bất hoạt

các enzym phục hồi do đó các đứt gay đơn tồn tại được qua pha S sẽ hình thành nên các

sai hình nhiễm sắc tử Đặc điểm biểu hiện cúa các kiểu sai hình NST do hoá chất là cơ

sở cho việc phan định hậu quả tác động của phóng xạ hay hoá chất khi khảo sát cáccộng đồng dan cư nghi vấn.

1.5 SAI HÌNH NHIÊM SẮC THỂ TRONG TỰ NHIÊN VÀ Ở CÁC QUẦN

THỂ NGƯỜI LIÊN QUAN ĐẾN PHÓNG XẠ, HOÁ CHẤT

1.5.1 SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ TRONG TỰNHIÊN

Sai hình NST không tự nhiên sinh ra, Buckton, Evan, Tonomura và nhiều nghiên cứu

khác đã không phát hiện được sai hình NST ở trẻ mới sinh [30, 194] Sai hình NST có

khả năng tạo thành do tác động của các yếu tố đột biến tự nhiên Tế bào lympho không

phân chia nên có khả năng tích luỹ sai hình NST, bởi vậy tan số sai hình 2 tâm trong tế

bào lympho phụ thuộc vào tuổi, Tonomura phát hiện thấy mối quan hệ giữa tần số saihình 2 tâm (y) và tuổi (X, X=10 năm) theo công thức y = 2,18.10 + 1,7.10% X[194].

Tần số sai hình NST theo kết quả từ khảo sát 42 cộng đồng dân cư khác nhau trên Thế

giới mà Lloyd tổng kết thì kiểu đa tâm nằm có giá trị từ 0-0,39% (19% có tần số >

0,1%), kiểu mảnh không tâm từ 0-1,5% (12% có tần số > 1,0%) [108, 114] Tần số đứt

gãy nhiễm sắc tử theo O’Riodan, 1978 là 0,10% [108] Kết quả nghiên cứu của Awa,

1983, 1992, Bender, 1988, Leonard, 1987, Lloyd, 1980, Tonomura, 1983 cho thấy tầnsố sai hình NST ở các cộng đồng dân cư tự nhiên không vượt 0,28% với đa tâm, 1,05%

với mảnh khong tâm và 2,0% với đứt nhiễm sắc tử [16, 17, 30, 108, 194].

1.5.2 SAI HÌNH NHIỄM SẮC THỂ Ở CÁC CỘNG ĐỒNG DÂN CƯ LIÊN QUAN

ĐẾN PHÓNG XẠ

Tần số sai hình NST cao khác thường đã được phát hiện ở các nhóm dân cư liên

quan đến phóng xạ, hóa chất Dolphin phân tích sai hình NST ở những người công nhân

làm việc trong môi trường có sự phân rã của plutonium đã nhận được kết quả tần số sai

hình 2 tâm là 0,5% (đối chứng 0,25%) [63| Tổng kết của Brandom cũng cho thấy tansố sai hình NST cao ở các mức độ khác nhau giữa các vùng môi trường có hoạt tính

phóng xạ khác nhau [33] Pohl-Ruling, Scheminzky, 1977 khảo sát nhóm dân cu vùng

hoạt tính phóng xạ tự nhiên ở Badgastein (Áo) cho thấy tần số sai hình NST phụ thuộc

vào hoạt tính phóng xạ của môi trường và có tần số từ 0,85%-0,73% đối với mảnhkhông tâm, từ 0,15%-0,28% đối với sai hình hai tâm [146] Khảo sát của Franca ở các

dân cư sống trong vùng có hoạt tính phóng xạ cao tại Brazil cho thấy tần số sai hình đa

tâm là 0,15% (đối chứng 0,06%), tần số mảnh không tâm là 1,00% (đối chứng 0,85%)

[146] Tần số sai hình NST khác thường cũng đã được phát hiện ở các vùng dân cư sốngtrong vùng hoạt tính phóng xạ tự nhiên ở Phần lan, Nhật bản, Trung quốc, Nam tư,

