Nghiên ứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi

Các nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính của cácpeptide thu được từ thủy phân da cá hồi cho thấychúng có khả năng chống ô xi hóa, khángkhuẩn, liên kết canxi.. Đây chính là cơ sở để chúng tôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1

LỜI CAM ĐOAN Học viên: Nguyễn Hà Trung

Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn 1: TS Phạm Kiên Cường

Đơn vị : Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học công nghệ Quân sự

Người hướng dẫn 2: PGS.TS Quản Lê Hà

Đơn vị : Viện Công nghệ Sinh học & công nghệ thực phẩm/ĐH Bách Khoa HN

Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học

từ phụ phẩm cá hồi”

Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận văn được tôi trực tiếp thực hiện Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào

Học viên

Nguyễn Hà Trung

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Kiên Cường, Viện Công nghệ mới - Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự và PGS.TS Quản Lê Hà, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận tình,hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Trong thời gian thực tập và làm việc tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Hóa sinh - Công nghệ mới - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật cùng sự động viên chân thành của anh, chi cán bộ của phòng Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ mới - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên

giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên

Nguyễn Hà Trung

3

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC BẢNG BIỂU 8

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Tổng quan về cá hồi 3

2 Tổng quan về Peptide có hoạt tính sinh học 5

2.1 Khái niệm chung về Peptide 5

2.1.1 Cấu tạo chung của Peptide 5

2.1.2 Tính chất hóa học của peptide 5

2.2 Peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 6

2.2.1 Giới thiệu về peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 6

2.2.2 Các hoạt tính sinh học peptide 7

2.4 Tổng quan về quá trình thủy phân protein 13

2.4.1 Quá trình thủy phân 13

2.4.2 Các phương pháp thủy phân protein 14

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme 16

2.5 Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ nguồn thủy sản 18

2.5.1 Trên thế giới 18

2.5.2 Tại Việt Nam 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 24

2.2 Thiết bị 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Xác định thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi 24

2.3.2 Phương pháp tách lipit khỏi phụ phẩm 26

2.3.3 Phương pháp thủy phân bằng enzyme 27

2.3.4 Xác định hàm lượng amino acid bằng ninhydrin 27

2.3.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của peptide bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) [51] 28

2.3.6 Xác định mức độ thủy phân 29

2.9 Phương pháp điện di trên gel Tricine-SDS-PAGE 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 33

3.1 Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu phụ phẩm cá hồi dùng cho thu hồi peptide có hoạt tính sinh học 33

3.2 Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm protease thương mại để thủy phân giới hạn phụ phẩm cá hồi thu peptide sinh học 36

3.3 Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, tỷ lệ enzyme/cơ chất, chất hoạt hóa 40

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân 40

3.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả phản ứng thuỷ phân 41

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thuỷ phân 43

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thuỷ phân 44

3.4 Điều kiện thủy phân phụ phẩm cá hồi để thu nhận peptit mạch ngắn có hoạt tính chống oxy hóa 47

3.5 Quy trình thủy phân phụ phẩm cá hồi thu peptide có hoạt tính sinh học 49

3.6 Thử nghiệm tạo bột peptide bằng phương pháp sấy phun 51

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy 51

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu 52

3.7 Xây dựng quy trình thu hồi peptide chức năng 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

1 Kết luận 56

2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Nghĩa của từ viết tắt

DHA Acid docosahexaenoic DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EPA Axit eicosapentaenoic OPA Ortho-phthalaldehyde SDS

PAGE

Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cá hồi vân ở Việt Nam [50] 4

Hình 1.3 Ảnh hưởng của peptide chức năng đến các hệ thống trên cơ thể 8

Hình 1.4 Quy trình tách và xác định các peptide chức năng từ nguồn protein thực phẩm [8] 23Hình 2.1 Phản ứng tạo phức của thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm amino (H2N=R) 29Hình 3.1 Ảnh hưởng của việc loại bỏ lipit trước thủy phân đến hiệu suất thủy phân phụ phẩm cá hồi 34Hình 3.2 Hàm lượng lipit trong sản phẩm thủy phân với alcalase và trypsin sau khi sấy khô 35Hình 3.3 So sánh hiệu suất tách lipit từ phụ phẩm cá hồi bằng 2 phương pháp 36Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian thủy phân lên mức độ thủy phân phụ phẩm cá hồi bởi một số enzyme 38Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại enzyme protease lên hoạt tính chống oxy hóa 39Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng thuỷ phân phụ phẩm cá hồi 41Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt tính quét gốc tự do DPPH của dịch thủy phân 41Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng thủy phân phụ phẩm cá hồi của Alcalase và Trypsin 42Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính quét gốc tự do DPPH của dịch thủy phân 42Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân phụ phẩm cá hồi bằng enzyme 44Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự do DPPH của dịch thủy phân 44

7

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian đến sản phẩm thủy phân phụ phẩm cá hồi bằng

enzyme 45

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự do DPPH của dịch thủy phân 45

Hình 3.14 Điện di kiểm tra dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi 49

Hình 3.15 Điện di dịch thủy phân sau khi lọc qua màng 30 kDa và 10 kDa 51

Hình 3.16 Hệ thống sấy phun dịch peptide 53

Hình 3.17 Sản phẩm bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 53

Hình 3.18 Bột cháy dính vào thành thiết bị 53

Hình 3.19 Quy trình công nghệ sản xuất bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 55

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Thành phần EPA, DHA trong phụ phẩm cá hồi (g.100g-1) [47] 3

Bảng 1.2: Thành phần amino acid từ da cá hồi [53] 4

Bảng 2.1 : Hoạt tính sinh học của một số peptide từ phụ phẩm cá 21

Bảng 2.1: Phương pháp xác định thành phần hóa học của nguyên liệu 24

Bảng 2.2 Giá trị các hằng số α, ß, htotal, của protein từ các vật liệu khác nhau 30

Bảng 2.3 Thành phần bản gel polyacrylamide 31

Bảng 2.4 Thành phần đệm chạy và đệm gel của Tricine-SDS-PAGE 32

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi đông lạnh 33

Bảng 3.2 Đánh giá kết quả thủy phân phụ phẩm cá hồi kết hợp trypsin và alcalase 48

Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy 52

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu 52

MỞ ĐẦU

Cá hồi có tên khoa học là Salmonidae là một họ cá vây tia, đồng thời là họ duy nhất sống trong bộ Salmoniformes (bộ cá hồi) Đầu năm 2005, 50.000 trứng điểm mắt

