Phân lập và tuyển họn các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học nhằm tạo chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN DŨNG SỸ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057204937001000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN DŨNG SỸ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG NUÔI TÔM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS KHUẤT HỮU THANH Hà Nội – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, luận văn kết nghiên cứu làm việc tôi, nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực, rõ ràng Nếu có vấn đề xảy tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, tháng năm 2018 Tác giả luận văn Trần Dũng Sỹ i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa học thạc sĩ kỹ thuật chun ngành cơng nghệ sinh học mình, trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Khuất Hữu Thanh - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tin tưởng, tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Trong thời gian học tập trường xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên Trần Dũng Sỹ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni tơm thực trạng xử lý mơi trường nuôi tôm 1.1.1 Tình hình ni tơm Thế giới Việt Nam 1.1.2 Thực trạng giải pháp xử lý môi trường nuôi tôm 1.2 Thực trạng nghiên cứu sử dụng biện pháp sinh học nuôi tôm Thế giới Việt Nam 14 1.2.1 Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật nuôi trồng thủy sản giới 14 1.2.2 Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật nuôi tôm nước lợ Việt Nam 16 1.3 Chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản 17 1.3.1 Định nghĩa chế phẩm sinh học 17 1.3.2 Các loại chế phẩm sinh học có hoạt tính sinh học 18 1.3.3 Một số yếu tố công nghệ tạo chế phẩm sinh học 20 1.3.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 21 1.3.3.2 Quá trình lên men vi sinh vật 23 1.3.3.3 Chất mang chế phẩm sinh học 24 1.3.3.4 Kỹ thuật sấy chế phẩm sinh học probiotic 25 1.3.4 Các nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng tạo chế phẩm sinh học 27 1.3.4.1 Vi khuẩn lactic 28 1.3.4.2 Vi khuẩn Bacillus 30 1.3.4.3 Vi khuẩn Nitrosomonas Nitrobacter 31 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.2 Hóa chất – môi trường 32 iii 2.2.1 Môi trường nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic 32 2.2.2 Môi trường nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus 32 2.2.3 Môi trường nhân giống chủng vi khuẩn phân hủy hợp chất chứa nitơ 32 2.3 Thiết bị 33 2.4 Phương pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt tính cao 33 2.4.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật phân hủy nitơ 34 2.4.3 Định tên chủng vi khuẩn kỹ thuật phân tử 35 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối 35 2.4.5 Xác định khả sinh trưởng số mật độ quang – OD 620 36 2.4.6 Phương pháp tạo chế phẩm sinh học 36 2.4.7 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện sấy chế phẩm 36 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học 37 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt tính cao 37 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính cao 40 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân hủy hợp chất nitơ 43 3.2 Định tên đến loài chủng vi sinh vật tuyển chọn 46 3.2.1 Định tên đến loài chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 46 3.2.2 Định tên đến loài chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 47 3.2.3 Định tên đến loài chủng vi khuẩn phân hủy hợp chất chứa nitơ tuyển chọn 47 3.3 Nghiên cứu điều kiện lên men (nhiệt độ, pH, oxy, dinh dưỡng) sản xuất chế phẩm sinh học quy mơ thí nghiệm 48 3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp nhân giống chủng vi khuẩn lactic 48 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus 50 iv 3.3.3 Nghiên cứu điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp nhân giống chủng vi khuẩn phân hủy nitơ 52 3.4 Nghiên cứu xác định yếu tố kỹ thuật thu hồi bảo quản chế phẩm vi sinh 54 3.4.1 Thu sinh khối thiết bị ly tâm liên tục 54 3.4.2 Nghiên cứu lựa chọn chất mang để tạo chế phẩm vi sinh 55 3.4.3 Ảnh hưởng kỹ thuật sấy đến chất lượng chế phẩm vi sinh 56 3.4.4 Kiểm tra số lượng tế bào sống sót chế phẩm sau bảo quản 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 67 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC VIẾT TẮT BOD (Biochemical oxygen demand) Nhu cầu oxy sinh học COD (Chemical Oxygen Demand) Nhu cầu oxy hóa học CMC Cacboxyl methyl cellulose CFU (Colony forming unit) Đơn vị khuẩn lạc DO (Demand oxygen) Nồng độ oxy hòa tan ĐC Đối chứng FOS Fructooligosaccharides MOS Mannan oligosaccharides MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường dinh dưỡng MRS NB (Nutrien Broth) Môi trường dinh dưỡng lỏng PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng khuếch đại gen USD Đô la Mỹ CPSH Chế phẩm sinh học NTTS Nuôi trồng thủy sản vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dự báo tình hình nuôi tôm giới Bảng 1.2 Các thơng số thích hợp cho nuôi tôm nước lợ 11 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu bao gồm: .33 Bảng 3.1 Hoạt tính enzym số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 38 Bảng 3.2 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh tôm chủng VK thuộc chi Bacillus 39 Bảng 3.3 Một số chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính enzym cao 41 Bảng 3.4 Khả đối kháng số chủng vi khuẩn gây bệnh tôm chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 42 Bảng 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn nitrit hóa 43 Bảng 3.6 Khả nitrat hóa chủng vi sinh vật 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic .48 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic .50 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Bacillus 51 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Bacillus 52 Bảng 3.11 Lượng tế bào sót sau ly tâm tốc độ khác 55 Bảng 3.12 Ảnh hưởng thành phần chất mang đến khả sống sót tế bào chế phẩm sau sấy .56 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến khả sống sót tế bào chế phẩm sau sấy .57 Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian sấy đến khả sống sót tế bào chế phẩm vi khuẩn lactic sau sấy 58 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thời gian sấy đến khả sống sót tế bào chế phẩm vi khuẩn Bacillus 59 Bảng 3.16 Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh sau bảo quản .60 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sản lượng khai thác nuôi trồng thủy sản Việt Nam từ 1995-2016 Hình 1.2 Diện tích ni tơm bị thiệt hại số tỉnh thành năm 2011 13 Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn kí hiệu DB 06 37 Hình 3.2 Hoạt tính protease số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 38 Hình 3.3 Hoạt tính Cellulose số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 39 Hình 3.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng Bacillus 40 Hình 3.5 Khả đối kháng V parahaemolyticus số chủng VK lactic 42 Hình 3.6 Khả nitrit hoá chủng vi sinh vật phân lập phản ứng màu với thuốc thử Griess 44 Hình 3.7 Hoạt tính nitrit hố chủng vi sinh vật DN1-DN8 44 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA 46 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng DW5 52 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng VK DN1 53 viii