Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng bằng cách cho dung môi pha lỏng xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật pha rắn và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sarker và cs., 2006.Nguyên liệu
TỔNG QUAN 1 Tổng quan về hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC)
Đặc điểm
Cây hoàng liên gai có tên khoa học là Berberis wallichiana DC, thuộc họ hoàng liên gai Berberidaceae Hoàng liên gai còn có tên gọi khác là hoàng mù- hoàng mộc, hoàng liên ba gai, tiểu la tán, tiểu nghiệt (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngoài ra còn có tên nước ngoài Wallich’s barberry, Wallich’s berberis
Hình 1.1 Hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC)
Cây bụi gai, cao 2-3 m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài 1-1,5 cm
Lá mọc thành chùm 3-4 lá, có khi đến 8 lá trên cùng mốt đốt Cuống lá dạng ngắn 0,5-1 cm, phiến lá nguyên có hình mác, mép có răng cưa to, cứng dài
Hoa có màu vàng, mọc thành chùm Quả mọng hình trái xoan, mọc trên cuống khi chính có màu tím đen bên trong có chứa hạt (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Phân bố và sinh thái
Cây hoàng liên gai phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm Trung Quốc và Ấn độ, và một số nước cộng hòa Liên Xô Ở Việt Nam, cây phát triển chủ yếu ở vùng núi cao Lào Cai Hoàng liên gai là cây ưa sáng, ẩm và có khí hậu mát quanh năm Cây thường mọc lẫn với các loại cây bụi khác trên núi đá với độ cao 1600-1700 m (Đỗ Huy Bích, 2004).
Thành phần hóa học
Rễ hoàng liên gai chứa alkaloid berberin với hàm lượng 3 - 4% Ngoài ra, vỏ rễ còn chứa alkaloid (Đỗ Huy Bích, 2004).
Tác dụng dược lý
Hoàng liên gai được dùng làm thuốc chữa đi lỵ, đau mắt, ăn uống khó tiêu Hoàng liên gai có thể dùng ngâm rượu chữa những triệu chứng của huyết áp cao như hoa mắt, nhức đầu, đau ngang lưng Ngoài ra, còn có thể chữa đau răng (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Sơ lược về berberin
Berberin có tên khoa học là 5,6 dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a- azonizindeno(5,6-a) anthraacen clorid dihydrat Một loại alkaloid chủ yếu trong hoàng liên gai, chiếm từ 3 - 4% có tác dụng kháng khuẩn, chữa lỵ, tiêu hóa kém và đau mắt
Hình 1.2 Công thức cấu tạo berberin
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
Berberin là alkaloid ở dạng tinh thể hay bột kết tinh có màu vàng, không mùi, có vị đắng
Berberin clorua rất ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, hầu như không tan trong cồn lạnh
Berberin sulfat tan tốt trong nước, tan nhiều trong cồn
Nhiệt độ nóng chảy: 145 o C (Phan Quốc Kinh, 2011)
Hóa tính của N : N của berberin là hydroxyd amoni bậc 4 đem tính kiềm cho phân tử Có thể cho muối cloride với HCl
Hóa tính của oxy: Có hóa chức ete có thể phân hủy cho alcol, riêng OH trong hydroxyd amoni bậc 4 : N không vững bền, trong môi trường kiềm dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal tương ứng (Từ Minh Koóng, 2007)
Hòa tan 10 mg chế phẩm trong 20 ml nước nóng, làm lạnh và thêm 1 ml dung dịch kali iodid 16,5 %, tủa màu vàng xuất hiện
Hòa tan 0,1 g chế phẩm trong 20 ml mước bằng cách đun nóng, thêm 0.5 ml acid nitric đậm đặc (TT), làm lạnh, để yên 10 phút, lọc Lấy 3 ml dịch lọc thêm 1 ml dung dịch bạc nitrat 2 % (TT), sẽ xuất hiện kết tủa trắng Tủa này không tan trong acid nitric loãng (TT), nhưng tan được trong dung dịch amoniac (TT) quá thừa
Hòa tan 5 mg chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT) Lắc đều, thêm một ít bột cloramin B (TT) sẽ có màu đỏ anh đào (Dược điển Việt Nam IV)
Berberin là một loại thuốc có hoạt tính kháng sinh, chống viêm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra berberin còn chống lại nhiều vi khuẩn gram (-) và gram (+) và các vi khuẩn kháng acid khác
Trên lâm sàng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột thì berberin có hoạt tính tốt hơn furazolidon, metronidazol và quimacrin Berberin có tác dụng kháng khuẩn với Shigella, tụ cầu và liên cầu (Phạm Thiệp, 2002)
Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với các β-lactam bán tổng hợp (ampicillin và oxacicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim) trên Staphylococcus aureus và không hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3 (Đinh Thị Liên, 2011)
SVTH: LÊ NGỌC HÂN 16 Ở nước ta, năm 1972 Phan Quốc Kinh và Đặng Thị Hồng Vân (Trường Đại học Hà Nội) đã nghiên cứu điều chế berberin từ hoàng liên gai để góp phần chủ yếu dập tắt dịch lỵ trong thời gian đó
Có tác dụng điều trị đau mắt hột ở các giai đoạn khác nhau Sau một đợt điều trị ba tuần bằng thuốc nhỏ mắt berberin thì đã không tìm thấy vi khuẩn Chlamydia trachomatis ở mắt bệnh nhân Về điều này, berberin hơn hẳn sulfacetamid
Berberin có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh Streptococus pyogenes Các nghiên cứu mới nhất chứng minh gần, khi dùng phối hợp berberin với một số kháng sinh sẽ làm hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột (Phan Quốc Kinh, 2009)
Tại Trung Quốc, năm 2006 tác giả Ben Liu và cộng sự đã tách chiết berberine từ thân rễ hoàng liên Trung Quốc sử dụng chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn (Liu, 2006) Năm 1976, các cơ sở y tế Sài Gòn, quân khu 5, xí nghiệp dược phẩm Hà Nội, Học viện Quân y nghiên cứu chiết xuất berberin hiệu quả thu được: đã chiết được hàng chục tấn berberin clorid tinh khiết Để sản xuất ra hàng loạt viên berberin có hàm lượng 0,05 g thì 1 tấn berberin có thể sản xuất ra khoảng 20 triệu viên
Năm 1982, Proefschrift (Hà Lan) nghiên cứu cây Coscinium fenestratum ở
Indonexia Theo tác giả so sánh cây này thấy đồng tên với cây Coscinium usitatum Pierre ở Đông Dương của Pierre tiêu bản số 1312 lưu trữ tại Leningrat, Newyork Nghiên cứu xác định hóa học của vàng đắng thấy có 6 alkaloid: berberin, jatrorrhizin, palmatin, berberubin, magnoflorin, thalifendin Từ alkaloid berberin có thể bán tổng hợp thành những muối khác nhau của berberin và những cộng hợp đồng phân tử (berberin sulfamid ) (Dược liệu chứa alkaloid)
Berberin cú tỏc dụng diệt khuẩn Vibrio cholerae ở nồng độ 35 àg/ml và khuẩn
Staphylococcus aureus ở nồng độ 50 àg/ml Ở nồng độ 10-25 àg/ml, berberin cú tỏc dụng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài nấm Altemaria spp., Aspergillus flavus, A.fumigatus,…
Cả berberine sulfat và berberine cloride đều kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào Ehrlich và tế bào gây ung thư máu ( Lã Đình Mới, 2005)
Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy berberine gây giảm đáng kể cholesterol trong máu, chất béo trung tính cũng như glucose trong bệnh nhân bị tăng lipid máu và bệnh tiểu đường loại 2 ( Li và cs., 2011)
Berberine có tác dụng bảo vệ gan chống lại CCl4 - gây nhiễm độc gan Berberine có tiềm năng phát triển một loại thuốc mới để điều trị giải độc tính gan (Feng và cs., 2010).
Phương pháp chiết xuất và tinh chế
Phương pháp ngâm dầm là phương pháp đơn giản và được sử dụng phổ biến để tách chiết hợp chất tự nhiên Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng bằng cách cho dung môi (pha lỏng) xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật (pha rắn) và hòa tan các hợp chất tự nhiên (Sarker và cs., 2006).
Nguyên liệu sau khi xay nhỏ thành bột sẽ được ngâm trong bình chứa thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn hợp chất có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để dung môi có thể hòa tan hết các hợp chất cần chiết, thỉnh thoảng có thể khuấy trộn hoặc lắc, sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung dịch cố định trong bình mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
SVTH: LÊ NGỌC HÂN 18 Ưu điểm phương pháp này là dễ thực hiện, rẻ tiền và thiết bị đơn giản Bên cạnh đó phương pháp ngâm nhiều lần giúp chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu (Từ Minh Kóong và cs., 2007).
3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp kết tinh là dùng một dung môi hữu cơ có độ tan chọn lọc hợp chất quan tâm để tách, tinh chế và thu sản phẩm tinh khiết Bằng cách tạo dung dịch bão hoà ở nhiệt độ cao (thường là nhiệt độ sôi của dung môi), các tạp chất sẽ ở lại trong dung dịch Sau đó kết tinh lại một số lần trong cùng một dung môi, hoặc trong các dung môi khác nhau, người ta có thể thu được tinh thể chất cần tinh chế ở dạng khá tinh khiết (Pavia, 2011).
Bước 1: Hòa tan chất rắn
Chọn dung môi kết tinh phù hợp Hòa tan chất rắn trong lượng tối thiểu dung môi sôi đến khi bão hòa Thêm than hoạt tính để khử màu và tạp chất.
Bước 2: Loại bỏ tạp chất không tan
Gạn lấy dịch trong hay lọc dung dịch nóng qua giấy lọc để loại bỏ các tạp chất không hòa tan hoặc than hoạt tính thêm vào ở các bước trên.
Làm nguội dung dịch thật chậm cho tới khi bằng với nhiệt độ phòng Khi xuất hiện tinh thể, làm mát hỗn hợp trong tủ lạnh Nếu tinh thể không xuất hiện thì gây kết tinh bằng cách: cọ đầu đũa thủy tinh vào thành erlen, cho thêm chất rắn nguyên chất vào dung dịch để tạo mầm, làm bay hơi vượt quá mức bão hoà của dung môi rồi làm mát một lần nữa.
Hình 1.3 Phương pháp kết tinh
Bước 4: Thu nhận và làm khô
Thu tinh thể bằng cách lọc áp suất kém qua phễu Buchner Rửa tinh thể bằng một lượng nhỏ dung môi lạnh Làm khô mẫu ngay trên phễu lọc chân không, để khô tự nhiên hay cho vào tủ sấy.
3.4 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)
Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Dựa vào việc sử dụng kích thước hạt silica gel khác nhau làm pha tĩnh và áp suất, người ta chia làm 3 loại sắc ký:
❖ Sắc ký cột thường (Sắc ký cột hở): dùng cột thủy tinh chứa hạt silicagel kích cỡ 60 –
❖ Sắc ký trung áp: kích cỡ hạt: 40 – 63 μm, áp suất 75 – 600 psi
❖ Sắc ký cao áp: cột bằng thép không rỉ chứa hạt silicagel 3 – 10 μm, áp suất 500 –
Với những hỗn hợp cao chiết có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột
Phương pháp phân tích berberin
4.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng
Phương pháp sắc kí bản mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
4.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC-MS)
Phương pháp HPLC là phương pháp phổ biến chính trong việc cô lập và tinh sạch các hợp chất tự nhiên hoạt động trong điều kiện: áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, mẫu chất lỏng ở trong dòng chảy của pha động với lượng thể tích lớn, chất khảo sát là thể lỏng và vận tốc lớn
Có nhiều loại giao diện khác nhau dùng cho HPLC-MS như tia nhiệt (thermospray, TSP, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmspheric pressure chemical ionization, APCI), chùm tia hạt (particle beam, PB), phun ion (electrospray, ES),…Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợp chất khảo sát mà sử dụng máy LC-MS phù hợp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
4.3 Phương pháp đo điểm nóng chảy Điểm nóng chảy chỉ ra sự tinh khiết của chất được đo Chất càng tinh khiết thì phạm vi nóng chảy của nó càng hẹp Khi chất có nhiều tạp chất sẽ làm cho điểm nóng chảy của nó giảm tỷ lệ thuận với lượng tạp chất (Pavia, 2011)
4.4 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR cho ta biết cấu trúc khung sườn carbon – hidrogen của hợp chất hữu cơ, từ đó giúp ta có thể xác định cấu trúc của toàn bộ phân tử Một số hạt nhân nguyên tử có trạng thái spin +1/2 và -1/2 và tính chất này cho phép khảo sát chung bằng phổ NMR, ví dụ: 1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P Phổ 1 H-NMR cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết tỷ lệ số hydro (H) trong từng mũi cộng hưởng Ngày nay máy quang phổ NMR thường hoạt động ở tần số 60 – 900 MHz, tần số hoạt động của máy càng cao từ trường bên ngoài càng mạnh thì dộ phân cực của phổ thu được càng tốt (Bruice, 2004).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Vật liệu
Đối tượng, phạm vi và phương pháp định danh và xác định cấu trúc hợp chất
Nghiên cứu được thực hiện trên cây hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC) từ Phòng khám Đông Y Nguyễn Hữu Toàn ở Hải Phòng
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong 03 tháng từ tháng 02 năm 2019 – tháng 05 năm 2019.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bi
- Acid sulfuric (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
- Chloroform (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Acid clohydric (VN - Chemsol Co., Việt Nam)
- n-Butanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Ethanol 96% (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Acid acetic (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Methanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Than hoạt tính(VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Berberin chuẩn (Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học, số 01, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
- Bản nhôm đã trắng sẵn silica gel 60 F245 20 × 20 cm (Merck)
- Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7
- Cân kỹ thuật SHINKO GS 3000g, cân phân tích SHIMADZU ATX224
- Máy bơm hút chân không GAST DOA – P504 – BN
- Đèn UV Vilber Lourmat VL – 6 LC
- Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11
- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội
- Hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) gồm hệ thống máy HPLC Ultimate 3000 – Dionex (Thermo scientific, Hoa Kỳ) và đầu do khối phổ MSQ Plus (Thermo scientific, Hoa Kỳ) tại phòng Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học (Số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
Hình 2.1 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz
Hình 2.2 Máy đo điểm nóng chảy
Hình 2.3 Cân kỹ thuật Shinko GS 3000g (trái);
Cân phân tích Shimadzu ATX224 (phải)
Hình 2.4 Bộ đun khuấy từ hồi lưu
Phương pháp nghiên cứu
2.1 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết
Hình 2.5 Sơ đồ quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết alkaloid
Thân rễ cây hoàng liên gai chặt thành lát mỏng, phơi khô rồi xay thô Cân chính xác 30 g dược liệu xay thô cho vào bình chứa Tiến hành ngâm với dung dịch acid sulfuric 0,4% với thể tích và nồng độ phù hợp Thời gian ngâm chiết là 24 giờ
Hình 2.6 Quy trình ngâm chiết berberin
Dịch alkaloid thu được từ phía trên, thêm muối NaCl dạng rắn với tỷ lệ 3-4% so với lượng dịch chiết, khuấy mạnh cho tan hết muối NaCl Để yên 24 giờ cho berberin kết tủa hết Rửa tủa bằng dung dịch HCl 0,4% sau đó rửa lại với nước cất cho hết phản ứng acid
Hòa tan berberin thô vừa thu được với ethanol 96 o nóng, tẩy màu với than hoạt tính đun nóng trong 10 phút, lọc bã than; cho dịch lọc vào becher, thực hiện quá trình kết tinh Để yên trong tủ lạnh từ 1 - 2 ngày cho sự kết tinh diễn ra
Khi tinh thể bám trong becher, hút dịch dư còn lại cho vào một becher khác, phần tinh thể được rửa bằng dung môi ethanol 96 o để loại tạp chất còn lại Gộp phần dịch còn dư và dung môi rửa tinh thể lại để thực hiện quá trình kết tinh lại.
2.1.1 Khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
Cân 30 g bột thân và rễ hoàng liên gai cho vào bình thủy tinh giống nhau Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu trong dung dịch acid sulfuric 0,4% với tỉ lệ bột nguyên liệu và thể tích dung dịch tăng dần như 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 tương ứng với thể tích là 90 ml, 120 ml, 150 ml, 180 ml Ở mỗi nghiệm thức thực hiện rút dịch chiết và lặp lại hai lần để chiết kiệt các alkaloid cần Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng Thể tích dung dịch H2SO4 tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất chiết xuất của berberin
Hình 2.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
2.1.2 Khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
Bột hoàng liên gai được ngâm chiết trong dung dịch acid sulfuric với thể tích tối ưu ở thí nghiệm trên theo các nồng độ khác nhau như 0,3%, 0,4%, 0,5% và 1% Dịch chiết sau khi lọc được tủa với dung dịch NaCl bão hòa Tiến hành thu tủa như quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất chiết xuất berberin và độ tinh khiết qua sắc kí bản mỏng
Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 2.2 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 g bột nguyên liệu cho vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với ethanol 70%, thời gian tối ưu Sau quá trình chiết thô, cô cạn thành cao sệt
Hình 2.9 Đun khuấy từ hồi lưu
Bước 2: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được trong nước nóng để loại bỏ nhựa, lọc lấy dịch sau đó thêm dung dịch NaCl bão hòa và khuấy đều Để yên 24 giờ, lọc lấy tủa và rửa tủa với ethanol 70 o
Bước 3: Lọc thu tinh thể
Hòa tan tủa trong ethanol 96%, lọc than hoạt tính trong 10 phút Thu dịch, để yên kết tinh lạnh Thu kết tinh, cân và tính hiệu suất
Hình 2.10 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
2.2.1 Khảo sát thể tích ethanol tối ưu
Cân chính xác 30 g bột hoàng liên gai bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Sau đó thực hiện quá trình đun khuấy từ hồi lưu với các tỷ lệ bột nguyên liệu và dung môi là 1/6, 1/7, 1/8 và 1/9 ứng với các thể tích 180 ml, 210 ml, 240 ml, 270 ml Dịch chiết thu được ở mỗi thí nghiệm được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng Tỷ lệ tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát thể tích ethanol tối ưu
2.2.2 Khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu
Cân chính xác 30 g bột hoàng liên gai bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Sau đó thực hiện quá trình đun khuấy từ hồi lưu với các tỷ lệ bột nguyên liệu và dung môi tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên với thời gian
2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi thí nghiệm được tiếp tục đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu
2.3 Cô lập berberin có trong hỗn hợp alkaloid
⮚ Phương pháp thực hiện : Sắc ký cột thường hay còn gọi là sắc ký cột hở cổ điển (Classical open – column chromatography)
⮚ Phương pháp nạp chất hấp thu vào cột: nạp chất hấp thu dạng sệt
⮚ Phương pháp nạp mẫu: nạp mẫu dạng dung dịch
- Pha động: khảo sát trước bằng sắc ký bản mỏng và chọn hệ dung môi giải ly là Chloroform : methanol : acid acetic với tỷ lệ (15 : 10 : 1)
- Pha tĩnh: Silica gel cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm, Merck
Sấy silica gel ở 110 o C trong 4 giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút Cột thủy tinh có đường kính Φ = 20 mm, chiều dài d = 400 mm được rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá
Cho sẵn một lượng dung môi được dùng cho bắt đầu quá trình giải ly cột vào một becher, cho chất hấp thu vào becher đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy đều Dùng phễu đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, mở nhẹ khóa bên dưới để dung môi chảy ra, hứng và một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột cho đến khi hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su nhỏ khẻ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu được đều trong trong cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột 3 đến 4 lần để cột được chặt, chất hấp thu được đồng nhất (tránh hiện tượng đầu cột không có dung môi sẽ làm khô đầu cột dễ dẫn tới gãy cột) Chiều cao chất hấp thu là 20 cm
Bước 3: Nạp mẫu lên cột sắc ký
Hòa tan mẫu vào một lượng dung môi khởi đầu cho quá trình sắc ký cột Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột sau đó đóng khóa lại