được nhập từ Phần Lan để thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu thủy sản nước lạnh

Sa Pa-Lào Cai Kể từ đó cá hồi vân đã được ấp, nở, ương và nuôi thương phẩm thành công tại nhiều nơi trong cả nước trong những năm qua (Lào Cai, Lai Châu, Lâm Đồng, ) (Báo cáo của Viện Kinh tế và Quy hoạch thủy sản., 2014) Theo phê duyệt:

“Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020” của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã xác định mục tiêu là: Tổng sản lượng nuôi cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3.460 tấn (cá tầm 2.012 tấn, cá hồi 1.448 tấn); đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 10.000 tấn (cá tầm 7.287 tấn, cá hồi 2.713 tấn) Tập trung ở một số vùng Đông Bắc, Tây Bắc, Bắc Trung bộ và duyên hải miền trung, Tây nguyên

Trong quá trình chế biến cá, một lượng lớncác sản phẩm phụ (xương, da, vụn thịt,…)thường được chế biến làm thức ăn cho tôm, cá,gia súc hoặc sử dụng cho các sản phẩm có giátrị kinh tế thấp như chế biến thành bột cá, dầucá hay làm dầu diezel sinh học Phụ phẩm cáhồi cũng chứa một hàm lượng protein lớn và cómột số ứng dụng như: chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm, tinh chế collagen, Chính vì vậy việc chế biến, xử lý các phụ phẩm cá hồi nhằmthu được protein có giá trị thương mại cao hơn đồng thời tránh các vấn đề về môi trường đangđược quan tâm nghiên cứu Trong đó, việc thủyphân bằng enzym để thu hồi protein từ phụphẩm cá là một cách tiếp cận hiệu quả và đượcứng dụng rộng rãi [2-4].Nghiên cứu của See và tập thể (2011) đã sử dụng enzym thủy phân protein từ nguồn phụphẩm từ cá hồi để tạo ra các peptide và các amino acid có giá trị dinh dưỡng cao Các nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính của cácpeptide thu được từ thủy phân da cá hồi cho thấychúng có khả năng chống ô xi hóa, khángkhuẩn, liên kết canxi

Hiện tại, chưa có công trình nào công bố ở Việt Nam nghiên cứu về peptide sinh học phân tử thấp từ phụ phẩm cá hồi để sử dụng làm nguyên liệu chế biến thực

phẩm chức năng Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn đề tài "Nghiên cứu thu

nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi "

Nội dung chính bao gồm:

- Nghiên cứu xử lý nguyên liệu phụ phẩm cá hồi để thu hồi peptide có hoạt tính sinh học;

- Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm protease thương mại để thủy phân giới hạn phụ phẩm cá hồi thu peptide sinh học;

- Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzyme/cơ chất);

- Xây dựng quy trình thu hồi peptide chức năng từ phụ phẩm cá hồi;

- Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ tới quá trình sấy sản phẩm peptide sinh học (nhiệt độ sấy, tốc độ và áp suất phun);

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tổng quan về cá hồi

Cá hồi có tên khoa học là Salmonidae là một họ cá vây tia, thuộc bộ

Salmoniformes (bộ cá hồi) Trong thiên nhiên, cá hồi là một loài thủy sản xứ lạnh,

được sinh đẻ trong môi trường nước ngọt nhưng hầu hết quãng đời còn lại chúng lại sống trong môi trường nước mặn, sau khi đã trưởng thành chúng trở về môi trường nước ngọt để duy trì nòi giống [50]

Cá hồi là nguồn cung cấp Omega-3 dồi dào cho con người Omega-3 bao gồm EPA (axit eicosapentaenoic), DHA (axit docosahexaenoic) có vai trò quan trọng trong sự phát triển của mô thần kinh, mô mắt đặc biệt cho sự phát triển của trẻ sơ sinh

và trẻ nhỏ, đồng thời cũng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, viêm, trầm cảm và các bệnh mãn tính khác Kết quả phân tích dinh dưỡng xác nhận cá hồi Scotland chứa hàm lượng EPA và DHA trung bình là 1,92 ± 0,47 g.100g-1, còn phi lê cá hồi Đại Tây Dương cung cấp 1,36 g.100g-1 EPA + DHA [47]

Bảng 1.1: Thành phần EPA, DHA trong phụ phẩm cá hồi (g.100g -1 ) [47]

Bên cạnh đó cá hồi còn chứa rất nhiều chất có lợi cho sức khỏe như các vitamin

A, D, B; các nguyên tố vi chất thiết yếu như iốt, selen, sắt, kẽm, canxi, phốt pho, kali

và giàu amino acid (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Thành phần amino acid từ da cá hồi [53]

Amino acid mol/100 mol amino axit Amino acid mol/100 mol amino axit

Hydroxypoline 6,5 ± 0,4 Isoleucine 1,1 ± 0,4 Axit aspartic 5,6 ± 0.3 Leucine 2,1 ± 0,1

* Hiện trạng của cá hồi tại Việt Nam

Hình 1.1: Cá hồi vân ở Việt Nam [50]

Ở Việt Nam, cá hồi được ươm, nuôi ở Sapa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng), Lạng Sơn, Bắc Giang và một số địa phương khác Theo “Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020, tầm nhìn 2030” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ước tính tổng sản lượng cá hồi đến năm 2015 đạt 1448 tấn, đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 2713 tấn đáp ứng 70-80% nhu cầu tiêu dùng Và tới năm 2030, sản

lượng cá nước lạnh đáp ứng 100% nhu cầu tiêu dùng trong nước và một số sản phẩm được xuất khẩu [50]

2 Tổng quan về Peptide có hoạt tính sinh học

2.1 Khái niệm chung về Peptide

2.1.1 Cấu tạo chung của Peptide

Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino acid liên kết với nhau, có khối lượng phân tử thường dưới 10.000 Dalton Chúng có thể được tổng hợp trong tự nhiên hoặc được hình thành do quá trình thủy phân protein Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có vai trò khá quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể [29]

2.1.2 Tính chất hóa học của peptide

Peptide có tính chất hóa lý không khác nhiều so với amino acid vì đều chứa nhóm –NH2 và nhóm –COOH tự do Sự sai khác chủ yếu là do R của gốc amino acid tham gia trong chuỗi peptide Chính sự khác nhau giữa các mạch bên R, khác về số lượng và loại amino acid trong peptide làm cho điểm đẳng điện, khối lượng cũng khác nhau [29]

