Nghiên cứu khả năng chiết xuất benzyl isothiocyanate hoạt tính sinh học từ hạt cây đu đủ

Phương pháp nghiên cứu

Thực hiện bằng cách: cân chính xác 10g nguyên liệu đã xay cho vào bình cầu đáy bằng 250ml và chai thủy tinh miệng nhám dung tích 500ml, tiếp đến cho các tỉ lệ dung môi tương ứng với lượng mẫu cần khảo sát tương ứng cho từng đợt thí nghiệm. Để kiểm chứng rằng, hợp chất BITC có nhiệt độ nóng chảy thấp vào khoảng 42oC và điểm sôi khoảng 241oC thì khi thu nhận cao thô bằng phương pháp cô quay hay phương pháp chưng cất thu hồi dung môi có sử dụng nhiệt có khiến cho hợp chất này bị phân hủy trong quá trình thu cao. Cho các dịch chiết tương ứng bởi các tỉ lệ mẫu/ dung môi tương ứng vào từng becher 250 mL riêng biệt và tiến hành loại dung môi bằng hai hướng: (1) để bay hơi trực tiếp ở nhiệt độ phòng; (2) đem loại dung môi bằng bếp cách thủy với mức nhiệt được cài đặt là 95oC (tức cao hơn nhiệt độ sôi của Ethanol là 78.37°C).

Trong quá trình đun loại dung môi, dùng nhiệt kế ghi nhận nhiệt độ không đổi của dịch chiết (điểm sôi là điểm trong suốt quá trình thu cao nhiệt độ tại đó không đổi và sẽ phải luôn thấp hơn nhiệt độ ta cài đặt trên bếp cách thủy thì kết quả mới được chấp nhận). Do qua kết quả khảo sát, ta có thể đánh giá một số thông tin cần thiết cho quá trình cô lập các hợp chất sau này khả năng tạo cao tinh chế tinh loại một số thành phần ta không monh muốn chiết trên cột, lựa chọn dung môi cho sắc ký. Cao thô thử nghiệm được cân một lượng vào khoảng 0,1-0,2g cho vào các ống nghiệm và cho 5 mL các dung môi có thể chuẩn bị được tương ứng vào vật đựng mẫu, các vật chứa sao đó được lắc nhẹ tay khoảng từ 10-20 lần và thu nhận trạng thái hòa tan của cao chiết với từng loại dung môi.

Tiến hành chọn cột để chạy sắc ký (phòng thí nghiệm chỉ có loại có đường kính 1,5cm), chọn pha tĩnh (phòng thí nghiệm chỉ có pha tĩnh là silicagel 60) và cân với tỉ lệ tối thiểu là gấp mười lần đường kính cột (tương đương 15g Silacagel 60). Để định danh chính xác nhất, kết quả có được sẽ được tiến hành so sánh và đối chiếu với lại cơ sở dữ liệu đã được công bố trên thế giới (đối với hợp chất đã được tách chiết, định danh và có công bố khoa học) trong Bảng 1.3; Nếu là trường hợp tách chiết chất mới phải tiến hành chạy nhiều loại phổ NMR khác nhau như 1H- NMRvà 13C NMR hay phổ HSQC, HMBC, IR… để có thể định danh chính xác hợp chất đã phân tách được.

Quá trình chiết xuất và thu cao thô .1. Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu

Trong đó tại sự tương quan nhau giữa phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn và tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:75 và 10:100 cho giá trị hiệu suất cao nhất và không khác biệt có ý nghĩa với nhau cũng như khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 % qua phép thử Duncan đối với những sự tương quan còn lại. Do đó nếu ta sử dụng tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:75 hay 10:100 và tiến hành chiết bằng phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn trong 6h sẽ cho hiệu suất cao nhất đối với phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn. Trong đó tại sự tương quan nhau giữa thời gian ngâm chiết và tỉ lệ mẫu/ dung môi là 10:100 trong 4h và 10:100 trong 6h cho giá trị hiệu suất cao nhất và không khác biệt có ý nghĩa với nhau cũng như khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 % qua phép thử Duncan đối với những sự tương quan còn lại.

Do tính chất của hai thí nghiệm khác nhau (có tác động và không tác động nhiệt) nên tiến hành chấm so vết phân tách chất trên bản mỏng được thực hiện để khảo sát phương pháp cô cao bằng nhiệt có làm mất đi một số phân đoạn chất trong quá trình cô thu cao hay không. Qua kết quả thu được ở Bảng 3.5 hiệu suất thu hồi cao không có sự khác biệt sai số quá 0,1g giữa các lần lặp của thí nghiệm và hiệu suất cũng không lệch nhau quá 0.1 % giữa hai phương pháp thu cao. Nên nếu phương pháp thu cao có sử dụng nhiệt được chứng minh có khả năng sử dụng để thu cao chiết thì ta có thể sử dụng điểm sôi của dung môi ethanol làm nhiệt độ cài đặt cho máy cô quay hay bộ chưng cất thu hồi dung môi.

Để có cái nhìn khách quan hơn về khả năng sử dụng nhiệt để thu cao, ta dựa vào kết quả chấm bản mỏng như Hình 3.1 và 3.3, có thể thấy không có sự khác biệt nhất định qua trực quang mà mắt quan sát được đối với các vệt phân tách chất trên bảng mỏng. Nhưng để biết kết quả chính xác nhất về sự thay đổi về thành phần trong cao chiết cũng như sự có mặt của BITC có bị phân hủy trong quá trình thu cao hay không, ta cần phải bổ sung thêm phương pháp LC-MS để biết chính xác sự thay đồi giữa hai kết quả.

Quá trình phân lập các thành phần có trong cao thô

Qua kết quả Hình 3.2 và Bảng 3.6 cho ta thấy tại ngưỡng nhiệt độ sôi không đổi tại 82±1oC, điểm sôi dung môi thay đổi (so với điểm sôi của ethanol) chiều hướng tăng lên. Vì nó giúp ta thu hồi lại được một phần lượng dung môi sử dụng trích ly, điều này giúp giảm gánh nặng kinh tế của đề tài. Ngoài ra nếu có hợp chất có điểm sôi nằm trong khoảng này (không cần thiết) sẽ được loại bỏ qua dạng hơi.

Do có có thể đánh giá rằng sơ bộ rằng có thể sử dụng nhiệt để thu hồi cao qua kết quả khảo sát. Do điều kiện thời gian không cho phép mà đề tài không thể cho thấy kết quả khảo sát này.

Tan Cao tan không hoàn toàn vẫn có một số thành phần không tan nổi trên

Qua khảo sát, ta có thể ứng dụng kết quả để tiến hành tinh sạch cao thô và thu cao tinh chế bằng cách loại các thành phân không phân cực bằng n-Hexane trước sau đó hòa tan phần cao còn lại trong dung môi như ethanol hay chloroform ta sẽ thu được cao tinh sạch hơn. Hệ sử dụng trong phương pháp của Li và cộng sự, 2014 không cho kết quả khả quan (vệt kéo nhiều, không có vết tách đẹp) trong việc phân tách hợp chất cao thô ethanol của khóa luận, điều này xảy ra một phần là cho có lẽ phương pháp trích ly của hợp chất của hai thí nghiệm là khác nhau ngoài ra hệ chỉ dùng cho khảo sát chất đã tinh khiết với mẫu chuẩn chứ không dùng để chạy sắc ký cột. Qua kết khảo sát hệ bằng phương pháp TLC, ta sắp xếp lại trình tự hệ giải ly và lựa chọn hệ giải ly đầu phù hợp cho sắc ký cột sao cho thỏa điều kiện đặt ra là vệt chất đầu tiên có Rf nằm trong khoảng dưới 2/3 bảng và hệ giải ly dùng giải ly cuối cùng trên cột nên là methanol để có thể giải rửa các chất còn lại trong cao và trong cột ra khỏi cột sau khi xác định dừng quá trình sắc ký.

Từ khảo sát bằng sắc ký bảng mỏng, thấy rằng hệ Hexane: CHCl3 (1:1) là hệ đánh giá là sử dụng làm hệ giải ly đầu nhưng do độ nén của pha tĩnh của bảng nhôm mỏng và của cột là khác nhau (độ nén pha tĩnh trên cột kém hơn so với bảng nhôm) nên cần giảm độ phân cực của hệ giải ly đầu xuống thành Hexane: CHCl3 (7:3) và ta xắp xếp trình tự các hệ giải ly trên cột dựa theo kết quả khảo sát qua sắc ký bảng mỏng ta được kết quả như Bảng 3.8 giúp việc phân tách và tinh sạch các hợp chất trên cột diễn ra dễ dàng hơn. Qua kết quả sắc ký cột phân đoạn PP 6 Bảng 3.10 cho ta thấy chỉ có duy nhất một phân đoạn cho một chất phân tách được riêng lẽ (PP 6.4) các phân đoạn còn lại vẫn chưa được phân tách tốt trên cột chứng tỏ hệ giải ly sử dụng chưa đủ khả năng. Ngoài ra, kết quả của phân đoạn PP 6.4 cho kết quả không thể hiện hình huỳnh quang cả bước sóng 254 và 365 nm nhưng vẩn bắt màu bởi thuốc thử hơi Iod và dung dịch 10% acid sulfuric trong cồn Hình 3.5 và không đủ hàm lượng khả thi để chạy phổ cộng từ hạt nhân nên chưa thể xác định hợp chất đã tinh sạch.

Còn qua kết quả sắc ký cột phân đoạn PP 07 cho thấy có 2 phân đoạn cho hai chất phân tách được riêng lẽ là phân đoạn PP 7.1 và PP 7.3 cũng cho kết quả không thể hiện hình huỳnh quang cả bước sóng 254 và 365 nm nhưng vẩn bắt màu bởi thuốc thử hơi Iod và dung dịch 10% acid sulfuric trong cồn. Kết quả cuối củng cho thấy lượng cao chiết còn quá thấp nên các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cao tổng cho hàm lượng chất quá thấp không thể tiến hành tình khiết sản phẩm có đủ hàm lượng để tiến hành định danh hợp chất.