nghiên cứu khảo sát ly trích các hợp chất tự nhiên có trong hạt cà phê robusta coffea canephora có hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học

Các thành phần trong hạt cà phê chủ yếu được biết là caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh và một số hợp chất tự nhiên đem lại lợi ích trong y học đã được nhiều nhà khoa học quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

- -

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

CHẤT TỰ NHIÊN CÓ TRONG HẠT CÀ PHÊ

ROBUSTA (COFFEA CANEPHORA) CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y – DƯỢC

GVHD: ThS Nguyễn Minh Hoàng Sinh viên: Trịnh Thị Hoài Phương

Khóa: 2015 - 2019

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời nói đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã để nhiều tâm huyết truyền đạt cho em những bài học quý báu trong năm tháng trên giảng đường đại học Những kiến thức được truyền lại từ Thầy Cô là nền tảng cho em trong quá trình

thực hiện đề tài này Em xin chân thành gửi đến Thầy Nguyễn Minh Hoàng lời cảm ơn sâu sắc, Thầy

đã tận tâm truyền đạt những bài học kinh nghiệm quý báu hướng dẫn và dạy bảo em và luôn tạo mọi điều kiện tốt cho em hoàn thiện đề tài thực tập Một lần nữa, em xin cảm ơn thầy và chúc thầy luôn vui vẻ, khỏe mạnh bên gia đình, người thân và bạn bè Và em cũng gửi lời cảm ơn thân thương đến các bạn, các em trong phòng thí nghiệm Hóa môi trường Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Lời cuối cùng, em xin dành gửi đến Ba – Người đã cho em hình hài này Con xin cảm ơn Ba vì tất cả, hơn 20 năm không chỉ là người cha mà Người còn cho con tình cảm thay phần tình mẹ con thiếu, không văn từ nào có thể nói hết công ơn Người Con xin cảm ơn Ba vì sự đã tần tảo chăm lo luôn ủng hộ con và cho con những điều tốt đẹp nhất Con xin cảm ơn Ba

Em xin chân thành cảm ơn!

Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019 Sinh Viên

Trịnh Thị Hoài Phương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ……….……… a MỤC LỤC ……….…….………… ……… b DANH MỤC HÌNH ……… d DANH MỤC BẢNG ……… ……… f DANH MỤC VIẾT TẮT ……… ……… …… g

3 TỔNG QUAN VỀ CHLOROGENIC ACID ……….9

4 TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA CHLOROGENIC ACID ………10

5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………12

5.1 Phương pháp thu mẫu ………12

5.2 Nguyên tắc tách chiết ……… 13

5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu ………13

5.4 Phương pháp chiết đun khuấy từ hồi lưu ……….15

1.1 Đối tượng nghiên cứu ………19

1.2 Địa điểm nghiên cứu ………19

1.3 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm ………19

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 20

2.1 Quy trình thực hiện chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta ……… 21

2.3 Định tính và xác định cấu trúc sản phẩm thu được ………28

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……….30

1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ TỐI ƯU ……… 30

2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU/DUNG MÔI CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ ………32

3 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT CAFFEINE THU ĐƯỢC ……… 34

4 KẾT QUẢ CHẠY PHỔ CỘNG TỪ HẠT NHÂN NMR CAFFEINE THU ĐƯỢC ……… 36

5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHLOROGENIC ACID TRONG HẠT CÀ PHÊ ROBUSTA ……… 37

5.1 Kết quả hàm lượng béo có trong hạt cà phê ……….37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Quả và hạt cà phê……… 3

Hình 1.1: Cà phê robusta (Coffea canephora) ……….5

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của caffeine……….7

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Chlorogenic acid ……… 9

Hình 1.4 : Công thức cấu tạo cholesterol……… 11

Hình 1.5: Hệ thống chiết Soxhlet……… 16

Hình 1.6: Bình sắc ký lớp mỏng ……….… 17

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta……… 22

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu ……… 23

Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết tối ưu……… 24

Hình 2.4: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu, chiết lỏng lỏng……… 25

Hình 2.5: Sơ đồ thực hiện quy trình chiết xuất chlorogenic acid……… 27

Hình 2.6: Bộ chiết Soxhlet bột cà phê và chiết lỏng lỏng……… 27

Hình 2.7: Máy thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy ………29

Hình 3.1: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất trích ly caffeine theo tỉ lệ thời gian……31

Hình 3.2: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất trích ly caffeine theo tỉ lệ nguyên liệu

/dung môi khác nhau……… 33

Hình 3.3: Kết quả sắc ký bản mỏng theo từng hệ dung môi ……….…….34

Hình 3.4: Hình ảnh đo điểm nóng chảy……… 35

Hình 3.5: Công thức của caffeine dự đoán từ các mũi phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR ……….….…… 37

Hình 3.6: Kết quả chấm sắc ký của dịch chiết methanol……….…… 38 Hình 3.7: Kết quả sắc ký sau khi thực hiện chiết lỏng – lỏng…… … …….39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm thực vật về cây cà phê ………4 Bảng 3.1: Kết quả khối lượng và hiệu suất trích ly caffeine thu được sau các khoảng thời gian chiết khác nhau ……… … 30 Bảng 3.2: Kết quả hiệu suất các mức thời gian qua xử lý thống kê ……… 31 Bảng 3.3: Kết quả khối lượng và hiệu suất trích ly caffeine thu được sau các tỉ

lệ nguyên liệu dung môi chiết khác nhau ……….… 32 Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất các mức tỉ lệ nguyên liệu / dung môi) qua xử lý

thống kê ……… 33 Bảng 3.5: Kết quả giá trị Rf sắc ký bản mỏng ……….……….35

Bảng 3.6: Bảng so sánh một số giá trị mũi H trong phổ 1H-NMR (phụ lục 1) với kết quả chạy phổ của Sitkowski năm 1994……… 36 Bảng 3.5: Kết quả phổ 13C-NMR của caffeine (dung môi chloroform) ( phụ lục

2) với kết quả chạy phổ của Sitkowski năm 1994…….…………36

DANH MỤC VIẾT TẮT

LDL Low Density Lipoprotein

GC- MS Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ HDL High Density Lipoprotein

HIV Human immunodeficiency virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography MHA Thạch Mueller Hinton Agar

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SLE Solid-Liquid Extraction SPE Solid-Phase Extraction

MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự đi lên và tiến bộ của xã hội ngày nay thì chế độ ăn uống và sức khỏe được quan tâm nhiều hơn, chứng tỏ sức mạnh của dinh dưỡng trong việc duy trì và cải thiện sức khỏe Trên cơ sở đó sự quan tâm đến việc tìm kiếm các sản phẩm mới có thể cải thiện sức khỏe được nhiều nhà khoa học chú ý Do đó, sức hút ngày càng tăng đối với các sản phẩm tự nhiên được tách chiết từ thực vật để giúp cải thiện nâng cao sức khỏe con người Thật thú vị, một số thành phần tự nhiên có trong thực phẩm lại có hoạt tính sinh học đã được chứng minh là làm giảm kích hoạt tiểu cầu, ức chế sự hình thành huyết khối Về điều này, chlorogenic acid là một trong những hợp chất polyphenol có nhiều nhất trong nhiều loại thực phẩm được tiêu thụ hàng ngày, như anh đào, táo, kiwi, atisô, cà tím, mận và cà phê Chlorogenic acid thể hiện nhiều đặc tính sinh học, bao gồm các hoạt động kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống viêm, đặc biệt là tác dụng hạ đường huyết

Xu hướng cô lập và tìm về các hợp chất tự nhiên có khả năng cải thiện sức khỏe ngày càng trở nên dành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Các sản phẩm từ hạt cà phê từ lâu được biết đến là thức uống Các thành phần trong hạt cà phê chủ yếu được biết là caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh và một số hợp chất tự nhiên đem lại lợi ích trong y học đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hạt cà phê đã thu hút các nhà nghiên cứu đào sâu và tìm hiểu về các hợp chất tự nhiên có trong hạt cà phê Trong một số nghiên cứu mới nhất gần đây đã cho biết các hợp chất điển hình trong hạt cà phê như caffeine và các flavonoid, gallic acid, catechin, caffeic acid, vanillin, chlorogenic acid,… là những hợp chất có thể ứng dụng trong y học (Nguyễn Phương Quyên và cs., 2015) Các diterpenes có chức năng kháng nấm, tác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thư tuyến tụy của con người (Fronza và cs., 2012) Chlorogenic acid có khả năng kháng virus viêm gan B (HBV), chống HIV, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm ở nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) là 20–80  μg/ml (Nuhu, 2014; Wang và cs, 2009), và đặc biệt

chlorogenic acid giúp giảm lượng cholesterol, hạn chế lượng mỡ trong máu, ức chế hình thành huyết khối hỗ trợ cải thiện sức khỏe

Trong nghiên cứu “Xác định hàm lượng caffeine và thành phần hương cà phê từ một số sản phẩm cà phê rang xay và hòa tan trên thị trường Việt Nam” của tác giả Nguyễn Phương Quyên và cộng sự năm 2015, nghiên cứu đã khảo sát chứng minh thành phần trong bột cà phê đã rang xay gồm có caffeine và các flavonoid, gallic acid, catechin, caffeic acid, vanillin, chlorogenic acid,… Việc xác định hàm lượng các hợp chất hữu cơ được thực hiện bằng phương pháp chính là phương pháp Soxhlet (Nguyễn Phương Quyên và cs., 2015)

Trên cơ sở đó, đề xuất đề tài “Nghiên cứu ly trích các hợp chất tự nhiên có

trong hạt cà phê robusta (Coffea canephora) có hoạt tính sinh học ứng dụng

trong y học.”

⮚ Mục tiêu của đề tài:

- Khảo sát quy trình chiết tách và tinh chế caffeine từ hạt cà phê robusta

(Coffea canephora)

Khảo sát chiết tối ưu, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết thô tối ưu, và lượng dung môi chiết lỏng lỏng

Tinh chế và xác định cấu trúc của caffeine

- Nghiên cứu quy trình ly trích chlorogenic acid từ hạt cà phê robusta (Coffea

canephora)

Từ ứng dụng của thành phần chlorogenic acid có trong hạt cà phê làm tiền đề

phát triển thành sản phẩm có hoạt tính sinh học

⮚ Đối tượng nghiên cứu:

Hạt cà phê robusta tên khoa học là Coffea canephora, thuộc chi Coffea, họ

Rubiaceae Hạt cà phê được thu hái ở xã Hòa Xuân TP.BMT tỉnh Đăk Lăk ▪ Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát các hợp chất tự nhiên có trong hạt cà phê

robusta được thu hái ở xã Hòa Xuân TP.BMT tỉnh Đăk Lăk

Hình 1: Quả (bên trái) và hạt (bên phải) cà phê robusta (Coffea canephora)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ROBUSTA

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cà phê thuộc họ Rubiaceae, chi Coffea, hiện nay cà phê được trồng phân bố rải

rác khắp các vùng nhiệt đới, đại diện có 3 loài chính sau:

• Cà phê chè (Coffea arabica): có nguồn gốc từ cao nguyên phía tây nam

Ethiopia, cây được du nhập sang vùng Nam Á là Ấn Độ Sau đó, cà phê chè được trồng ở đảo Java năm 1710 ở vùng Caribê và Nam Mỹ Hiện nay cà phê chè dược trồng nhiều ở vùng châu Mỹ la tinh, Trung Phi, Ấn Độ, Indonexia, Philippin, Thái Lan và Việt Nam

• Cà phê vối (Coffea canephora): Có nguồn gốc ở vùng rừng xích đạo châu

Phi, từ Guinca đến Uganda Cà phê vối cũng sớm được thuần hóa và trồng nhiều ở châu Phi, Đến năm 1900 du nhập vào Java sau đó tiếp tục được đưa đến các nước khác Hiện nay, cà phê vối được trồng nhiều nhất ở Indonexia sau đó đến Việt Nam

• Cà phê mít (Coffea liberica): Có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Trung và Tây

Phi Năm 1792, được trồng đầu tiên ở Liberia, từ năm 1872 – 1875 du nhập dến Indonesia Hiện nay cà phê mít được trồng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam tuy nhiên với sản lượng không lớn (Đỗ Huy Bích, 2006)

Cây cà phê robusta có tên khoa học: Coffea canephora hay Coffea robusta,

thường được gọi là cà phê vối, thuộc họ thiên thảo Đặc điểm thực vật được thể hiện ở bảng 1.1 bên dưới

Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật về cây caffeine

Giới (Kingdom) Plantae (Thực vật) Ngành (Division) Magnoliophyta

Chi (Genus) Coffea Loài (Species) Coffea canephora

Cà phê là cây nhiệt đới, ưa sáng thích hợp với vùng khí hậu nóng ẩm Chiều cao cây 5 – 6 m, thân cành hình trụ phân nhánh nhiều, tán rộng Lá mọc đối đầu hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 10 – 15 cm, rộng 5 – 6 cm, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới rất nhạt, gân nổi rõ, mép uống lượn, cuốn lá dài 0,7 – 1 cm Cà phê thuộc loại cây công nghiệp, sinh trưởng sau 3 năm bắt đầu có hoa Hoa mọc thành chùm

tụ tập ở kẽ lá, màu trắng, hoa có 5 cánh đều, hoa cà phê robusta không bao giờ ra lại

vào mùa sau tại vị trí cũ Quả hạch, hình bầu dục hoặc tròn hơi dẹt đường kính 10 – 13 mm, bên trong chứa hai nhân nhưng đôi khi có một nhân nhân dẹt hơi cong màu

xám vàng, quả non màu xanh, quả chín màu vàng đến đỏ sẫm (Đỗ Huy Bích, 2006)

Hình 1.1: Cà phê Robusta (Coffea canephora)

1.2 Tác dụng dược lý

Theo tài liệu nước ngoài, quả cà phê tươi có tác dụng hạ sốt, lợi tiểu Hạt cà phê rang hiện đang là thức uống có tác dụng kích thích thần kinh Caffeine là chất chính trong hạt cà phê có tác dụng kích thích thần kinh trung ương, lợi tiểu và làm giản cơ trơn (Đỗ Huy Bích, 2006)

1.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học đối với hạt cà phê

Hạt cà phê chứa một số chất điển hình:

⬩ Glucid: có 5 – 8% đường khử và saccharose, ít mantol, polysaccharid,… Không có tinh bột

⬩ Lipid: chiếm 10- 15%

⬩ Acid hữu cơ: oxalic acid, citric acid, malic acid ⬩ Acid phenol: 5 – 10% chlorogenic acid

⬩ Caffeine: 1,5 – 2,5% (Đỗ Huy Bích, 2006) ❖ Các nghiên cứu trong nước

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Phương Quyên năm 2015 đã cho biết các hợp chất điển hình có trong hạt cà phê gồm caffeine và các flavonoid, gallic acid, catechin, caffeic acid, vanillin, chlorogenic acid,… là những hợp chất có thể ứng dụng trong y học Nhóm tác giả đã tiến hành trích ly và phân tích hàm lượng caffeine của 15 mẫu cà phê bằng phương pháp Soxhlet và sử dụng máy HPLC để định lượng caffein có trong hạt cà phê và định danh một số hợp chất hóa học trong thành phần của hương cà phê bằng phương pháp GC- MS (Nguyễn Phương Quyên và cs., 2015)

❖ Các nghiên cứu ngoài nước

Năm 2014 tác giả Nuhu AA đã nghiên cứu cô lập từ hạt cà phê bằng kỹ thuật chiết pha rắn Solid-Phase Extraction (SPE) cùng với sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC- MS) đã định danh xác đinh một số hợp chất tiêu biểu trong hạt cà phê có ứng ụng trong y học gồm caffeine, chlorogenic acid, diterpen và trigonelline

Năm 2012 Abdul Munahb A G Nasser đã cô lập thành công chlorogenic acid từ hạt cà phê bằng phương pháp sắt ý cột C18

2 TỔNG QUAN VỀ CAFFEINE

2.1 Phân loại

Caffeine danh pháp quốc tế: 1,3,7-Trimethylpurine-2,6-dione, có công thức hóa học là C8H10N4O2, thuộc nhóm các chất methylxanthine, ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng, tan được trong nước và các dung môi hữu cơ như methanol, chloroform,… là chất kích thích tự nhiên có nhiều trong lá chè, hạt cà phê, hạt coca và các loài thực vật khác (Najafi và cs., 2003) Caffeine là chất kích thích hệ thần kinh trung ương, làm cho tinh thần minh mẫn, tăng cường sự nhận biết của não bộ, kích thích hoạt động tim, thận, phổi (Spiller, 2000; Lynge, 1997) đã và đang có ứng dụng nhiều trong dược phẩm

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của caffeine

Tính chất hóa lý: Caffeine tinh khiết dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng, nhiệt độ nóng chảy 235o

C, trong nước ở nhiệt độ bình thường tan một ít, tan nhiều trong nước nóng hoặc tan nhiều trong chloroform

2.2 Hoạt tính sinh học

Đối với hệ thần kinh trung ương caffeine có tác dụng mạnh nhất trong các methylxanthine Tạo cho người dùng cảm giác ít mệt mỏi và tỉnh táo, đôi khi với

liều lượng lớn có thể khiến người dùng rơi vào trạng thái bồn chồn lo lắng, mất ngủ

Đối với tim mạch, caffeine có tác dụng kích thích tim làm nhịp tim nhanh hơn, huyết áp tăng nhẹ

Đối với co cơ trơn, caffeine có tác dụng làm giản cơ trơn, tác dụng này ứng dụng trong y học giúp điều trị cho các bệnh nhân co thắt

Đối với cơ vân, caffeine có tác dụng tăng cường khả năng làm việc của cơ bắp

ở người (Đỗ Huy Bích, 2006)

Cơ chế hoạt động của caffeine đối với cơ thể: Tác dụng tiềm tàng của caffeine ở cấp độ tế bào có thể được giải thích bằng ba cơ chế hoạt động: sự đối kháng của các thụ thể adenosine, đặc biệt là trong hệ thống thần kinh trung ương; việc huy động lưu trữ canxi nội bào; sự ức chế phosphodiesterase.

▪ Sự đối kháng của Adenosine: Caffeine ngăn chặn các thụ thể adenosine, chủ yếu là các phân nhóm A1 và A2A, góp phần kích thích giải phóng dopamine, noradrenalin và glutamate Caffeine có thể làm giảm lưu lượng máu não và lưu lượng máu cơ tim, bằng cách ức chế thụ thể adenosine A1, A2A và A2B trong các mạch máu và hạn chế sự giãn mạch qua trung gian adenosine, là thụ thể có thể được tìm thấy trong hầu hết các khu vực vùng não Nồng độ cao nhất là ở vỏ não

▪ Huy động Canxi nội bào: Caffeine làm giải phóng canxi từ mạng lưới sarcoplasmic và ức chế sự tái hấp thu Thông qua các cơ chế này, caffeine có thể làm tăng khả năng co bóp trong các cơn co thắt dưới mức tối đa ở những người sử dụng caffeine theo chỉ định hay ngẫu nhiên Canxi nội bào xác định sự kích hoạt của nitric oxide synthase nội mô (eNOS), với việc sản xuất một lượng nitrogen oxit cao hơn Do đó, một số tác động gây ra bởi caffeine sẽ được điều hòa bởi chức năng thần kinh cơ và tăng lực co bóp trong cơ xương Một tác dụng đối kháng tiềm năng của caffeine được thể hiện là kích thích lợi tiểu, chịu trách nhiệm về tác dụng ergolytic ở các vận động viên sức bền trong quá trình tập luyện và thi đấu kéo dài

▪ Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Caffeine làm tăng nhận thức về sự tỉnh táo và đôi khi gây ra lo lắng, đặc biệt là ở liều cao Hơn nữa, sự đối kháng của thụ thể A1 và A2 có thể gây co giật và co mạch máu não

Sản phẩm có chứa caffein

▪ Caffein được dùng trong thành phần các loại thuốc cảm cúm (cold and flu medication), antipyretics (hạ sốt) và analgesics (giảm đau) vì làm tăng khả năng hấp thụ trong ruột (intestinal absorption) và chống lại tình trạng buồn ngủ (counteract drowsiness)

Ví dụ: thuốc Extra-strength Excedrin có chứa 250 mg acetaminophen tức hoạt chất paracetamol, 250 mg aspirin, and 65 mg caffeine

▪ Caffeine phổ biến nhất trong chế độ ăn uống là cà phê, bên cạnh đó đồ uống ca cao, nước ngọt, nước tăng lực, thuốc, và các loại thực phẩm và chất bổ sung thể thao chuyên dụng cũng chứa caffeine Hiện tại có vô số nhãn hiệu có thể tìm thấy hàm lượng caffeine dao động từ mức khiêm tốn 50 mg đến mức đáng báo động 500 mg mỗi lon hoặc chai Trong những năm gần đây, để hạn chế hiện tượng này, các giới hạn đã được đặt ra cho những đồ uống chứa caffeine

3 TỔNG QUAN VỀ CHLOROGENIC ACID

Công thức phân tử: C16H18O9

Trọng lượng phân tử: 354,31 g/mol

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 2-propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic

3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic Nhiệt độ nóng chảy: 210oC

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Chlorogenic acid

Chlorogenic acid có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng tan được trong nước và các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol,…

Chlorogenic acid có khả năng kháng virus B trong mô hình vịt và có khả năng kháng virus cúm H1N1, hoạt động chống HIV và kháng khuẩn và kháng nấm Phương pháp thu nhận các hợp chất chlorogenic acid trong hạt cà phê chủ yếu được

sử dụng là chiết lỏng lỏng với dung môi chloroform và chiết pha rắn, tuy nhiên trong một số nghiên cứu sử dụng hỗn hợp dung môi của ethanol và nước với tỉ lệ

1:1 (Nuhu, 2014)

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây tử vong và là nguyên nhân quan trọng nhất trong các bệnh về tim mạch Rối loạn mỡ máu là một yếu tố nguy cơ cao dẫn tới chứng xơ vữa động mạch Hiện nay, phương pháp phổ biến để điều trị xơ vữa động mạch là giảm nồng độ lipid huyết tương bằng cách sử dụng statin Tuy nhiên, việc sử dụng statin chỉ ngăn ngừa khoảng 50% đến 60% các rủi ro về tim mạch Do đó để điều trị triệt để xơ vữa động mạch cần mở rộng ứng dụng các phương pháp khác nhau Chlorogenic acid cũng đã được công nhận là có các hoạt động chống xơ vữa động mạch, hạ đường huyết chống oxy hóa và chống viêm Mặc dù có khả năng chống xơ vữa động mạch tuy nhiên các nghiên cứu đề cập đến tác dụng của chlorogenic acid đối với chứng xơ vữa động mạch còn khan hiếm Các nghiên cứu sơ bộ gần đây cho thấy chlorogenic acid thực sự làm giảm cholesterol, và cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột hỗ trợ tiêu hóa (Wang Z và cs., 2019)

4 TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA CHLOROGENIC ACID

Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, đặc biệt nhiều ở các mô thần kinh sỏi mật, thể vàng của buồng trứng và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Hầu hết cholesterol không có nguồn gốc từ thức ăn mà nó được tổng hợp bên trong cơ thể Cholesterol được đào

thải qua đường ruột, dưới tác dụng của vi khuẩn tạo ra coprosterol

Hình 1.4: Công thức cấu tạo cholesterol

Cholesterol hiện diện với nồng độ cao ở các mô tổng hợp nó hoặc có mật độ màng dày đặc như gan, tủy sống, não và mảng xơ vữa động mạch, đóng vai trò trung tâm trong nhiều quá trình sinh hóa Nhưng nồng độ cholesterol trong máu cao (còn gọi là mỡ máu cao) là nguyên nhân chủ yếu gây ra chứng xơ vữa động mạch Từ các mảng xơ vữa sẽ làm hẹp các động mạch cung cấp máu để nuôi các cơ quan khác trong cơ thể, trong đó có động mạch vành ở tim Khi động mạch vành bị hẹp thì lượng máu đến nuôi cơ tim bị thiếu, nên gây ra cơn đau thắt ngực, nếu thiếu máu nặng sẽ gây nên cơn nhồi máu cơ tim

Có hai loại cholesterol là LDL và HDL Hai loại này chỉ phân biệt được nhờ tỉ trọng khác nhau

⬩ LDL (Low Density Lipoprotein) xuất phát từ gan, vận chuyển cholesterol đến tế bào để tạo năng lượng (là cholesterol xấu)

⬩ HDL (High Density Lipoprotein) có chức năng ngược lại, vận chuyển cholesterol từ tế bào vào gan để tái biến dưỡng (là cholesterol tốt) (Dương Nhật Linh, 2018)

Cơ chế điều hòa lượng cholesterol trong máu:

Có những thụ thể ở gan để điều hòa lượng cholesterol trong máu bằng cách nhận biết nồng độ cholesterol trong máu, nhận biết nồng độ cholesterol từ thức ăn Nếu lượng cholesterol từ thức ăn đủ đảm bảo thì trong cơ thể sẽ ngừng tạo

cholesterol Nhưng lượng cholesterol trong máu cao thì sẽ tăng chuyển hóa và đào thải cholesterol

Lượng cholesterol thừa ở trong máu sẽ bị các thực bào macrocyte (trong tế bào đã thừa nhưng vẫn tăng sinh thụ thể để hấp thu) trên các thành động mạch bắt lấy và tạo thành các xơ vữa trên thành động mạch Hậu quả của nó dẫn đến:

• Xơ vữa động mạch tim dẫn đến cơn đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim • Xơ vữa động mạch não dẫn đến tai biến mạch máu não

Chlorogenic acid có khả năng ức chế sự hình thành huyết khối động mạch Sự điều hòa cholesterol nhờ tác động của chlorogenic acid đã được một số nhà khoa học tìm hiểu và chứng minh thử nghiệm trên chuột Những con chuột được nuôi thử nghiệm với chế độ ăn giàu cholesterol và bổ sung điều trị với 2 hướng là có chlorogenic acid và không có chlorogenic acid để so sánh, kết quả sau 6 tuần ta thấy sử dụng chlorogenic acid (150 mg mỗi kg mỗi ngày) làm giảm đáng kể giảm nồng độ lipid trong huyết tương và thay đổi biểu hiện của mRNA và các gen liên quan đến lipogenesis và lipolysis trong mô mỡ Hơn nữa, chlorogenic acid cũng cải thiện chứng rối loạn vi sinh vật đường ruột do tăng cholesterol gây ra, bao gồm ức chế sự phát triển của Desulfovibrionaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae,

Erysipelotrichaceae và làm tăng sự phát triển của Bacteroidaceae (Wang và cs.,

Quả cà phê robusta được thu hái trực tiếp tại rẫy cà phê Quả cà phê khi thu

hoạch được xác định các thông số về sinh trưởng kiểm tra đo kích thước hạt hơi tròn đường kính khoảng 1,2 cm, màu chín đỏ hoặc hơi ươm màu chín, mức độ trưởng thành và tuổi thu hoạch trước khi thu hoạch Quả cà phê tươi sau khi thu hoạch được phơi khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời, sau đó tách vỏ để thu lấy hạt thô

5.2 Nguyên tắc tách chiết

Khi cho nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, ban đầu dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu sau đó những chất trong tế bào nguyên liệu cây sẽ hòa tan vào dung môi rồi khuếch tán ra ngoài tế bào Trong quá trình tách chiết sẽ xảy ra một số quá trình sau: Khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm ngấm kiệt, ngâm dầm, chiết với máy Soxhlet,… Sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn,… (Selvam V, 2007)

Có nhiều cách để chiết xuất các hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng Chiết tách là sử dụng một loại dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng hòa tan chất cần tách, tinh chế và cô lập hợp chất mong muốn

5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu

⮚ Lựa chọn dung môi để tách chiết

Thông thường muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất tự nhiên có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hay chiết một lần lấy tất cả các hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các hợp chất tự nhiên trong mẫu cây) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Nguyên tắc của sự tách chiết là dung môi không phân cực (ví dụ: eter dầu hỏa, hexan, heptan, benzen, toluen,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ: các alcol béo, ester béo,…), dung môi phân cực trung bình (ví dụ: diethyl ether, chloroform,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình

(các hợp chất có chứa nhóm chức eter –O–, aldehyde –CH=O, cetone –CO–, ester –COO–…) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ: metanol, ethanol,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH…) (Selvam, 2007)

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet,… Sau khi chiết, phần bã cây còn lại lọc bỏ, dung môi thu hồi bằng bộ thu hồi dung môi hoặc bằng máy cô quay chân không

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được các hợp chất cần khảo sát Sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi quá độc như benzen hoặc dễ cháy do nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, cacbon tetraclorur,…

⮚ Nhiệt độ tách chiết

Khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình tách chiết trong các trường hợp sau:

Đối với những hợp chất kém bền với nhiệt khi nhiệt độ tăng cao sẽ gây biến đổi hoặc làm mất tính chất hóa học của chúng Ví dụ: alkaloid, vitamin, glycosid,…

Đối với tạp chất: Khi nhiệt độ tăng không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà độ tan của tạp chất cũng tăng theo làm cho dịch chiết thu được sẽ nhiều tạp chất như gôm, chất nhày… ngoài ra khi nhiệt độ tăng sẽ làm cho một số chất trong nguyên liệu bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết (Selvam, 2007)

Đối với dung môi dễ bay hơi nhiệt độ sôi thấp, khi tăng nhiệt độ thì dung môi sẽ bị hao hụt, có thể gây cháy nổ trong quá trình chiết nên thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lưu dung môi

⮚ Thời gian tách chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó đến các phân tử lớn hơn (thường

là tạp chất như nhựa, keo,…) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong nguyên liệu cây, nhưng nếu thời gian chiết dài quá thì dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản (Selvam, 2007)

⮚ Độ mịn của nguyên liệu

Khi nguyên liệu cây quá thô dung môi sẽ khó thấm ướt nguyên liệu, hoạt chất khó chiết vào dung môi nên thời gian chiết sẽ lâu hơn Khi nguyên liệu cây mịn quá thì bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi tăng lên, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng, do đó thời gian chiết sẽ ngắn hơn

Tuy nhiên nếu nguyên liệu quá mịn, khi ngấm vào dung môi bột nguyên liệu bị dính vào nhau, nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết lẫn nhiều tạp (Selvam, 2007)

5.4 Phương pháp chiết đun khuấy từ hồi lưu

Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây Caffeine (1,3,7-

trimethylxanthine) là 1 alkaloid thường gặp trong cà phê Trong cà phê, caffeine có thể chiếm đến 0,3 - 2,5 % Caffeine ít tan trong nước (21,7 g/l) nhưng tan trong nước nóng; Tan nhiều hơn trong CHCl3 Ở đây đùng phương pháp đun hồi lưu bột cà phê với nước được kiềm hóa bằng CaCO3

5.5 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Kỹ thuật chiết lỏng lỏng được áp dụng để phân chia cao thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không tan vào nhau Hằng số phân bố của một số chất cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai chất lỏng tại thời điểm cân bằng hằng số phân bố K (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

5.6 Phương pháp chiết soxhlet

Phương pháp chiết soxhlet là một quá trình chiết liên tục, được lặp đi lặp lại nhiều lần nhằm ngấm kiệt hoạt chất

Cách tiến hành: Bột nguyên liệu xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải màu trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau của trụ chiết Rót dung môi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (không được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn 2/3 thể tích bình cầu) Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Tiếp tục cho tới khi chiết kiệt chất trong bột cây (Từ Minh Koóng, 2007)

Hình 1.5: Hệ thống chiết soxhlet 5.7 Phương pháp định tính

▪ Phương pháp sắc ký bản mỏng:

Phương pháp sắc ký lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần di chuyển với tốc độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng,

2007)

Hình 1.6: Bình sắc ký lớp mỏng

Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau, ngoài ra còn có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn cần đối chứng

▪ Phương pháp đo điểm nóng chảy:

Điểm nóng chảy chỉ ra sự tinh khiết của chất được đo Chất càng tinh khiết thì phạm vi nóng chảy của nó càng hẹp Khi chất có nhiều tạp chất sẽ làm cho điểm nóng chảy của nó thay đổi (Pavia, 2011)

▪ Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR cho biết cấu trúc khung sườn cacbon – hidrogen của hợp chất hữu cơ, từ đó có thể xác định cấu trúc của toàn bộ phân tử Một số hạt nhân nguyên tử có trạng thái +1/2 và -1/2 và tính chất này cho phép khảo sát chung bằng phổ NMR

Ví dụ: 1H, 13C, 15N, 19F, 31P Phổ 1H-NMR cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết tỉ lệ hydro (H) trong từng mũi cộng hưởng

Ngày nay máy quang phổ cộng hưởng NMR thường hoạt động ở tần số 60 – 900 MHz, tần số hoạt động của máy càng cao từ trường bên ngoài càng mạnh thì độ phân giải của phổ thu được càng tốt

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: Hạt cà phê robusta tên khoa học là Coffea canephora, thuộc chi

Coffea, họ Rubiaceae, được thu hái ở xã Hòa Xuân TP.BMT tỉnh Đăk Lăk Nguyên

liệu được phơi khô và xay thành bột

1.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi Trường, Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh Địa chỉ: 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, Thủ Dầu Một, Bình Dương

1.3 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

❖ Hóa chất

Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc) Chloroform (VN Chemsol Co., Việt Nam)

Methanol (VN Chemsol Co., Việt Nam)

n-Butanol (Xilong Scientific Co., Trung Quốc) NH3 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)

Petroleum ether (VN Chemsol Co., Việt Nam) Acetone (VN Chemsol Co., Việt Nam)

Amoniac đậm đặc (Xilong Scientific Co., Trung Quốc) ❖ Dụng cụ - thiết bị

Bình lóng 250 ml Bomex

Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml Bể ổn nhiệt Memmert WB7

Bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab (bình cầu đáy bằng 1000 ml nhám 24/29, ống sinh hàn nhám 24/29, bếp khuấy từ)

Bộ thu hồi dung môi (bình cầu đáy tròn 1000 ml, ống sinh hàn thẳng, nhiệt kế, đầu chưng cất, nhánh thu dung môi)

Cân kỹ thuật OHAUS GS 3000g

Bản nhôm 20x20 cm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck KgaA – Frankfurter Strasse 250, Darmstadt, Germany)

Đèn UV Vilber Lourmat VL – 6LC Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE Tủ sấy đối lưu ALM400 (Đức)

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp chiết là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào đặc tính của chất cần chiết và dung môi Khi cho nguyên liệu dược liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, ban đầu dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu sau đó những chất trong tế bào nguyên liệu sẽ hòa tan vào dung môi rồi khuếch tán ra ngoài tế bào Trong thực nghiệm, việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm ngấm kiệt, ngâm dầm, sự trích ly với máy chiết Soxhlet, ngoài ra còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn,… Hiện nay, có nhiều phương pháp chiết tách như: Phương pháp chiết CO2 siêu tới hạn (Icen, 2010; Zosel, 1978), chiết dưới áp suất cao (Xi, 2009), chiết dưới sự hỗ trợ của lò vi sóng (Wang và cs., 2011) Tuy nhiên, những phương pháp trên đòi hỏi kỹ thuật cao, khó thực hiện Đến nay, trong và ngoài nước đã có một số công trình công bố phương pháp tách caffeine sử dụng dung môi chiết như: benzene, chloroform, trichloroetylen, và nước nóng (Nguyễn Minh Thảo và cs., 1993-1994), Tuy nhiên, có bằng chứng đưa ra rằng những dung môi clo hóa có khả năng gây ung thư (Lynge, 1997) Do đó, phương pháp tách truyền thống bằng nước nóng có lẽ vẫn là phương pháp hiệu quả

2.1 Quy trình thực hiện chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô

Cân 30g bột hạt cà phê bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với nước, khảo sát thời gian chiết tối ưu Sau quá trình chiết thô, thu dịch chiết bỏ bã và dịch chiết được cô cạn còn 200 ml Sau đó đem dịch chiết đã cô cạn để nguội ở nhiệt độ phòng và thực hiện chiết lỏng – lỏng với dung

môi chloroform, thu dịch chloroform

Bước 2: Thu hồi dung môi

Dịch chiết chloroform được cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 2 viên đá bọt nhỏ vào rồi tiến hành thu hồi dung môi với bộ thu hồi dung môi ở nhiệt độ 61- 63oC

Bước 3: Thăng hoa thu tinh thể

Dịch chiết chloroform chứa caffeine sau khi được cô cạn tiến hành thực hiện thăng hoa caffeine ở khoảng 200o

C thu tinh thể caffeine Cân và tính hiệu suất quá trình trích ly

Các bước thực hiện được thể hiện trong hình 2.3 bên dưới