Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019
Trang 2BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Trang 3SVTH: LÊ NGỌC HÂN 1
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong những năm tháng trên giảng đường đại học Chính những kiến thức mà Thầy Cô giảng dạy là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của em đến thầy Nguyễn Minh Hoàng, người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài thực tập này
Ngoài ra, không thể thiếu sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể thành viên lớp DH15SH05, những người bạn cùng thực tập và các em học việc trong phòng Hóa – Môi trường Mọi người đã luôn động viên, chia sẻ những khó khăn vui buồn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện thực tập
Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến Ba Mẹ tình cảm sâu sắc tận đáy lòng con Nhờ có sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt và tạo mọi điều kiện cho con có thể phát huy hết được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm yêu thích của mình Con sẽ cố gắng và nỗ lực bước đi hết con đường tốt đẹp mà Ba Mẹ đã dành cho con
Gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả mọi người và chúc các bạn của tôi hoàn thành tốt thực tập tốt nghiệp của mình và thành công trong cuộc sống.
Xin cảm ơn tất cả mọi người!
Tp Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 06 năm 2019 Sinh viên
Lê Ngọc Hân
Trang 5SVTH: LÊ NGỌC HÂN 3
3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 18
3.3 Phương pháp kết tinh 18
3.4 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ 20
4 Phương pháp phân tích berberin 21
4.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng 21
4.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC-MS) 21
4.3 Phương pháp đo điểm nóng chảy 21
4.4 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 21
PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Vật liệu 23
1.1.Đối tượng, phạm vi và phương pháp định danh và xác định cấu trúc hợp chất 23
1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bi 23
1.2.1 Hóa chất 23
1.2.2 Dụng cụ - thiết bị 24
2 Phương pháp nghiên cứu 27
2.1.Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết 27
2.1.1 Khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 29
Trang 6SVTH: LÊ NGỌC HÂN 4
2.1.2 Khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 30
2.2.Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 31
2.2.1 Khảo sát thể tích ethanol tối ưu 34
2.2.2 Khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu 35
2.3.Cô lập berberin có trong hỗn hợp alkaloid 36
2.4.Định tính berberin thô thu được 38
2.4.1 Sắc kí bản mỏng 38
2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 39
2.4.4 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 40
2.4.5 So sánh kết quả rotudin thu nhận được và một số mẫu thuốc trên thị trường 40
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Kết quả khảo sát quy trình ngâm chiết tối ưu 42
1.1 Kết quả khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 42
1.2 Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 44
2 Kết quả khảo sát quy trình đun khuấy từ hồi lưu tối ưu 48
2.1.Kết quả khảo sát thể tích ethanol tối ưu 48
2.2.Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu 50
Trang 7SVTH: LÊ NGỌC HÂN 5
3 Quá trình cô lập và xác định cấu trúc hợp chất 53
3.1.Kết quả sắc ký bản mỏng 53
3.2.Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 54
3.3.Kết quả cô lập hợp chất berberin bằng sắc kí cột 56
3.4.Kết quả đo điểm nóng chảy 59
3.5.Xác định hợp chất cô lập được 59
3.6.Kết quả so sánh hợp chất berberine thu nhận được và một số mẫu thuốc 61
PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 Kết luận 63
2 Đề nghị 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 68
Trang 8Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thể tích ethanol (phụ lục 3) 48
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ (phụ lục 4) 50
Bảng 3.6 Kết quả đo giá trị Rf trong sắc kí bản mỏng 54
Bảng 3.7 Các phân đoạn sắc ký cột 57
Bảng 3.8 Kết quả đo điểm nóng chảy 59
Bảng 3.9 Số liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của chất Ber1 (phụ lục 5 và phụ lục 6) 60
Bảng 3.10 Kết quả sắc ký so sánh giữa berberin và một số thuốc trên thị trường 62
Trang 9SVTH: LÊ NGỌC HÂN 7
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC) 12
Hình 1.2 Công thức cấu tạo berberin 14
Hình 1.3 Phương pháp kết tinh 19
Hình 2.1 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz …………25
Hình 2.2 Máy đo điểm nóng chảy 25
Hình 2.3 Cân kỹ thuật Shinko GS 3000g (trái); Cân phân tích Shimadzu ATX224 (phải) 26
Hình 2.4 Bộ đun khuấy từ hồi lưu 26
Hình 2.5 Sơ đồ quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết 27
Hình 2.6 Quy trình ngâm chiết berberin 28
Hình 2.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 30 Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 31
Hình 2.9 Đun khuấy từ hồi lưu 32
Hình 2.10 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 33
Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát thể tích ethanol tối ưu 34
Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu 35
Hình 2.13 Các bước thực hiện sắc ký cột 37
Hình 2.14 Bản mỏng sắc ký 39
Hình 2.15 Đo điểm nóng chảy 40
Hình 2.16 Bản mỏng so sánh berberin với một số loại thuốc 41
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết berberin thô theo các tỷ lệ ngâm chiết acid sulfuric khác nhau……… 43
Hình 3.2 Kết quả sắc kí bản mỏng berberin thô chiết bằng các dung dịch acid sulfuric 45 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết berberin thô theo các nồng độ acid sulfuric 46
Trang 10SVTH: LÊ NGỌC HÂN 8
Hình 3.4 Tinh thể berberin thô 47
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết berberin thô theo các tỷ lệ thể tích ethanol khác nhau 49
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ thân rễ hoàng liên gai theo các thời gian khác nhau 51
Hình 3.7 Kết quả sắc kí bản mỏng của berberin thô và berberin chuẩn trong các hệ dung môi 53
Hình 3.8 Kết quả sắc kí lỏng hiệu năng cao ở bước sóng UV- vis 320 nm 55
Hình 3.9 Kết quả sắc kí lỏng hiệu năng cao ở bước sóng UV-vis 280 nm 56
Hình 3.10 Một số phân đoạn sắc ký cột 58
Hình 3.11 Cấu trúc berberin 59
Hình 3.12 Kết quả sắc kí bản mỏng giữa berberin và một số loại thuốc trên thị trường 62
Trang 12SVTH: LÊ NGỌC HÂN 10
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật đa dạng và chứa nhiều công dụng Tác dụng chữa bệnh của cây chính là do các hợp chất tự nhiên có chứa ở trong chúng quyết định Đã có một thời, các sản phẩm hóa dược chiếm ưu thế trên thị trường, còn các cây thuốc, bài thuốc dân tộc có lúc chỉ được quan tâm rất ít hoặc gần như không được coi trọng Nhưng sau nhiều năm sử dụng, một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc tổng hợp đã bộc lộ những nhược điểm, như gây ra những tai biến hoặc tác dụng phụ có hại về lâu dài…Nên xu hướng chung của thế giới, trước hết là các nước đang phát triển quay trở lại với cây cỏ làm thuốc
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể Một xu hướng quan trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc mới Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc Chính vì thế, dược phẩm với hoạt chất từ nguồn thiên nhiên đã trở thành đề tài nghiên cứu hàng đầu được các nhà khoa học quan tâm và ứng dụng rộng rãi
Berberin là alkaloid đã được phát hiện đầu tiên ở các loài Hoàng liên thuộc chi Hoàng liên gai (Berberis) và trong họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) - phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm cả Trung Quốc và Ấn Độ Ở Việt Nam, cây phân bố chủ yếu trên những vùng núi cao Sa Pa tỉnh Lào Cai Trước đây, hoàng liên gai được sử dụng ngâm rượu trị đau răng, huyết áp cao, đau đầu, chóng mặt, đau ngang lưng,
Trang 13Vì vậy, vấn đề đặt ra ở đây là phải nghiên cứu, xây dựng một quy trình chiết xuất berberin từ hoàng liên gai đạt hiệu quả cao, có khả năng ứng dụng trong công nghiệp để tận dụng nguồn dược liệu có sẵn của nước nhà Từ đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
quy trình chiết xuất tối ưu berberin từ cây Hoàng liên gai (Berberis wallichiana
D.C)” Đây sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự
nhiên với độ tinh sạch, hoạt tính cao trong việc phòng và chữa bệnh Mục tiêu đề tài:
- Nghiên cứu quy trình chiết xuất berberin từ Hoàng liên gai - Cô lập và tinh sạch hợp chất berberin thu được
Trang 14Hình 1.1 Hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC)
Cây bụi gai, cao 2-3 m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài 1-1,5 cm
Lá mọc thành chùm 3-4 lá, có khi đến 8 lá trên cùng mốt đốt Cuống lá dạng ngắn 0,5-1 cm, phiến lá nguyên có hình mác, mép có răng cưa to, cứng dài
Trang 15SVTH: LÊ NGỌC HÂN 13
Hoa có màu vàng, mọc thành chùm Quả mọng hình trái xoan, mọc trên cuống khi chính có màu tím đen bên trong có chứa hạt (Đỗ Tất Lợi, 2004)
1.2 Phân bố và sinh thái
Cây hoàng liên gai phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm Trung Quốc và Ấn độ, và một số nước cộng hòa Liên Xô Ở Việt Nam, cây phát triển chủ yếu ở vùng núi cao Lào Cai Hoàng liên gai là cây ưa sáng, ẩm và có khí hậu mát quanh năm Cây thường mọc lẫn với các loại cây bụi khác trên núi đá với độ cao 1600-1700 m (Đỗ Huy Bích, 2004)
Berberin có tên khoa học là 5,6 azonizindeno(5,6-a) anthraacen clorid dihydrat. Một loại alkaloid chủ yếu trong hoàng liên gai, chiếm từ 3 - 4% có tác dụng kháng khuẩn, chữa lỵ, tiêu hóa kém và đau mắt
Trang 16dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-SVTH: LÊ NGỌC HÂN 14
Công thức cấu tạo:
Hình 1.2 Công thức cấu tạo berberin
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
Trang 17Hòa tan 5 mg chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT) Lắc đều, thêm một ít bột cloramin B (TT) sẽ có màu đỏ anh đào (Dược điển Việt Nam IV)
Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với các β-lactam bán tổng hợp (ampicillin và oxacicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim) trên Staphylococcus
aureus và không hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3 (Đinh Thị Liên, 2011)
Trang 18SVTH: LÊ NGỌC HÂN 16
Ở nước ta, năm 1972 Phan Quốc Kinh và Đặng Thị Hồng Vân (Trường Đại học Hà Nội) đã nghiên cứu điều chế berberin từ hoàng liên gai để góp phần chủ yếu dập tắt dịch lỵ trong thời gian đó
Có tác dụng điều trị đau mắt hột ở các giai đoạn khác nhau Sau một đợt điều trị ba
tuần bằng thuốc nhỏ mắt berberin thì đã không tìm thấy vi khuẩn Chlamydia trachomatis
ở mắt bệnh nhân Về điều này, berberin hơn hẳn sulfacetamid
Berberin có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh Streptococus pyogenes Các
nghiên cứu mới nhất chứng minh gần, khi dùng phối hợp berberin với một số kháng sinh sẽ làm hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột (Phan Quốc Kinh, 2009)
Tại Trung Quốc, năm 2006 tác giả Ben Liu và cộng sự đã tách chiết berberine từ thân rễ hoàng liên Trung Quốc sử dụng chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn (Liu, 2006)
Năm 1976, các cơ sở y tế Sài Gòn, quân khu 5, xí nghiệp dược phẩm Hà Nội, Học viện Quân y nghiên cứu chiết xuất berberin hiệu quả thu được: đã chiết được hàng chục tấn berberin clorid tinh khiết Để sản xuất ra hàng loạt viên berberin có hàm lượng 0,05 g thì 1 tấn berberin có thể sản xuất ra khoảng 20 triệu viên
Năm 1982, Proefschrift (Hà Lan) nghiên cứu cây Coscinium fenestratum ởIndonexia Theo tác giả so sánh cây này thấy đồng tên với cây Coscinium usitatum Pierre ở Đông Dương của Pierre tiêu bản số 1312 lưu trữ tại Leningrat, Newyork Nghiên cứu xác định hóa học của vàng đắng thấy có 6 alkaloid: berberin, jatrorrhizin, palmatin, berberubin, magnoflorin, thalifendin Từ alkaloid berberin có thể bán tổng hợp thành những muối khác nhau của berberin và những cộng hợp đồng phân tử (berberin sulfamid ) (Dược liệu chứa alkaloid)
Berberin có tác dụng diệt khuẩn Vibrio cholerae ở nồng độ 35 µg/ml và khuẩn
Staphylococcus aureus ở nồng độ 50 µg/ml Ở nồng độ 10-25 µg/ml, berberin có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài nấm Altemaria spp., Aspergillus flavus,
A.fumigatus,…
Trang 19Berberine có tác dụng bảo vệ gan chống lại CCl4 - gây nhiễm độc gan Berberine có tiềm năng phát triển một loại thuốc mới để điều trị giải độc tính gan (Feng và cs., 2010)
Phương pháp ngâm dầm là phương pháp đơn giản và được sử dụng phổ biến để tách chiết hợp chất tự nhiên Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng bằng cách cho dung môi (pha lỏng) xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật (pha rắn) và hòa tan các hợp chất tự nhiên (Sarker và cs., 2006).
Nguyên liệu sau khi xay nhỏ thành bột sẽ được ngâm trong bình chứa thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn hợp chất có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để dung môi có thể hòa tan hết các hợp chất cần chiết, thỉnh thoảng có thể khuấy trộn hoặc lắc, sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung dịch cố định trong bình mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Trang 20SVTH: LÊ NGỌC HÂN 18
Ưu điểm phương pháp này là dễ thực hiện, rẻ tiền và thiết bị đơn giản Bên cạnh đó phương pháp ngâm nhiều lần giúp chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu (Từ Minh Kóong và cs., 2007).
3.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
3.3 Phương pháp kết tinh
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp kết tinh là dùng một dung môi hữu cơ có độ tan chọn lọc hợp chất quan tâm để tách, tinh chế và thu sản phẩm tinh khiết Bằng cách tạo dung dịch bão hoà ở nhiệt độ cao (thường là nhiệt độ sôi của dung môi), các tạp chất sẽ ở lại trong dung dịch Sau đó kết tinh lại một số lần trong cùng một dung môi, hoặc trong các dung môi khác nhau, người ta có thể thu được tinh thể chất cần tinh chế ở dạng khá tinh khiết (Pavia, 2011).
Bước 1: Hòa tan chất rắn
Chọn dung môi kết tinh phù hợp Hòa tan chất rắn trong lượng tối thiểu dung môi sôi đến khi bão hòa Thêm than hoạt tính để khử màu và tạp chất.
Bước 2: Loại bỏ tạp chất không tan
Gạn lấy dịch trong hay lọc dung dịch nóng qua giấy lọc để loại bỏ các tạp chất không hòa tan hoặc than hoạt tính thêm vào ở các bước trên.
Bước 3: Kết tinh
Trang 21SVTH: LÊ NGỌC HÂN 19
Làm nguội dung dịch thật chậm cho tới khi bằng với nhiệt độ phòng Khi xuất hiện tinh thể, làm mát hỗn hợp trong tủ lạnh Nếu tinh thể không xuất hiện thì gây kết tinh bằng cách: cọ đầu đũa thủy tinh vào thành erlen, cho thêm chất rắn nguyên chất vào dung dịch để tạo mầm, làm bay hơi vượt quá mức bão hoà của dung môi rồi làm mát một lần nữa.
Hình 1.3 Phương pháp kết tinh
Bước 4: Thu nhận và làm khô
Thu tinh thể bằng cách lọc áp suất kém qua phễu Buchner Rửa tinh thể bằng một lượng nhỏ dung môi lạnh Làm khô mẫu ngay trên phễu lọc chân không, để khô tự nhiên hay cho vào tủ sấy.
Trang 22SVTH: LÊ NGỌC HÂN 20
3.4 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)
Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Dựa vào việc sử dụng kích thước hạt silica gel khác nhau làm pha tĩnh và áp suất, người ta chia làm 3 loại sắc ký:
❖ Sắc ký cột thường (Sắc ký cột hở): dùng cột thủy tinh chứa hạt silicagel kích cỡ 60 – 200 μm, áp suất khí quyển
❖ Sắc ký trung áp: kích cỡ hạt: 40 – 63 μm, áp suất 75 – 600 psi
❖ Sắc ký cao áp: cột bằng thép không rỉ chứa hạt silicagel 3 – 10 μm, áp suất 500 – 3000 psi
Với những hỗn hợp cao chiết có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột
Trang 234.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC-MS)
Phương pháp HPLC là phương pháp phổ biến chính trong việc cô lập và tinh sạch các hợp chất tự nhiên hoạt động trong điều kiện: áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, mẫu chất lỏng ở trong dòng chảy của pha động với lượng thể tích lớn, chất khảo sát là thể lỏng và vận tốc lớn
Có nhiều loại giao diện khác nhau dùng cho HPLC-MS như tia nhiệt (thermospray, TSP, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmspheric pressure chemical ionization, APCI), chùm tia hạt (particle beam, PB), phun ion (electrospray, ES),…Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợp chất khảo sát mà sử dụng máy LC-MS phù hợp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
4.3 Phương pháp đo điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy chỉ ra sự tinh khiết của chất được đo Chất càng tinh khiết thì phạm vi nóng chảy của nó càng hẹp Khi chất có nhiều tạp chất sẽ làm cho điểm nóng chảy của nó giảm tỷ lệ thuận với lượng tạp chất (Pavia, 2011)
4.4 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Trang 24SVTH: LÊ NGỌC HÂN 22
Phổ NMR cho ta biết cấu trúc khung sườn carbon – hidrogen của hợp chất hữu cơ, từ đó giúp ta có thể xác định cấu trúc của toàn bộ phân tử Một số hạt nhân nguyên tử có trạng thái spin +1/2 và -1/2 và tính chất này cho phép khảo sát chung bằng phổ NMR, ví dụ: 1H, 13C, 15N, 19F, 31P Phổ 1H-NMR cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết tỷ lệ số hydro (H) trong từng mũi cộng hưởng Ngày nay máy quang phổ NMR thường hoạt động ở tần số 60 – 900 MHz, tần số hoạt động của máy càng cao từ trường bên ngoài càng mạnh thì dộ phân cực của phổ thu được càng tốt (Bruice, 2004).
Trang 25SVTH: LÊ NGỌC HÂN 23
1.1 Đối tượng, phạm vi và phương pháp định danh và xác định cấu trúc hợp chất
Nghiên cứu được thực hiện trên cây hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC) từ
Phòng khám Đông Y Nguyễn Hữu Toàn ở Hải Phòng
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong 03 tháng từ tháng 02 năm 2019 – tháng 05 năm 2019
1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Acid sulfuric (Xilong Scientific Co., Trung Quốc) - Chloroform (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Acid clohydric (VN - Chemsol Co., Việt Nam) - n-Butanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam)
- Ethanol 96% (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Acid acetic (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Methanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Than hoạt tính(VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Silica gel 60 F254 (Merck)
- Berberin chuẩn (Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học, số 01, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
Trang 26- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội
- Hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) gồm hệ thống máy HPLC Ultimate 3000 – Dionex (Thermo scientific, Hoa Kỳ) và đầu do khối phổ MSQ Plus (Thermo scientific, Hoa Kỳ) tại phòng Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học (Số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
Trang 27SVTH: LÊ NGỌC HÂN 25
Hình 2.1 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz
Hình 2.2 Máy đo điểm nóng chảy
Trang 29SVTH: LÊ NGỌC HÂN 27
2.1 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết
Hình 2.5 Sơ đồ quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp ngâm chiết
Trang 30SVTH: LÊ NGỌC HÂN 28
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết alkaloid
Thân rễ cây hoàng liên gai chặt thành lát mỏng, phơi khô rồi xay thô Cân chính xác 30 g dược liệu xay thô cho vào bình chứa Tiến hành ngâm với dung dịch acid sulfuric 0,4% với thể tích và nồng độ phù hợp Thời gian ngâm chiết là 24 giờ
Hình 2.6 Quy trình ngâm chiết berberin
Bước 2: Tinh chế berberin
Dịch alkaloid thu được từ phía trên, thêm muối NaCl dạng rắn với tỷ lệ 3-4% so với lượng dịch chiết, khuấy mạnh cho tan hết muối NaCl Để yên 24 giờ cho berberin kết tủa hết Rửa tủa bằng dung dịch HCl 0,4% sau đó rửa lại với nước cất cho hết phản ứng acid
Trang 31SVTH: LÊ NGỌC HÂN 29
Hòa tan berberin thô vừa thu được với ethanol 96o nóng, tẩy màu với than hoạt tính đun nóng trong 10 phút, lọc bã than; cho dịch lọc vào becher, thực hiện quá trình kết tinh Để yên trong tủ lạnh từ 1 - 2 ngày cho sự kết tinh diễn ra
Khi tinh thể bám trong becher, hút dịch dư còn lại cho vào một becher khác, phần tinh thể được rửa bằng dung môi ethanol 96o để loại tạp chất còn lại Gộp phần dịch còn dư và dung môi rửa tinh thể lại để thực hiện quá trình kết tinh lại.
2.1.1 Khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
Cân 30 g bột thân và rễ hoàng liên gai cho vào bình thủy tinh giống nhau Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu trong dung dịch acid sulfuric 0,4% với tỉ lệ bột nguyên liệu và thể tích dung dịch tăng dần như 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 tương ứng với thể tích là 90 ml, 120 ml, 150 ml, 180 ml Ở mỗi nghiệm thức thực hiện rút dịch chiết và lặp lại hai lần để chiết kiệt các alkaloid cần Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng Thể tích dung dịch H2SO4 tốt nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất chiết xuất của berberin
Trang 32SVTH: LÊ NGỌC HÂN 30
Hình 2.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thể tích dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
2.1.2 Khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu
Bột hoàng liên gai được ngâm chiết trong dung dịch acid sulfuric với thể tích tối ưu ở thí nghiệm trên theo các nồng độ khác nhau như 0,3%, 0,4%, 0,5% và 1% Dịch chiết sau khi lọc được tủa với dung dịch NaCl bão hòa Tiến hành thu tủa như quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất chiết xuất berberin và độ tinh khiết qua sắc kí bản mỏng
Trang 33SVTH: LÊ NGỌC HÂN 31
Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu 2.2 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 g bột nguyên liệu cho vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với ethanol 70%, thời gian tối ưu Sau quá trình chiết thô, cô cạn thành cao sệt
Trang 34SVTH: LÊ NGỌC HÂN 32
Hình 2.9 Đun khuấy từ hồi lưu
Bước 2: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được trong nước nóng để loại bỏ nhựa, lọc lấy dịch sau đó thêm dung dịch NaCl bão hòa và khuấy đều Để yên 24 giờ, lọc lấy tủa và rửa tủa với ethanol 70o
Bước 3: Lọc thu tinh thể
Hòa tan tủa trong ethanol 96%, lọc than hoạt tính trong 10 phút Thu dịch, để yên kết tinh lạnh Thu kết tinh, cân và tính hiệu suất
Trang 35SVTH: LÊ NGỌC HÂN 33
Hình 2.10 Quy trình chiết xuất berberin bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Trang 36SVTH: LÊ NGỌC HÂN 34
2.2.1 Khảo sát thể tích ethanol tối ưu
Cân chính xác 30 g bột hoàng liên gai bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Sau đó thực hiện quá trình đun khuấy từ hồi lưu với các tỷ lệ bột nguyên liệu và dung môi là 1/6, 1/7, 1/8 và 1/9 ứng với các thể tích 180 ml, 210 ml, 240 ml, 270 ml Dịch chiết thu được ở mỗi thí nghiệm được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng Tỷ lệ tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát thể tích ethanol tối ưu
Trang 37SVTH: LÊ NGỌC HÂN 35
2.2.2 Khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu
Cân chính xác 30 g bột hoàng liên gai bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Sau đó thực hiện quá trình đun khuấy từ hồi lưu với các tỷ lệ bột nguyên liệu và dung môi tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên với thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi thí nghiệm được tiếp tục đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát thời gian đun khuấy từ tối ưu
Trang 38SVTH: LÊ NGỌC HÂN 36
2.3 Cô lập berberin có trong hỗn hợp alkaloid
⮚ Phương pháp thực hiện : Sắc ký cột thường hay còn gọi là sắc ký cột hở cổ điển (Classical open – column chromatography)
⮚ Phương pháp nạp chất hấp thu vào cột: nạp chất hấp thu dạng sệt ⮚ Phương pháp nạp mẫu: nạp mẫu dạng dung dịch
Bước 1: Chuẩn bị
- Pha động: khảo sát trước bằng sắc ký bản mỏng và chọn hệ dung môi giải ly là Chloroform : methanol : acid acetic với tỷ lệ (15 : 10 : 1)
- Pha tĩnh: Silica gel cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm, Merck
Sấy silica gel ở 110oC trong 4 giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút Cột thủy tinh có đường kính Φ = 20 mm, chiều dài d = 400 mm được rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá
Bước 2: Nhồi cột
Cho sẵn một lượng dung môi được dùng cho bắt đầu quá trình giải ly cột vào một becher, cho chất hấp thu vào becher đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy đều Dùng phễu đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, mở nhẹ khóa bên dưới để dung môi chảy ra, hứng và một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột
Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột cho đến khi hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su nhỏ khẻ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu được đều trong trong cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột 3 đến 4 lần để cột được chặt, chất hấp thu được đồng nhất (tránh hiện tượng đầu cột không có dung môi sẽ làm khô đầu cột dễ dẫn tới gãy cột) Chiều cao chất hấp thu là 20 cm
Trang 39SVTH: LÊ NGỌC HÂN 37
Bước 3: Nạp mẫu lên cột sắc ký
Hòa tan mẫu vào một lượng dung môi khởi đầu cho quá trình sắc ký cột Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột sau đó đóng khóa lại
Dùng pipet pasteur cho một lượng mẫu chất đặt sát mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột để mẫu chất được đều Tiếp tục dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùng dung môi này để rửa sạch thành cột do dung dịch mẫu bị dính trên thành cột Cho một lớp bông gòn dày khoảng 5 mm đặt nhẹ lên mặt thoáng đầu trên của cột để bảo vệ mặt cột không bị xáo trộn
Bước 4: Triển khai cột
⮚ Phương pháp giải ly: giải ly sử dụng dung môi đường nồng độ
⮚ Dung môi sử dụng để giải ly là chloroform : methanol : acid acetic (15 : 10 : 1)
Hình 2.13 Các bước thực hiện sắc ký cột
Trang 40SVTH: LÊ NGỌC HÂN 38
Bước 5: Hứng và kiểm tra các phân đoạn
Hứng dung dịch giải ly trong chai bi có đánh số thứ tự Mỗi chai bi có lượng thể tích được đánh dấu ở mức 10 ml
Bước 6: Thu hồi và kiểm tra, định lượng các phân đoạn
Thu các phân đoạn giải ly cột Sau đó, các phân đoạn sẽ được sắc ký bản mỏng để gom lại thành những phân đoạn có thành phần giống nhau Từng phân đoạn được tiến hành thu hồi dung môi để thu berberin.
2.4 Định tính berberin thô thu được
2.4.1 Sắc kí bản mỏng
Sản phẩm thu được và berberin chuẩn hòa tan trong nước nóng Chấm mẫu sản phẩm và mẫu chuẩn bằng ống vi quản lên trên bản mỏng đã tráng silica gel 60 F254 Bên trái là chất chuẩn, bên phải là berberin thô thu được Chiều dài chạy mẫu là 8 cm Tiến hành bão hòa bình sắc ký với 4 hệ dung môi khác nhau:
- Hệ dung môi 1: n-Butanol : acetic acid : nước (14 : 3 : 4) (Rojsanga, 2006)
- Hệ dung môi 2: n-Butanol : acid acetic : nước (7 : 1 : 2) (Nair, 1992)
- Hệ dung môi 3: Chloroform : methanol : acid acetic ( 15 : 10 : 1) - Hệ dung môi 4: Chloroform : methanol (4 : 1) (Tani, 1974)
Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 365 nm và ghi nhận lại Rf hiện trên bản Giá trị Rf = khoảng di chuyển của chất (cm)
khoảng di chuyển của dung môi (=10 cm)