VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
• Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật của khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
• Thời gian thực hiện: tháng 4/2022 đến tháng 8/2022
• Cây sâm bố chính nuôi cấy in vitro trong phòng Công nghệ tế bào thực vật của khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
• Phòng chuẩn bị môi trường, phòng hấp khử trùng, phòng bảo quản hóa chất: nồi hấp, máy cất nước một lần, lò vi sóng, tủ lạnh, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, đĩa Petri, Erlen
• Phòng cấy vô trùng: tủ cấy, máy điều hòa, dao cấy, kẹp, đèn cồn
• Phòng nuôi cấy: máy điều hòa, kệ sắt, nhiệt kế, đèn chiếu sáng
• Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux
• pH môi trường nuôi cấy: 5,7 – 5,8
• Sử dụng môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/L, agar 10 g/L và chất điều hòa tăng trưởng thực vật NAA, IAA và than hoạt tính (nồng độ thay đổi theo mục đích từng thí nghiệm)
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ chất tăng trưởng thực vật NAA giúp cây tạo rễ bất định
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân, lá in vitro cây sâm bố chính
Mô tả thí nghiệm: Cây sâm bố chính được nuôi cấy in vitro sẽ được dùng để lấy mẫu thân, cành, lá in vitro Đối với mẫu đoạn thân sẽ được cắt thành các đoạn có chiều dài
Mẫu lá sử dụng trong thí nghiệm có kích thước từ 2 – 3 cm Chúng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/L, agar 10 g/L, pH 5,7 và nồng độ NAA thay đổi theo bảng 2 - 1.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 7 lần, 1 mẫu trên 1 bình thuỷ tinh 500 mL
Thời gian theo dõi: 60 ngày
Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng rễ và chiều dài rễ
Bảng 2 - 1: Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Số thứ tự Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l)
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ chất tăng trưởng thực vật IAA giúp cây tạo rễ bất định
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân, lá in vitro cây sâm bố chính
Mô tả thí nghiệm: Cây sâm bố chính được nuôi cấy in vitro sẽ được dùng để lấy mẫu thân, cành, lá in vitro Đối với mẫu đoạn thân sẽ được cắt thành các đoạn có chiều dài
1 – 2 cm; Mẫu lá sẽ chọn các lá có kích thước 2 – 3 cm Mẫu sẽ được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/L, agar 10 g/L, pH 5,7, IAA ở các mức nồng độ khác nhau theo bảng 2 - 2
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 7 lần, 1 mẫu trên 1 bình thuỷ tinh 500 mL
Thời gian theo dõi: 60 ngày
Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng rễ và chiều dài rễ
Bảng 2 - 2: Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Số thứ tự Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l)
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ thích hợp của than hoạt tính giúp cây tạo rễ bất định
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân, lá in vitro cây sâm bố chính
Mô tả thí nghiệm: Cây sâm bố chính được nuôi cấy in vitro sẽ được dùng để lấy mẫu thân, cành, lá in vitro Đối với mẫu đoạn thân sẽ được cắt thành các đoạn có chiều dài
Kích thước mẫu lá được chọn từ 2 - 3 cm Các mẫu lá này được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/L, agar 10 g/L và pH 5,7 Than hoạt tính được bổ sung ở các nồng độ khác nhau, theo bảng 2 - 3.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 7 lần, 1 mẫu trên 1 bình thuỷ tinh 500 mL
Thời gian theo dõi: 60 ngày
Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng rễ và chiều dài rễ
Bảng 2 - 3: Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Số thứ tự Nghiệm thức Nồng độ than hoạt tính (g/l)
2.2.4 Phương pháp thu thập, tổng kết tài liệu
• Thu thập, nghiên cứu các tài liệu được công bố trong và ngoài nước về những nghiên cứu có liên quan
• Sử dụng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và phần mềm excel
• Phân tích phương sai (ANOVA – analysis of variance) để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức
• So sánh các giá trị trung bình bằng kiểm định Duncan.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN`
Kết quả
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Bảng 3 - 1: Kết quả ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân
Số thứ tự Nghiệm thức
Các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% qua phép thử Duncan
Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân được thể hiện ở bảng 3 -
1 cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro đoạn thân cây sâm bố chính trong môi trường
MS bổ sung 0 – 3 mg/L NAA không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Ở các môi trường nuôi cấy, thân in vitro chỉ tạo ra được mô sẹo hoặc chồi con mà gần như không tạo ra rễ hoặc rễ rất ngắn Giải thích cho kết quả này, theo sách "Sinh lý thực vật" của Bùi Trang Việt, tuỳ từng loại cây và cơ quan thì nồng độ auxin sẽ gây các ảnh hưởng khác nhau đến cây hay cơ quan đó NAA là một loại auxin tổng hợp, nên khi ở nồng độ cao, kết hợp với cytokinin nội bào, có sẵn trong thực vật sẽ gây kích thích phân chia tế bào in vitro Kết quả này khác so với thí nghiệm của Trịnh Thị
Hương và cs (2019) và thí nghiệm của Nguyễn Thị Huyền Trang và cs (2015), ở cả
21 hai thí nghiệm trên cây đều cho ra rễ ở môi trường MS và MS có bổ sung NAA ở các mức nồng độ từ 0,25 – 2 mg/L
Hình 3 - 1: Đoạn thân sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung NAA sau 60 ngày
N0, N1, N2, N3 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung chất tăng trưởng thực vật NAA ở các mức nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L
Bảng 3 - 2: Kết quả ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá
Số thứ tự Nghiệm thức Tỉ lệ ra rễ
Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật NAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá được thể hiện ở bảng 3 - 2 cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro lá cây sâm bố chính trong môi trường MS và MS bổ sung 1 – 3 mg/L NAA không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Ở các môi trường nuôi cấy, lá cây sâm bố chính in vitro không tạo ra rễ và mô sẹo
Hình 3 - 2: Lá sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung
N0, N1, N2, N3 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung chất tăng trưởng thực vật NAA ở các mức nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Bảng 3 - 3: Kết quả ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân
Số thứ tự Nghiệm thức
Các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% qua phép thử Duncan
Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân được thể hiện ở bảng
3 - 3 Tỉ lệ hình thành rễ cao nhất ở môi trường MS có bổ sung IAA 3 mg/L (71,4%) Thân cây sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung IAA
3 mg/L cho số lượng rễ trung bình là cao nhất (9,85 rễ) và chiều dài trung bình rễ đạt
4 cm, rễ mọc thành chùm, nhiều lông con Ngoài ra, đoạn thân cũng hình thành thành cây con hoàn chỉnh và có thể đem ra ngoài để tiếp tục trồng Đối với các nồng độ thấp hơn thì tỉ lệ ra rễ giảm và số lượng rễ cũng giảm đi đáng kể, thân chưa phát triển được
25 thành cây con hoặc nếu phát triển được thì chiều cao thấp, rễ mọc thành chùm và nhiều lông con Giải thích cho kết quả này, cũng theo sách “Sinh lý thực vật”, trong nuôi cây mô, auxin mà cụ thể ở đây là IAA, giúp kích thích phân hoá rễ và phát triển rễ nhánh Ngoài ra, auxin khi kết hợp với cytokinin ở tỷ lệ thích hợp sẽ tăng trưởng chồi non và khởi tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Một nghiên cứu trên cây đậu bắp (Abelmoschus esculentus L.) (Dhande, et al., 2012) chỉ ra khi nuôi cấy in vitro chồi ngọn ở môi trường MS bổ sung IAA 1,0 mg/L sẽ cho tỷ lệ ra rễ cao nhất
(99%) và chiều dài trung bình của rễ là 5 cm
Hình 3 - 3: Đoạn thân sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung IAA sau 60 ngày
I0, I1, I2, I3 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung chất tăng trưởng thực vật IAA ở các mức nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L
Bảng 3 - 4: Kết quả ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá
Số thứ tự Nghiệm thức Tỉ lệ ra rễ
Kết quả được thí nghiệm ảnh hưởng của chất tăng trưởng thực vật IAA đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá được thể hiện ở bảng 3 - 4 cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro lá cây sâm bố chính trong môi trường MS và
MS bổ sung 1 – 3 mg/L IAA không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Ở các môi trường nuôi cấy, lá cây sâm bố chính in vitro không tạo ra rễ và mô sẹo
Hình 3 - 4: Lá sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung IAA sau 60 ngày
I0, I1, I2, I3 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung chất tăng trưởng thực vật IAA ở các mức nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính
Bảng 3 - 5: Kết quả ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân
Số thứ tự Nghiệm thức
Các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% qua phép thử Duncan
Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với đoạn thân được thể hiện ở bảng 3 - 5 Tỉ lệ hình thành rễ cao nhất ở môi trường MS có bổ sung 1 g/L than hoạt tính (85,7%) Thân cây sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung 1 g/L IAA cho số lượng rễ trung bình là cao nhất (11,8 rễ) và chiều dài trung bình rễ đạt
15,7 cm, rễ mọc thành chùm, nhiều lông con Ngoài ra, đoạn thân cũng hình thành thành cây con hoàn chỉnh và có thể đem ra ngoài để tiếp tục trồng Đối với các nồng độ cao hơn thì tỉ lệ ra rễ giảm và số lượng rễ giảm đi rất nhiều hoặc không hình thành nên rễ Thân được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 3 – 4 g/L than hoạt tính vẫn tiếp tục phát triển thành cây con, ra lá nhưng không hình thành rễ, chiều cao cây thấp, thân có nhiều lông tơ Giải thích cho điều trên là than hoạt tính giúp tạo môi trường tối cho cây, giúp hấp phụ các chất ức chế tăng trưởng tế bào thực vật và giúp phát triển cây Kết quả nghiên cứu trên cây hoa đồng tiền (Dương Tấn Nhựt và cs,
2013) cũng chỉ ra rằng ở môi trường MS có bổ sung nồng độ than hoạt tính 1 g/L cho ra số lượng rễ nhiều nhất (4,33 rễ)
Hình 3 - 5: Đoạn thân sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường
MS có bổ sung than hoạt tính sau 60 ngày
C0; C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung than hoạt tính 0; 1; 2; 3; 4 g/L
Bảng 3 - 6: : Kết quả ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá
Số thứ tự Nghiệm thức Tỉ lệ ra rễ (%) Số lượng rễ
Các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% qua phép thử Duncan
Kết quả được thí nghiệm ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ bất định của cây sâm bố chính đối với lá được thể hiện ở bảng 3 - 6 cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro lá cây sâm bố chính trong môi trường MS và MS bổ sung than hoạt tính nồng độ 1 – 4 g/L không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Ở các môi trường nuôi cấy, lá cây sâm bố chính in vitro gần như không tạo ra rễ và mô sẹo, nếu có thì rễ cũng rất ngắn
Hình 3 - 6: Lá sâm bố chính được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có bổ sung than hoạt tính sau 60 ngày
C0; C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với môi trường MS bổ sung than hoạt tính
