nghiên cứu quy trình chiết suất tối ưu isoflavone từ thân rễ cây sắn dây pueraria thomsonii benth

tác dụng giải nhiệt, được sử dụng như một vị thuốc mát, giúp hỗ trợ tiêu hóa, viêm ruột và đau dạ dày,…Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu, công trình khoa học chứng minh tác dụng của dịch c

-x0x - 4^

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Vũ Thị Ngọc Uyên

Ngày sinh: 03/08/1998 Nơi sinh: Đăk Nông

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Y dược Mã sinh viên: 1653010373 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Vũ Thị Ngọc Uyên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Minh Hoàng

Học viên thực hiện: Vũ Thị Ngọc Uyên Lớp: DH16YD01

Tên đề tài: “Nghiên cứu quy trình chiết xuất tối ưu isoflavone từ thân rễ cây sắn dây

(Pueraria Thomsonii Benth.)”

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Vũ Thị Ngọc Uyên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian học trên giảng đường đại học và làm thực tập tốt nghiệp tại khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh là khoảng thời gian mà để lại nhiều kỉ niệm, nhiều cảm giác khó quên trong lòng em Em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người đã giúp đỡ và động viên em trong suốt khoảng thời gian vừa qua

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu, những kinh nghiệm thực tế trong những năm tháng trên giảng đường đại học Chính những kiến thức, những kinh nghiệm mà Thầy Cô giảng dạy đã là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của em đến thầy Nguyễn Minh Hoàng, người Thầy đã truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết, tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu của mình, đồng thời cũng tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp

Ngoài ra, không thể thiếu sự giúp đỡ nhiệt tình của những người bạn, người em, người anh chị đã ở bên động viên trong những năm mới bước chân vào giảng đường đại học này và cả các bạn cùng thực tập, thực hiện nghiên cứu và các em học việc trong phòng Hóa – Môi trường đã đồng hành cùng em trong suốt khoảng thời gian học việc và thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học vừa qua Mọi người đã luôn động viên, khích lệ em, chia sẻ những khó khăn vui buồn trong suốt quá trình học tập và công tác trên giảng đường đại học cũng như trong khoảng thời gian thực hiện nghiên cứu khoa học

Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến gia đình con, Ba Mẹ của con tình cảm chân thành và sâu sắc nhất từ tận đáy lòng con Nhờ có sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt, rèn dũa và tạo mọi điều kiện cho con có thể phát huy hết

được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm yêu thích của mình Cũng như trong suốt thời gian qua không những luôn động viên và ủng hộ con Mà gia đình của con, Ba Mẹ của con còn là một điểm tựa vững chắc, là một tia hy vọng, là một niềm vui, là một lý do giúp cho con nỗ lực cố gắng những lúc con cảm thấy mệt mỏi và khó khăn nhất Con sẽ luôn cố gắng và nỗ lực bước đi trên con đường mà con đã chọn, đi hết con đường tốt đẹp mà Ba Mẹ đã dành tất cả cho con

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót, cũng như bị gián đoạn việc nghiên cứu do đại dịch Covid-19, em rất mong nhận được những ý kiến góp ý để em có thể học hỏi được nhiều kinh nghiệm và đúc kết làm hành trang cho công việc sau này

Với tất cả lòng biết ơn, em xin chúc Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trên con đường giảng dạy Em cũng xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả mọi người và chúc các bạn của em sẽ hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình và thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2020 Sinh viên

Vũ Thị Ngọc Uyên

5.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng định tính các isoflavone có trong hợp chất 15

5.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC – MS) 15

5.3 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 16

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

1.Vật liệu và phương pháp 18

1.1 Đối tượng, phạm vi và phương pháp định danh và xác định cấu trúc hợp chất 18

1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 18

2.Phương pháp nghiên cứu 20

2.1 Quy trình chiết xuất các isoflavone bằng phương pháp ngâm chiết 21

2.2 Quy trình chiết xuất isoflavone bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 25

2.3 Khảo sát tỉ lệ dung môi n-butanol thực hiện chiết lỏng - lỏng tối ưu 27

2.4 Khảo sát hệ dung môi tối ưu để tinh chế isoflavone 28

2.5 Cô lập isoflavone có trong cao n-butanol 28

2.6 Định tính isoflavone thô thu được 32

3.Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 32

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

1.Kết quả khảo sát quy trình ngâm chiết 34

1.1 Kết quả khảo sát nồng độ dung môi EtOH ngâm chiết tối ưu 34

1.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi EtOH ngâm chiết tối ưu 36

2.Kết quả khảo sát quy trình đun khuấy từ hồi lưu 37

2.1 Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu tối ưu 37

2.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi EtOH đun khuấy từ hồi lưu tối ưu38

3. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi n-butanol thực hiện chiết lỏng - lỏng tối ưu

4.Kết quả khảo sát hệ dung môi tối ưu cho sắc ký bản mỏng 41

4.1 Kết quả khảo sát hệ dung môi tối ưu để phân tách trên cao n-butanol ban đầu 41

4.2 Kết quả khảo sát hệ dung môi tối ưu để phân tách isoflavone từ cao phân đoạn SD 2.5 43

5.Kết quả cô lập hợp chất isoflavone bằng sắc kí cột 45

5.1 Kết quả sắc ký cột cao n-butanol ban đầu 45

5.2 Kết quả sắc ký cột trên cao phân đoạn SD 2.5 47

Hình 1.5 Công thức cấu tạo tổng quát của nhóm chất isoflavone 8

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của puerarin 9

Hình 1.7 Cấu trúc phân tử daidzin 9

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử của genistein 10

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử daidzein 10

Hình 1.10 Cấu trúc phân tử genistin 10

Hình 2.1 Cân phân tích Shimadzu ATX224 (trái) và cân kỹ thuật 4100g Ohaus - Mỹ (phải) 19Hình 2.2 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz 19

Hình 2.3 Ngâm chiết thân rễ sắn dây 22

Hình 2.4 Chiết lỏng - lỏng hai pha H2O : n-butanol (1:1) 23

Hình 2.5 Dịch chiết sau 24 giờ ở các thể tích dung môi EtOH 1:4; 1:5; 1:6 24

Hình 2.6 Đun khuấy từ hồi lưu 26

Hình 2.7 Nạp và ổn định cột (trái), triển khai cột (phải) 31

Hình 3.1 Dịch chiết sau 24 giờ ở các nồng độ dung môi EtOH 50o, 60o, 80o, 96o 34

Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu suất các nồng độ dung môi EtOH ngâm chiết 35

Hình 3.3 Kết quả TLC cao n-butanol trong hệ dung môi 4 42

Hình 3.4 Kết quả TLC PĐ 2.5 cho quá trình thực hiện sắc ký cột tiếp theo 43

Hình 3.5 Kết quả TLC một số phân đoạn của cao SD 2.5 46

Hình 3.6 Kết quả TLC một số phân đoạn SD 2.5.2 – SD 2.5.4 48

Hình 3.7 Hợp chất SD II thu được từ phân đoạn SD 2.5.3 48

Hình 3.8 Kết quả TLC cao phân đoạn SD 2.5 và hợp chất SD II 49

Hình 3.9 Kết quả TLC chất SD II thu được 50

Hình 3.10 Cấu trúc daidzein 52

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1.Quy trình nghiên cứu chung 20 Sơ đồ 2.2 Quy trình chiết xuất isoflavone bằng phương pháp ngâm chiết 21 Sơ đồ 2.3 Quy trình chiết xuất isoflavone bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 25 Sơ đồ 2.4 Quy trình cô lập hợp chất từ thân rễ sắn dây 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại các dẫn chất của isoflavone (Zhang và Yang, 2009) 8

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát nồng độ dung môi EtOH ngâm chiết 34

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi EtOH ngâm chiết 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian đun khuấy từ hồi lưu 37

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi EtOH đun khuấy từ hồi lưu 38

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiết lỏng - lỏng 39

Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột trên cao n-butanol 45

Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SD 2.5 47

Bảng 3.8 Hệ số lưu của hợp chất SD II 50

Bảng 3.9 Số liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của chất SD II 51

DANH MỤC VIẾT TẮT

TLC Sắc ký bản mỏng Uv Ultraviolet o

C Nhiệt độ

LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry

NMR Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) Rf Retention factor (hệ số lưu)

CHCl3 Chloroform

MeOH Methanol EA Ethyl acetate

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đất nước Việt Nam ta được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật đa dạng và chứa nhiều công dụng đặc biệt về mặt y học đã được ông cha ta sử dụng từ thời xa xưa Tác dụng chữa bệnh của các cây thực vật dược chính là do các hợp chất tự nhiên có chứa ở trong cây quyết định Đã có một khoảng thời gian, các sản phẩm hóa dược chiếm ưu thế đối với người tiêu dùng và cả trên thị trường, còn các cây thuốc, bài thuốc dân tộc hầu như bị lãng quên, được quan tâm rất ít hoặc gần như không được coi trọng Nhưng sau nhiều năm được ưa chuộng và sử dụng, một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc tổng hợp đã có những nhược điểm, như gây ra những tai biến hoặc tác dụng phụ có hại về lâu dài đối với người tiêu dùng…Nên xu hướng chung của thế giới hiện nay, trước hết là các nước đang phát triển đã và đang quay trở lại với cây cỏ làm thuốc

Những năm gần đây, với những tiến bộ vượt bậc của y học, các hợp chất tự nhiên có dược tính được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu nhằm tạo ra các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên để đáp ứng được các nhu cầu đa dạng của con người Tuy nhiên, các loại thuốc gần đây đều có nguồn gốc tổng hợp và các loại thuốc này không phải là giải pháp tối ưu đối với các quốc gia đang phát triển như Việt Nam, vì khi sử dụng thuốc tổng hợp để điều trị sẽ gây tốn kém và các tác dụng phụ không mong muốn làm ảnh hưởng tới sức khỏe người dùng Để giải quyết vấn đề trên thì việc lựa chọn thuốc có nguồn gốc thảo dược thiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm vì những loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vừa dễ sử dụng, tiết kiệm được chi phí mà còn làm giảm đi những tác dụng phụ không mong muốn Chính vì vậy mà những nghiên cứu về những hợp chất tự nhiên ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi hơn

Cây sắn dây có tên khoa học là Pueraria thomsonii Benth thuộc họ Đậu (Fabaceae) và được trồng rất phổ biến ở nước ta Nhân dân ta từ lâu đã dùng sắn

dây để ứng dụng trong thực phẩm và y học từ các bài thuốc dân gian Sắn dây có

tác dụng giải nhiệt, được sử dụng như một vị thuốc mát, giúp hỗ trợ tiêu hóa, viêm ruột và đau dạ dày,…Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu, công trình khoa học chứng minh tác dụng của dịch chiết sắn dây như: chữa đau đầu (Sewell, 2009), chống oxy hóa (Bebrevska et al, 2010; Guerra et al, 2000), giải rượu (Keung và Vallee, 1998),…

Trong thân rễ cây sắn dây, thành phần quan trọng và có hàm lượng lớn là các isoflavone Trong đó, các isoflavone có hoạt tính estrogen hay còn gọi là các phytoestrogen có tác dụng ngăn ngừa các biểu hiện rối loạn hoocmon cũng như các bệnh về tim mạch, loãng xương hay ung thư vú,…ở phụ nữ thời tiền mãn kinh và còn có tác dụng phòng chống ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới Vì vậy, việc tách chiết thu nhận hợp chất tự nhiên này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Ở Châu Âu, Châu Mỹ, Nhật Bản và Trung Quốc thì các sản phẩm isoflavone từ sắn dây đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong mảng thuốc và thực phẩm chức năng Tuy có nhiều tác dụng như vậy nhưng Việt Nam chúng ta vẫn phải nhập khẩu hoạt chất đó từ Trung Quốc với giá cao

Do đó, vấn đề phải đặt ra là xây dựng quy trình chiết xuất hợp chất isoflavone từ thân rễ cây sắn dây với hiệu suất tốt và độ tinh sạch cao Từ đó, tiến

hành thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT TỐI ƯU

ISOFLAVONE TỪ THÂN RỄ CÂY SẮN DÂY (PUERARIA THOMSONII

BENTH.)”.Đây sẽ là một tiền đề cho việc nghiên cứu chiết xuất các sản phẩm

thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên với độ tinh sạch cao, có hoạt tính cao trong phòng trị bệnh

TỔNG QUAN

1 Tổng quan về cây sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.)

1.1 Tên gọi

Cây sắn dây có tên khoa học là Pueraria thomsonii Benth., thuộc họ Đậu

(Fabaceae) Ngoài tên thông thường của sắn dây còn có những tên khác như: bạch cát, cát căn, cam cát căn, phấn cát, sắn cơm,… (Lê Thị Diên, 2006 và Đỗ Tất Lợi, 2004)

Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou (Pháp)

Hình 1.1 Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.)

1.2 Phân loại

Lớp Ngọc Lan: Magnoliosida Phân lớp Hoa Hồng: Rosidae Bộ Đậu: Fabales

Họ Đậu: Fabacecae

Chi: Pueraria DC

Loài: Pueraria thomsonii Benth

Hình 1.4 Thân rễ sắn dây

Lá kép, mọc so le gồm 3 lá chét, lá chét hình trứng, bản thân lá chét dài 7 – 15 cm, rộng 5 - 12 cm có lông nằm rạp trên 2 mặt lá, cuống lá chết giữa dài, cuống 2 lá chét 2 bên ngắn hơn (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá có màu xanh tím, mùi thơm Quả dẹt, màu vàng, có lông mềm, thắt lại giữa các hạt (Lê Thị Diên, 2006)

1.4 Phân bố và sinh thái

Sắn dây được trồng và mọc hoang dại khắp nơi, đặc biệt là miền rừng núi nước ta Tuy nhiên phần lớn bột sắn dây dùng làm thuốc và thân rễ sắn dây được thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3 - 4 năm sau và nguồn cung cấp chủ yếu là thu hoạch từ cây được trồng trọt (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Mùa hoa: tháng 9 – 10, mùa quả: tháng 11 – 12

1.5 Thành phần hóa học

Hàm lượng tinh bột chiếm phần lớn trong sắn dây,với tỷ lệ 12 – 15% (tính trên rễ tươi) Ngoài ra, còn chứa các thành phần hóa học như saponin và một số isoflavone khác như: daidzein chừng 0,13%, puerarin,… (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hàm lượng các chất cũng như các isoflavone đều bị ảnh hưởng nhiều vào vùng trồng trọt cũng như khoảng thời gian thu hái

1.6 Tác dụng dược lý

Sắn dây có công dụng làm mát huyết, chữa cảm sốt, khát nước, mụn nhọt, ra mồ hôi (Lê Thị Diên, 2006) Không những thế nó còn có tác dụng chữa đau đầu (Sewell, 2009), chống oxy hóa (Bebrevska et al, 2010; Guerra et al, 2000), giải rượu (Keung và Vallee, 1998) Ngoài ra, còn được dùng và hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt, làm đẹp và bảo vệ da, làm chắc và săn chắc vòng một cho phái nữ (Phan Quốc Kinh, 2011),…

Không những thế trong các bài thuốc Đông y cổ truyền sắn dây còn được vận dụng và sử dụng nhiều như: giải nhiệt, chữa nhức đầu, phòng ngừa chướng khí, chữa uốn ván , giải độc, giải rượu,… (Nguyễn Bá Tĩnh, 2007)

2 Sơ lược về isoflavone

Isoflavone thuộc nhóm flavone là nhóm chính được biết có hoạt tính estrogen, có hoạt tính chống oxy hóa, kháng vi sinh vật, , hoạt tính đối với mạch máu,…(Trần Văn Sung et al, 2011), đại diện điển hình là daidzein, glycistein, genistein và puerarin có trong đậu tương, sắn dây,…là phytoestrogen có hoạt tính như nội tiết tố sinh dục nữ estrogen (Đỗ Thị Hoa viên, 2006) Isoflavone được dùng để chống lão hóa, giảm thiểu các triệu chứng thần kinh và tuần hoàn, phòng chống ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới có tác dụng ngăn ngừa các biểu hiện rối loạn hoocmon cũng như các bệnh về tim mạch, loãng xương hay ung thư vú,…

Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenol (các chất có nhiều vòng phenyl) có liên quan với các flavone (isoflavone và flavone khác nhau ở vị trí gắn của vòng benzen) Sự khác biệt trong cấu tạo phân tử giữa isoflavone và flavone ở vị trí gắn nhóm phenyl vào gốc chromone (vị trí 3 ở isoflavone và vị trí 2 ở flavone)

Các isoflavone có mặt nhiều trong thức ăn có nguồn gốc thực vật như các loại rau, hoa quả và ngũ cốc, bao gồm: genistein, daidzein, glycitein, biochanin A và formononetin (trong đó chủ yếu là genistein, daidzein và puerarin)

Công thức cấu tạo:

Hình 1.5 Công thức cấu tạo tổng quát của nhóm chất isoflavone

Bảng 1.1 Bảng phân loại các dẫn chất của isoflavone (Zhang và Yang, 2009)

Daidzein H H H H H Daidzin H Glca H H H Formononetin H H H H CH3

Genistein OH H H H H Genistin OH Glca H H H Genistein8–C–glucose OH H Glca H H Puerarin H H Glca H H PG-1 H H Glca OH H PG-3 H H Glca OCH3 H Neopuerarin H H Glcb H H NeopuerarinA H H Glcc H H NeopuerarinB H H Glcd H H

Glca: β-pyranoglucose Glcb: α-pyranoglucose Glcc: α-furanoglucose Glcd: β-furanoglucose

Tính chất hóa lý của một số chất trong isoflavone

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của puerarin

Hình 1.7 Cấu trúc phân tử daidzin

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử của genistein

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử daidzein

Hình 1.10 Cấu trúc phân tử genistin

Nhiệt độ nóng chảy: 315 - 320℃

Công thức phân tử: C15H10O4 (trọng lượng phân tử 254)

3 Lịch sử nghiên cứu

Trong nước

Năm 2006, Đỗ Thị Hoa Viên đã nghiên cứu cao chiết isoflavone từ thân rễ

cây sắn dây Pueraria thomsonii Benth có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen (trên

51,5% chuột nhắt trắng khi dùng với liều uống 150 mg/con/ngày đã cho kết quả khá rõ rệt)

Nước ngoài

Năm 1997, Peter B.Kaufman và cộng sự bằng cách thực hiện nghiền nguyên vật liệu trong hệ dung môi acetonitrile : H2O (4:1) đã chỉ ra rằng ở các cây họ đậu trên các bộ phận thực vật là nguồn thu tuyệt vời của isoflavone do có nhiều hàm lượng hơn so với ở các hạt giống của chúng

Năm 1999, Xueli Cao và cộng sự đã sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao

với hệ dung môi EA : n-butanol : H2O với tỷ lệ 2:1:3 (v/v/v) tách được 6 hợp chất tinh khiết sau lần chạy sắc ký đầu tiên Các chất tinh chế được có độ tinh khiết cao

Năm 2001, Zhenku Guo và cộng sự đã tiến hành chiết isoflavone từ sắn dây bằng vi sóng Kết quả tuyệt vời của chiết xuất puerarin hỗ trợ vi sóng từ sắn dây trong 1 phút cho thấy một triển vọng tươi sáng cho việc tách chiết các thành phần có hiệu quả từ thảo dược sử dụng chiết xuất bằng lò vi sóng với nước hoặc ethanol như chiết dung môi

Năm 2007, Hua-Neng Xu và cộng sự đã nghiên cứu tìm ra hệ dung môi hai

pha n-butanol : H2O tỷ lệ 1:1 (v/v) không những dùng được cho quá trình chiết rắn - lỏng và tinh chế lỏng - lỏng mà còn giúp chiết được daidzein và isoflavone toàn phần với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi chiết một pha thông thường Ngoài ra, Hua-Neng Xu và cộng sự cũng đã nghiên cứu tinh chế puerarin từ phần

pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol Quá trình tinh chế tương

đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phẩm tinh chế sạch khi phân tích sắc ký (Xu et al., 2007a&b)

Năm 2007, Hua – Neng Xu, Yingxin Zang và Chaohong He bằng việc sử dụng siêu âm hỗ trợ chiết xuất isoflavone đã chỉ ra rằng sản lượng của tổng số isoflavone cao hơn trong chiết xuất khi được hỗ trợ bằng siêu âm cùng với dung môi EtOH 50% so với phương pháp chiết xuất thông thường và các hệ dung môi khác (Xu et al., 2007c)

Năm 2008, Yang Hu và cộng sự nghiên cứu đề xuất một phương pháp mới

để nhanh chóng chiết xuất và làm khô isoflavone từ Pueraria Lobata Ohwi

(Pueraria) bằng cách kết hợp phương pháp siêu âm và chân không vi sóng Thời gian cần thiết để chiết xuất isoflavone bằng phương pháp siêu âm ngắn hơn 20 lần so với phương pháp chiết xuất hồi lưu thông thường Hơn nữa, kết quả thử nghiệm để làm khô chất chiết xuất từ sắn dây cho thấy phương pháp chân không vi sóng nhanh hơn 10 lần so với phương pháp hút chân không hai bước thông thường

Cuối cùng, cấu trúc và thành phần của Pueraria isoflavone thu được bằng phương

pháp siêu âm và chân không vi sóng tương tự như công nghệ được sản xuất bằng

Năm 2012, Jie-Ping Pan và cộng sự đã tạo ra hệ thống hai pha nước dựa trên chất lỏng ion khác nhau (IL-ATPS) được đánh giá để chiết xuất puerarin từ thân rễ

Pueraria lobatae Kết quả chỉ ra rằng nat-ure của IL-ATPS, khả năng loại bỏ muối

và tính acid và tính cơ bản dung dịch giàu muối có ảnh hưởng quan trọng đến việc chiết xuất, hiệu suất chiết xuất của puerarin là hơn 99% bởi trích xuất một bước, chỉ ra rằng IL-ATPS được đánh giá là một phương tiện khai thác tiềm năng

4 Phương pháp chiết xuất và tinh chế 4.1 Phương pháp ngâm dầm

Phương pháp ngâm dầm là phương pháp đơn giản và được sử dụng phổ biến để tách chiết hợp chất tự nhiên Đây là phương pháp chiết xuất rắn – lỏng bằng cách cho dung môi (pha lỏng) xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật (pha rắn) và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Nguyên liệu sau khi xay nhỏ thành bột sẽ được ngâm trong bình chứa thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn hợp chất có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để dung môi có thể hòa tan hết các hợp chất cần chiết, thỉnh thoảng có thể khuấy trộn hoặc lắc, sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung dịch cố định trong bình mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Ưu điểm phương pháp này là dễ thực hiện, rẻ tiền và thiết bị đơn giản Bên cạnh đó phương pháp ngâm nhiều lần giúp chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu (Từ Minh Kóong, 2007)

4.2 Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Bên cạnh đó ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

4.3 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Phương pháp chiết lỏng - lỏng còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Phương pháp chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

4.4 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha : một pha động và một pha tĩnh)

Trong sắc ký cột, pha tĩnh thường được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly

Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Dựa vào việc sử dụng kích thước hạt silica gel khác nhau làm pha tĩnh và áp suất, người ta chia làm 3 loại sắc ký:

- Sắc ký cột thường (Sắc ký cột hở): dùng cột thủy tinh chứa hạt silica gel kích cỡ 60 – 200 μm, áp suất khí quyển

- Sắc ký trung áp: kích cỡ hạt: 40 – 63 μm, áp suất 75 – 600 psi

- Sắc ký cao áp: cột bằng thép không rỉ chứa hạt silica gel 3 – 10 μm, áp suất 500 – 3000 psi

Với những hỗn hợp cao chiết có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực hiện nhiều lần sắc ký cột

5 Phương pháp phân tích isoflavone

5.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng định tính các isoflavone có trong hợp chất

Phương pháp sắc kí bản mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

5.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC – MS)

Phương pháp HPLC là phương pháp phổ biến chính trong việc cô lập và tinh sạch các hợp chất tự nhiên hoạt động trong điều kiện: áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, mẫu chất lỏng ở trong dòng chảy của pha động với lượng thể tích lớn, chất khảo sát là thể lỏng và vận tốc lớn

Có nhiều loại giao diện khác nhau dùng cho HPLC-MS như tia nhiệt

chemical ionization, APCI), chùm tia hạt (particle beam, PB), phun ion (electrospray, ES),…Tùy thuộc vào khối lượng phân tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợp chất khảo sát mà sử dụng máy LC-MS phù hợp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

5.3 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR cho ta biết cấu trúc khung sườn carbon – hidrogen của hợp chất hữu cơ, từ đó giúp ta có thể xác định cấu trúc của toàn bộ phân tử Một số hạt nhân nguyên tử có trạng thái spin ± ½ và tính chất này cho phép khảo sát chung bằng phổ NMR, ví dụ: 1H, 13C, 15N, 19F, 31P Phổ 1H-NMR cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết tỷ lệ số hydro (H) trong từng mũi cộng hưởng Ngày nay máy quang phổ NMR thường hoạt động ở tần số 60 -900 MHz, tần số hoạt động của máy càng cao, từ trường bên ngoài càng mạnh thì độ phân cực của phổ thu được càng tốt

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu và phương pháp

1.1 Đối tượng, phạm vi và phương pháp định danh và xác định cấu trúc hợp chất

Nghiên cứu được thực hiện trên cây sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.)

được thu từ vườn trồng tại xã Yên Lợi, huyện Ý Yên, tỉnh Nam Định

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường thuộc khoa Công nghệ sinh học – Trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh trong 02 tháng từ tháng 05 năm 2020 – tháng 07 năm 2020

1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 1.2.1 Hóa chất

- Chloroform (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - n-Butanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam)

- Ethanol 96% (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Ethyl acetate (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Methanol (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Than hoạt tính (VN – Chemsol Co., Việt Nam) - Silica gel 60 F254(Merck)

1.2.2 Dụng cụ - thiết bị

- Bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 20 × 20 cm (Merck) - Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7 - Máy bơm hút chân không GAST DOA – P504 – BN - Cân kỹ thuật 4100g Ohaus, Mỹ

- Cân phân tích SHIMADZU ATX224 - Đèn UV Vilber Lourmat VL – 6 LC

- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội

Hình 2.1 Cân phân tích Shimadzu ATX224 (trái) và cân kỹ thuật 4100g Ohaus - Mỹ (phải)

2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ 2.1.Quy trình nghiên cứu chung

2.1 Quy trình chiết xuất các isoflavone bằng phương pháp ngâm chiết

Sơ đồ 2.2 Quy trình chiết xuất isoflavone bằng phương pháp ngâm chiết

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết isoflavone bằng phương pháp ngâm chiết

Thân rễ cây sắn dây được chặt thành lát nhỏ, phơi khô rồi xay thô Cân chính xác 30g dược liệu cho vào bình chứa Tiến hành ngâm dược liệu với dung môi EtOH với thể tích và nồng độ phù hợp sẽ được thực hiện khảo sát sau Thời gian ngâm chiết là 24 giờ

Hình 2.3 Ngâm chiết thân rễ sắn dây

Sau thời gian chiết 24 giờ lọc lấy dịch chiết, thực hiện lặp lại quá trình ngâm chiết 3 lần Gộp các dịch chiết lại với nhau, đun đuổi dung môi thu được cao tổng EtOH

Bước 2: Tinh chế cao thô

Cao tổng EtOH thu được ở trên được tiến hành hòa tan với 60 ml H2O Sau

đó được đưa vào bình lóng thực hiện chiết lỏng - lỏng với n-butanol theo tỉ lệ H2O

: n-butanol (1:1) Thực hiện chiết lỏng - lỏng 4 lần để thu được hiệu suất tốt nhất

Hình 2.4 Chiết lỏng - lỏng hai pha H2O : n-butanol (1:1)

Sau đó thu dịch n-butanol Để loại bớt đi 1 ít tạp chất còn sót lại, thực hiện

loại bỏ tạp chất bằng cách lọc nóng với than hoạt tính theo tỉ lệ 0,01% Lọc bỏ bã

than hoạt tính, cô cạn và thu được cao n-butanol

2.1.1 Khảo sát nồng độ dung môi EtOH ngâm chiết tối ưu

Cân 30g bột thân rễ cây sắn dây cho vào các bình thủy tinh giống nhau Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu với dung môi EtOH với các nồng độ EtOH khác nhau là: 50o, 60o, 80o, 96o với tỉ lệ ngâm chiết giữa bột nguyên liệu : dung môi EtOH là 1:5

Thực hiện khảo sát 3 lần, ở mỗi thí nghiệm thực hiện thu dịch chiết và lặp lại ba lần để chiết kiệt các isoflavone cần Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất