chiết suất curcumin ly trích từ thân rễ cây nghệ curcuma longa l

Curcumin chứa trong nghệ đã được các nhà khoa học khẳng định rằng có hiệu quả trong việc hỗ trợ các bệnh mãn tính nan y như: ung thư, bệnh tiểu đường, các bệnh về tim mạch, chống oxy hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

CHIẾT SUẤT CURCUMIN LY TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY

NGHỆ (CURCUMA LONGA L)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Nông Nghiệp – Dược – Môi Trường

GVHD: ThS Nguyễn Minh Hoàng SVTH: Lê Thị Kỳ Duyên

MSSV: 1253010063

Khóa: Công Nghệ Sinh Học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Nguyễn Minh Hoàng đã

tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm hóa –môi trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều

kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày càng gặt hái được nhiều thành công trong công việc

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt chuyên đề thực tập tốt nghiệp của mình và thành công trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện

Lê thị Kỳ Duyên

I.2.2 Cấu trúc của Curcuminoid 13

I.2.3 Hoạt tính sinh học của curcuminoid 14

I.2.4 Ứng dụng của curcuminoid 16

I.2.5 Phương pháp chiết xuất, cô lập tinh chế 17

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

II.1 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 25

II.2 Phương pháp nghiên cứu 26

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

III.1 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT CURCUNIOD TỪ CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU 35

III.1.1 Dung môi Acetone 35

III.1.2 Dung môi Ethanol 96% 35

III.2 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT CURCUMINOID BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT KHÁC NHAU 37

III.3 XÁC ĐỊNH HỆ DUNG MÔI SẮC KÝ BẢN MỎNG CURCUMINOID 38

III.4 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CURCUMINOID 39

DANH MỤC VIẾT TẮT

DMC Demetoxycurcumin BDMC Bisdemetoxycurcumin

NMR Nuclear Magnetic Resonance

TLC: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

TMS Tetra methyl silan

S SingletD Double G Gam

DANH MỤC BẢNG

Bảng I 1 Thành phần hóa học của nghệ Curcuma longa L 11

Bảng I 2 Tính chất hóa lý của curcuminoid 12

Bảng I 3 Cấu trúc các thành phần của curcuminoid 13

Bảng I 4 Một số loại thuốc có thành phần chính là curcuminoid 16

Bảng I 5 Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet 19

Bảng I 6 Ưu và nhược điểm của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 20

Bảng III 1 Hiệu suất các lần chiết curcumin bằng dung môi acetone 35

Bảng III 2 Hiệu suất các lần chiết curcumin bằng dung môi ethanol 96% 35

Bảng III 3 Khối lượng và hiệu suất trung bình các lần chiết curcumin từ 2 dung môi acetone và ethanol 96% 36

Bảng III 4 Khối lượng trung bình và hiệu suất chiết trong thời gian 10 tiếng của hai phương pháp chiết 37

Bảng III 5 Bảng kết quả xác định hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng 38

Bảng III 6 Các phân đoạn sắc ký cột 41

Bảng III 7 So sánh số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 44

DANH MỤC HÌNH

Hình I 1 Curcuma longa L 10

Hình I 2 Công thức hóa học chung của curcuminoid 13

Hình I 3 Công thức cấu tạo của curcumin 14

Hình I 4 Hệ thống chiết Soxhlet 18

Hình I 5 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ tan và nhiệt độ 20

Hình I 6 Các bước kết tinh và thu tinh thể 22

Hình II 4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết tối ưu 29

Hình II 5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát các phương pháp chiết 30

Hình II 6 Các bước thực hiện sắc ký cột: (A) nhồi cột; (B) nạp mẫu; (C) hứng các phân đoạn 34

Hình III 1 hiện tượng hỗ biến ceton-enol 45

Hình III 2 Curcumin C21H20O6 (M=368) 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây với những tiến bộ vượt bậc của y học, các hợp chất tự nhiên có dược tính được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu Nhằm tạo ra các sản phẩm chiết xuất từ tự nhiên để đáp ứng được các nhu cầu đa dạng của con người