Peptide tham gia các phản ứng đặc trưng của nhóm –NH2 và nhóm –COOH

- Tính lưỡng tính

H2N-R-COOH + H+ H3N + -R-COOH

H2N-R-COOH + OH- H2N-R-COO- + H2O

- Tạo phức chất với este

H2N-R-COOH + R-OH H2N-R-COOR+ H2O

Sản phẩm tạo ra ở dạng muối, lấy sản phẩm cho tác dụng với ammoniac để tái tạo nhóm chức amin (-NH2)

- Phản ứng màu đặc trưng

Ngoài phản ứng của nhóm –NH2 và -COOH đầu tận cùng, các gốc R của peptide cũng cho những phản ứng màu đặc trưng của các amino acid tự do tương ứng Một trong những phản ứng màu đặc trưng nhất cho liên kết peptide đó là phản ứng Biure, phản ứng này không xảy ra với amino acid tự do Trong môi trường kiềm

mạnh, liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím đỏ và có khả năng hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm Đây là phản ứng được sử dụng rộng rãi để định lượng protein [29]

2.2 Peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học

2.2.1 Giới thiệu về peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học

Nhưng trong 20 năm trở lại đây, xu hướng nghiên cứu về các loại peptide có nguồn gốc thực phẩm ngày càng được gia tăng, đặc biệt là các peptide từ các nguồn protein có trong sữa [39] Từ năm 1950, các peptide sinh học từ nguồn thực phẩm đã được tìm ra bởi Mellander Ông phát hiện ra rằng peptide có nguồn gốc từ casein từ sữa có thể làm tăng khả năng hấp thụ Vitamin D mà không ảnh hưởng tới sự vôi hóa xương ở trẻ em bị bệnh còi xương [33] Các peptide có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm khác nhau như sữa, thịt và thực vật, và các protein

từ các nguồn này là những nguồn nguyên liệu có tiềm năng lớn để thu được các loại peptide có hoạt tính sinh học Tuy nhiên chỉ có một vài sản phẩm thực phẩm từ thịt hoặc thủy sản có thể thu được peptide có hoạt tính sinh học có tính thương mại [24] Các peptide có hoạt tính sinh học thu được có nhiều chức năng sinh lý khác nhau như chống oxy hóa, chống vi khuẩn, làm tiền chất, chống huyết khối và điều hòa miễn dịch, trong đó thì hoạt tính chống cao huyết áp đã được nghiên cứu và công bố rộng rãi nhất, đặc biệt là các peptide có khả năng ức chế ACE [8] Đã có một số sản phẩm thương mại chứa peptide có hoạt tính sinh học được đưa ra thị trường như Calpis (từ Nhật Bản) và Evolus (từ Phần Lan), cả 2 đều có nguồn gốc từ các protein lên men sữa

Các peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học hay các peptide chức năng ngoài các giá trị về dinh dưỡng còn bổ sung thêm các chức năng sinh lý cho cơ thể [54] Các peptide chức năng không hoạt động hoặc ở dạng tiềm ẩn, được giải phóng ra khỏi chuỗi protein mẹ (thủy phân bằng enzyme, được giải phóng trong quá trình tiêu hóa

và trong quá trình chế biến thực phẩm) để có thể chuyển sang dạng hoạt động và từ

đó tạo ảnh hưởng sinh lý đến cơ thể [24]

Có hai yếu tố quyết định quá trình giải phóng peptide chức năng: chuỗi protein ban đầu và độ đặc hiệu của một hay nhiều enzyme được sử dụng để tạo ra peptide [19] Kích cỡ của các peptide chức năng thường là khoảng 2-20 amino acid, nhưng nhiều loại nhiều hơn 20 amino acid cũng đã được tìm thấy Các peptide chức năng có thể được hấp thụ bởi ruột và được vận chuyển nguyên vẹn trong hệ tuần hoàn, tại đây chúng sẽ thể hiện tác dụng sinh lý, hoặc chúng có thể ở trong đường tiêu hoá để tạo

ra các hiệu quả cục bộ [14]

Các peptide chức năng đã được phát hiện trong nhiều loại thực phẩm từ nguồn thực vật, nấm và vi tảo, sữa, pho mát, trứng, cá, thủy sản, thịt lợn và thịt bò, nguồn thực vật như lúa mì, gạo và hạt khoai lang, từ nấm như men bia [39] Các chức năng sinh học có ảnh hưởng đến các hệ thống khác nhau trong cơ thể (xem hình 1.2) Hơn nữa, một số peptide chức năng có thể có đặc tính đa chức năng, trong đó các trình tự peptide cụ thể có thể có hai hoặc nhiều hoạt tính sinh học khác nhau [19]

Hình 1.2 Ảnh hưởng của peptide có hoạt tính sinh học đến cơ thể người

2.2.2 Các hoạt tính sinh học peptide

Các hoạt tính sinh học của peptide mạch ngắn được khái quát ở sơ đồ sau:

Hình 1.3 Ảnh hưởng của peptide chức năng đến các hệ thống trên cơ thể 2.2.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Oxi hóa là phản ứng cần thiết cho quá trình hô hấp và trao đổi chất của mọi cơ thể sống, trong đó electron được chuyển từ chất khử sang chất oxi hóa có khả năng tạo thành các gốc tự do (O2-, -OH, H2O2) Khi các gốc tự do được sản xuất vượt quá ngưỡng và không được loại bỏ, chúng có thể tấn công các phân tử gần nhất bằng cách lấy đi các electron dẫn đến một phân tử không có điện tử tấn công các phân tử khác, gây nên hàng loạt các phản ứng dây truyền tấn công lipit ở màng tế bào, protein, DNA nhiều rối loạn sức khỏe nghiêm trọng [13] Quá trình oxi hóa là nguyên nhân dẫn tới nhiều căn bệnh khác nhau

Hoạt tính chống oxi hoá của peptide có liên quan đến thành phần, cấu trúc, tính kỵ nước và khả năng trì hoãn, ngăn chặn các quá trình oxi hóa từ sự cho điện tử

và sự ổn định của gốc tự do mà vẫn còn trong cấu trúc của chất chống oxi hóa hơn là trong phản ứng Chúng có thể tìm thấy trong các nguồn động vật và thực vật, như sữa, sản phẩm từ sữa, trứng, cá, hàu, ngũ cốc (lúa, lúa mạch, kiều mạch, lúa mạch và bắp), đậu nành, hạt củ cải và các nguồn giàu protein khác [36, 45]

Hoạt tính sinh học của peptide

Hoạt tính opioid

và kháng opioid

Hoạt tính liên kết canxi

Chống oxy hóa

Hạ huyết áp Chống huyết khối

Hạ colesterol

Hạ lipid

Hệ cơ quan của cơ thể được tác động

Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh việc thủy phân các protein từ cá thu nhận được nhiều peptide có giá trị, trong đó một số peptide chống oxi hóa đã được tách chiết và xác định trình tự sau đó đánh giá hoạt tính chống oxi hóa qua khả năng quét gốc tự do DPPH Năm 2012, Amissah [5] đã đánh giá hoạt tính của các peptide được thủy phân từ da cá hồi cho thấy chúng có khả năng chống oxi hóa, kháng khuẩn

và đặc tính ức chế protease Kết quả hiệu quả loại bỏ các gốc tự do của sản phẩm peptide đạt 58,3% khi thủy phân bằng trypsin, đạt 26,3% khi thủy phân với α-chymotrypsin và khả năng loại bỏ gốc tự do đạt 55,9% khi thủy phân da cá hồi bằng papain

Ahn và cộng sự (2014) báo cáo rằng peptide FLNEFLHV (1018,48 Da) có hoạt tính chống oxi hóa tốt với giá trị IC50 là 1,63mg/ml thu nhận từ vây ngực cá hồi [2] Peptide LTPCGAH (861,6 Da) trong nghiên cứu của Kim 2007 cũng có khả năng chống oxi hóa tương tự Đo hoạt tính chống oxi hóa của peptide này qua khả năng quét gốc tự do DPPH là 84,5 ± 1,2% Ngoài ra chúng còn ức chế thành công quá trình oxi hóa lipit, tổn thương DNA, cải thiện khả năng chống oxi hóa các loại tế bào khác nhau của cơ thể [26]

Peptide VKAGFAWTANQQLS (1.519 Da) được tách chiết từ xương sống cá ngừ có hoạt tính ức chế các chất chống oxi hóa, loại bỏ DPPH lên đến 60% Bên cạnh đánh giá in vitro, nhóm còn nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của peptide thu được lên sợi cơ người và kết quả cho thấy peptide này không có tác động gây độc đối với

tế bào nguyên sợi phổi MRC-5 và tế bào nội mô ECV304 [34]

2.2.2.2 Hoạt tính liên kết canxi

Canxi là một yếu tố cần thiết cho nhiều chức năng trong cơ thể như cấu tạo nên hệ khung xương, duy trì tính ổn định của các quá trình sinh lý trong cơ thể Canxi liên tục được giải phóng và tồn trữ trong xương thông qua hoạt động của tế bào tạo xương Nguồn canxi ngoại bào có vai trò quan trọng đối với các kích thích thần kinh trong cơ bắp, canxi nội bào cần thiết cho hoạt động của actin và myosin trong quá trình co cơ Ngoài ra canxi cũng cần thiết cho quá trình đông máu, đặc biệt

là quá trình biến đổi fibrinogen và prothrombin thành fibrin và thrombin

Một số nghiên cứu (in vitro và in vivo) cho thấy các peptide phân tử lượng nhỏ từ thủy sản có khả năng tăng cường hòa tan các hợp chất chứa canxi và thúc đẩy

sự hấp thụ canxi Các peptide có hoạt tính liên kết canxi thường chứa từ 3 đến 20 amino acid có khả năng tạo phức với canxi sau khi được phosphoryl hóa Hoạt tính liên kết canxi của các peptide phụ thuộc vào trình tự amino acid và hàm lượng của chúng trong mẫu thử nghiệm Các peptide này có thể thu nhận được từ nhiều nguồn thủy sản khác nhau như xương cá hoki, xương cá Alaska pollack, phế phẩm tôm Nghiên cứu in vitro đã tiến hành đánh giá khả năng liên kết canxi của peptide dựa trên khả năng chúng làm tăng tính hòa tan canxi trong dung dịch Dung dịch peptide (nồng độ 250 mg/l) được thu nhận từ thủy phân xương cá hoki (Johnius belengerii)

có khả năng liên kết canxi với hàm lượng 41,1 mg Ca2+/l dịch thủy phân Trong khi

đó, dung dịch chứa peptide (nồng độ 250 mg/l) thu nhận từ thủy phân xương sống cá Alaska pollack có khả năng liên kết với là 32 mg Ca2+/l dịch thủy phân [25, 26]

Nghiên cứu của Jung W.K và cộng sự (2005) cũng cho thấy các peptide từ cá còn có khả năng thúc đẩy sự hấp thụ canxi Việc tăng cường khả năng liên kết các khoáng chất như canxi làm các peptide dễ dàng được hấp thu trong đường ruột Trong nghiên cứu này, các phosphopeptide được tách chiết từ cá hoki chứa 23,6% phospho

có khối lượng phân tử 3,5 kDa có khả năng liên kết với canxi mà không tạo kết tủa canxi phosphat Hơn nữa pH của hệ phản ứng được duy trì ở mức 7,8, tại pH thấp có thể làm tăng độ hòa tan của muối canxi không hòa tan Do đó, các peptide từ cá có tiềm năng ứng dụng tạo ra sản phẩm dinh dưỡng với khả năng liên kết với canxi cao [28]

2.2.2.3 Hoạt tính chống stress và tăng sức đề kháng

Một số các peptide có tính chất tương tự như morphine, chúng có thể tác động lên hệ thần kinh được gọi là opioid peptide/opiate peptide (gồm 4-8 amino acid) Khả năng liên kết của chúng với thụ thể opioid trong hệ thần kinh trung ương cũng như nhiều mô ngoại vi liên quan đến một số chức năng sinh lý như điều chỉnh chức năng thần kinh trung ương (xử lý stress, trầm cảm), kiểm soát chức năng dạ dày, ruột, kiểm soát chức năng miễn dịch, kiểm soát cơ chế sinh sản [44] Bằng cách thay đổi các

tính chất điện của các nơron đích của chúng, làm cho các nơron này khó kích động hơn, các opioid peptide có thể ảnh hưởng đến sự giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau vì thế các peptide opioid có thể gây ra giảm đau và phấn khởi, điều hòa hành vi cư xử, tạo cảm giác dễ ngủ Cấu trúc các opioit peptide thường có gốc tyrosine ở đầu N và có các gốc amino acid chứa vòng thơm (như tyrosine, phenylalanine), trình tự chủ yếu là chứa các chuỗi amino acid Tyr-X-Phe hay Tyr-

X1-X2-Phe ở đầu C, cấu trúc như vậy giúp peptide dễ dàng kết hợp với các thụ cảm

Sản phẩm thủy phân từ cá tuyết và cá thu được phát hiện là có khả năng giảm

lo lắng ở người, cải thiện khả năng học tập và trí nhớ Bernet và cộng sự (2000) ghi nhận tác dụng giảm stress của sản phẩm thủy phân cá tuyết có tác dụng tương tự như thuốc diazepam-1- một loại thuốc an thần đáp ứng với căng thẳng ở tuyến thượng thận của chuột [9]

2.2.2.4 Peptide có hoạt tính chống ung thư

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách

vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn)

Phân chia tế bào (tăng sinh) là quá trình sinh lý xảy ra trong những điều kiện nhất định ở hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật đa bào Bình thường sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào được điều h a một cách chặt chẽ để đảm bảo cho tính toàn vẹn của cơ quan và mô Khi các tế bào xảy

ra những đột biến trong DNA, chúng có thể phá vỡ cơ chế điều khiển này và dẫn đến ung thư

Hiện nay có khoảng 200 loại ung thư Ngày nay, phương pháp điều trị ung thư

có các bước tiến bộ đáng kể, bệnh nhân được điều trị bằng hóa chất hoặc vật lý trị liệu Tuy nhiên, quá trình điều trị thường xảy ra hiện tượng kháng thuốc do có hiện tượng hàm lượng enzyme tăng trong tế bào giải độc cho quá trình chống ung thư, ngăn không cho quá trình vận chuyển thuốc điều trị chống lại khối u Những nghiên cứu gần đây đã lựa chọn peptide chức năng thay thế cho phương pháp điều trị thông thường Tuy nhiên, không phải peptide chức năng nào cũng có hoạt tính chống ung

thư Năm 2008, Hoskin và Ramamoorthy đã phân loại peptide có hoạt tính chống ung thư thành hai nhóm chính: peptide có hoạt tính chọn lọc và peptide có hoạt tính không chọn lọc (có khả năng tấn công cả vi khuẩn, tế bào gây ung thư, tế bào khỏe mạnh) Các peptide có hoạt tính chống ung thư được tìm thấy ở nấm men, nọc rắn, cua, trong protein sữa và vi khuẩn…[21]

2.2.2.5 Các hoạt tính sinh học khác

a Peptide miễn dịch

Các đáp ứng miễn dịch với những peptide tổng hợp tạo nên một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng Từ các nghiên cứu này, các loại huyết thanh antipeptide được tạo ra như những chất thử mạnh mẽ trong việc phát hiện và xác định thuộc tính của protein

b Peptide độc

Thành phần quan trọng của nọc rắn là các chất độc thần kinh dạng polypeptide như là cobrotoxin, một chất độc chết người bởi khả năng làm tê liệt hệ thần kinh cơ Những peptide của nấm amanita như các loại antamanide nằm trong số các chất độc được biết đến nhiều nhất Ngoài ra còn có một số loại peptide độc được tách chiết từ các sinh vật biển cũng đang được nghiên cứu trong thập niên gần đây

c Peptide thần kinh

Có khoảng 50 peptide loại này đã được biết cấu trúc phân tử Một vài peptide gây nghiện nội sinh [endorphins, enkephalins, dynorphins, dermorphins, deltorphins, dermorphin gene associated peptide (DGAD)] đã được nghiên cứu khá kĩ lưỡng

Enkephalins (có nghĩa là tách chiết từ não), hai pentapeptides PheMet/Leu) đã được tìm thấy với hàm lượng lớn trong các vùng của hệ thống thần kinh Một lượng tương đối lớn các dạng tương đồng của những peptide này cũng đã được tổng hợp để xác định vai trò của chúng trong việc truyền tải cảm giác đau

(Tyr-Gly-Gly-d Peptide Leukotrienne

Những peptide loại này gây ra sự co thắt các cơ trơn ở phế quản và chúng còn thực hiện vai trò quan trọng như một chất trung gian trong phản ứng dị ứng và viêm nhiễm

2.4 Tổng quan về quá trình thủy phân protein

2.4.1 Quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương (dipositive bond) trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn giản dưới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của yếu tố nước trong phản ứng [32]

Cơ chất của quá trình thủy phân là tập hợp những hợp chất cao phân tử và chứa đựng liên kết nhị dương như: tinh bột, protein, xenluloza, pectin, glucoza và một số hợp chất hữu cơ như lipit, ATP,…các chất này thường là các thành phần cấu tạo của nguyên liệu

Sơ đồ quá trình thủy phân protein:

Xúc tác Xúc tác Xúc tác

Protein Polypeptide Peptide Amino acid

Quá trình thủy phân protein là quá trình phân cắt mạch peptide tại các liên kết peptid qua các dạng trung gian như pepton, polypeptide, peptide và cuối cùng là amino acid theo phản ứng sau:

Như vậy sản phẩm thủy phân của protein là bao gồm các pepton, polypeptid, peptid và các amino acid

Trong hầu hết các amino acid thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-α amino acid Vị của acid amin phụ thuộc vào cấu trúc không gian, Dạng L có vị đắng, dạng D- có vị ngọt, còn amino acid có gốc R mạch vòng có cả vị đắng và vị ngọt Cường độ vị phụ thuộc vào giá trị “ngưỡng nồng độ”, là nồng độ thấp nhất để

có thể cảm nhận sự có mặt của amino acid Ngưỡng này lại phụ thuộc vào tính kỵ nước của gốc R trong phân tử amino acid L-tryptophan và L-tyrosine có vị đắng nhất L-glutamic acid ở nồng độ cao có vị ngọt của thịt, ở nồng độ thấp là chất tăng

2.4.2 Các phương pháp thủy phân protein

* Thủy phân bằng acid

Trong sản xuất thường dùng HCl ngoài ra có thể dùng H2SO4 Acid phân ly càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng nhanh Acid clohydric (HCl) có hoạt

độ lớn nhất nên được sử dụng phổ biến nhất, ngoài ra sau khi thủy phân phản ứng trung hoà tạo thành NaCl có lợi cho sản phẩm thực phẩm Phương pháp này là dùng acid HCL 6N dư thừa ở nhiệt độ 100-120oC trong khoảng 24 giờ Sản phẩm thu được

chủ yếu là các acid amin tự do dưới dạng hydrogenclorate Một số amino acid như serine và threonine bị phá huỷ một phần, tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, glutamine

và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+

* Thuỷ phân bằng kiềm

Người ta cũng có thể thu nhận các amino acid bằng phương pháp thuỷ phân với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ Sản phẩm thu được hầu hết là các amino acid nhưng đều bị racemic hóa, các amino acid cysteine, serine và treonine bị phá huỷ nhưng tryptophan không bị phá huỷ Vì vậy, phương pháp thuỷ phân bằng

kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan [44]

* Thuỷ phân bằng enzyme

Để thu nhận chế phẩm acid amin ngày nay việc thuỷ phân bằng enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau bởi sử

dụng enzyme có nhiều ưu điểm là không có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ thấp nên ít ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, ít tốn năng lượng

Do mỗi loại enzyme có tính đặc hiệu riêng nên vị trí liên kết peptid bị cắt mạch

là tùy vào loại enzyme protease Protease được phân chia thành hai loại là endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, mà exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm như sau:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm – OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN (bacterial protease Nagase) Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid) [44]

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với

sự tăng của nhiệt độ Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme Kết quả này phụ

thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc từng sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme Ở nhiệt độ

thấp hơn 10oC sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme nhưng nếu thấp quá thì

enzyme sẽ mất hoạt động Nhiệt độ từ 60oC trở lên đa số enzyme sẽ giảm hoặc

ngừng hoạt động Đa số enzyme mất hoạt tính xúc tác ở nhiệt độ cao hơn 80oC, trừ

Papain, Myokinase có thể tồn tại ở 100oC Nhiệt độ thích hợp của enzyme thông

thường từ 30 – 50oC [52]

* Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Như vậy enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất

ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích pH tối thích của mỗi enzyme không cố định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ

* Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme

Khi môi trường có đầy đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với lượng enzyme Khi nồng độ cơ chất thấp, không đủ để lôi kéo tất cả lượng enzyme vào

phản ứng thì tốc độ phản ứng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng

đạt tối đa khi tất cả enzyme đều kết hợp vào cơ chất

* Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm enzyme

Những chất nào có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme thì được gọi là chất hoạt hóa enzyme Các chất đó thường là các ion kim loại như: K+, Na+,

Mg2+, Ca2+, Co2+, Zn2+, Mn2+,… Sự hoạt động của các enzyme đều có thể bị kìm hãm bởi các tác động gây biến tính protein

Đối với muối ăn (NaCl) khi cho vào hỗn hợp thủy phân thì sẽ làm thay đổi hoạt độ của nước (aw), dẫn đến ảnh hưởng hoạt động sống của vi sinh vật Vì vậy trong thủy phân người ta thường dùng NaCl để khống chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa Do khả năng chịu muối của enzyme thủy phân tốt hơn vi sinh vật cho nên trong phạm vi độ mặn nhất định enzyme vẫn có tác dụng thủy phân protein, thậm chí trong môi trường muối bão hòa enzyme vẫn hoạt động được nhưng tác dụng thủy phân rất chậm [32]

* Ảnh hưởng của tỷ lệ nước

Nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn

là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa Nước không những có ảnh hưởng đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Việc bổ sung thêm nước là tạo môi trường lỏng giúp cho enzyme hoạt động được dễ dàng, làm tăng khả năng thủy phân Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa Lượng nước bổ sung vào cho quá trình thủy phân là tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu

* Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân, thời gian thuỷ phân càng dài thì protease càng có điều kiện thuỷ phân cơ chất càng triệt

để Nhưng nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ dẫn tới vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra càng nhiều các sản phẩm thứ cấp như: NH3, H2S, CO2, … Nhưng nếu thời gian thủy phân rút ngắn, sự thuỷ phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân

kém, gây lãng phí nguyên liệu Thường thì trong thời gian đầu tốc độ của quá trình thủy phân xảy ra mạnh, càng về sau do nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản phẩm tạo thành tăng, đồng thời do độ bền của enzyme giảm theo thời gian nên tốc

độ của phản ứng thủy phân giảm dần

* Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Trong quá trình thủy phân yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc Để tạo điều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzyme là làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước

cơ chất trước khi thủy phân

Dịch sau khi thủy phân và bất hoạt enzyme sẽ được tinh sạch Tinh sạch là quá trình thu nhận các phân đoạn peptide mong muốn cũng như loại bỏ các thành phần tạp như béo, khoáng, cặn không tan

2.5 Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ nguồn thủy sản

Peizhi Lian và cộng sự, (2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp trực giao quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme Flavourzyme 1000 MG và Protamex Nghiên cứu cho thấy hàm lượng acid amin tự do sau thủy phân đạt 24,8%

so với 8,2% so với mẫu đối chứng Sản phẩm thu được có kết quả tốt nhất ở 50oC sau

6 giờ thủy phân [31]

Năm 2003, Bjørn Liaset và cộng sự đã nghiên cứu thủy phân phế liệu (phần xương sau khi phi lê tách thịt) cá hồi bằng enzyme Protamex ở điều kiện nhiệt độ

55oC, pH tự nhiên là 6,5, nồng độ enzyme là 11,1 AU/kg protein thô với tỷ lệ phế

liệu/nước là 1,14 Sau 6 giờ thủy phân, kết quả thu được hỗn hợp thủy phân giàu các acid amin thiết yếu và acid béo [10]

Taniguchi (Nhật Bản) năm 2003, đã bổ sung các enzyme thủy phân protein là:

protease A, aroase, và papain W40 hoặc nội tạng cá vào thịt cá hồi Oncohynchus keta

để sản xuất nước mắm chất lượng cao Bên cạnh đó, người ta còn so sánh chúng với mẫu thủy phân lên men theo kiểu truyền thống Kết quả nhận thấy, các mẫu nước mắm có sự khác nhau về tốc độ thủy phân protein và sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào loại enzyme protease bổ sung vào cá Hàm lượng nitơ tổng số và lượng nitơ amin cũng như tốc độ amin hóa ở mẫu nước mắm bổ sung cao hơn mẫu không bổ sung enzyme [3]

Năm 2004, Suthasinee Nilsang và cộng sự ở trường đại học Mahidol – Thái Lan đã dùng 2 loại enzyme protease là Flavourzyme 1000L và Kojizyme 800L bổ sung để thủy phân dịch thải từ qui trình cá ngừ đóng hộp để sản xuất dịch đạm Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu khi sử dụng Flavourzyme 1000L bổ sung vào thủy phân là ở nhiệt độ 45oC, nồng độ enzyme là 50 LAPU/g protein (5%), nồng

độ cơ chất 20% (w/w) ở tại pH tự nhiên của nguyên liệu (5,9-6,0), thời gian thủy phân

6 giờ thì DH đạt 62% Đối với Kojizyme 800L, điều kiện tối ưu là ở nhiệt độ 50oC, nồng độ enzyme là 40 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w) ở tại pH tự nhiên của nguyên liệu (5,9-6,0), thời gian thủy phân 6 giờ thì DH đạt 68% [48]

Hariono (Singapore) năm 2005 cũng đã nghiên cứu bổ sung Koij và enzyme

protease tách chiết từ nấm Aspergillus oryzae vào phế thải chế biến cá ngừ (bao gồm:

ruột và phủ tạng cá) để sản xuất nước mắm nhằm nâng cao giá trị của cá ngừ và giảm

ô nhiễm môi trường Phản ứng được duy trì nhiệt độ ủở 35oC với 1% protease, 25% Koij Việc sử dụng protease làm rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm xuống (2,5 tháng) so với nước mắm sản xuất theo công nghệ truyền thống (1-2 năm) đồng thời nước mắm thu được có chất lượng đạm cao hơn, năng suất hơn

Một số nghiên cứu trên thế giới đã thủy phân phụ phẩm cá hồi thu nhận peptide

có hoạt tính sinh học thành công như năm 2011, nghiên cứu của See và tập thể (See 2011) đã sử dụng enzyme Alcalase 2.4 L để thủy phân protein từ da cá hồi nhằm thu

nhận peptide và các amino acid Phản ứng thủy phân với điều kiện 55,3oC, pH 8,39,

tỷ lệ enzyme là 2,5%, mức độ thủy phân cao nhất đạt 77,03% [43]

Năm 2012 Amissah đã thu hồi peptide có hoạt tính sinh học từ da cá hồi bằng phương pháp thủy phân enzyme Hệ enzyme được sử dụng trong quá trình thu nhận peptide này như: trypsin, papain hoặc chymotrypsin Phản ứng thủy phân tại pH 8 hoặc 6 trong 4 giờ Hỗn hợp được khuấy trong bể ổn nhiệt 370C, tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,1% (khối lượng/khối lượng) [5]

Năm 2013 Girgih và tập thể đã thủy phân cá hồi với enzyme pepsin, 10000 unit enzyme/g protein cá, hỗn hợp được ủ ở 37oC qua đêm sau đó tiếp tục thủy phân hỗn hợp với trypsin và chymotrypsin (1:1) với 1000 unit enzyme/mg protein cá ở

37oC trong 4 giờ Dịch thủy phân sau khi lọc tiếp tuyến qua màng 1kDa được phân tách bằng kỹ thuật HPLC đảo pha thành các phân đoạn khác nhau Kết quả đánh giá hoạt tính các phân đoạn đều có khả năng chống oxi hóa Các trình tự peptide AH, EL, FIKK, FL, GGE, IKK, MY, PEL từ da, FLNEFLHV từ vây ngực cá hồi đã được tìm thấy và xác định có hoạt tính chống oxi hóa [2, 15, 46]

Sáu enzyme alcalase, flavourzyme, neutrase, pepsin, protamex, trypsin được

sử dụng thủy phân phụ phẩm cá hồi trong nghiên cứu của Ahn và cộng sự 2014 (Ahn

C B 2014) Tỷ lệ enzyme/cơ chất 1% (khối lượng/ khối lượng) được sử dụng, phản ứng thủy phân trong 8 giờ pH tối ưu đối với alcalase, flavourzyme, neutrase, protamex, trypsin là 7,0 và 2,0 với pepsin Nhiệt độ phản ứng 37°C với trypsin và pepsin, và 50oC đối với alcalase, flavourzyme, neutrase, protamex

Bảng 2.1 : Hoạt tính sinh học của một số peptide từ phụ phẩm cá

Cá hoki Xương

sống

Chống oxi hóa ESTVPERTHPACPDFN Kim, S Y

2007 Liên kết canxi VLSGGTTMYASLYAE

Liên kết canxi VLSGGTTMAMYTLV Jung, W K

2006

2.5.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng protease, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, ứng dụng … Một số công trình nghiên cứu về protease tại Việt Nam như:

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex G-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp ở 500C, 600C và pH thích hợp tương ứng là 8,5 và 7,5 Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm trong thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [30]

Đỗ Văn Ninh (2004), nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá và gan mực cho thấy enzyme thu được là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ hoạt động thích hợp là 50 – 550C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân ứng dụng sản xuất các sản phẩm thủy phân từ cá cũng như bột đạm để ứng dụng trong các lĩnh vực khác [35]

Vũ Ngọc Bội (2004), nghiên cứu về protease B subtilis S5 cho thấy có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường nuôi cấy B subtilis S5 theo phương pháp bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng

cách dùng ethanol để gây kết tủa Protease thu được có nhiệt độ hoạt động thích hợp

là 550C và pH thích hợp là 6 Protease có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cá tạp

để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn

ngày [11]

Năm 2009, GS.TS Phan Văn Chi – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam đã nghiên cứu đề tài khảo sát, xác định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics Đề tài đã khảo sát, xác định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics Trên cơ sở các kết quả khảo sát, lựa chọn 1-2 peptide/protein có hoạt tính giảm đau thần kinh (conotoxin) để thiết kế biểu hiện Nghiên cứu các đặc tính và khả năng ứng dụng của 1-2 loại conotoxin tái tổ hợp

Năm 2012, Nguyễn Thị Mỹ Hương đã nghiên cứu quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng protease thương mại (hình 1.3) Sản phẩm thủy phân protein đã được sản xuất từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0,5% ở nhiệt độ 45oC và pH tự nhiên trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1:1 Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tăng lên cùng với sự tăng thời gian thủy phân Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đã đạt được 30,1% và tỉ lệ thu hồi nitơ là 85,1% Sản phẩm thủy phân protein này có hàm lượng axít amin không thay thế cao và có thể được sử dụng trong sản xuất thức ăn cho người và động vật [22]

Hình 1.4 Quy trình tách và xác định các peptide chức năng từ nguồn protein thực

phẩm [8]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

Phụ phẩm trong quá trình chế biến cá hồi như: vụn thịt, da được thu mua bảo quản lạnh từ Sapa (Lào Cai), vận chuyển về phòng thí nghiệm Phụ phẩm cá hồi được rửa sạch, cắt nhỏ kích thước khoảng 1x1 cm, sau đó xay nhuyễn chia thành nhiều phần đều nhau cho mỗi lần thí nghiệm Mẫu được bảo quản lạnh -20oC cho đến khi

sử dụng

Các hoá chất Alcalase 2.4L, Trypsin của Novozymes, axit L-glutamic, pyridine, butylated hydroxyanisole (BHA), thang chuẩn protein 1,1–diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) và một số hóa chất khác của hãng Sigma (Mỹ), Mecrk (Đức), Thermo Scientific (Đức)

2.2 Thiết bị

Các thiết bị chính bao gồm tủ ấm của hãng Memmert (Đức), máy khuấy từ gia nhiệt của hãng Cole Palmer (Mỹ), máy vortex (Mỹ), máy đo pH S220-K của hãng Mettler Tolero (Thụy Sĩ), máy lắc Bigbill của hãng Thermolyne (Mỹ), máy quang phổ UV-VIS Halo RB-10 của hãng Dynamica (Thụy Sĩ), thiết bị điện di đứng của hãng Thermo Scientific (Mỹ), máy short spin của hãng Hermle (Mỹ), máy ly tâm lạnh của hãng Orto lresa (Tây Ban Nha), hệ thống lọc tiếp tuyến AKTA flux của hãng

GE Healthcare (Úc), hệ thống lọc tiếp tuyến AKTA flux của hãng GE Healthcare (Thụy Điển), hệ thống gia nhiệt có cánh khuấy dung tích 100L (Đức), hệ thống sấy phun APS Anhydro A/S (Đan Mạch), máy vắt ly tâm 20L/mẻ (Việt Nam)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi

Các thành phần hóa học như độ ẩm, hàm lượng protein và lipit của phụ phẩm

cá hồi được xác định theo các phương pháp như trong Bảng 2.1

Bảng 2.1: Phương pháp xác định thành phần hóa học của nguyên liệu

Hàm lượng protein tổng số Phương pháp Kjeldahl

Hàm lượng lipit Phương pháp Soxhlet

Độ ẩm: được đánh giá bằng phương pháp sấy khô ở 105oC cho đến khi có khối lượng không đổi

- Cân mẫu trước khi sấy

20g mẫu được làm sạch có kích thước, hình dáng tùy ý(độ chính xác lên đến 0,01g)

- Sấy mẫu

Mẫu được sấy ở 105oC cho đến khi khối lượng của nó không đổi Sau khi sấy được 6 giờ, mẫu được lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng rồi đem cân (Khối lượng của mẫu được coi là không đổi khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp cách nhau 6 giờ có độ chênh lệch không lớn hơn 0,1 %)

- Cân mẫu thử sau khi sấy

Sau khi sấy xong, các mẫu được làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng Mẫu được cân ngay sau khi lấy ra khỏi bình hút ẩm với độ chính xác đến 0,01 g (m0)

Độ ẩm của phụ phẩm tính theo % khối lượng, xác định theo công thức:

Độ ẩm =   

 × 100 (%) Trong đó: m1: khối lượng của mẫu trước khi sấy (g)

m0: khối lượng của mẫu sau khi sấy (g)

Hàm lượng protein :được xác định bằng phương pháp Kjeldahl

1g phụ phẩm cá hồi, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4), 10ml H2SO4 đậm đặc được cho vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ, thu được dung dịch trong suốt không màu Hỗn hợp trong bình Kjeldahl được chuyển sang bình định mức 500ml, thêm 10-15ml NaOH 40% và vài giọt phenolphtalein, sau đó thêm nước cất đến 300ml Ở bình hứng NH3 cho thêm 10ml axit Boric, lắp bình vào hệ thống, đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch axit Boric Quá trình cất được thực hiện đến khi dung dịch trong bình hứng đạt 150 ml, thấy dung dịch trong bình hấp thụ chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh, kiểm tra nước chảy ra từ ống sinh hàn bằng quỳ tím thấy quỳ không đổi màu thì dừng, tháo bình hấp thụ ra Dung dịch trong bình được chuẩn

độ bằng H2SO4 0,1N

Hàm lượng protein được tính theo công thức:

0,0014*(VH2SO4- V’H2SO4)*100*6,25

m

Hàm lượng lipit: được xác định bằng phương pháp Soxhlet

5g phụ phẩm cá hồiđược nghiền nhỏ, gói bằng giấy cho vào tháp trích ly của máy Soxhlet Lắp bình cầu vào máy sau khi đã sấy khô Rót dung môi CCl4 vào bình qua cổ sinh hàn đến 2/3 thể tích bình Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh

Trích ly lipit: Đun từ từ dung môi trong bình cầu bằng bếp điện, trong 1 giờ thực hiện được 5-6 chu trình Dung môi sôi, bay hơi gặp lạnh ngưng tụ ở tháp trích

ly đồng thời dung môi sẽ trích ly lipit, đến khi dung môi trong tháp trích ly vượt quá đầu ống xiphông sẽ tràn về bình cầu kéo theo lipit Nhỏ vài giọt dung môi ngưng tụ

ra giấy lọc không thấy vết của chất béo, quá trình chiết kết thúc

Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc, cất, thu hồi dung môi trong tháp Chuyển lipit trong bình cầu sang cốc thủy tinh Sấy ở nhiệt độ 100-1050C trong

1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm, cân, sấy tiếp trong 30 phút, sấy đến trọng lượng sai lệch nhau không quá 0,002gam

Công thức tính hàm lượng lipit trong phụ phẩm cá hồi:

Hàm lượng lipit =   

Trong đó: m1: Khối lượng cốc và lipt trước khi sấy (g)

m2: Khối lượng cốc và lipit sau khi sấy (g) g: Khối lượng mẫu ban đầu (g)

2.3.2 Phương pháp tách lipit khỏi phụ phẩm

Trước khi thủy phân, phụ phẩm cá hồi đã xay nhỏ, rã đông ở nhiệt độ phòng

sẽ được xử lý loại bỏ lipit theo 2 cách:

- Tách lipit bằng gia nhiệt [5]: Phụ phẩm cá hồi xay nhỏ được bổ sung theo tỷ

lệ 1:1 (khối lượng/thể tích), hỗn hợp được lắc đều với tốc độ 200 vòng/phút Tiếp theo hỗn hợp được gia nhiệt 95oC trong 1 giờ sau đó hạ nhiệt độ hỗn hợp về nhiệt độ phòng Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 10 000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC để phân lớp lipit Loại bỏ lipit, hỗn hợp phụ phẩm được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp