^0^---PHÙNG VÃN BẢONGHIÊN CỨU KHẢO SÁT CÁC HỢP CHẤT ALKALOID CÓ TRONG LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG CRINUM LATIFOLIUM L.. Nguyễn Minh Hoàng Học viên thực hiện: Phùng Văn Bảo Lớp: DH16YD01 Ngày
TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực vật học
Vị trí phân loại
Đặc điểm thực vật
Hình 1.1 Trinh nữ hoàng cung
⮚ Trinh nữ hoàng cung là một loại cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10
- 15 cm, bẹ lá úp nhau thành một thân giả dài khoảng 10 - 15 cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 - 100 cm, hai bên mép lá lượn sóng
⮚ Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím
⮚ Hoa mọc thành tán gồm 6 - 18 hoa, trên một cánh hoa dài 30 - 60 cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra để trồng riêng dễ dàng.
Đặc điểm phân bố và sinh thái
⮚ Cây Trinh nữ hoàng cung được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào
⮚ Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh Miền Trung và Nam Trung Bộ
⮚ Là loại cây ưa ẩm, sáng hoặc một phần bóng mát Sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Mỗi năm cây cho 6 - 8 lá mới và đẻ thêm 3 -
⮚ Cây ra hoa hàng năm vào khoảng tháng 6 - 8 Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành.
Tác dụng dược lý
⮚ Theo y học dân gian: thân hành hoặc lá Trinh nữ hoàng cung được xào nóng hoặc giã đắp bên ngoài trong điều trị đau khớp, viêm da, mụn nhọt, rắn cắn, , dịch ép lá trị đau tai
⮚ Theo y học hiện đại: Trinh nữ hoàng cung còn có một số hoạt chất sinh học để làm thuốc trong điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư hầu họng, (Đỗ Tất Lợi, 2007; Cao et al, 2013; McNulty et al, 2007; Soromou et al, 2012)
Một số công thức hóa học
Hình 1.2 Công thức hóa học của các hợp chất alkaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
⮚ Vào năm 2000, nhóm tác giả Tôn Nữ Quỳnh Như và Võ Thị Bạch Huệ đã khảo sát sự biến đổi alkaloid trong lá thay đổi theo tháng, theo mùa, sự tập trung alkaloid trong các bộ phận khi cây chưa nở hoa cũng như lúc đã nở hoa Đặc biệt, nhóm tác giả đã xác định hàm lượng alkaloid toàn phần trong 100g cao cồn
Crinum latifolium L thu được 6–hydroxy crinamidin với hiệu suất 15 – 21% (Tôn
Nữ Quỳnh Như và Võ Thị Bạch Huệ, 2000)
Các hợp chất E-p-hydroxycinnamat metyl, E-3,4-dihidro-xycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-gluco-pyranosit và kaemperol-3-4’-di-O-β-D-glyco-pyranosit được nhóm tác giả Mai Đình Trị và Nguyễn Công Hào phân lập từ lá tươi cây Trinh nữ hoàng cung năm 2004 Các cấu trúc hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ học hiện đại bao gồm phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C (NMR), và phổ hồng ngoại (IR).
⮚ Năm 2010, Nguyễn Nhật Thành và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của Trinh nữ hoàng cung có các nhóm chất: triterpenoid, flavonoid, alkaloid, tannin, saponin, chất khử, acid hữu cơ và hợp chất polyuronid, trong đó các hợp chất ở nhóm triterpenoid và flavonoid tồn tại cả ở dạng tự do và dạng glycosid Kết quả
SVTH: PHÙNG VĂN BẢO 8 phân tích định tính, định lượng hai nhóm chất chính của hoa Trinh nữ hoàng cung bằng các kỹ thuật sắc ký nhóm flavonoid và alkaloid cho thấy thành phần hoạt chất trong mỗi nhóm cũng rất phong phú và khác nhau cả về thành phần và tỉ lệ hoạt chất trong từng bộ phận của cành hoa (Nguyễn Nhật Thành và cộng sự, 2010)
Năm 2014, hợp chất tinh khiết mới 6-ethoxyundulatin được Nguyễn Hữu Lạc Thủy cô lập từ cao phân đoạn alkaloid trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp SFE Cấu trúc của hợp chất này được làm sáng tỏ nhờ các phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ hồng ngoại IR.
⮚ Năm 2018, Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự đã cô lập được 3 loại alkaloid mới thuộc khung crinane: 6-methoxyundulatine, 6-methoxycrinamidine và undulatine N-oxide Cấu trúc hợp chất được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như: phổ NMR, MS,…(Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự, 2018)
1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài
⮚ Năm 1983, Kobayashi và cộng sự đã xác định cấu trúc của các hợp chất từ Crinum latifolium L như: lycorine, 1-O-acetyllycorine, crinine, powelline và crinamine bằng phổ 1H-NMR, IR, MS (Kobayash et al, 1983)
⮚ Năm 2001, Zvetkova E và cộng sự đã khảo sát cao chiết Crinum latifolium L bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sinh sản của tế bào lympho T trong thử nghiệm invitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người Trong thử nghiệm invivo, tác dụng cũng tương tự: kích thích sự sinh sản hoạt hóa tế bào lympho T trong máu ngoại vi chuột (Zvetkova et al, 2001)
⮚ Năm 2018, Ming – Xin Chen và cộng sự đã cô lập 4 hợp chất mới, 1 alkaloid cũ: 4,8-dimethoxy-cripowellin C; 4,8-dimethoxy-cripowellin D; 9-methoxy- cripowellin B; 4-methoxy-8hydroxy-cripowellin B; cripowellin C từ cao ethanol 95% của Crinum latifolium L và cấu trúc các hợp chất được xác định bằng các
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (SVTH) đã ứng dụng 9 phương pháp hóa lý hiện đại như phổ MS, NMR 1H, 13C, IR để nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Các hợp chất này có khả năng chống lại tế bào ung thư phổi, kháng khuẩn và chống viêm đã được chứng minh trong nghiên cứu của Chen et al., 2018.
Phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên
Phương pháp ngâm là cách chiết tách hợp chất tự nhiên phổ biến và dễ thực hiện Quá trình này là phương pháp chiết xuất rắn-lỏng, trong đó dung môi ở dạng lỏng thấm vào tế bào thực vật (pha rắn), hòa tan các hợp chất tự nhiên.
⮚ Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi)
❖ Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền (Từ Minh Koong, 2007)
1.3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần để chiết kiệt chất trong mẫu cây (Từ Minh Koong, 2007).
Phương pháp sắc ký bản mỏng
⮚ Phương pháp sắc ký bản mỏng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên một nền phẳng
SVTH: PHÙNG VĂN BẢO 10 như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau
⮚ Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau, ngoài ra còn có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Phương pháp sắc ký cột
⮚ Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)
⮚ Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường được nạp trong một cột làm bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có môt lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly Pha tĩnh trong sắc ký cột là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
⮚ Dựa vào việc sử dụng kích thước hạt silica gel khác nhau làm pha tĩnh và áp suất người ta chia làm 3 loại sắc ký cột:
✔ Sắc ký cột thường: dùng cột thủy tinh chứa hạt silica gel kích cỡ 60 – 200 àm, ỏp suất khớ quyển
✔ Sắc ký trung ỏp: kớch cỡ hạt 40 – 63 àm, ỏp suất 75 – 600 psi
✔ Sắc ký cao ỏp: cột bằng thộp khụng rỉ chứa hạt silica gel 3 – 10 àm, ỏp suất
⮚ Với những hỗn hợp cao chiết có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu
Lá Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L được thu mua tại các tiệm thuốc Đông y ở Hải Thượng Lãn Ông,Phường 10, Quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh.
Dung môi và hóa chất
⮚ Ethanol 96% (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
⮚ Methanol (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
⮚ Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
⮚ HCl (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
⮚ Chloroform (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
⮚ Ethyl acetate (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
⮚ NH3 (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
⮚ Acetone (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
Trang thiết bị nghiên cứu
⮚ Bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab (bình cầu đáy bằng 1000 ml nhám 29/32, ống sinh hàn nhám 29/32, bếp khuấy từ)
⮚ Bộ thu hồi dung môi (bình cầu đáy tròn 1000 ml, ống sinh hàn thẳng, nhiệt kế, đầu chưng cất, nhánh thu dung môi và bếp đun bình cầu 1000 ml)
⮚ Bản nhôm 20 * 10 cm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck)
⮚ Bể ổn nhiệt Memmert WB7
⮚ Cân kỹ thuật Ohaus PA1402, cân phân tích Shimadzu ATX224
⮚ Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE.
⮚ Tủ sấy đối lưu Memmert UM 500 (Đức)
⮚ Đèn UV Viber Lourmat VL – 6LC
Hình 2.1 Cân kỹ thuật Ohaus PA1402 (trái) và cân phân tích Shimadzu ATX 224
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.2 Quy trình chiết hoạt chất từ lá Trinh nữ hoàng cung
Bột lá Trinh nữ hoàng cung
Lá Trinh nữ hoàng cung
- Ngâm hoặc đun khuấy từ hồi lưu
- Hòa tan với dung dịch HCl 1%
- Kiềm hóa bằng NH3 (pH=9-10)
Phơi khô và xay nhỏ
2.3.1.1 Chiết cao cồn bằng phương pháp ngâm
Cân đúng 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung vào bình thủy tinh và đổ ngập ethanol khoảng 1-2 cm để xác định nồng độ ethanol, thời gian ngâm chiết và tỷ lệ dược liệu: ethanol tối ưu Sau khi chiết thô, lọc lấy phần trong, phần bã tiếp tục chiết thêm 2 lần Dịch chiết thu được đem cô dung môi để thu cao ethanol.
Hình 2.3 Bộ thu hồi dung môi a Khảo sát nồng độ ngâm chiết
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol (50 0 , 70 0 , 96 0 ) ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm và ngâm trong 24 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Nồng độ tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo b Khảo sát thời gian ngâm chiết
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol 70 0 ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm và ngâm trong các thời gian là 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong
SVTH: PHÙNG VĂN BẢO 16 cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo c Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình thủy tinh Sau đó, cho ethanol 70 0 ngập dược liệu theo các thể tích khác nhau là 180 ml, 240 ml, 300 ml tương ứng với tỉ lệ dược liệu : ethanol 70 0 là 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10 và tiến hành ngâm trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng
Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ ngâm chiết
Bột lá Trinh nữ hoàng cung
Phơi khô và xay nhỏ
Lá Trinh nữ hoàng cung
Thu hồi dung môi Khảo sát các yếu tố ngâm chiết
Nồng độ Thời gian Tỉ lệ
2.3.1.2 Chiết cao cồn bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Để chiết xuất cao từ lá Trinh nữ hoàng cung, cần chuẩn bị 30 gam bột lá Đổ ethanol ngập dược liệu khoảng 1 - 2 cm rồi đun hồi lưu để xác định nồng độ ethanol, thời gian và tỉ lệ chiết tối ưu Sau khi chiết thô, gạn phần trong, lọc và bỏ bã Thu hồi dung môi từ dịch chiết để thu được cao ethanol.
Hình 2.5 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
SVTH: PHÙNG VĂN BẢO 19 a Khảo sát nồng độ đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol (50 0 , 70 0 , 96 0 ) ngập dược liệu khoảng 1 – 2 cm và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong thời gian 4 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Nồng độ tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo b Khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol 70 0 ngập dược liệu khoảng 1 – 2 cm và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong các thời gian là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng Thời gian tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo c Khảo sát tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột lá Trinh nữ hoàng cung cho vào bình cầu 1000 ml Sau đó, cho ethanol 70 0 ngập dược liệu theo các thể tích khác nhau là 180 ml, 240 ml, 300 ml tương ứng với tỉ lệ dược liệu : ethanol 70 0 là 1 : 6, 1 : 8, 1 : 10 và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu trong khoảng thời gian phù hợp đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký lớp mỏng
Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát nồng độ, thời gian và tỉ lệ đun khuấy từ hồi lưu
2.3.1.3 Chiết phân đoạn flavonoid và alkaloid a Chiết phân đoạn flavonoid
Cân chính xác 50 gam cao ethanol hòa tan với dung dịch acid hydrochloric 1% Tỷ lệ cao ethanol 70 0 : acid hydrochloric 1% (1 : 30), lọc lấy phần dịch Tiếp theo, cho dịch chiết vào bình lóng và chiết với dung môi ethyl acetate cho đến khi chiết kiệt hợp chất flavonoid, tỷ lệ dịch acid : ethyl acetate (1 : 5), thực hiện chiết 5 lần Gộp các dịch chiết ethyl acetate lại với nhau và thu hồi dung môi, thu được phân đoạn flavonoid thô
Bột lá Trinh nữ hoàng cung
Phơi khô và xay nhỏ
Lá Trinh nữ hoàng cung
Thu hồi dung môi Khảo sát các yếu tố đun khuấy từ hồi lưu
Nồng độ Thời gian Tỉ lệ
Hình 2.7 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid và ethyl axetate b Chiết phân đoạn alkaloid
Lớp dịch acid sau khi chiết flavonoid được đem đi kiềm hóa bằng NH3 cho đến khi đạt độ pH = 9 – 10 Tiếp theo, cho dịch acid sau khi kiềm hóa vào bình lóng và chiết với dung môi chloroform theo tỉ lệ dịch acid đã kiềm hóa : chloroform (1 : 3) Thực hiện chiết 3 lần Gộp các dịch chiết chloroform lại với nhau và thu hồi dung môi, thu được phân đoạn alkaloid thô
Hình 2.8 Chiết lỏng – lỏng giữa dịch acid đã kiềm hóa và chloroform
2.3.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng
⮚ Loại bản mỏng: Bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254, độ dài 5 – 10 cm
⮚ Chuẩn bị ly sắc ký: Ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng Cắt giấy lọc hình thang vừa vào ly sắc ký và để giấy lọc ở mặt trong của ly sắc ký (để bão hòa dung môi trong bình) sao cho có khoảng trống để quan sát đường chạy của dung môi Cho lượng dung môi (khoảng 5 – 10 ml tùy vào kích thước của bản mỏng) vào ly sắc ký sao cho lớp dung môi cao khoảng 0,5 – 0,7 cm (mực dung môi phải thấp hơn vị trí vết chấm)
⮚ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan một lượng nhỏ cao phân đoạn alkaloid trong methanol
⮚ Khảo sát các hệ dung môi chạy sắc ký:
✔ Hệ 1: Chloroform : acetone tỉ lệ 9,5 : 0,5 (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
✔ Hệ 2: Chloroform : acetone tỉ lệ 5 : 5
✔ Hệ 3: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 8 : 2
✔ Hệ 4: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 7 : 3
✔ Hệ 5: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 6 : 4
✔ Hệ 6: Chloroform : ethyl acetate tỉ lệ 5 : 5
✔ Hệ 7: Chloroform : ethyl acetate : methanol tỉ lệ 4,5 : 4,5 : 1
✔ Hệ 8: Chloroform : ethyl acetate : methanol tỉ lệ 2 : 2 : 1
⮚ Mẫu sản phẩm alkaloid thu được được hòa tan trong methanol Chấm mẫu sản phẩm bằng ống vi quản lên trên bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Chiều dài chạy mẫu là 4 cm hoặc 8 cm tương ứng với chiều dài bản nhôm là 5 cm hoặc 10 cm Khai triển bằng hệ dung môi khảo sát Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm và ghi nhận Rf hiện trên bản
Giá trị Rf = Khoảng di chuyển của chất (cm)
Khoảng di chuyển của dung môi (cm)
2.3.3 Phương pháp sắc ký cột
❖ Các bước thực hiện như sau:
✔ Pha động: Khảo sát trước bằng sắc ký bản mỏng và chọn hỗn hợp hệ dung môi giải ly là chloroform : acetone
✔ Pha tĩnh : Silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm, Merck
✔ Cột thủy tinh được rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá đỡ
✔ Khối lượng mẫu nạp: 1,8 g cao phân đoạn alkaloid và khối lượng silica gel: 25g
✔ Chất hấp thu silica gel được nạp vào cột và nén chặt, chiều cao hấp thu là 28 cm
Để tiến hành ổn định cột sắc ký, đưa dung môi qua cột cho đến khi thấy lớp hấp phụ đồng nhất, tốc độ nhỏ giọt chậm là 1 giọt/giây.
Nghiền mịn mẫu rồi trộn đều với silica gel theo tỉ lệ 1 : 1 về khối lượng Nạp hỗn hợp mẫu và silica gel vào cột Cho một lượng nhỏ dung môi giải ly lên đầu cột để rửa sạch thành cột do dung dịch mẫu bị dính lên Cho một lớp bông gòn đặt nhẹ lên mặt thoáng đầu trên của cột để bảo vệ mặt cột không bị xáo trộn
Hệ dung môi giải ly là chloroform : acetone
5 Hứng và kiểm tra các phân đoạn
Hứng dung dịch giải ly trong các chai bi có đánh số thứ tự, mỗi chai bi có lượng thể tích được đánh dấu ở mức 10 ml
6 Thu hồi, kiểm tra và định lượng các phân đoạn