Pháp, Mỹ [146] Stephan và Oestreicher đã công bố các khảo sát sai hình NST của

nhóm dân cư nhiễm bụi phóng xa từ sự cố nổ lò phản ứng hạt nhân Chernobyl, theo đómẫu lấy năm 1988 có tần số sai hình đa tâm là 0,24%, mảnh không tâm là 0,82%, mẫu

lấy năm 1989 có kết quả tần số sai hình các kiểu tương ứng là 0,16% và 0,82% [187].Tần số sai hình NST đa tâm được phát hiện ở công nhân trung tâm hạt nhân Elbmarsch,

Cộng hòa liên bang Đức là 0,18% (đối chứng là 0,046%) [49] Khảo sát của Tanaka,

Kamada, Ohkita, Kuramoto trên các dân cu Hiroshima gần 40 năm sau vụ nổ bom

nguyên tử cho thấy tần số sai hình NST vẫn cao khác thường (19,6%-22,1% đối với sai

hình ổn định, 1.5% đối với sai hình bất ổn định) [191].

1.5.3 SỬ DỤNG KỸ THUẬT PHAN TICH SAI HÌNH NHIEM SẮC THỂ Ở TẾ BAO

LYMPHO TRONG ĐỊNH LIỀU PHÓNG XẠ

Kết quả phân tích sai hình NST không chỉ đóng vai trò chi thi, trên cơ sở các nghiên

cứu của Bender, 1962, 1963, 1966, Evans, 1972, Dolphin, 1973, Lloyd, 1973, Purott,

1973, Hội nghị Do liều Sinh học được Co quan Năng lượng Nguyên tử (IAEA) tổ chức

tại Amsterdam, Hà lan năm 1982, thống nhất đưa kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế

bào lympho vào thường qui định liều phóng xa [131, 186] Hội nghị Madrid, Tây Ban

Nha, 1990 đã dé ra một số nguyên tắc cơ bản: Thứ nhất, phải sử dụng các phương trình

chuẩn liều-hiệu ứng thích hợp với nguồn bức xa gay nên sự cố; Thứ hai, phải kiểm tra

phân bố sai hình 2 tâm giữa các tế bào lympho để xác định nạn nhân bị chiếu toàn thânhay bị chiếu bộ phận để đưa ra giải pháp định liêu thích hợp Phân bố này tuân theo qui

luật Poisson tức nạn nhân bị chiếu toàn thân, không theo qui luật Poisson tức nạn nhân

bị chiếu bộ phận Công thức định liều cho trường hợp bị chiếu toàn thân là D = {-a +

[œ? + 4B (y-C)(1 + ©)|'"}/2B, công thức định liều cho trường hợp bị chiếu bộ phận làQdr = (aD + BD?) /[1- exp (aD + BD’) Trong đó œ và B là hệ số hồi qui của phương

trình chuẩn; Qdr = X/Nu; X: số sai hình 2 tâm được xác định; Nu: số tế bào tối thiểu có

1 sai hình Công thức tính liều tương đương: H = D Wr (D: liều hấp thụ; Wr: trọng số

bức xạ) Đơn vị là Sv Trong trường hợp giá trị X/Nu không lớn hơn 1, tức không có tế

bào nào chứa 2 sai hình 2 tâm trở lên thì không thể kiểm tra qui luật Poisson, liều được

tính như liều tích luỹ.

Sử dụng kỹ thuật phân tích sai hình NST ở tế bào lympho đã xác định được mối

tương quan giữa liều nhiễm xạ và tần số sai hình NST ở các vùng dân cư Hiroshima,

Nagasaki (Nhật bản), Đông U ran (Nga), Elbmarch (Đức), Chernobyl (Ukraine), sự cố

ở Ấn độ, ở Tanzania [10, 16, 23, 33, 49, 92, 95, 119, 141, 146, 186, 187, 192] Phuong

pháp Qdr đã được Ishihara sử dung trong việc xác định liều ở các vùng dân cư bi anh

hưởng của bom nguyên tử [95] Với đường chuẩn xây dựng trên nguồn gamma Cs'??,

và phương pháp Qdr, việc phân tích sai hình NST cho định liều đã được tiến hành sau

sự cố nguồn Cs!*’ tại Goiânia, Brazil, 1987, liều cá nhân xác định được phụ thuộc vào

mức độ tiếp xúc của nạn nhân với nguồn, có giá trị phân bố từ 0,1Gy đến 5,3Gy [92].

1.5.4 SỬ DỤNG SAI HÌNH NHIEM SẮC THE 6 TE BAO LYMPHO NGƯỜI LAM

CHỈ THỊ PHAT HIEN VUNG NHIEM CHẤT HÓA HOC

Sai hình NST ở tế bao lympho máu ngoại vi được tin cậy sử dung trong cảnh báo va

đánh giá nhiễm độc môi trường của nhiều tổ chức Quốc tế [11, 41] Hội thảo Quốc tế

về việc sử dụng hiệu ứng sinh học trong đánh giá hoá chất độc di truyền tại

Luxembourg tháng 7 nam 1987 coi sai hình NST là một hiệu ứng sớm trong chi thị

nhiễm độc hóa học [8] Beek, Carrano, Evans, More, Obe, Natarajan cho rằng việc sử

dụng sai hình NST tế bào lympho máu ngoại vi là một nguyên tac để phát hiện các chat

đột biến hóa học làm nhiễm bẩn môi trường [63, 67, 131, 180, 183] Petres,

Schmid-Ullrich, Sigel, Wolf phát hiện thấy tần số sai hình NST cao hơn mức ngẫu nhiên rất

nhiều ở người sử dụng các loại thuốc trừ sâu chứa Asen, Asen có khả năng ức chế phụchồi các tổn thương phân tử ADN gay bởi các tác nhân đột biến khác [180] Kha năng

làm tang tần số sai hình NST ở tế bào lympho bởi các hợp chất chứa thủy ngân cũng đã

được khẳng định [108, 180] Phát hiện hiện trạng sai hình NST khác thường ở những

công nhân luyện Cadmium đã được Deknudt va Leonard, 1975 công bố [50].

1.6 MỘT SỐ NGUY CƠ NHIÊM ĐỘC MÔI TRƯỜNG TẠI VIỆT NAM

Hội nghị Độc chất Môi trường Quốc tế tại Hà nội tháng 11 nam 1998 khuyến cáo 2

nguy cơ độc môi trường tại Việt nam là chất độc chiến tranh và độc hoá nông dược.

Cuộc chiến tranh hoá học do Mỹ tiến hành với mật danh Operation Ranch Hand từ

nam 1961-1971 đã rải xuống tất cả các địa phương nam vĩ tuyến mười bảy 544,398

triệu lít chất da cam, 19,835 triệu lít chất trắng, 8,182 triệu lít chất xanh da trời, 9 triệu

kg chất CS và 3 triệu kg chất Melathion Lượng chất Dioxin có trong chất da cam

khoảng 170 kg [199] Tình trạng nhiễm độc môi trường do chất độc chiến tranh và hậuquả của chúng lên hệ sinh thái nói chung con người nói riêng tại Việt nam đã được tổng

kết ở 2 hội thảo Quốc tế (1/1983 và 11/1993) Cuộc tổng điều tra nạn nhân chất độc

chiến tranh trong phạm vi toàn quốc (bắt đầu từ tháng 4 năm 1998) đã phát hiện hàng

vạn nạn nhân mắc các bệnh hiểm nghèo, hang van con cái họ bị di dang dị tat [199].

Hàng năm chúng ta nhập về hơn 400 tấn (khoảng 4 triệu lít) hoá chất các loại để sử

dụng cho sản xuất nông nghiệp Tình hình ngộ độc hoá nông dược hầu như có ở khắp

các địa phương trong nước Một số loại hoá chất cực độc như các hợp chất clor hữu cơđã bị cấm sử dụng ở các nước khác vẫn tồn tại ở Việt nam Các loại thuốc trừ sâu lân

hữu cơ được Thế giới cũng như các nhà khoa học Việt nam xác nhận gây hậu quả di

truyền [22, 78, 79] vẫn còn chiếm ty trọng rất cao trong danh mục cấp phép và thực tế

sản xuất.

Hiện chúng ta có một lò phản ứng hạt nhân hàng năm sản xuất khoảng 150 Ci chất

đồng vị phóng xạ, 2 nhà máy khử trùng và bảo quản thực phẩm, | máy phát neutron

năng lượng 14 MeV, 1 máy gia tốc điện tử năng lượng 15 MeV, một số nguồn Co® vàX rays dùng trong điều trị ung thư, một số thiết bi sử dụng nguồn phát xa suất liều thấp

dùng cho chẩn đoán bệnh và phát hiện khuyết tật trong công nghiệp Đặc biệt hơn 1000

máy chiếu chụp X quang được trang bị đến các bệnh viện tuyến huyện Ngoài số lượng

150 Ci chất đồng vị phóng xa được sản xuất tại lò phản ứng hạt nhân Da lạt, sự điều trị

hiệu quả và phát triển nhanh chóng các khoa y học hạt nhân (2 trước 1984, nay hơn 20)

đã phải tiêu thụ một lượng lớn dược chất đồng vị ghiữnglzÄ8 các nước khác Các chất

đồng vị phóng xạ hiện cũng được sử dụng hiệu quả trong công nghiệp, nông nghiệp,khai thác mỏ [các báo cáo chuyên ngành về an toàn phóng xa, an toàn hạt nhân tại Việt

nam tham gia các hội nghị trong và ngoài nước từ năm 1985-2003].

Chúng ta đã phải chịu hậu quả nặng nề củachất độc chiến tranh, chúng ta cũng đã rất

cố gắng để kỳ vọng vào một sự an toàn hoá nông dược, an toàn phóng xạ cho cộng

đồng Dư lượng các yếu tố độc và hiệu ứng sinh học sinh ra bởi chúng là hai tham số

được sử dụng để đánh giá mức độ nhiễm độc môi trường Bằng các phương pháp vật lý,

hóa học, khoa học hiện đại cho phép xác định các dư lượng chất độc trong môi trường

cũng như trong cơ thể sinh vật với độ chính xác cao, song bản thân các số liệu đó tự nó

không phản ánh đầy đủ ảnh hưởng của chất độc lên hệ sinh thái nói chung con người

nói riêng Các hiệu ứng sinh học di nhiên là thước đo xác định giới hạn độc hại của các

yếu tố độc trong môi trường sống Sai hình NST ở tế bào lympho người với những đặcđiểm ưu việt được Quốc tế chấp nhận, là loại chỉ thị phản ánh một cách khách quan và

chính xác ảnh hưởng của các loại độc chất môi trường được đề cập Đối với phóng xạ,các nghiên cứu chỉ thị sai hình NST còn nhằm xác định tính an toàn và trả lại sự công

bằng trước công luận về hoạch định phát triển một loại năng lượng có nhiều tai tiếng

nhưng ích lợi cho xã hội.

CHUONG II

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 TẾ BÀO LYMPHO MÁU NGOẠI VI NGƯỜI.

Luận án đã sử dụng tế bao lympho máu ngoại vi người làm đối tượng nghiên cứu.

Các mẫu máu sử dụng cho nghiên cứu được lấy từ 2 nhóm đối tượng: quần thể người

bình thường và quần thể người nghi vấn có liên quan đến phóng xạ hoặc hoá chất trừsâu 15§ người khoẻ mạnh đại diện cho quần thể người bình thường ở Lâm đồng (người

chưa có tiền sử xạ trị, không liên quan đến các vùng nhiễm độc môi trường) đã cung

cấp máu để nghiên cứu đặc điểm karyotyp, sai hình NST tự nhiên và nguồn máu cho

nghiên cứu sai hình NST gây tạo trong in vitro 214 người thuộc quần thể nghi vấn

(những người có tiếp xúc với phóng xa hoặc sống ở các vùng có sử dụng nhiều hoá chất

trừ sâu nhóm lân hữu cơ) được lấy máu để phân tích đặc điểm sai hình NST in vivo.

- Trong 158 mẫu máu lấy từ quần thể người bình thường đã sử dụng 11 mẫu cho phân

tích karyotype, 76 mẫu cho nghiên cứu sai hình NST tự nhiên, 59 mẫu cho nghiên cứu

đặc điểm sai hình NST in vitro dưới tác động của bức xạ ion hoá và 12 mẫu cho nghiên

cứu đặc điểm sai hình NST in vitro dưới tác động của hoá chất trừ sâu nhóm lân hữu cơ.

- Trong 214 mẫu máu lấy từ các quần thể nghi vấn có 133 mẫu lấy từ công nhân viên

làm các công việc khác nhau thuộc 2 nhóm hưởng chế độ độc hại bức xạ khác nhau tại

Viện Nghiên cứu Hạt nhân để xác định mức độ sai hình NST liên quan đến mức độ tiếp

xúc và chế độ độc hại phóng xa và 81 mâu máu lấy từ các nông dân cùng canh tác chè,

cà phê, dâu tằm, có độ tuổi, thời gian định cư khác nhau thuộc 5 vùng địa lý khác nhau

về nguồn nước tại huyện Lâm hà tỉnh Lâm đồng để xác định mức độ sai hình NST liên

quan đến việc sử dụng hoá nông dược.

2.1.2 CAC NGUỒN BỨC XA SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CUU.1 Nguồn phát bức xa gamma Co® suất liều 0,0125 Gy/s (1*).

Nguồn phat gamma đơn nang do đồng vi Co” phát ra, suất liều 0,0125 Gy/s, bản

chất sóng điện từ, thuộc LET thấp Tại Viện NCHN.

2 Nguồn phat neutron nhiệt tại cột nhiệt Lò PUHN Da lạt (2*)

Nguồn phát neutron nhiệt với thông lượng neutron nhiệt (,,) = 1,40.10?n/cm”⁄%,

thông lượng neutron cộng hưởng (0.„) = 1,43.10°n/cm?/s, và bức xa gamma suất liều

0.0083 Gy/s Thanh phần liều gồm 33,40% neutron nhiệt, 1,71% neutron cộng hưởng,64,89% liều gamma.

3 Nguồn phát neutron nhiệt tại kênh ngang số 3 Lò PƯHN Đà lạt (3*)

Nguồn phát neutron nhiệt với ,,=52,19x10°n/cm’/s, ÿ,„=1,43x 10°n/cm”/s, và bức xạ

gamma suất liều 0,00002 Gy/s Thanh phần liều 87,50% neutron nhiệt, 2,40% neutron

cộng hưởng, 10,1% gamma.

4 Nguồn phát bức xa toàn phan của kênh ngang số 4 Lò PUHN Da lạt (4*).

Nguồn phát neutron toàn phần với neutron nhiệt, neutron cộng hưởng, neutron nhanhvà gamma Thành phần liều gồm neutron nhiệt 9,21%, neutron cộng hưởng 15,08%,neutron nhanh chiếm 65,38% và gamma .

5 Nguồn phat bức xa gamma suất liều thấp tai cột nhiệt khi lò không chạy (5*).

Nguồn phát gamma suất liều thấp (0.000036 Gy/s) Thành phan bức xa trong thời

điểm chiếu mau chủ yếu là gamma chiếm 99,26% va gần 1% bức xa khác.

2.1.3 CÁC HOA CHẤT SỬDỤNG TRONG NGHIÊN CUU.

1 Thuốc trừ sâu Bai58, Dimenat: Chúng đều được pha chế từ hoạt chất Dimethoat.

Tên hóa học dimethyl-methyl carbamoyl methylphosphorodithioate, công thức hóa họcC;H;;NO;PS;, công thức cấu tao:

2 Thuoc trừ sâu Supracid: Pha chế từ Methidathion, tên hóa học

s-2,3-dihydro-5-methoxI-2-oxo- L,3,4-thiadiazol-3-yÌmethyl-o.o-dimethylphposphodithioate, công thứchóa học C,H, ,N,O,PS;, công thức cấu tạo:

3 Thuốc diệt có Touchdown: Pha chế từ hoạt chất Sulfosate, công thức hóa học là

C¿H;„NO;PS, công thức cấu tạo:

Các thiết bi nuôi cấy tế bao động vat va làm tiêu bản cố định nhiễm sac thể Kính

hiển vi quang học (JENA) chụp ảnh tự động độ phóng dai tối đa 2600 lan Kính hiển vi

kỹ thuật số Ấn độ Máy quét ảnh Máy tính.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.2.1 KY THUẬT NUÔI CẤY TE BAO LYMPHO VA LAM TIÊU BẢN HIẾN VI.

Luận án sử dụng qui trình nuôi cấy té bào lympho của Cơ Quan Nang Lượng

Nguyên Tử Quốc Te (IAEA) Đại học Leiden Hà lan, Phòng thí nghiệm RERF.

Hiroshima, Nhat ban [131] [197].1 Hoa chat.

- Môi trường nudi cây tế bao bột F10 (Difco)

- Lithium Heparin | 000 000E/mI (Gifco)

- Phytohemaglutin (PHA) (Gifco)- L-Glutamin (Gifco)

- Kháng sinh gồm benzylpenicillin 10 000 IU/ml va streptomicin sulphate 10 mg/ml.

- Huyết thanh thai bò (Difco)

- Colcemid hoặc colchicin (Gifco)

2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào

- Chuẩn bị môi trường gốc: 9,9 gr bột F10 / 1000 ml nước cất 2 lần, chỉnh PH bang

NaHCO3 đến PH 7,3 lọc vô trùng qua giấy lọc 0.22, bảo quản 4°C.

- Chuẩn bị môi trường toàn phần: 100 ml dung dịch F10 + 20 ml huyết thanh + 5 mlPHA (1 lo) + 1,25 ml L-Glutamin + 1,25 ml heparin + | ml kháng sinh.

3 Qui trình nuôi cấy tế bao, làm tiêu ban hiển vi: Tiến hành theo các bước:

Tủ ấm 37°C/46 giờ +

2 giờ colchicine

Máu toàn phan chống Lọ chứa môi

| đông trong hep arin trường toàn phần5 g hep 5 p

Nhuộm tiêu bản: | Nhỏ từng giọt tế ' Cố định và làm | Ly tâm

| - Thường | bào cố định lên | sạch bang cách

| a |®—— ¬ „ TẾ :

| - Hoechst 33258 | phiến kính lạnh roi : ly tâm trong Nhược

J - { 2 2 | * + ,

| Kiém tra va cố | đặt lên On nhiệt âm | dung dịch trương KCl

| định tiêu bản | 65°C/100giây | carnoa 4 lần

Ee eee aes

2.2.2 PHƯƠNG PHAP PHAN TÍCH ĐẶC DIEM KARYOTYPE NGƯỜI:

Tiến hành theo các bước:

- KTTD = kích thước trung bình từng cặp/một nửa tổng kích thước bộ NST với X.

- Sai số chuẩn (SE) được tính cho số liệu phân tích trong mỗi mẫu và giữa các mẫu vớinhau, công thức SE = + [3,"(X-X,) : (1- n)]'”, trong đó X là giá trị trung bình cong; X;

là giá trị trung bình của khoảng chia thứ ¡, n là số lượng mẫu.b Phân tích chỉ số tâm động (CSTĐ)

- CSTD = kích thước vai ngan/ kích thước NST.

- Sai số chuẩn được tính cho số liệu phân tích trong mẫu và giữa các mau với nhau,công thức SE =k DRE Cra : tI- n)}'”,

2.2.3 PHƯƠNG PHAP PHAN TÍCH SAI HÌNH NHIEM SAC THỂ.

Nhận biết các kiểu sai hình nhiễm sac thể:

2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu sai hình NST in vitro ở tế bao lympho dưới tacđộng của bức xạ ion hoá.

1 Sơ đồ chung và các bước nghiên cuu:

| Máu ¡ Chiếu liều khác nhau Nuôi cấy

toàn | 4§ giờ, cố——————— >> °

phần Các nguồn bức xạ I*-5* | định, làm

Phân tích sai hình NST, |||

2 Xác định phân bố các tổn thương đứt gãy đôi giữa các NST: Các bước:

Chọn tế bào có Phân tích karyotype Thống kê

sai hình ở mẫu để xác định NST có _„|số DSB

chiếu nguồn| | tổn thương DSB gây trên các

nên sai hình cap NST

Phép kiểm định giả thiết phan bố đều theo tiêu chuẩn Chi bình phương (x7) +Ÿ

Kiểm định giả thiết đều

2 2 M ˆ

Ly | theo chuân x“ cua phân

các đơn vi dài của NST

Dixy, = X* [(mi - npi)?/npij, trong đó i: số cặp NST trong karyotype: mi: số sai hình

NST phân tích được ở cặp NST i; n: số sai hình NST tổng số phân tích được; pi: kích

thước tương đối của cặp NST i.

3 Xác định phan bố sai hình nhiễm sac thể giữa các tế bào: Các bước:

Phân tích sai hình NST, thống

Mẫu chiếu

bức xạ kê sai hình 2 tâm, thống kê số Ly

K” lượng tế bào có số lượng 2 tâm

khác nhau (0, 1, 2, 3 )

và 3*

Kiểm định giả thiết Poisson

theo chuẩn x? phân bố số

lượng đa tâm giữa các tế bào

bị chiếu

Phép kiểm định gia thiết Poisson được kiểm định trên cơ sở tiêu chuẩn x”, x? = >*xŸ

= 3;* [(mi - npi)’/np,], trong đó i: số tự nhiên chỉ mức sai hình NST trong một tế bao (i

=0.1.2 3 ):m: số tế bào có mức ¡ sai hình; n: số tế bào phân tích: pi: trị số Poisson

lý thuyết, p, = N’x/N = e* AX/x!; A: tân số sai hình trung bình trong | tế bao A = #m/n.

4 Xác định số lượng mảng dư trong tế bào có sai hình: Các bước:

Mẫu chiếu | | Chọn tế Phân tích karyotype để | | Thống kê số lượng |

(mảnh dư là mảnh tạo thành do liên kết không hoàn toàn ví dụ tế bào có | sai hình hai

tâm nếu liên kết hoàn toàn giữa các mánh thì sẽ có 1 mảnh, nếu liên kết không hoàn

toàn thì sẽ có 2 mảnh, như vậy 1 mảnh bị dư)

5 Xác định quan hệ liều-hiệu ứng và đường cong chuẩn thực nghiệm: Các bước:

Xác định hệ số Xác định hệ số hồi

tương quan,

Phân tích, thống kê tần Lập bảng

số sai hình 2 tâm ở các qui, lập phương

liều khác nhau của phương trình trình chuẩn

Công thức tính hệ số tương quan tuyến tính r(y,d) = [Ö"D,Y,n.D Y)] /[@ ",D¿

-D”)!2 (DY; - Y?)'] Phương trình tổng quát y = kD + C, trong đó D là liều hấp thụ

từng nguồn bức xa (5) tổng quát

trung bình Y là tân số sai hình 2 tâm trung bình, y, là tần số sai hình 2 tâm phân tích

được ở mau chiếu liều D,.

Công thức tính hệ số tương quan bình phương với r = [Ề"Z,Y,n.Z Y)]/[Q"⁄'

-Z”)'^ @Œ"Y; - Y?)!2] Phương trình tổng quát y = kD + C, trong đó Z là bình phương

liều hấp thụ trung bình Z=D”; Y là tần số sai hình 2 tâm trung bình.

- Hệ số phụ thuộc tuyến tính a = {3 ,"[(y; - C)/D, ] - B`,"D, }/n.

Hệ số phụ thuộc bình phương B = {3 ,"(y;, C) [>,"D, >,"[(y, C/D.]]/n) /[5,D;

-(X,"D,; 3 ,"D,/n] (Yi(%) là tan số sai hình NST phát hiện được ở liều hấp thụ D,(Gy):

ava B là hệ số hồi qui thực nghiệm; C là tan số sai hình NST ngau nhiên: n là số điểm

chiếu mẫu Don vi của hê số œ là 10.Gv'!: đơn vi của hê số B là 10.Gy”)Ị : ` Ị : y

6 Xac dinh hiéu qua sinh hoc tuong doi

- Xác định hiệu qua sinh hoc tương đối (RBE): Theo các bước:

Xác định tần số (f,) sai hình

Xác định tần số (f,) sai hình Tính RBEI

2 tâm ở các liều hấp thụ

:2_ tâm ở các liều hấp thụ

tương ứng của nguồn bức xạ

| khác nhau của nguồn bức xạ hấp thụ tương

| 1* (nguồn chuẩn) ứng

- Xác định hiệu quả sinh học tương đối cực đại (RBEo)

Công thức RBEo = a/a, (a): hệ số a của đường chuẩn liều-hiệu ứng với nguồn bức

xạ khảo sát; a: hệ số a của đường chuẩn liều-hiệu ứng với nguồn bức xa gamma suât

liều 0,125 Gy/s).

2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu sai hình nhiễm sắc thể in vitro ở tế bao lympho

dưới tác động của hóa chất: Tiến hành theo mô hình nghiên cứu chung:

- Máu

¡ toàn

Nuôi cấy 48 giờ, Xác định kiểu và tần số

Xử lý nồng độ khác nhau,

phương thức khác nhau 72 giờ, cố định, sai hình, luận giải cơ chế

phần làm tiêu bảnBai58, Dimenat, Supracid

- Nồng độ xử lý: Bai5§ từ 2.107-8.10% (80mg-320mg/lít), Dimenat 2.107-5.10”(§0mg-320mg/lít), Supracid 2.10~5.10 (80mg-200mg/lit), Touchdown 2.10-20 10

- Phương thức xử lý: * Xử lý trước khi cho PHA, rửa sạch, sau đó cho tế bào phân chia.

* Xử lý liên tục trong môi trường có tế bào đang phân chia Không rửa.

2.2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SAI HÌNH NST IN VIVO.

2.2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm sai hình nhiễm sắc thể tự nhiên.

‘a =)

- Mau mau từ người khoe mạnh chưa tiếp xúc phóng xạ Nuoi cấy 48 giờ.

- Số tế bào phân tích tối thiểu/mẫu máu là 1114 (số lượng tế bào tối thiểu để có the bat

gap | sai hình 2 tâm ngẫu nhién theo Tonomura)

- Thống kê kiểu, tần số xác định tần số trung bình và do lệch chuẩn.

2.2.4.2 Nghiên cứu sai hình NST ở các đối tượng nghỉ vấn liên quan đến hoa chất

Nuôi cấy (Phân tích |

Chong kê cộng đồng, các yếu

a) › ä z |

tố anh hưởng, phân tích cơ |

chế di truyền các kiểu saihình để định hướng xác định

tan số sai hình trình chuan

2tam vuot gia