Các nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính của cácpeptide thu được từ thủy phân da cá hồi cho thấychúng có khả năng chống ô xi hóa, khángkhuẩn, liên kết canxi.. Đây chính là cơ sở để chúng tôi
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN HÀ TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PEPTIDE MẠCH NGẮN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ PHỤ PHẨM CÁ HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM KIÊN CƯỜNG PGS.TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - Năm 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057204866331000000 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Nguyễn Hà Trung Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn 1: TS Phạm Kiên Cường Đơn vị : Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học công nghệ Quân Người hướng dẫn 2: PGS.TS Quản Lê Hà Đơn vị : Viện Công nghệ Sinh học & công nghệ thực phẩm/ĐH Bách Khoa HN Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi” Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, suốt trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Nguyễn Hà Trung LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Kiên Cường, Viện Công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Quân PGS.TS Quản Lê Hà, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình,hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Hóa sinh Cơng nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành anh, chi cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Nhân dịp tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Viện cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn Hà Trung MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan cá hồi Tổng quan Peptide có hoạt tính sinh học 2.1 Khái niệm chung Peptide 2.1.1 Cấu tạo chung Peptide 2.1.2 Tính chất hóa học peptide 2.2 Peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 2.2.1 Giới thiệu peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 2.2.2 Các hoạt tính sinh học peptide 2.4 Tổng quan trình thủy phân protein 13 2.4.1 Quá trình thủy phân 13 2.4.2 Các phương pháp thủy phân protein 14 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme 16 2.5 Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ nguồn thủy sản 18 2.5.1 Trên giới 18 2.5.2 Tại Việt Nam 21 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu hóa chất 24 2.2 Thiết bị 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Xác định thành phần hóa học phụ phẩm cá hồi 24 2.3.2 Phương pháp tách lipit khỏi phụ phẩm .26 2.3.3 Phương pháp thủy phân enzyme 27 2.3.4 Xác định hàm lượng amino acid ninhydrin .27 2.3.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa peptide 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) [51] 28 2.3.6 Xác định mức độ thủy phân 29 2.9 Phương pháp điện di gel Tricine-SDS-PAGE 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ 33 3.1 Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu phụ phẩm cá hồi dùng cho thu hồi peptide có hoạt tính sinh học 33 3.2 Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm protease thương mại để thủy phân giới hạn phụ phẩm cá hồi thu peptide sinh học 36 3.3 Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, tỷ lệ enzyme/cơ chất, chất hoạt hóa 40 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân 40 3.3.2 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu phản ứng thuỷ phân 41 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thuỷ phân 43 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian đến phản ứng thuỷ phân 44 3.4 Điều kiện thủy phân phụ phẩm cá hồi để thu nhận peptit mạch ngắn có hoạt tính chống oxy hóa .47 3.5 Quy trình thủy phân phụ phẩm cá hồi thu peptide có hoạt tính sinh học 49 3.6 Thử nghiệm tạo bột peptide phương pháp sấy phun 51 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy 51 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu 52 3.7 Xây dựng quy trình thu hồi peptide chức 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 Kết luận 56 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nghĩa từ viết tắt DHA Acid docosahexaenoic DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EPA Axit eicosapentaenoic OPA Ortho-phthalaldehyde SDS Sodium dodecyl sulfate PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cá hồi vân Việt Nam [50] Hình 1.3 Ảnh hưởng peptide chức đến hệ thống thể Hình 1.4 Quy trình tách