Nghiên cứu ứng dụng vào y học của hợp chất chlorogenic acid chiết xuất từ hạt cà phê robusta

TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA CHLOROGENIC ACID

Những con chuột được nuôi thử nghiệm với chế độ ăn giàu cholesterol và bổ sung điều trị với 2 hướng là có chlorogenic acid và không có chlorogenic acid để so sánh, kết quả sau 6 tuần ta thấy sử dụng chlorogenic acid (150 mg mỗi kg mỗi ngày) làm giảm đáng kể giảm nồng độ lipid trong huyết tương và thay đổi biểu hiện của mRNA và các gen liên quan đến lipogenesis và lipolysis trong mô mỡ. Hơn nữa, chlorogenic acid cũng cải thiện chứng rối loạn vi sinh vật đường ruột do tăng cholesterol gây ra, bao gồm ức chế sự phát triển của Desulfovibrionaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Erysipelotrichaceae và làm tăng sự phát triển của Bacteroidaceae.

VẬT LIỆU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xây dựng quy trình chiết xuất chlorogenic acid trong hạt cà phê robusta

Bước 1: Hạt cà phê được xay thành bột và chiết Soxhlet với dung môi petroleum ether 8 – 10 giờ để loại thành phần béo trong hạt cà phê. Trịnh Thị Hoài Phương 26 Bước 2: Bột cà phê sau khi đã loại béo tiếp tục chiết bằng hệ thống chiết Soxhlet với dung môi methanol trong 12 giờ. Bước 3: Dịch chiết methanol được cô cạn và đem hòa tan với nước sau đó thực hiện chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform để tách caffeine ra khỏi dịch chiết nước.

Bước 4: Kiểm tra sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết nước bằng sắc ký bản mỏng và sau đó xây dựng hệ dung môi lên cột sắc ký để tách các hợp chất hữu cơ còn lại trong dịch chiết. Bước 5: Đem dịch nước có chlorogenic acid đem chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate, sau đó đem dung dịch ethyl acetate thu được cô cạn để thu nhận chlorogenic acid. Kết quả phân tích được thực hiện tại phòng cộng hưởng từ, Viện Hóa học (nhà A18, số 18, Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, thành phố Hà Nội).

Sau đó đặt ống vi quản này vào đúng vị trí, sao cho ống vi quản vào đúng khe soi mẫu, đầu ống có thể quan sát được và nằm giữa thị kính. Đợi khi nhiệt độ đạt 60% điểm nhiệt độ nóng chảy dự kiến thì bắt đầu giảm 10oC/phút, đến khi nhiệt độ cách điểm nóng chảy dự kiến 15oC thì tiếp tục hạ xuống cứ 1oC/phút cho điểm khi đạt điểm nóng chảy. Quan sát chất nóng chảy qua thị kính, ghi nhận nhiệt độ trên nhiệt kế từ khoảng thời điểm lúc chất bắt đầu nóng chảy cho đến khi chảy hoàn toàn.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ TỐI ƯU

Trịnh Thị Hoài Phương 31 Bảng 3.2 Kết quả hiệu suất các mức thời gian qua xử lý thống kê. Các giá trị được thể hiện theo giá trị trung bình của kết quả thống kê 3 lần lặp lại. Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm qua thống kê.

Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự thì không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 % qua phép thử Duncan. Từ kết quả bảng số liệu trên, tiến hành xây dựng đồ thị so sánh hiệu suất chiết suất giữa các khoảng thời gian khác nhau. Trong khoảng thời gian chiết 3 giờ hiệu suất thu được chỉ đạt 0,25 % có thể thấy khi đun khuấy từ thời gian ngắn thì.

Trịnh Thị Hoài Phương 32 hợp chất hữu cơ chưa được chiết kiệt và khi tăng thời gian chiết lên 6 giờ và 9 giờ thì hiệu suất chiết hợp chất tăng lên hơn so với thời gian chiết 3 giờ, tuy nhiên đến mức 9 giờ hiệu suất trích ly tăng không đáng kể.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU/DUNG MÔI CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ

Trịnh Thị Hoài Phương 32 hợp chất hữu cơ chưa được chiết kiệt và khi tăng thời gian chiết lên 6 giờ và 9 giờ thì hiệu suất chiết hợp chất tăng lên hơn so với thời gian chiết 3 giờ, tuy nhiên đến mức 9 giờ hiệu suất trích ly tăng không đáng kể. Vậy rút ra thời gian chiết tối ưu có thể là 6 giờ. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU/DUNG MÔI CHIẾT. Trịnh Thị Hoài Phương 33 Bảng 3.2 Kết quả hiệu suất các mức tỉ lệ nguyên liệu / dung môi) qua xử lý. Từ kết quả bảng số liệu trên, tiến hành xây dựng đồ thị so sánh hiệu suất chiết suất giữa các tỉ lệ nguyên liệu/dung môi khác nhau. Trịnh Thị Hoài Phương 34 Từ kết quả qua xử lý thống kê và hình 3.2 thể hiện về hiệu suất trích ly caffeine với các tỉ lệ dung môi khác nhau.

Ta thấy ở tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1:5 thì lượng dung môi ít không đủ để khuấy chiết hợp chất nên hiệu suất trích ly chỉ đạt 0,30 %. Vậy từ kết quả thu được ta thấy ở tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1:15 thì hiệu suất trích ly ổn định và có thể chiết kiệt hợp chất hữu cơ.

KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT CAFFEINE THU ĐƯỢC

Ở hệ dung môi này là một hệ dung môi có tính phân cực kém, do chloroform là chất ít phân cực và chiếm tỉ lệ cao trong hệ dung môi. Kết quả hiện hình bản sắc ký dưới UV cho thấy xuất hiện vết chất hữu cơ đơn và được kéo lên không quá cao, và không xuất hiện vết của tạp chất. Ở hệ dung môi này chất được dung môi kéo khoảng đường khá cao, và không xuất hiện vết của tạp chất.

Qua quan sát bản mỏng dưới UV ta thấy xuất hiện 1 vết chất hữu cơ sơ với chất chuẩn và chất hữu cơ được kéo lên khá cao, và không xuất hiện vết của tạp chất. Thực hiện đo điểm nóng chảy của hợp chất caffeine cô lập được và ghi nhận điểm nhiệt độ bắt đầu nóng chảy. Trịnh Thị Hoài Phương 36 Ghi nhận chất bắt đầu nóng chảy tại nhiệt độ 235,5OC và bị nóng chảy hoàn toàn khi nhiệt độ đạt 238oC.

Nhiệt độ này gần với nhiệt độ nóng chảy của caffeine vào khoảng 234 – 239oC trong Dược điển Việt Nam IV.

KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHLOROGENIC ACID TRONG HẠT CÀ PHÊ ROBUSTA

Kết quả sắc kí bản mỏng

❖ Sau khi thu được dịch chiết methanol để đánh giá sơ bộ các hợp chất có trong dịch chiết chúng ta tiến hành chấm sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau. Thứ tự các vết chấm từ trái qua phải lần lượt là: Chất chuẩn caffeine : dịch chiết methanol : chất chuẩn chlorogenic acid. Kết quả hiện hình bản sắc ký dưới đèn UV cho thấy ở vết dịch chiết thì chỉ xuất hiện vết chất hữu cơ ngang bằng với vệt chất chuẩn caffeine và một vết chấm chất chưa được dung môi kéo lên và ở vết chấm chất chuẩn chlorogenic acid cũng không được dung môi kéo lên.

Kết quả hiện hình bản sắc ký dưới đèn UV cho thấy vết chấm dịch chiết có quãng đường Rf ngang bằng với chất chuẩn caffeine, và. Trịnh Thị Hoài Phương 39 cũng có vết chất chạy quãng đường Rf ngang bằng với quãng đường Rf của vết chấm chất chuẩn chlorogenic acid. Kết quả hiện hình bản sắc ký dưới đèn UV cho thấy có 1 vết chấm dịch chiết chất có quãng đường Rf ngang bằng với chất chuẩn caffeine, và 1 vết chất có quãng đường Rf ngang bằng với quãng đường chạy của vết chấm chất chuẩn chlorogenic acid.

❖ Kết quả sắc ký sau khi thực hiện chiết lỏng – lỏng tách caffeine ra khỏi dịch chiết và thu nhận chlorogenic acid từ dịch chiết dung môi ethyl acetate. Trịnh Thị Hoài Phương 40 thấy xuất hiện một vết chất có quãng đường Rf ngang bằng với quãng đường Rf của vết chấm chất chuẩn acid chlorogenic. Kết quả hiện hình bản sắc ký dưới đèn UV cho thấy chỉ xuất hiện một vết chất có quãng đường Rf ngang bằng với quãng đường Rf của vết chấm chất chuẩn chlorogenic acid.

Đề nghị

Nguyễn Phương Quyên, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, Lê Thị Kim Phụng, Phạm Thành Quân (2015), “Xác định hàm lượng caffeine và thành phần hương cà phê từ một số sản phẩm cà phê rang xay và hòa tan trên thị trường Việt Nam”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, trang 86-94. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Tp. Nguyễn Minh Thảo, Nguyễn Đình Thành, Hà Thị Điệp (1993-1994), “Tách chiết cophein từ phế liệu chè Việt Nam; tách chiết nicotin từ phế liệu thuốc lá và chuyển hóa nó thành niconamit”, Đề tài cấp Bộ.

(2010) “Effect of ethanol content on supercritical carbon dioxide extraction of caffeine from tea stalk and fiber wastes”, The Journal of Supercritical Fluids, 55, 156-160. (2003), “Determination of caffeine in black tea leaves by Fourier transform infrared spectrometry using multiple linear regression”, Microchemical Journal, 75, 151-158. “Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid, quinic acid and caffeic acid in vivo and in vitro”, Antiviral Research.

“Dynamic microwave-asisted extraction coupled online with clean-up for determination of caffeine in tea”, LWT-Food Science and Technology, 44, 1490- 1495. “Chlorogenic acid alleviates obesity and modulates gut microbiota in high-fat-fed mice” Food Science & Nutrition, 7 (2), 579-588. (2009), “Caffeine extraction from green tea leaves assisted by high pressure processing”, Journal of Food Engineering, 94, 105-109.