khảo sát khả năng tách chiết và thu nhận hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate bitc từ hạt cây đu đủ carica papaya l

Do đó, em tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng tách chiết hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate BITC từ hạt của cây đu đủ Carica papaya L.” với mong muốn

TỔNG QUAN

Tổng quan về đề tài

1.1.1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Đề tài có các mục tiêu đề ra như sau:

Tìm được các phương pháp và điều kiện trích ly tối ưu trong các phương pháp trích ly cổ điển sử dụng

Phân lập và định danh chính xác được hợp chất BITC qua sắc ký cột

Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất sau phân lập để khẳng định kết quả 1.1.2 Cách tiếp cận, phương pháp và phạm vi nghiên cứu

1.1.2.1 Cách tiếp cận Đề tài tiếp cận các vấn đề nghiên cứu từ các góc độ sau:

Tiếp cận từ cơ sở kiến thức chuyên môn cũng như tổng quan về khả năng tách chiết hợp chất BITC từ các nghiên cứu trên thế giới

Tiến hành các thí nghiệm trong đề tài nghiên cứu giúp đánh giá khả năng thu nhận hợp chất BITC từ thực tiễn Quá trình này giúp xác định hiệu suất chiết xuất và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận BITC, cung cấp cơ sở khoa học để tối ưu hóa quy trình sản xuất và tạo ra sản phẩm chất lượng cao.

1.1.2.2 Phương pháp nghiên cứu Đề tài được thực hiện bằng một số phương pháp nghiên cứu truyền thống như:

Phương pháp chiết và thu nhận các thành phần trích ly từ mẫu vật ban đầu (Phương pháp ngâm chiết cơ bản và phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn)

Phương pháp phân lập các thành phần trong cao chiết (Phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký cột)

Phương pháp định danh sản phẩm (Phương pháp phổ cộng từ hạt nhân)

Ngoài các phương pháp kể trên, đề tài có thể sử dụng thêm một số phương pháp khác nhằm phục vụ cho quá trình thực hiện đề tài

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Do hạn chế về thời gian và nguồn lực tài chính, đề tài xác định được các phạm vi như sau:

Phạm vi không gian của nghiên cứu này tập trung đánh giá chất lượng mẫu chiết từ đối tượng thu nhận tại một khu vực cụ thể là Cao Lãnh, Đồng Tháp Các hoạt động nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa - Môi trường của Đại học

Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Phạm vi thời gian: Đề tài chỉ cho phép thực hiện theo khuôn khổ thời gian được cho phép từ phía nhà trường

Phạm vi tài chính: Đề tài chỉ thực hiện trên điều kiện được hỗ trợ tài chính từ phía nhà trường.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Dựa theo những dữ liệu được tổng hợp từ các nguồn sách như “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, 2006” và “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2007”, tổng hợp thành các thông tin chính như sau:

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật

Carica papaya L có chiều cao vào khoảng 2-4 m và có khi cao đến gần 7m

Cây thân thẳng và hiếm khi phân nhánh, trên thân cây có nhiều vết sẹo của cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le ở ngọn cây, có cuống lá rất dài, lá xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim đầu nhọn, mỗi thùy lá lại chia tiếp thành các thùy nhỏ hơn không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn

Hoa có màu vàng lục nhạt, mọc ở kẻ lá; Hoa đực và cái có thể cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực phân nhánh thành chùy xim, dài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm, cụm hoa cái có 2 đến 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hoi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu một ô, nhiều lá noãn

Quả mọng to hình trứng ngược hoặc thuôn dài khoảng 20-30 cm, đường kính vào khoảng 15-20 cm Thịt quả dày có màu giống vỏ khi chín thường là vàng đến cam có khi cam đến đỏ, ruột trái chứa nhiều hạt có giống không hạt (giống lai mới ngày nay) có màu đen và bọc bên ngoài là màng bọc giúp chứa sinh chất bên trong, hình thái hạt gần giống với thông trần có lớp vảy sần đen bọc bên ngoài và phần noãn có màu ngà nằm bên trong

Hình 1.1 Đu đủ (Carica papaya L.)

Hình bên trái là hình cây chụp ngoài thực tế còn bên phải là hình phác họa chi tiết

Hình 1.2 Cấu trúc của hoa đực (A), hoa cái (B) và hạt của đu đủ (C)

Giới (Kingdom): Thực vật – Plantae

Ngành chính (Superdivision): Thực vật có hạt – Spermatophyta

Ngành (Division): Thực vật có hoa – Magnoliophyta

Lớp (Class): Thực vật song tử diệp – Magnoliopsida

Họ (Family): Họ đu dủ - Caricaceae

Chi (Genus): Đu đủ - Carica L

Loài (Species): Đu đủ - Carica papaya L

Loài Carica papaya L có nguồn gốc xuất phát từ vùng nhiệt đới châu Mĩ, được tìm thấy ở độ cao từ 1500-3000 m từ Panama đến Bolivia, có giống cây đu đủ mọc tự nhiên cho quả ăn được C pubescens Linné & Koch Giống cây đu đủ trồng hiện nay có thể là giống lai tự nhiên của loài C peltata Hock & Ann

Cây được người Tây Ban Nha du nhập giống vào Đông Nam Á vào khoảng thế kỉ XVI, từ đây giống cây được du nhập tiếp và trồng ở nhiều nơi khác trên thế giới

SVTH: Võ Hữu Minh Đức Ở Việt Nam, giống đu đủ đã được người dân trồng từ rất lâu và vẫn chưa thể xác định được thời gian mà giống cây du nhập là khi nào Đu đủ có rất nhiều giống, gần như việc trồng ở các vùng sinh thái khác nhau cho ra một giống loài mới Đu đủ là loài cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là từ 21-33 o C, lượng mưa hằng năm trên 1200 mm, cây sống thích hợp trên nhiều loại đất song không thể chịu ngập úng quá 20 giờ nên cần có biện pháp thoát nước nhanh

Cây không thể trồng ở độ cao trên 1500 m tại Việt Nam Đu đủ là loài cây sinh trưởng nhanh, cây trồng từ hạt sau 4-5 tháng là có thể ra hoa, hoa được côn trùng và gió thụ phấn nên sẽ dễ xuất hiện sự lai tạp càng về các thế hệ sau Đu đủ không chỉ được xem là giống cây ăn quả quan trọng ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Ngoài ra cây đu đủ còn được trồng để lấy nhựa (mủ) cây ở một số quốc gia 1.2.4 Bộ phận sử dụng:

Hầu hết các bộ phận trên cây đều có thể sử dụng kể đến như: quả, nhựa từ quả, lá, hoa, rễ và hạt

Quả đu đủ thường được sử dụng làm thực phẩm bổ sung dưỡng chất cần thiết cho cơ thể con người như các dưỡng chất, các vitamin và các thành phần khhoa1ng chất Nhưng hiện nay, cũng có nghiên cứu tìm thấy ở hạt và lá của cây cũng cho giá trị tương tự Kết quả được tổng hợp lại trong Bảng 1.1 và 1.2 và những kết quả tô vàng cho thấy sự nổi trội về các thành phần có trong cả 3 bộ phận cây đu đủ trên 5 kiểu hình quả và các kết qủa tô màu xanh cho thấy sự kém nổi trội tương ứng về các thành phần như số liệu đã công bố Kiểu hình cho thấy sự nổi trội về thành phần dưỡng chất thiết yếu như vitamin, protein thuộc về các kiểu hình như quả thuôn vỏ cam, quả thô vỏ cam và quả thuôn vỏ đỏ Còn đối với một số thành phần vi lượng ta có các kiểu hình như: thuôn dài vỏ đỏ và quả bầu vỏ cam cho kết quả trội hơn Các

SVTH: Võ Hữu Minh Đức kiểu hình này đều có ở Việt Nam chứ không chỉ là đối tượng trong nghiên cứu của Nwofia (Nwofia và cs, 2012)

Ngoài ra không chỉ mang giá trị dưỡng chất, mà nhiều công bố khác cũng cho thấy tiềm năng trong việc chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ cây đu đủ có hoạt tính sinh học và có giá trị trong trị liệu lâm sàng (Habtemariam và cs, 2019) Đối với ông cha ta xưa đến nay vẫn xem cây đu đủ là một vị thuốc dân gian vì hầu như các bộ phận cây đều có thể sử dụng để chữa một số bệnh về tiêu hóa, giúp vô trùng vết thương, hay hỗ trợ điều trị nhiễm sinh vật như giun, sán, kí sinh trùng trong cơ thể (Đỗ Huy Bích và cs, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004)

Bảng 1.1 Các thành phần quan trọng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình quả đu đủ Carica papaya L

Quả thuôn dài vỏ đỏ

Quả thuôn dài vỏ vàng

Trong cùng một cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0.05% qua phép thử Duncan

Bảng 1.2 Các thành phần khoáng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình quả đu đủ Carica papaya L.

Quả thuôn dài vỏ đỏ

Quả thuôn dài vỏ vàng

1.2.6 Thành phần hóa học Đu đủ sau khi được nghiên cứu cho thấy là loài tiềm năng trong việc phân lập các hợp chất tự nhiên như: các phenolic acid, các flavonoid, các alkaloid và một số thành phần khác như “nhóm chất isothiocyanate và các hợp chất liên quan” cũng như là nơi sinh ra một số loại enzyme và protein quan trọng chỉ có mặt ở loài này (Habtemariam, 2019)

1.2.6.1 Các hợp chất flavonoid đã được phân lập:

1.2.6.2 Các hợp chất phenolic đã được phân lập

1.2.6.3 Nhóm isothiocyanate và các hợp chất liên quan khác

1.2.6.4 Các nhóm alkaloid đã được phân lập

Tổng quan về Benzyl isothiocyanate (BITC)

Theo thông tin từ thư viện PubChem, hợp chất benzyl isothiocyanate có số (26) Tên gọi đầy đủ theo IUPAC của hợp chất này là isothiocyanatomethylbenzene.

BITC thuộc nhóm các hợp chất benzen và các dẫn xuất thay thế Đây là những hợp chất thơm chứa một hệ thống đơn vòng gồm benzen (PubChem Database; Kim và cs, 2018)

BITC là chất độc có tác dụng lên cả vi khuẩn, vi nấm và một số dòng tế bào của người (Barba và cs, 2016; Li và cs, 2014) nhưng chủ yếu những dòng tế bào sai chức năng và không có khả năng gây độc cho con người nhưng có thể gây kích ứng trên một số cơ quan như mắt (Eye Irrit 2A) và hệ hô hấp (STOT SE3) nếu tiếp xúc trực tiếp theo GHS Classification

BITC thường thấy ở hai dạng: dưới dạng rắn (PubChem, Cas No.622-78-6) và nhiều nhất là dưới dạng lỏng (LKTLab và ChemSpider, Cas No.622-78-6)

Hợp chất có thể tan trong nước ở mức 0.109 mg/mL tại 25°C khác so với các hợp chất có vòng benzen khác là do nhóm chức isothiocyanate (Drobnica và cs, 1967)

Tỷ trọng vào khoảng 1.125 g/mL tại 25 o C

Nhiệt độ sôi vào khoảng 241-242 o C (PubChem) và nhiệt độ nóng chảy rất thấp vào khoảng 41-42 o C (PubChem)

Phân tử khối vào khoảng 142.92 g/mol

BITC tan được trong nhiều dung môi hữu cơ như Ethanol, Chloroform, DMSO Khi hòa tan trong dung môi, nó tạo thành dung dịch có màu vàng nhạt, trong suốt, theo LKT Laboratories và ChemSpider.

BITC được hình thành do quá trình thủy phân xúc tác bởi enzyme myrosinase có trên bề mặt hạt với tiền chất benzylglucosinolate có trong hạt (BG) (25) (Li và cs, 2014)

Là hợp chất có khả năng tác động kìm hãm với sinh vật (giun, sán, kí sinh trùng), vi sinh vật, vi nấm và đối với một số dòng tế bào sai chức năng ở người (Barba và cs, 2016; Habtemariam và cs, 2019)

Theo Bennett và cs (1997) đã chứng minh hợp chất BITC là hợp chất isothiocyanate duy nhất hình thành trong cây đủ đủ

Theo Nakamura và cs (2007) chứng minh hạt đu đủ là nguồn chính sản sinh hợp chất BITC

Theo Rossetto và cs (2008) cho thấy hàm lượng benzylglucosinolate có mặt nhiều nhất là trong hạt của đu đủ và giảm dần ở các bộ phận khác của cây

Theo Li và cs (2014) đã tìm ra phương pháp chiết tối ưu để thu nhận hợp bằng các enzyme nội sinh trong hạt đu đủ

Theo nghiên cứu của Barroso và cộng sự (2016), kỹ thuật chiết xuất siêu tới hạn sử dụng CO2 đã được sử dụng để phân lập thành công hợp chất quan trọng từ dầu hạt đu đủ nghiền.

Nghiên cứu về khả năng kháng nấm

Một số nghiên cứu đã cho thấy có thể phân lập từ các nguồn như vi sinh, thực vật cho thấy khả năng kháng một số loại nấm thường thấy trên cây ăn quả (Smolinska và cs, 2003; Mari và cs, 1993; Manici, 1997) hay loài nấm Fusarium oxysporum

(Drobnica và cs, 1967) và một số nghiên cứu khác trên loài nấm trong đất (Smolinska và Horbowicz, 1999)

Nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn

Theo Dias và cộng sự (2014) đã cho thấy khả năng kháng khuẩn của nhóm hợp chất mang ion isothiocyanate từ một số cây họ cải đối với chủng MRSA (chủng

Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là một trong những chủng vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay do khả năng kháng lại cả các loại kháng sinh mạnh nhất Điều này khiến MRSA trở thành mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng, vì nó có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng khó điều trị bằng thuốc kháng sinh thông thường.

Nghiên cứu về khả năng tác động đến một số dòng tế bào đột biến

Theo Srivastava và công sự (2004) cho thấy có khả năng kìm hãm khả năng phát triển của tế bào ung thư tuyến tụy

Theo Abe và cộng sự (2007) cho thấy BITC có khả năng hạn chế phát triển những tế bào ung thư (dòng tế bào p53-defcient) có năng chống đông máu

Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy những ảnh hưởng nhất định của hợp chất BITC đối với thử nghiệm lâm sàng và những ứng dụng thử nghiệm khác trong tìm ra phương pháp điều trị một số loại ung thư ngày nay (Lui và cs, 2003; Kuroiwa và cs, 2006; Zhu và cs, 2015; Rao, 2013)

Hiện nay, chưa tìm thấy bất kì công bố nào đã tách chiết thành thành công hợp chất BITC trên các bất kì đối tượng nào cũng như khảo sát hoạt tính của hợp chất này trong điều trị lâm sàn có công bố trên các tạp chí và công bố khoa học ở Việt Nam.

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp ngâm chiết cổ điển (ngâm dầm) và ngâm chiết có khuấy trộn

Theo Zang và cộng sự (2018) việc tách chiết các hợp chất sẽ trải quá trình gồm

4 giai đoạn: (1) dung môi sẽ được sử dụng để hoàn tan mẫu cần chiết, (2) các hợp chất tan vào dung môi, (3) các hợp chất tan tách khỏi mẫu chiết, (4) thu nhận dung môi chứa các hợp chất tan

Việc sử dụng dung môi nào để tách chiết khá quan trọng vì nếu trích ly các hợp chất có trong mẫu dược liệu bằng dung môi như EtOH hay MeOH sẽ cho dãy phân cực các hợp chiết được sẽ rộng hơn so với dùng một dung môi kém phân cực hơn

Ngoài ra, hiệu suất tách chiết còn bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác như kích thước mẫu, nhiệt độ, thời gian chiết,… Do đó, các phương pháp chiết sẽ có sự khác biệt với nhau giữa những yếu tố nêu trên Trong đó phương pháp ngâm dầm (Maceration) là một trong hai phương pháp dễ dàng sử dụng nhất trong các phương

SVTH: Võ Hữu Minh Đức pháp thường gặp dùng trích ly các hợp chất có trong mẫu dược liệu Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp đều rất dễ để có thể điều kiển và có thể sử dụng được đối với những phòng thí nghiệm thiếu điều kiện nhất

Do nhược điểm lớn nhất của phương pháp ngâm dầm là thời gian, vì phải mất 24h mới có thể thu kết quả Nên phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn bằng máy khuấy từ được xem là phương pháp sẽ giúp tăng hiệu suất chiết so với phương pháp ngâm dầm Tính nổi trội ở đây chính là sự gia tăng tiếp xúc của mẫu chiết và dung môi, điều này giúp thời gian chiết được giảm thiểu đáng kể (không cần mất đến 24h), và rút gọn thời gian nghiên cứu giai đoạn đầu

1.4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Phương pháp sắc kí bản mỏng hay sắc kí lớp mỏng (TLC) là phương pháp đơn giản và đa dụng, sử dụng trong việc xác định bước đầu các thành phần hợp chất có trong một mẫu thử tách chiết từ mẫu dược liệu và chứa nhiều thành phần hợp chất

Sử dụng pha động có độ phân cực khác nhau (từ kém phân cực đến phân cực nhất) và pha tĩnh là hạt silica gel 60 tráng trên bản kính hoặc bảng nhôm tráng sẵn silica gel 60 để thử nghiệm.

Ta có thể quan sát được sự phân tách các vệt chất trên bảng mỏng bằng việc xác định chúng dưới tia UV-vis, sẽ là các vết màu đen ở bước sóng 254mn và vệt sáng có màu đối với bước sóng 365mn, hay cũng có thể nhận biết chúng bằng một số thuốc thử đa dụng như hơi Iod hay 10% sulfuric acid trong cồn hoặc một số loại thuốc thử đặc trưng riêng cho một số nhóm định chức Để xác định sự phân tách hợp chất có tốt trên bảng mỏng hay không ta tính các thông số Rf (Rate of flow) tốc độ lôi cuốn của dung môi hay khoảng cách giữa các vệt chất và Rs (Rate of separation), các tỉ lệ này được tính dưa theo khoảng di chuyển của một chất trên bản mỏng như Hình 1.3

Qua tác động của pha động sử dụng, các vệt chất sẽ được phân tách và hiện hình trên bảng mỏng giúp ta đo và tính toán khoảng cách di chuyển của chúng Kết quả của hai thông số tính toán được và cho kết quả tốt nhất khi Rf có giá trị nằm trong khoảng từ 0,25 đến 0.75 (Li và cs, 2014) hay khi dùng để tìm hệ giải ly tốt nhất cho sắc ký cột thì giá trị nên nằm trong khoảng từ 1/3 đến 2/3 của bảng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Còn đối với thông số Rs thì giá trị tốt nhất nên nằm quanh khoảng 0.5 (Li và cs, 2014) để khoảng cách giữa hai vệt chất phân tách là tốt nhất Công thức tính toán các thông số như sau:

𝑏 (Rf nằm trong khoảng từ 0.25 đến 0.75)

(𝐼 1 + 𝐼 2 ) (Rs nên dao động xung quanh 0.5)

Vết (A): vết chất BITC tinh Vết (B): Vết BITC chưa tinh

Vết (C): Vết chất khác tách được trong mẫu chưa tinh

(D): Vạch dung môi a 1 : khoảng cách từ vạch xuất phát đến vết C a 2 : khoảng cách từ vạch xuất phát đến vết BITC

I 1 : khoảng cách từ vạch kết thúc đến vết B

I 2 : khoảng cách từ vết BITC đến vết C

Hình 1.3 Các thông số ghi nhận qua bảng mỏng a 1 a 2

Vạch xuất phát Vạch kết thúc

1.4.3 Phương pháp sắc ký cột (CC)

Phương pháp sắc ký cột hay cụ thể là phương pháp sắc ký cột hở cổ điển (open Chromatography Column) là phương pháp dựa trên nền tảng của phương pháp TLC Nhưng đối với sắc ký cột, pha động sẽ được dựng thành một trình tự các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần được cho chạy liên tục thành dòng giúp hòa tan hợp chất trong mẫu cao sử dụng chạy sắc ký ra khỏi cột

Việc tìm hệ giải ly đầu trên cột là một điều vô cùng quan trọng nó giúp hạn chế tối đa những sai xót xảy ra trong quá trình chạy cột như: tụt cột hay các chất bị giữ lại trên cột khiến hiệu quả phân tách hợp chất kém Do đó, hệ giải ly đầu và trình tự các hệ giải ly sử dụng cho sắc ký cột phải được xây dựng trước khi thực hiện sắc kí cột và khảo sát bằng phương pháp TLC

Kích thước cột và loại pha tĩnh được lựa chọn sao cho phù hợp với mục đích phân tách các hợp chất:

Kích thước cột thường được lưu ý đầu tiên, vì đường kính và chiều dài cột càng giảm ta phân tách loại mẫu cao chiết càng tinh khiết

Chất sử dụng làm pha tĩnh chạy cột quan trọng nhất là cấu trúc hạt và kích thước hạt Kích thước mạng lưới hạt càng nhỏ sẽ cho các hợp chất có kích thước phân tử càng nhỏ ra khỏi cột trước tiên và tùy vào độ phân cực của hạt mà chất có độ phân cực ngược với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột trước nhất Ngày nay, pha tĩnh có nhiều loại như: aluminum oxide, silicagel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid và mỗi loại đều có có nhiều kích thước hay đường kính hạt khác nhau cũng như hạt có cấu trúc đặc biệt dùng đề phân tách và tinh sạch các hợp chất trên cột với mục đích khác nhau

1.4.4 Phương pháp định danh hợp chất Để tiến hành định danh một hợp chất tinh thu nhận từ quá trình sắc ký cột ta đem mẫu thu được (lượng mẫu tối thiểu cần đạt 5mg, được loại dung môi và ẩm hoàn toàn) đi chạy các loại phổ như phổ cộng từ hạt nhân NMR ( 13 C NMR và 1 H NMR)

Khi so sánh phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất được phân lập với phổ công bố trong tài liệu, nếu thấy các đặc điểm đồng nhất về số lượng, vị trí và cường độ tín hiệu thì có thể khẳng định hợp chất phân lập chính là hợp chất đối chiếu Thông số phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất BITC đã được công bố và tổng hợp trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3 Số liệu phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của hợp chất BITC

1 H-NMR (****) (CDCl 3 ) δ C (ppm) δ H (ppm) δ C (ppm) δ H (ppm)

(*): Vị trí C đánh dấu theo Hình 1.4

(**): Tài kiệu tham khảo theo Talab và cộng sự (2014), phổ 1 H-NMR (300Hz, DMSO) thể hiện ở Phụ lục 3

(***): Tài liệu tham khảo trên Spectrabase (SpectraBase Spectrum ID: EjrhlY33Pr6) (****): Tài liệu tham khảo trên Spectrabase (SpectraBase Spectrum ID:

SVTH: Võ Hữu Minh Đức Đối với trường hợp, hợp chất phân tách không có điểm tương đồng với hợp chất cần tìm ta tiến hành so sánh nó với các hợp chất còn lại đã được công bố đã tách chiết thành công từ đối tượng nghiên cứu ban đầu Nếu tồn tại trường hợp, không có điểm tương đồng so với tất cả những hợp chất đã được ông bố ta tiến hành chạy thêm một số loại phổ khác như HSQC, HMQC hay IR để tiến hành định danh cấu trúc phân tử của hợp chất ta phân lập được và từ những yếu tố cấu thành phân tử đã được phân tích ta tổng hợp và xây dựng nên cấu trúc phân tử hoàn thiện của hợp chất ta cần xác định

Hình 1.4 Đánh dấu vị trí carbon trên công thức hợp chất BITC

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Ethanol 99,5% (Xilong Co., Trung quốc)

Methanol (Xilong Co., Trung quốc)

Chloroform (Xilong Co., Trung quốc)

Ethyl acetate (Xilong Co., Trung quốc)

Acetone (Xilong Co., Trung quốc) n-Hexane (Xilong Co., Trung quốc) n-Butanol (Xilong Co., Trung quốc)

Silica gel 60 chạy cột (Đường kính hạt 0.063-0.200 mm, Merck)

Silica gel 60 F254 chạy TLC (Merck)

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Bản nhôm 20 x 20 cm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck)

Cân kỹ thuật PIONEER – Series: PA4102

Cân phân tích SHIMADU – Series: ATX224

Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE

Tủ sấy đối lưu MEMMERT – Series: UM 500 (Đức) Đèn UV Viber Lourmat VL – 6LC (254 & 365 nm)

2.1.3.1 Đối tượng, thu thập và phạm vi thực hiện

Nghiên cứu trên đối tượng là hạt của giống cây đu đủ (Carica papaya L.) được trồng tại tỉnh Đồng Tháp

Nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi Trường trực thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ ngày 07/10/2019 đến ngày 07/08/2020

2.1.3.2 Xử lý nguyên liệu thô

Hạt đu đủ sau khi thu mua, được làm sạch bằng cách phá các màng bọc bao quanh phần hạt để loại bỏ phần dịch chất bên trong Hạt được rửa kĩ dưới dòng nước máy, sau đó được hong khô bằng quạt trần trong bóng râm (độ ẩm tồn còn khoảng 10%), cuối cùng đem xay để sử dụng để tiến hành thí nghiệm ở giai đoạn sau Nếu hạt không sử dụng hết sẽ được bảo quản trong túi zip như Hình 2.1 để tránh hạt bị lại ẩm và mốc

Hình 2.1 Hạt sau khi xay được bảo quản trong túi zip kín

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất thu cao ethanol thô

Xử lý màng bọc ngoài và rửa sạch

Xay đến kích cỡ mong muốn

Ngâm chiết có khuấy từ trong 6h, tại nhiệt độ phòng Đun trên bếp cách thủy với nhiệt độ 95 o C Chiết với ethanol

2.2.1.1 Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu

Xác định phương pháp chiết cao tối ưu đồng thời với tỉ lệ mẫu/ dung môi chiết để tìm ra phương pháp chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi tối ưu tương ứng Thực hiện bằng cách: cân chính xác 10g nguyên liệu đã xay cho vào bình cầu đáy bằng 250ml và chai thủy tinh miệng nhám dung tích 500ml, tiếp đến cho các tỉ lệ dung môi tương ứng với lượng mẫu cần khảo sát tương ứng cho từng đợt thí nghiệm Bình cầu đáy bằng sẽ được cho thêm cá từ và đặt lên bếp đun khuấy từ với điều chỉnh tốc độ đảo trộn đều và ổn định, không điều chỉnh nhiệt chiết trong 6 giờ Còn chai thủy tinh sẽ được đặt trong phòng nơi tránh ánh sáng trực tiếp và ngâm chiết trong 24 giờ Hình 2.2

Hình 2.2 Minh họa cho phương pháp (A) ngâm dầm và (B) ngâm chiết có khuấy trộn

Hai phương pháp đều thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 25-35 o C Dịch lọc sau thu được loại dung môi sẽ đem cân và thu nhận kết quả để tính toán và nhận xét qua thống kê, khảo sát được lặp lại 3 lần

2.2.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và thời gian chiết đến khối lượng cao thu được

Tiến hành cân 10g nguyên liệu đã xay nhỏ cho vào 3 bình cầu tròn đáy bằng 250ml và cho dung môi tương ứng theo tỉ lệ mẫu nguyên liệu/ dung môi 10:50, 10:75 và 10:100 (g/ml) vào mỗi bình cầu Thực hiện ngâm chiết có khuấy trộn lần lượt trong

Mỗi đợt thí nghiệm tiến hành khảo sát song song giữa tỉ lệ mẫu/dung môi và thời gian chiết ly tại 3 mốc thời gian: 2h, 4h và 6h Mỗi cặp nghiệm thức được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậy Cao thu tương ứng sau mỗi quá trình chiết ly được đem đi cân để thu nhận kết quả phục vụ cho quá trình tính toán và nhận xét thống kê Kết quả tối ưu nhất sẽ được chọn để tối ưu hóa phương pháp chiết ly.

2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khi thu cao:

Quy trình thực hiện: Để kiểm chứng rằng, hợp chất BITC có nhiệt độ nóng chảy thấp vào khoảng

42 o C và điểm sôi khoảng 241 o C thì khi thu nhận cao thô bằng phương pháp cô quay hay phương pháp chưng cất thu hồi dung môi có sử dụng nhiệt có khiến cho hợp chất này bị phân hủy trong quá trình thu cao Ta thực hiện khảo sát nhiệt độ trong quá trình thu cao như sau:

Cho các dịch chiết tương ứng bởi các tỉ lệ mẫu/ dung môi tương ứng vào từng becher 250 mL riêng biệt và tiến hành loại dung môi bằng hai hướng: (1) để bay hơi trực tiếp ở nhiệt độ phòng; (2) đem loại dung môi bằng bếp cách thủy với mức nhiệt được cài đặt là 95 o C (tức cao hơn nhiệt độ sôi của Ethanol là 78.37°C)

Ngoài ra, trong quá trình thu cao sẽ khảo sát thêm về điểm sôi của dịch chiết (dung môi chứa chất tan thì điểm sôi sẽ thay đổi) Từ đây, nếu phương pháp thu cao

Hình 2.3 Đun loại dung môi trên bếp cách thủy

Trong quá trình thu cao bằng nhiệt, việc đo nhiệt độ không đổi tại điểm sôi giúp xác định ngưỡng nhiệt tối ưu cho các lần thu sau Các số liệu nhiệt độ này được ghi nhận và phân tích để đưa ra kết luận về phương pháp thu cao hiệu quả nhất Để kiểm chứng khách quan, sắc ký bản mỏng được thực hiện đối chứng giữa hai phương pháp thu cao, giúp đánh giá sự khác biệt giữa chúng một cách chính xác.

2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất

2.2.2.1 Khảo sát khả năng hòa tan cao thô với các đơn môi thường dùng

Tính chất của mỗi loại cao chiết không hoàn toàn giống nhau (ảnh hưởng bởi dung môi chiết, chất tan hòa tan được, loại dược liệu chiết, phương pháp trích ly,…) Việc xác định khả năng hòa tan cao trong các loại dung môi bước đầu nhằm tìm hiểu Khả năng tinh chế của cao chiết Do qua kết quả khảo sát, ta có thể đánh giá một số thông tin cần thiết cho quá trình cô lập các hợp chất sau này khả năng tạo cao tinh chế tinh loại một số thành phần ta không monh muốn chiết trên cột, lựa chọn dung môi cho sắc ký Ngoài ra, có thể khảo sát sự kết tính của một số thành phần trong cao chiết

Cao thô thử nghiệm được cân một lượng vào khoảng 0,1-0,2g cho vào các ống nghiệm và cho 5 mL các dung môi có thể chuẩn bị được tương ứng vào vật đựng mẫu, các vật chứa sao đó được lắc nhẹ tay khoảng từ 10-20 lần và thu nhận trạng thái hòa tan của cao chiết với từng loại dung môi

2.2.2.2 Khảo sát khả năng phân tách chất bằng phương pháp TLC Quy trình thực hiện:

Cao thô tiến hành cân và cho vào một chai bi một lượng khoảng 0,1g và hòa tan bằng 5 mL chloroform Mẫu sau đó được chấm bằng ống vi quản lên bảng nhôm tráng sẵn lớp mỏng silica gel Các hệ tiến hành khảo sát trên các hệ dichlomethane: petroleum ether (1:20) (Li và cs, 2014), n- Hexane: chloroform (1:1), n- Butanol: chloroform (1:1), chloroform, chloroform: ethyl acetate (9:1) Thu nhận kết quả và tính thông số Rf và Rs hoặc đánh giá qua cảm quang bằng mắt để đưa ra kết luận

2.2.2.3 Xây dựng trình tự hệ dung môi dùng cho sắc ký cột (CC)

Qua quá trình khảo sát các hệ dung môi trên bản mỏng, các hệ dung môi sẽ được lựa chọn và sắp xếp lại, sắp xếp theo trật tự tăng dần độ phân cực Trình tự các hệ dung môi phù hợp với sắc ký cột sẽ được lựa chọn để tối ưu hóa quá trình tách và phân tích mẫu.

Hệ giải ly đầu được sử dụng trong sắc ký cột có độ phân cực được làm giảm đi so hơn với hệ giải ly được xác định bằng TLC (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Sau khi quá trình phân tách kết thúc, cột sắc ký sẽ được rửa sạch bằng hệ dung môi hoặc đơn dung môi có độ phân cực cao như Methanol Quá trình rửa giải này nhằm loại bỏ hoàn toàn các chất bám dính trên cột sắc ký.

2.2.2.4 Phân tách các hợp chất bằng sắc ký cột

Tiến hành chọn cột để chạy sắc ký (phòng thí nghiệm chỉ có loại có đường kính 1,5cm), chọn pha tĩnh (phòng thí nghiệm chỉ có pha tĩnh là silicagel 60) và cân với tỉ lệ tối thiểu là gấp mười lần đường kính cột (tương đương 15g Silacagel 60) Ngâm pha tĩnh với dung môi giải ly đầu trên cột

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Quá trình chiết xuất và thu cao thô

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu:

Thông qua khảo sát khối lượng cao sau khi thu của từng phương pháp và tỉ lệ mẫu/ dung môi sử dụng ta tổng hợp dữ liệu thành bảng sau:

Bảng 3.1 Hiệu suất thu cao chiết tương quan giữa phương pháp chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi

Tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/ml)

Phương pháp chiết Ngâm chiết có khuấy trộn (6h)

Thí nghiệm thừa số (Factorial experiment) bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho ta kết quả như sau (phụ lục 1): p-value = 0,00 < α=0.01

Suy ra, sự khác biệt nội trong các nghiệm thức như phương pháp và tỉ lệ mẫu/ dung môi và giữa hai nghiệm thức với nhau có sự khác biệt rất có ý nghĩa p-value = 0,29 > α=0.05

Suy ra, sự khác biệt giữa các nghiệm thức lần lặp không có sự khác biệt

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi đến hiệu suất chiết cao

Tỉ lệ mẫu/ dung môi

Ngâm chiết có khuấy trộn (6h)

(Hệ số biến động) cv% 1,38

Số liệu tổng hợp dựa trên phụ lục 1

Qua kết quả ở mục phụ lục 1 thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa qua thống kê giữa các nghiệm thức phương pháp chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi sử dụng cũng như sự tương quan giữa hai nghiệm thức Trong đó tại sự tương quan nhau giữa phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn và tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:75 và 10:100 cho giá trị hiệu suất cao nhất và không khác biệt có ý nghĩa với nhau cũng như khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 % qua phép thử Duncan đối với những sự tương quan còn lại

Do đó nếu ta sử dụng tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:75 hay 10:100 và tiến hành chiết bằng phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn trong 6h sẽ cho hiệu suất cao nhất đối với phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn

3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để thu cao chiết

3.1.2.1 Khảo sát giữa các tỉ lệ dung môi và thời gian chiết ly

Thông qua khảo sát khối lượng cao sau khi thu của mốc thời gian chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi sử dụng ta tổng hợp dữ liệu thành bảng sau:

Bảng 3.3 Hiệu suất thu cao chiết và sự tương quan giữa thời gian chiết ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi

Tỉ lệ mẫu/ dung môi (g/ml)

Sau đó tiến hành phân tích số liệu qua thống kê ta được bảng tóm tắt báo cáo kết quả như sau:

Thí nghiệm thừa số (Factorial experiment) bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho ta kết quả như sau (phụ lục 2): p-value = 0,00 < α=0.01

Sự khác biệt giữa các nghiệm thức xét trên các phương pháp và tỷ lệ mẫu/dung môi, cũng như giữa hai nghiệm thức với nhau là rất có ý nghĩa Giá trị p là 0,49, lớn hơn mức ý nghĩa là 0,05, cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức Điều này cho thấy rằng các phương pháp và tỷ lệ mẫu/dung môi khác nhau không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của các nghiệm thức.

Suy ra, sự khác biệt giữa các nghiệm thức lần lặp không có sự khác biệt

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi đến hiệu suất chiết cao

Nghiệm thức Trung bình hiệu suất Thời gian chiết Tỉ lệ mẫu/ dung môi (%)

(Hệ số biến động) cv% 1,55

Số liệu tổng hợp dựa trên phụ lục 2

Theo thống kê trong phụ lục 2, có sự khác biệt có ý nghĩa giữa thời gian chiết và tỷ lệ mẫu/dung môi sử dụng, cũng như giữa hai nghiệm thức này Trong đó, sự tương quan giữa thời gian ngâm chiết và tỷ lệ mẫu/dung môi là 10:100 trong 4 giờ và 10:100 trong 6 giờ cho hiệu suất cao nhất Những sự tương quan này không khác biệt có ý nghĩa với nhau, nhưng khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05% so với các sự tương quan còn lại theo phép thử Duncan.

Do đó nếu ta sử dụng tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:100 và tiến hành trích ly trong 4h hay 6h sẽ cho hiệu suất thu cao là cao nhất

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thu cao Khảo sát phương pháp thu hồi thu cao chiết:

Kết quả hiệu suất thu cao thô bằng hai cách loại dung môi được thể hiện qua bảng số liệu sau:

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát phương pháp thu hồi cao

Khối lượng cao thu được (g) Đun trực tiếp Bay hơi tự nhiên

Trung bình lượng cao thu được (g) 0.397 0.387

Lượng mẫu sử dụng tương ứng cho mỗi đợt thí nghiệm là 10g

Do tính chất của hai thí nghiệm khác nhau (có tác động và không tác động nhiệt) nên tiến hành chấm so vết phân tách chất trên bản mỏng được thực hiện để khảo sát phương pháp cô cao bằng nhiệt có làm mất đi một số phân đoạn chất trong quá trình cô thu cao hay không Kết quả thu được như hình sau:

Hình 3.1 Kết quả TLC cao thu của 2 phương pháp thu hồi dung môi

Chấm bên trái thể hiện phương pháp cao thu hồi qua quá trình bay hơi tự nhiên, trong khi chấm bên phải đại diện cho phương pháp cao thu hồi thông qua đun trực tiếp.

Khảo sát ngưỡng nhiệt độ sôi tối ưu cho quá trình thu cao:

Trong quá trình thử nghiệm phương pháp thu hồi cao su bằng cách loại bỏ dung môi trực tiếp trên bếp điện, nhiệt độ sôi được ghi nhận lại để phục vụ cho các lần thu hồi cao su tiếp theo Bảng dưới đây tóm tắt kết quả thu được từ các lần thử nghiệm.

Bảng 3.6 Khảo sát ngưỡng nhiệt độ sôi trong quá trình thu hồi cao

Tỉ lệ dung môi Điểm sôi không đổi* ( o C)

*Điểm sôi không đổi là điểm sôi mà tại đó nhiệt độ sẽ không đổi trong suốt quá trình loại dung môi đến khi cao gần cô cạn

Hình 3.2 Ngưỡng nhiệt độ sôi của dung dịch chiết

Nhiệt độ nước bể ổn nhiệt

Kết quả đối chứng qua trực quan của hai cách loại dung môi được tiến hành chấm sắc ký bản mỏng để kiểm tra lại sự thay đổi mà mắt ta thấy được, đồng thời kiểm tra chéo giữa các tỉ lệ dung môi chiết ly được thể hiện qua hai hình dưới đây:

Qua kết quả thu được ở Bảng 3.5 hiệu suất thu hồi cao không có sự khác biệt sai số quá 0,1g giữa các lần lặp của thí nghiệm và hiệu suất cũng không lệch nhau quá 0.1 % giữa hai phương pháp thu cao Do đó, kết quả gần như là không có sự khác biệt với nhau Nên việc sử dụng nhiệt để loại dung môi cho kết quả là khả thi dựa trên lượng cao thu

Hình 3.3 Sắc ký bảng mỏng đối chứng hai phương pháp loại dung môi

Lần lượt vết chấm từ trái qua phải là tỉ lệ từ 10:50, 10:75; 10:100

Hình ở bên trái chụp ở bước sóng 245nm và hình bên phải chụp ở bước sóng 365nm lần lượt từ trái qua phải của hai phương pháp loại dung môi sử dụng nhiệt và cho bay hơi

Qua kết quả Hình 3.2 và Bảng 3.6 cho ta thấy tại ngưỡng nhiệt độ sôi không đổi tại 82±1 o C, điểm sôi dung môi thay đổi (so với điểm sôi của ethanol) chiều hướng tăng lên Nên nếu phương pháp thu cao có sử dụng nhiệt được chứng minh có khả năng sử dụng để thu cao chiết thì ta có thể sử dụng điểm sôi của dung môi ethanol làm nhiệt độ cài đặt cho máy cô quay hay bộ chưng cất thu hồi dung môi Vì nó giúp ta thu hồi lại được một phần lượng dung môi sử dụng trích ly, điều này giúp giảm gánh nặng kinh tế của đề tài Ngoài ra nếu có hợp chất có điểm sôi nằm trong khoảng này (không cần thiết) sẽ được loại bỏ qua dạng hơi Để có cái nhìn khách quan hơn về khả năng sử dụng nhiệt để thu cao, ta dựa vào kết quả chấm bản mỏng như Hình 3.1 và 3.3, có thể thấy không có sự khác biệt nhất định qua trực quang mà mắt quan sát được đối với các vệt phân tách chất trên bảng mỏng Do có có thể đánh giá rằng sơ bộ rằng có thể sử dụng nhiệt để thu hồi cao qua kết quả khảo sát

Nhưng để biết kết quả chính xác nhất về sự thay đổi về thành phần trong cao chiết cũng như sự có mặt của BITC có bị phân hủy trong quá trình thu cao hay không, ta cần phải bổ sung thêm phương pháp LC-MS để biết chính xác sự thay đồi giữa hai kết quả Do điều kiện thời gian không cho phép mà đề tài không thể cho thấy kết quả khảo sát này.

Quá trình phân lập các thành phần có trong cao thô

3.2.1 Khảo sát khả năng tan của cao thô với các đơn môi thông dụng:

Kết quả khảo sát khả năng hòa tan của cao thô trong một số đơn môi thông dụng thường thấy được tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 3.7 Khảo sát độ tan của cao trong một số loại dung môi thường dùng

Tên các dung môi được dùng Trạng thái Đánh giá cảm quan

CHCl 3 (**) Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có một số thành phần không tan nổi trên n - Butanol (*) Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có thành phần không tan chìm dưới

MeOH Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn còn thành phần không tan chìm dưới

EtOH (**) Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có một số thành phần không tan chìm dưới

EA Tan Tan hoàn toàn n -Hexane Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có một số thành phần không tan chìm dưới

DMSO (*), (**) Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có một số thành phần không tan nổi trên

(*) : Dung môi bay hơi chậm và có độ nhớt cao không thích hợp cho làm sạch phân đoạn cao và dung môi chạy sắc ký

(**): Dung môi có thể hòa tan hợp chất BITC.

Qua kết quả Bảng 3.7, có thể thấy trong cao chiết có chứa cả thành phần không phân cực và phân cực Qua khảo sát khi hòa tan cao trong dung môi không phân cực, cho thấy có độ hòa tan cao hơn (màu sắc dung môi sau khi hòa tan có màu vàng đậm hơn) so với khi dùng dung môi phân cực Có thể thấy, cao chứa nhiều thành phần không phân cực hơn (kết quả nhận định lại bởi kết quả sắc ký cột Bảng 3.9)

Do hợp chất cần phân lập có khả năng hòa tan trong một số loại dung môi như chloroform, ethanol, DMSO Nên hợp chất có độ phân cực cao nhưng vẫn có thể hòa tan trong dung môi kém phân cực như chloroform Qua khảo sát, ta có thể ứng dụng kết quả để tiến hành tinh sạch cao thô và thu cao tinh chế bằng cách loại các thành phân không phân cực bằng n-Hexane trước sau đó hòa tan phần cao còn lại trong dung môi như ethanol hay chloroform ta sẽ thu được cao tinh sạch hơn

Do điều kiện thời gian không cho phép nên việc tiến hành khảo sát không thể đi xa hơn về phía khảo sát cao tinh sạch

3.2.2 Khảo sát khả năng phân tách của cao thô bằng phương pháp TLC

Qua việc sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng để xây dựng hệ sắc ký chỉ có ba hệ cho kết quả khả quan nhất được biểu thị qua Hình 3.4 như sau:

Hình 3.4 Kết quả khảo sát hệ giải ly bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Các hệ được sử dụng lần lượt từ trái sang phải là n-Hexane: chloroform (1:1), chloroform; chloroform: ethyl acetate (9:1)

Qua kết quả thu được có thể thấy hệ giải ly tốt nhất là hệ chloroform: ethyl acetate (9:1) với các vết phân tách riêng biệt rất rõ ràng trên bảng mỏng Hệ sử dụng trong phương pháp của Li và cộng sự, 2014 không cho kết quả khả quan (vệt kéo nhiều, không có vết tách đẹp) trong việc phân tách hợp chất cao thô ethanol của khóa luận, điều này xảy ra một phần là cho có lẽ phương pháp trích ly của hợp chất của hai thí nghiệm là khác nhau ngoài ra hệ chỉ dùng cho khảo sát chất đã tinh khiết với mẫu chuẩn chứ không dùng để chạy sắc ký cột

Nhưng nếu để làm hệ giải ly đầu trên cột (xác định trên bảng mỏng) là hệ n-

Hexane: chloroform (1:1) sẽ cho kết quả tách chất kém phân cực ra khỏi cột đầu tiên và tốc độ phân tách chất trên cột sẽ dễ kiểm soát hơn

3.2.3 Xây dựng hệ giải ly cho phương pháp sắc ký cột

Qua kết khảo sát hệ bằng phương pháp TLC, ta sắp xếp lại trình tự hệ giải ly và lựa chọn hệ giải ly đầu phù hợp cho sắc ký cột sao cho thỏa điều kiện đặt ra là vệt chất đầu tiên có Rf nằm trong khoảng dưới 2/3 bảng và hệ giải ly dùng giải ly cuối cùng trên cột nên là methanol để có thể giải rửa các chất còn lại trong cao và trong cột ra khỏi cột sau khi xác định dừng quá trình sắc ký Nên trình tự hệ dùng giải ly trên cột sắp xếp như sau:

Bảng 3.8 Trình tự hệ dùng cho sắc ký cột cao thô

Thứ tự hệ vào cột Thành phần hệ và tỉ lệ dung môi Ghi chú

Hexane: CHCl3 (7:3) Hệ giải ly đầu và trung hòa cột

Hệ 10 EA: MeOH (1:1) Hệ giải ly cuối cùng

Hệ 11 MeOH Hệ rửa giải cột

Từ khảo sát bằng sắc ký bảng mỏng, thấy rằng hệ Hexane: CHCl3 (1:1) là hệ đánh giá là sử dụng làm hệ giải ly đầu nhưng do độ nén của pha tĩnh của bảng nhôm mỏng và của cột là khác nhau (độ nén pha tĩnh trên cột kém hơn so với bảng nhôm) nên cần giảm độ phân cực của hệ giải ly đầu xuống thành Hexane: CHCl3 (7:3) và ta xắp xếp trình tự các hệ giải ly trên cột dựa theo kết quả khảo sát qua sắc ký bảng mỏng ta được kết quả như Bảng 3.8 giúp việc phân tách và tinh sạch các hợp chất trên cột diễn ra dễ dàng hơn.

Phân tách hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột

Sau quá trình giải ly và phân tách các phân đoạn hợp chất của cao ethanol thô trên cột ta thu được kết quả số liệu sau:

Sắc ký cột cao tổng

Bảng 3.9 Các cao phân đoạn thu được sau sắc ký cột cao tổng

Thứ tự chai hứng cùng phân đoạn Hệ dùng giải ly Cao

2 vết xuất hiện ngang nhau (a)

EA EA: MeOH (9:1) EA: MeOH (1:1)

Tổng lượng cao ban đầu: 1.8g Tổng lượng cao thu được: 1.495g (hiệu suất 83.01%)

(a): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform

(b): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform: ethyl acetate (9:1)

(c): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform: ethyl acetate (1:1)

Chạy sắc ký cột cao phân đoạn PP06

Tiếp tục khảo sát khả năng phân tách các phân đoạn thu được trên cao phân đoạn PP 06, tiến hành chạy phân tách các thành phần cao phân đoạn PP 06 ta thu được kết quả phân tách các hợp chất trên cột như sau:

Bảng 3.10 Các phân đoạn thu được sau giải ly cao phân đoạn PP 06

Thứ tự chai hứng cùng phân đoạn

Cao (mg) Sắc ký lớp mỏng

Tổng lượng cao ban đầu: 22mg Tổng lượng cao thu được: 15,6mg (hiệu suất 70.90%) Ghi chú:

(a): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform

(b): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform: ethyl acetate (9,5:0,5)

(c): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform: methanol (9,5:0,5)

Sắc ký cột cao phân đoạn PP07

Tiếp tục khảo sát khả năng phân tách các phân đoạn thu được trên cao phân đoạn PP 07, tiến hành chạy phân tách các thành phần cao phân đoạn PP 07 ta thu được kết quả phân tách các hợp chất trên cột như sau:

Bảng 3.11 Các phân đoạn thu được sau giải ly cao phân đoạn PP 07

Thứ tự chai hứng cùng phân đoạn

Cao (mg) Sắc ký lớp mỏng

EA: MeOH (9:1) EA: MeOH (9:1) MeOH

Tổng lượng cao ban đầu: 12,1mg Tổng lượng cao thu được: 10,7mg (hiệu suất 89.17%) Ghi chú:

(a): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là chloroform: ethyl acetate (1:1)

(b): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là ethyl acetate

(c): Hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng là ethyl acetate: methanol (9:1)

Khảo sát độ tinh khiết cao phân đoạn PP 6.4

Hình 3.5 Kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn PP06-04 phương pháp sắc ký bản mỏng

Các hệ được sử dụng lần lượt là: chloroform, chloroform; ethyl acetate (9,5:0,5); chloroform: methanol (9,5:0,5) và được hiện hình bằng bình hơi Iod

Qua kết quả phân tách hợp chất của cao tổng Bảng 3.9 có thề thấy mẫu cao chứa nhiều hợp chất hơn kết quả dự kiến thu được ban đầu (quan sát trên sắc ký bản mỏng)

Do hợp chất cần bắt có độ phân cực cao và có khả năng hòa tan trong chloroform nên ta chọn các phân đoạn có độ phân cực cao hơn chloroform để khảo sát tiếp Do đó cao phân đoạn PP 6 và PP 7 được tiến hành sử dụng để tiến hành khảo sát trước để xem trong phân đoạn này có hợp chất nào là hợp chất cần tìm hay không

Qua kết quả sắc ký cột phân đoạn PP 6 Bảng 3.10 cho ta thấy chỉ có duy nhất một phân đoạn cho một chất phân tách được riêng lẽ (PP 6.4) các phân đoạn còn lại vẫn chưa được phân tách tốt trên cột chứng tỏ hệ giải ly sử dụng chưa đủ khả năng

SVTH: Võ Hữu Minh Đức đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để phân lập từng chất Đáng chú ý, kết quả của phân đoạn PP 6.4 không hiển thị huỳnh quang dưới cả bước sóng 254 nm và 365 nm nhưng vẫn bắt màu với thuốc thử hơi iốt và dung dịch axit sulfuric 10% trong cồn (Hình 3.5) Tuy nhiên, mẫu phân lập chưa đạt khối lượng đủ để chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do đó chưa xác định được hợp chất đã được tinh sạch hoàn toàn.

Kết quả sắc ký cho thấy có hai phân đoạn PP 7.1 và PP 7.3 không phát huỳnh quang nhưng phản ứng với hơi iod và axit sulfuric loãng So sánh TLC với phân đoạn PP 7.2 cho thấy việc đổi hệ dung môi nhanh chóng dẫn đến tình trạng phân đoạn PP 7.2 chứa lẫn phân đoạn PP 7.1 Do hàm lượng không đủ để chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân và thời gian nghiên cứu hạn chế, nên việc xác định hợp chất trong các phân đoạn này không thể thực hiện được.

Kết quả cuối củng cho thấy lượng cao chiết còn quá thấp nên các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cao tổng cho hàm lượng chất quá thấp không thể tiến hành tình khiết sản phẩm có đủ hàm lượng để tiến hành định danh hợp chất Do kiến thức về sắc ký cột còn hạn chế cũng như thời gian tiến hành thì nghiệm bị sử dụng chưa đúng mục đích và gặp nhiều điều kiện bất lợi nên kết quả thu được không được như mục tiêu mà đề tài đặt ra

Tiêu đề	Khảo Sát Khả Năng Tách Chiết Và Thu Nhận Hợp Chất Tự Nhiên Có Hoạt Tính Sinh Học Benzyl-Isothiocyanate (Bitc) Từ Hạt Cây Đu Đủ Carica Papaya L.
Tác giả	Võ Hữu Minh Đức
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Minh Hoàng
Trường học	Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Tp. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	2,59 MB