xác định peptide chức từ nguồn protein thực phẩm [8] 23 Hình 2.1 Phản ứng tạo phức thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm amino (H2N=R) 29 Hình 3.1 Ảnh hưởng việc loại bỏ lipit trước thủy phân đến hiệu suất thủy phân phụ phẩm cá hồi 34 Hình 3.2 Hàm lượng lipit sản phẩm thủy phân với alcalase trypsin sau sấy khô 35 Hình 3.3 So sánh hiệu suất tách lipit từ phụ phẩm cá hồi phương pháp 36 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian thủy phân lên mức độ thủy phân phụ phẩm cá hồi số enzyme 38 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại enzyme protease lên hoạt tính chống oxy hóa 39 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến phản ứng thuỷ phân phụ phẩm cá hồi 41 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 41 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả thủy phân phụ phẩm cá hồi Alcalase Trypsin 42 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH mơi trường đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 42 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thủy phân phụ phẩm cá hồi enzyme 44 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng thời gian đến sản phẩm thủy phân phụ phẩm cá hồi enzyme 45 Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 45 Hình 3.14 Điện di kiểm tra dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi 49 Hình 3.15 Điện di dịch thủy phân sau lọc qua màng 30 kDa 10 kDa 51 Hình 3.16 Hệ thống sấy phun dịch peptide 53 Hình 3.17 Sản phẩm bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 53 Hình 3.18 Bột cháy dính vào thành thiết bị 53 Hình 3.19 Quy trình công nghệ sản xuất bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 55 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Thành phần EPA, DHA phụ phẩm cá hồi (g.100g-1 ) [47] Bảng 1.2: Thành phần amino acid từ da cá hồi [53] Bảng 2.1 : Hoạt tính sinh học số peptide từ phụ phẩm cá 21 Bảng 2.1: Phương pháp xác định thành phần hóa học nguyên liệu 24 Bảng 2.2 Giá trị số α, ß, htotal, protein từ vật liệu khác 30 Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamide 31 Bảng 2.4 Thành phần đệm chạy đệm gel Tricine-SDS-PAGE 32 Bảng 3.1 Thành phần hóa học phụ phẩm cá hồi đông lạnh 33 Bảng 3.2 Đánh giá kết thủy phân phụ phẩm cá hồi kết hợp trypsin alcalase 48 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy 52 Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu 52 MỞ ĐẦU Cá hồi có tên khoa học Salmonidae họ cá vây tia, đồng thời họ sống Salmoniformes (bộ cá hồi) Đầu năm 2005, 50.000 trứng điểm mắt nhập từ Phần Lan để thử nghiệm Trung tâm Nghiên cứu thủy sản nước lạnh Sa Pa-Lào Cai Kể từ cá hồi vân ấp, nở, ương nuôi thương phẩm thành công nhiều nơi nước năm qua (Lào Cai, Lai Châu, Lâm Đồng, ) (Báo cáo Viện Kinh tế Quy hoạch thủy sản., 2014) Theo phê duyệt: “Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020” Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn xác định mục tiêu là: Tổng sản lượng nuôi cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3.460 (cá tầm 2.012 tấn, cá hồi 1.448 tấn); đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 10.000 (cá tầm 7.287 tấn, cá hồi 2.713 tấn) Tập trung số vùng Đông Bắc, Tây Bắc, Bắc Trung duyên hải miền trung, Tây nguyên Trong trình chế biến cá, lượng lớn sản phẩm phụ (xương, da, vụn thịt,…) thường chế biến làm thức ăn cho tôm, cá, gia súc sử dụng cho sản phẩm có giá trị kinh tế thấp chế biến thành bột cá, dầu cá hay làm dầu diezel sinh học Phụ phẩm cá hồi chứa hàm lượng protein lớn có số ứng dụng như: chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm, tinh chế collagen, Chính việc chế biến, xử lý phụ phẩm cá hồi nhằm thu protein có giá trị thương mại cao đồng thời tránh vấn đề môi trường quan tâm nghiên cứu Trong đó, việc thủy phân enzym để thu hồi protein từ phụ phẩm cá cách tiếp cận hiệu ứng dụng rộng rãi [2-4] Nghiên cứu See tập thể (2011) sử dụng enzym thủy phân protein từ nguồn phụ phẩm từ cá hồi để tạo peptide amino acid có giá trị dinh dưỡng cao Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính peptide thu từ thủy phân da cá hồi cho thấy chúng có khả chống xi hóa, kháng khuẩn, liên kết canxi Hiện tại, chưa có cơng trình cơng bố Việt Nam nghiên cứu peptide sinh học phân tử thấp từ phụ phẩm cá hồi để sử dụng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm chức Đây sở để chúng tơi lựa chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi "