khảo sát khả năng tách chiết và thu nhận hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate bitc từ hạt cây đu đủ carica papaya l

Do đó, em tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng tách chiết hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate BITC từ hạt của cây đu đủ Carica papaya L.” với mong muốn

VÕ HỮUMINH ĐỨC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

BENZYL-ISOTHIOCYANATE (BITC) TỪ HẠT CÂY

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : VÕ HỮU MINH ĐỨC

Ngày sinh: 07/04/1998 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1653010064 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Minh Hoàng

Học viên thực hiện: Võ Hữu Minh Đức Lớp: DH16YD01

Ngày sinh: 07/04/1998 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Tên đề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BENZYL-ISOTHIOCYANATE (BITC) TỪ HẠT

CÂY ĐU ĐỦ CARICA PAPAYA L

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu khoa học cho đến nay, ngoài sự phấn đấu của bản thân, em cũng đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ, chỉ dẫn và động viên chân thành Vì vậy, em xin dành vài lời cảm ơn sâu sắc dành gửi đến:

ThS Nguyễn Minh Hoàng (GVHD của em), Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thầy đã ân cần truyền dạy cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em thực hiện đề tài Thầy là một giáo viên chân thành, một tấm gương về sự đam mê khoa học Một lần nữa em xin gửi lời cảm ơn chân thành gửi đến thầy

Em xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ của em người đã dành cho em những sự ân cần lo lắng, luôn hỏi han và giúp đỡ em về mặt tinh thần và hỗ trợ về vật chất trong lúc em thực hiện đề tài

Cảm ơn những người bạn và người thân xung quanh đã động viên và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các thầy cô khoa Công nghệ sinh học đã truyền dạy cho em những kiến thức hữu ích và thiết thực hỗ trợ em trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận của em

Cảm ơn nhà trường đã cho phép sử dụng phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường cũng nhưng những thiết bị và vật dụng cần thiết để em có thể thực hiện đề tài của mình

Trong quá trình thực hiện đề tài do không tránh khỏi những thiếu sót, cũng như bị gián đoạn việc nghiên cứu do đại dịch Covid-19 ngoài mong muốn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báo của thầy, cô để em có thể học hỏi được nhiều kinh nghiệm hơn và đúc kết nó làm hành trang cho công việc tương lai sau này

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Em xin dành sự biết ơn và mong các thầy cô đã chỉ day em cũng như gia đình và bạn bè thân thiết xung quanh em một lời chúc sức khỏe và thành công trong những lĩnh vực mà mọi người mong muốn đạt được trong học tập và công việc

Một lần nữa em xin gửi lời cảm ơn chân thành trước sự trợ giúp của tất cả mọi người!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 04 năm 2020 Sinh viên

Võ Hữu Minh Đức

1.1.1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 4

1.1.2 Cách tiếp cận, phương pháp và phạm vi nghiên cứu 4

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

1.2.6.2.Các hợp chất phenolic đã được phân lập 13

1.2.6.3.Nhóm isothiocyanate và các hợp chất liên quan khác 13

1.2.6.4.Các nhóm alkaloid đã được phân lập 14

1.3.Tổng quan về Benzyl isothiocyanate (BITC) 14

1.3.1 Tính chất hóa lý 15

1.3.1.1.Tính chất vật lý 15

1.3.1.2.Tính chất hóa học 15

1.3.2 Hoạt tính sinh học 15

1.3.3 Nghiên cứu ngoài nước 16

1.3.4 Nghiên cứu trong nước 17

1.4.Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 17

1.4.1. Phương pháp ngâm chiết cổ điển (ngâm dầm) và ngâm chiết có khuấy trộn 17

2.1.3.1.Đối tượng, thu thập và phạm vi thực hiện 24

2.1.3.2.Xử lý nguyên liệu thô 25

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

2.2.Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất 26

2.2.1.1.Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu 27

2.2.1.2.Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và thời gian chiết đến khối lượng cao thu được 28

2.2.1.3.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khi thu cao: 28

2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 30

2.2.2.1 Khảo sát khả năng hòa tan cao thô với các đơn môi thường dùng 30

2.2.2.2.Khảo sát khả năng phân tách chất bằng phương pháp TLC 30

2.2.2.3.Xây dựng trình tự hệ dung môi dùng cho sắc ký cột (CC) 31

2.2.2.4.Phân tách các hợp chất bằng sắc ký cột 31

2.2.2.5.Định danh hợp chất tinh khiết sau phân tách 33

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1Quá trình chiết xuất và thu cao thô 35

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu: 35

3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để thu cao chiết 37

3.1.2.1.Khảo sát giữa các tỉ lệ dung môi và thời gian chiết ly 37

3.1.2.2.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thu cao 39

3.2Quá trình phân lập các thành phần có trong cao thô 43

3.2.1 Khảo sát khả năng tan của cao thô với các đơn môi thông dụng: 43

3.2.2 Khảo sát khả năng phân tách của cao thô bằng phương pháp TLC 453.2.3 Xây dựng hệ giải ly cho phương pháp sắc ký cột 46

Globally Harmonized System of Classification and

Labelling of Chemicals

Hệ thống phân loại và đánh nhãn mức độ nguy hiểm hóa học Hexan n-Hexane

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Phổ tương tác đa chiều đồng hạt nhân

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân

IR Near-infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại L Liter hay litre Lít

LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry

Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ

MeOH Methanol

mg Miligram Mili gam mL Milliliter Mili lít MRSA Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus kháng

methicillin

s singlet Mũi cộng hưởng đơn

TLC Thin Layer Chromatography Phương pháp sắc ký bản mỏng hay sắc ký lớp mỏng

m Multiplet Mũi cộng hưởng đa

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

DANH MỤC CÁC BẢNG Chương 1

Bảng 1.1 Các thành phần quan trọng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình quả

đu đủ Carica papaya L 9

Bảng 1.2 Các thành phần khoáng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình quả đu đủ Carica papaya L 10

Bảng 1.3 Số liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất BITC 21

Chương 3 Bảng 3.1 Hiệu suất thu cao chiết tương quan giữa phương pháp chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi 35

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi đến hiệu suất chiết cao 36

Bảng 3.3 Hiệu suất thu cao chiết và sự tương quan giữa thời gian chiết ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi 37

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly và tỉ lệ mẫu/ dung môi đến hiệu suất chiết cao 38

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát phương pháp thu hồi cao 39

Bảng 3.6 Khảo sát ngưỡng nhiệt độ sôi trong quá trình thu hồi cao 41

Bảng 3.7 Khảo sát độ tan của cao trong một số loại dung môi thường dùng 44

Bảng 3.8 Trình tự hệ dùng cho sắc ký cột cao thô 46

Bảng 3.9 Các cao phân đoạn thu được sau sắc ký cột cao tổng 48

Bảng 3.10 Các phân đoạn thu được sau giải ly cao phân đoạn PP 06 49

Bảng 3.11 Các phân đoạn thu được sau giải ly cao phân đoạn PP 07 50

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Chương 2

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất thu cao ethanol thô 26

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Chương 1

Hình 1.1 Đu đủ (Carica papaya L.) 6

Hình 1.2 Cấu trúc của hoa đực (A), hoa cái (B) và hạt của đu đủ (C) 7

Hình 1.3 Các thông số ghi nhận qua bảng mỏng 19

Hình 1.4 Đánh dấu vị trí carbon trên công thức hợp chất BITC 22

Chương 2 Hình 2.1 Hạt sau khi xay được bảo quản trong túi zip kín 25

Hình 2.2 Minh họa cho phương pháp (A) ngâm dầm và (B) ngâm chiết có khuấy trộn 27

Hình 2.3 Đun loại dung môi trên bếp cách thủy 29

Hình 2.4 Quá trình chạy sắc ký phân đoạn PP 6 32

Chương 3 Hình 3.1 Kết quả TLC cao thu của 2 phương pháp thu hồi dung môi 40

Hình 3.2 Ngưỡng nhiệt độ sôi của dung dịch chiết 41

Hình 3.3 Sắc ký bảng mỏng đối chứng hai phương pháp loại dung môi 42

Hình 3.4 Kết quả khảo sát hệ giải ly bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 45

Hình 3.5 Kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn PP06-04 phương pháp sắc ký bản mỏng 51

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cho đến nay, y học cổ truyền và y học hiện đại đã có sự kết hợp rất tốt trong điều trị một số loại bệnh Trong thế giới tự nhiên tiềm ẩn rất nhiều loại thảo dược tưởng chừng vô năng nhưng lại có công dụng chữa bệnh rất hữu hiệu Hơn nữa điều trị bằng dược liệu chứa các hoạt chất tự nhiên hiện nay đang là một hướng đi tích cực được khuyến khích nghiên cứu và phát triển trong cộng đồng y học Việt Nam hiện nay cũng như trên thế giới vì khả năng chữa và điều trị bệnh ít gây tác dụng phụ cho cơ thể con người và chi phí nghiên cứu không quá lớn

Mặt khác, theo các tài liệu công bố hiện nay khoảng từ 70-80% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành trên thị trường hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên Tuy nhiên, phần lớn các dược phẩm hiện đang được lưu hành trong nước ta đều phải nhập khẩu do khả năng nghiên cứu cũng như cung cấp dược liệu cho ngành công nghiệp hoá dược nước ta còn rất hạn chế Trong khi đó tiềm năng về tài nguyên thiên nhiên của nước ta được đánh giá là phong phú vào loại bậc nhất thế giới Mặc dù, chúng ta đã có những thành công nhất định trong việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thuốc chữa bệnh, nhưng mới chỉ đáp ứng được chừng vài phần trăm nhu cầu Rõ ràng những kết quả đó chưa tương xứng với tiềm năng to lớn về tài nguyên thiên nhiên của nước ta Điển hình trong số đó có cây đu đủ là đại diện điển hình nhất

Đu đủ được xem là một cây đa dụng, rất hữu ích tại những quốc gia nghèo nên đã được nghiên cứu khá nhiều về các hoạt tính dược tính, giá trị dinh dưỡng và khả năng công nghiệp hóa tiềm năng sử dụng Cây rất dễ trồng vì có thể mọc từ hạt và thời gian cây cho hoa chỉ mất 4 đến 5 tháng (Đỗ Tất Lợi, 2004; Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

Dù đã được biết đến từ thời xa xưa nhưng đến nay, đu đủ chỉ đa phần được sử dụng trong điều trị dân gian Việt Nam chứ chưa có công trình nghiên cứu cụ thể trên

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

các bộ phận khác của cây trừ lá của cây điều này khác biệt rất lớn so với các nước phát triển trên thế giới khác Do đó, em tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng tách chiết hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate (BITC) từ

hạt của cây đu đủ Carica papaya L.” với mong muốn đóng góp một phần hiểu biết

về thành phần hóa học có trong hạt của cây đu đủ cũng như có thể tìm ra phương pháp tách chiết và phân lập phù hợp để có thể thu nhận hợp chất BITC với điều kiện hạn chế về mặt khoa học kỹ thuật như các nước phát triển trên thế giới

Vì hiện nay nước ta chỉ mới có thể chiết thành công hợp chất này thông qua cây Chùm ngây cũng như chưa có nghiên cứu khoa học nào trên đối tượng là hạt đu đủ Trong khi nó được xem là một phế phẩm bị loại bỏ trong đời sống của người dân thì theo nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tiềm năng rất lớn trong điều trị bệnh ở người (Srivastava và cs 2004; Lui, và cs, 2003; Kuroiwa và cs, 2006; Zhu và cs (2015); Rao, 2013;…)

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

PHẦN 1 TỔNG QUAN

Phân lập và định danh chính xác được hợp chất BITC qua sắc ký cột

Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất sau phân lập để khẳng định kết quả 1.1.2 Cách tiếp cận, phương pháp và phạm vi nghiên cứu

1.1.2.1 Cách tiếp cận

Đề tài tiếp cận các vấn đề nghiên cứu từ các góc độ sau:

Tiếp cận từ cơ sở kiến thức chuyên môn cũng như tổng quan về khả năng tách chiết hợp chất BITC từ các nghiên cứu trên thế giới

Tiếp cận từ thực tiễn, khảo sát đánh giá khả năng thu nhận được hợp chất BITC qua các thí nhiệm được tiến hành trong quá trình thực hiện đề tài

1.1.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện bằng một số phương pháp nghiên cứu truyền thống như: Phương pháp chiết và thu nhận các thành phần trích ly từ mẫu vật ban đầu (Phương pháp ngâm chiết cơ bản và phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn)

Phương pháp phân lập các thành phần trong cao chiết (Phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký cột)

Phương pháp định danh sản phẩm (Phương pháp phổ cộng từ hạt nhân)

Ngoài các phương pháp kể trên, đề tài có thể sử dụng thêm một số phương pháp khác nhằm phục vụ cho quá trình thực hiện đề tài

1.1.2.3 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi thời gian: Đề tài chỉ cho phép thực hiện theo khuôn khổ thời gian được cho phép từ phía nhà trường

Phạm vi tài chính: Đề tài chỉ thực hiện trên điều kiện được hỗ trợ tài chính từ phía nhà trường

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Dựa theo những dữ liệu được tổng hợp từ các nguồn sách như “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, 2006” và “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2007”, tổng hợp thành các thông tin chính như sau:

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật

Carica papaya L có chiều cao vào khoảng 2-4 m và có khi cao đến gần 7m

Cây thân thẳng và hiếm khi phân nhánh, trên thân cây có nhiều vết sẹo của cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le ở ngọn cây, có cuống lá rất dài, lá xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim đầu nhọn, mỗi thùy lá lại chia tiếp thành các thùy nhỏ hơn không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn

Hoa có màu vàng lục nhạt, mọc ở kẻ lá; Hoa đực và cái có thể cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực phân nhánh thành chùy xim, dài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm, cụm hoa cái có 2 đến 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hoi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu một ô, nhiều lá noãn

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Quả mọng to hình trứng ngược hoặc thuôn dài khoảng 20-30 cm, đường kính vào khoảng 15-20 cm Thịt quả dày có màu giống vỏ khi chín thường là vàng đến cam có khi cam đến đỏ, ruột trái chứa nhiều hạt có giống không hạt (giống lai mới ngày nay) có màu đen và bọc bên ngoài là màng bọc giúp chứa sinh chất bên trong, hình thái hạt gần giống với thông trần có lớp vảy sần đen bọc bên ngoài và phần noãn có màu ngà nằm bên trong

Hình 1.1 Đu đủ (Carica papaya L.)

Hình bên trái là hình cây chụp ngoài thực tế còn bên phải là hình phác họa chi tiết

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Hình 1.2 Cấu trúc của hoa đực (A), hoa cái (B) và hạt của đu đủ (C)

1.2.2 Phân loại khoa học

Giới (Kingdom): Thực vật – Plantae

Ngành chính (Superdivision): Thực vật có hạt – Spermatophyta Ngành (Division): Thực vật có hoa – Magnoliophyta

Lớp (Class): Thực vật song tử diệp – Magnoliopsida Họ (Family): Họ đu dủ - Caricaceae

Chi (Genus): Đu đủ - Carica L

Loài (Species): Đu đủ - Carica papaya L

1.2.3 Vị trí phân bố:

Loài Carica papaya L có nguồn gốc xuất phát từ vùng nhiệt đới châu Mĩ, được

tìm thấy ở độ cao từ 1500-3000 m từ Panama đến Bolivia, có giống cây đu đủ mọc

tự nhiên cho quả ăn được C pubescens Linné & Koch Giống cây đu đủ trồng hiện

nay có thể là giống lai tự nhiên của loài C peltata Hock & Ann

Cây được người Tây Ban Nha du nhập giống vào Đông Nam Á vào khoảng thế kỉ XVI, từ đây giống cây được du nhập tiếp và trồng ở nhiều nơi khác trên thế giới

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Ở Việt Nam, giống đu đủ đã được người dân trồng từ rất lâu và vẫn chưa thể xác định được thời gian mà giống cây du nhập là khi nào Đu đủ có rất nhiều giống, gần như việc trồng ở các vùng sinh thái khác nhau cho ra một giống loài mới

Đu đủ là loài cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là từ 21-33oC, lượng mưa hằng năm trên 1200 mm, cây sống thích hợp trên nhiều loại đất song không thể chịu ngập úng quá 20 giờ nên cần có biện pháp thoát nước nhanh

Cây không thể trồng ở độ cao trên 1500 m tại Việt Nam Đu đủ là loài cây sinh trưởng nhanh, cây trồng từ hạt sau 4-5 tháng là có thể ra hoa, hoa được côn trùng và gió thụ phấn nên sẽ dễ xuất hiện sự lai tạp càng về các thế hệ sau Đu đủ không chỉ được xem là giống cây ăn quả quan trọng ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới Ngoài ra cây đu đủ còn được trồng để lấy nhựa (mủ) cây ở một số quốc gia

trị tương tự Kết quả được tổng hợp lại trong Bảng 1.1 và 1.2 và những kết quả tô

vàng cho thấy sự nổi trội về các thành phần có trong cả 3 bộ phận cây đu đủ trên 5 kiểu hình quả và các kết qủa tô màu xanh cho thấy sự kém nổi trội tương ứng về các thành phần như số liệu đã công bố Kiểu hình cho thấy sự nổi trội về thành phần dưỡng chất thiết yếu như vitamin, protein thuộc về các kiểu hình như quả thuôn vỏ cam, quả thô vỏ cam và quả thuôn vỏ đỏ Còn đối với một số thành phần vi lượng ta có các kiểu hình như: thuôn dài vỏ đỏ và quả bầu vỏ cam cho kết quả trội hơn Các

Đối với ông cha ta xưa đến nay vẫn xem cây đu đủ là một vị thuốc dân gian vì hầu như các bộ phận cây đều có thể sử dụng để chữa một số bệnh về tiêu hóa, giúp vô trùng vết thương, hay hỗ trợ điều trị nhiễm sinh vật như giun, sán, kí sinh trùng trong cơ thể (Đỗ Huy Bích và cs, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004)

Bảng 1.1 Các thành phần quan trọng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu

hình quả đu đủ Carica papaya L.

Hình thái % Tro tàn

dư

% Béo

% Protein

% Chất xơ

% Ẩm

% Carbohydrate Bộ phận

cây Quả thuôn

Quả thô vỏ cam

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Quả thuôn dài vỏ

Bảng 1.2 Các thành phần khoáng có trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình

quả đu đủ Carica papaya L.

Hình thái

Canxi (Ca) mg/100g

Magie (Mg) mg/100g

Photpho (P) mg/100g

Sắt (Fe) mg/100g Bộ phận cây

Quả thuôn dài vỏ đỏ

1.2.6.1 Các hợp chất flavonoid đã được phân lập:

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

1.2.6.2 Các hợp chất phenolic đã được phân lập

1.2.6.3 Nhóm isothiocyanate và các hợp chất liên quan khác

25 Benzylglucosinolate 26 Benzyl isothiocyanate

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

1.2.6.4 Các nhóm alkaloid đã được phân lập

1.3 Tổng quan về Benzyl isothiocyanate (BITC)

Theo các thông tin trên thư viện dữ liệu về các hợp chất hóa học được ứng dụng

trong dược học và vật liệu hóa học PubChem Benzyl isothiocyanate (26) có tên đầy

đủ theo IUPAC là isothiocyanatomethylbenzene

BITC thuộc nhóm các hợp chất benzen và các dẫn xuất thay thế Đây là những hợp chất thơm chứa một hệ thống đơn vòng gồm benzen (PubChem Database; Kim và cs, 2018)

BITC là chất độc có tác dụng lên cả vi khuẩn, vi nấm và một số dòng tế bào của người (Barba và cs, 2016; Li và cs, 2014) nhưng chủ yếu những dòng tế bào sai chức năng và không có khả năng gây độc cho con người nhưng có thể gây kích ứng trên một số cơ quan như mắt (Eye Irrit 2A) và hệ hô hấp (STOT SE3) nếu tiếp xúc trực tiếp theo GHS Classification

SVTH: Võ Hữu Minh Đức 1.3.1 Tính chất hóa lý

Tỷ trọng vào khoảng 1.125 g/mL tại 25oC

Nhiệt độ sôi vào khoảng 241-242oC (PubChem) và nhiệt độ nóng chảy rất thấp vào khoảng 41-42oC (PubChem)

Phân tử khối vào khoảng 142.92 g/mol

1.3.1.2 Tính chất hóa học

BITC có thể tan trong một số dung môi hữu cơ như: Ethanol, Chloroform, DMSO Khi tồn tại trong dung môi sẽ tạo dung dịch có màu vàng nhạt, trong suốt theo LKT Laboratories và ChemSpider

BITC được hình thành do quá trình thủy phân xúc tác bởi enzyme myrosinase

có trên bề mặt hạt với tiền chất benzylglucosinolate có trong hạt (BG) (25) (Li và cs,

2014)

1.3.2 Hoạt tính sinh học

Là hợp chất có khả năng tác động kìm hãm với sinh vật (giun, sán, kí sinh trùng), vi sinh vật, vi nấm và đối với một số dòng tế bào sai chức năng ở người (Barba và cs, 2016; Habtemariam và cs, 2019)

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

1.3.3 Nghiên cứu ngoài nước

Theo Bennett và cs (1997) đã chứng minh hợp chất BITC là hợp chất isothiocyanate duy nhất hình thành trong cây đủ đủ

Theo Nakamura và cs (2007) chứng minh hạt đu đủ là nguồn chính sản sinh hợp chất BITC

Theo Rossetto và cs (2008) cho thấy hàm lượng benzylglucosinolate có mặt nhiều nhất là trong hạt của đu đủ và giảm dần ở các bộ phận khác của cây

Theo Li và cs (2014) đã tìm ra phương pháp chiết tối ưu để thu nhận hợp bằng các enzyme nội sinh trong hạt đu đủ

Theo Barroso và cs (2016) đã cô lập thành công hợp chất bằng chiết siêu tới hạn sử dụng CO2 từ dầu thu được từ việc nghiền hạt của đu đủ

Nghiên cứu về khả năng kháng nấm

Một số nghiên cứu đã cho thấy có thể phân lập từ các nguồn như vi sinh, thực vật cho thấy khả năng kháng một số loại nấm thường thấy trên cây ăn quả (Smolinska

và cs, 2003; Mari và cs, 1993; Manici, 1997) hay loài nấm Fusarium oxysporum

(Drobnica và cs, 1967) và một số nghiên cứu khác trên loài nấm trong đất (Smolinska và Horbowicz, 1999)

Nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn

Theo Dias và cộng sự (2014) đã cho thấy khả năng kháng khuẩn của nhóm hợp chất mang ion isothiocyanate từ một số cây họ cải đối với chủng MRSA (chủng

Staphylococcus aureus có khả năng kháng methicillin), chủng được cho là chủng

mạnh nhất hiện nay do có khả năng năng kháng hàng phong vệ cuối cùng của kháng sinh

Nghiên cứu về khả năng tác động đến một số dòng tế bào đột biến

1.3.4 Nghiên cứu trong nước

Hiện nay, chưa tìm thấy bất kì công bố nào đã tách chiết thành thành công hợp chất BITC trên các bất kì đối tượng nào cũng như khảo sát hoạt tính của hợp chất này trong điều trị lâm sàn có công bố trên các tạp chí và công bố khoa học ở Việt Nam

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp ngâm chiết cổ điển (ngâm dầm) và ngâm chiết có khuấy trộn

Theo Zang và cộng sự (2018) việc tách chiết các hợp chất sẽ trải quá trình gồm 4 giai đoạn: (1) dung môi sẽ được sử dụng để hoàn tan mẫu cần chiết, (2) các hợp chất tan vào dung môi, (3) các hợp chất tan tách khỏi mẫu chiết, (4) thu nhận dung môi chứa các hợp chất tan

Việc sử dụng dung môi nào để tách chiết khá quan trọng vì nếu trích ly các hợp chất có trong mẫu dược liệu bằng dung môi như EtOH hay MeOH sẽ cho dãy phân cực các hợp chiết được sẽ rộng hơn so với dùng một dung môi kém phân cực hơn

Ngoài ra, hiệu suất tách chiết còn bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác như kích thước mẫu, nhiệt độ, thời gian chiết,… Do đó, các phương pháp chiết sẽ có sự khác biệt với nhau giữa những yếu tố nêu trên Trong đó phương pháp ngâm dầm (Maceration) là một trong hai phương pháp dễ dàng sử dụng nhất trong các phương

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

pháp thường gặp dùng trích ly các hợp chất có trong mẫu dược liệu Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp đều rất dễ để có thể điều kiển và có thể sử dụng được đối với những phòng thí nghiệm thiếu điều kiện nhất

Do nhược điểm lớn nhất của phương pháp ngâm dầm là thời gian, vì phải mất 24h mới có thể thu kết quả Nên phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn bằng máy khuấy từ được xem là phương pháp sẽ giúp tăng hiệu suất chiết so với phương pháp ngâm dầm Tính nổi trội ở đây chính là sự gia tăng tiếp xúc của mẫu chiết và dung môi, điều này giúp thời gian chiết được giảm thiểu đáng kể (không cần mất đến 24h), và rút gọn thời gian nghiên cứu giai đoạn đầu

1.4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Phương pháp sắc kí bản mỏng hay sắc kí lớp mỏng (TLC) là phương pháp đơn giản và đa dụng, sử dụng trong việc xác định bước đầu các thành phần hợp chất có trong một mẫu thử tách chiết từ mẫu dược liệu và chứa nhiều thành phần hợp chất

Bằng việc sử dụng các pha động (mobile phase) thích hợp có sự chênh lệch về độ phân cực (từ kém phân cực đến phân cực nhất) của các hệ dung môi và pha tĩnh (stationary phase) sử dụng ở đây sử dụng là hạt silica gel 60 tráng lên bảng kính hay sử dụng bảng nhôm đã được tráng sẵn silica gel 60 để tiến hành khảo sát

Ta có thể quan sát được sự phân tách các vệt chất trên bảng mỏng bằng việc xác định chúng dưới tia UV-vis, sẽ là các vết màu đen ở bước sóng 254mn và vệt sáng có màu đối với bước sóng 365mn, hay cũng có thể nhận biết chúng bằng một số thuốc thử đa dụng như hơi Iod hay 10% sulfuric acid trong cồn hoặc một số loại thuốc thử đặc trưng riêng cho một số nhóm định chức

Để xác định sự phân tách hợp chất có tốt trên bảng mỏng hay không ta tính các

thông số Rf (Rate of flow) tốc độ lôi cuốn của dung môi hay khoảng cách giữa các vệt chất và Rs (Rate of separation), các tỉ lệ này được tính dưa theo khoảng di chuyển

của một chất trên bản mỏng như Hình 1.3

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Qua tác động của pha động sử dụng, các vệt chất sẽ được phân tách và hiện hình trên bảng mỏng giúp ta đo và tính toán khoảng cách di chuyển của chúng Kết

quả của hai thông số tính toán được và cho kết quả tốt nhất khi Rf có giá trị nằm trong

khoảng từ 0,25 đến 0.75 (Li và cs, 2014) hay khi dùng để tìm hệ giải ly tốt nhất cho sắc ký cột thì giá trị nên nằm trong khoảng từ 1/3 đến 2/3 của bảng (Nguyễn Kim Phi

Phụng, 2007) Còn đối với thông số Rs thì giá trị tốt nhất nên nằm quanh khoảng 0.5

(Li và cs, 2014) để khoảng cách giữa hai vệt chất phân tách là tốt nhất Công thức tính toán các thông số như sau:

Với chỉ số Rf: 𝑅𝑓 = 𝑎

𝑏 (Rf nằm trong khoảng từ 0.25 đến 0.75) Với chỉ số Rs: 𝑅𝑠 = 𝐼1

(𝐼1+ 𝐼2) (Rs nên dao động xung quanh 0.5)

Chú thích hình ảnh: Vết (A): vết chất BITC tinh Vết (B): Vết BITC chưa tinh

Vết (C): Vết chất khác tách được trong mẫu chưa tinh

(D): Vạch dung môi

a1: khoảng cách từ vạch xuất phát đến vết C

a2: khoảng cách từ vạch xuất phát đến vết BITC

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

1.4.3 Phương pháp sắc ký cột (CC)

Phương pháp sắc ký cột hay cụ thể là phương pháp sắc ký cột hở cổ điển (open Chromatography Column) là phương pháp dựa trên nền tảng của phương pháp TLC Nhưng đối với sắc ký cột, pha động sẽ được dựng thành một trình tự các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần được cho chạy liên tục thành dòng giúp hòa tan hợp chất trong mẫu cao sử dụng chạy sắc ký ra khỏi cột

Việc tìm hệ giải ly đầu trên cột là một điều vô cùng quan trọng nó giúp hạn chế tối đa những sai xót xảy ra trong quá trình chạy cột như: tụt cột hay các chất bị giữ lại trên cột khiến hiệu quả phân tách hợp chất kém Do đó, hệ giải ly đầu và trình tự các hệ giải ly sử dụng cho sắc ký cột phải được xây dựng trước khi thực hiện sắc kí cột và khảo sát bằng phương pháp TLC

Kích thước cột và loại pha tĩnh được lựa chọn sao cho phù hợp với mục đích phân tách các hợp chất:

Kích thước cột thường được lưu ý đầu tiên, vì đường kính và chiều dài cột càng giảm ta phân tách loại mẫu cao chiết càng tinh khiết

Chất sử dụng làm pha tĩnh chạy cột quan trọng nhất là cấu trúc hạt và kích thước hạt Kích thước mạng lưới hạt càng nhỏ sẽ cho các hợp chất có kích thước phân tử càng nhỏ ra khỏi cột trước tiên và tùy vào độ phân cực của hạt mà chất có độ phân cực ngược với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột trước nhất Ngày nay, pha tĩnh có nhiều loại như: aluminum oxide, silicagel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid và mỗi loại đều có có nhiều kích thước hay đường kính hạt khác nhau cũng như hạt có cấu trúc đặc biệt dùng đề phân tách và tinh sạch các hợp chất trên cột với mục đích khác nhau

1.4.4 Phương pháp định danh hợp chất

Để tiến hành định danh một hợp chất tinh thu nhận từ quá trình sắc ký cột ta đem mẫu thu được (lượng mẫu tối thiểu cần đạt 5mg, được loại dung môi và ẩm hoàn toàn) đi chạy các loại phổ như phổ cộng từ hạt nhân NMR (13C NMR và 1H NMR)

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Nếu hợp chất có các điểm tương đồng qua so sánh đối chiếu với các mũi cộng từ hạt nhân trên các tài liệu và thông tin đã được công bố ta sẽ khẳng định hợp chất ta phân lập được là hợp chất ta đã đối chiếu Đối với thông số phổ cộng từ hạt nhân của hợp

chất BITC đã được công bố và tổng hợp trong Bảng 1.3 như sau:

Bảng 1.3 Số liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất BITC

Vị trí C (*)

13C-NMR (**)(75,5Hz,

DMSO)

1H-NMR (**)(300Hz, DMSO)

13C-NMR (***)(CHCl3)

1H-NMR (****)(CDCl3) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm)

1 134.6 134.2 2 128.0

7.31–7.42 (5H, m)

126.7 3 128.5 128.8 4 127.0 128.10 5 128.5 128.8 6 128.0 126.7

7 47.9 4.91 (2H, s) 48.5 4.59 (2H, s) 8 129.2 126.7

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Đối với trường hợp, hợp chất phân tách không có điểm tương đồng với hợp chất cần tìm ta tiến hành so sánh nó với các hợp chất còn lại đã được công bố đã tách chiết thành công từ đối tượng nghiên cứu ban đầu Nếu tồn tại trường hợp, không có điểm tương đồng so với tất cả những hợp chất đã được ông bố ta tiến hành chạy thêm một số loại phổ khác như HSQC, HMQC hay IR để tiến hành định danh cấu trúc phân tử của hợp chất ta phân lập được và từ những yếu tố cấu thành phân tử đã được phân tích ta tổng hợp và xây dựng nên cấu trúc phân tử hoàn thiện của hợp chất ta cần xác định

Hình 1.4 Đánh dấu vị trí carbon trên công thức hợp chất BITC

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

n-Hexane (Xilong Co., Trung quốc) n-Butanol (Xilong Co., Trung quốc)

Silica gel 60 chạy cột (Đường kính hạt 0.063-0.200 mm, Merck) Silica gel 60 F254 chạy TLC (Merck)

2.1.3 Nguyên liệu

2.1.3.1 Đối tượng, thu thập và phạm vi thực hiện

Nghiên cứu trên đối tượng là hạt của giống cây đu đủ (Carica papaya L.) được

trồng tại tỉnh Đồng Tháp

SVTH: Võ Hữu Minh Đức

Nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi Trường trực thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ ngày 07/10/2019 đến ngày 07/08/2020

2.1.3.2 Xử lý nguyên liệu thô

Hạt đu đủ sau khi thu mua, được làm sạch bằng cách phá các màng bọc bao quanh phần hạt để loại bỏ phần dịch chất bên trong Hạt được rửa kĩ dưới dòng nước máy, sau đó được hong khô bằng quạt trần trong bóng râm (độ ẩm tồn còn khoảng 10%), cuối cùng đem xay để sử dụng để tiến hành thí nghiệm ở giai đoạn sau Nếu

hạt không sử dụng hết sẽ được bảo quản trong túi zip như Hình 2.1 để tránh hạt bị lại

ẩm và mốc

Hình 2.1 Hạt sau khi xay được bảo quản trong túi zip kín