Nghệ (Curcuma longa L.) một loại cây có nguồn gốc vùng nhiệt đới Tamil Nadu,

phía đông nam Ấn Độ Từ lâu, nghệ đã được dùng trong thực phẩm và y học Không những với mục đích tạo màu đẹp mà còn có tác dụng phòng và trị một số bệnh như: chất chống ung thư, chống oxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ, chống viêm loét dạ dày- tá tràng[18]

Ngày nay, các nhà khoa học đã khám phá ra hoạt chất tạo nên màu vàng và đem lại dược tính của nghệ vàng là curcuminoid[18]

Curcumin chứa trong nghệ đã được các nhà khoa học khẳng định rằng có hiệu quả trong việc hỗ trợ các bệnh mãn tính nan y như: ung thư, bệnh tiểu đường, các bệnh về tim mạch, chống oxy hóa [4][11] Hiện nay, do hoạt tính sinh học quý giá của hợp chất này nên việc chiết tách và sử dụng của curcumin đang được nhiều nước tiếp tục

nghiên cứu

Nghệ chứa nhiều thành phần khác nhau, nhưng quan trọng nhất vẫn là curcuminoid, hợp chất chủ yếu tạo nên màu vàng đặc trưng và dược tính cho nghệ Curcuminoid được cấu thành từ ba hợp chất chính là: curcumin, demethoxycurcumin( DMC) và bisdemethoxycurcumin(BMC) Nhóm hợp chất này được thu nhận bằng phương pháp chính là trích ly trực tiếp từ củ nghệ nhằm thu hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học nhằm thu hợp chất curcuminoid có độ tinh khiết cao hơn Mặc dù có thể sản xuất được curcumin với độ tinh khiết cao bằng phương pháp tổng hợp hoá học nhưng việc tổng hợp này lại rất tốn kém và không đủ điều kiện Trong khi đó, hàm lượng curcuminoid chứa trong thân rễ cây nghệ khá nhiều, khoảng 2 – 6% trọng lượng khô.[15] Với xu thế ngày càng ưa chuộng các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên thì việc chiết xuất curcuminoid trực tiếp từ thân rễ cây nghệ tỏ ra hiệu quả và kinh tế hơn

Từ đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Chiết suất curcumin ly trích từ thân

rễ cây nghệ (Curcuma longa L.) ”

Mục tiêu nghiên cứu:

Chiết suất curcumin ly trích từ thân rễ cây nghệ (Curcuma longa L.)

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu: thân rễ cây nghệ (Curcuma longa L.) được thu nhận từ

huyện Ngọc Hồi, tỉnh Kon Tum

Phạm vi nghiên cứu: tách chiết curcumin Phương pháp nghiên cứu:

Tách béo bột Nghệ bằng phương pháp chiết Soxhlet

Khảo sát năng suất, thời gian chiết tối ưu, cũng như xác định hệ dung môi phù hợp của Curcumin bằng các phương pháp chiết: Soxhlet, đun khuấy hồi lưu…

Định tính curcumin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng Tách sản phẩm bằng sắc ký cột

PHẦN I TỔNG QUAN

I.1 Tổng quan về cây nghệ I.1.1 Mô tả thực vật

Nghệ có tên khoa học là Curcuma longa L hay Curcuma

domestica Lour Cây thuộc họ Gừng – Zingiberaceae

Trong đông y, tùy theo từng bộ phận được sử dụng mà có từng tên gọi khác nhau Nếu dùng thân rễ của cây thì gọi là

Khương hoàng (Rhizoma Curcuma longae), nếu dùng rễ củ thì gọi là Uất kim (Radix Curcumae longae) Nghệ được

trồng nhiều ở các vùng nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistan, Trung Quốc, Việt Nam… dùng để làm gia vị và làm thuốc Nghệ được thu hoạch sau từ 7 – 9 tháng trồng, thông

thường là vào mùa thu[4][17]

Nghệ là một loại cây thân thảo cao khoảng 0,6 đến 01 mét

Thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng cam sẫm do có chứa chất màu curcumin Lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn dài tới 45cm, rộng tới 18cm, lá khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá non hẹp hơn, màu hơi tím nhạt[4] Cụm hoa mọc từ giữa các lá lên thành hình nón thưa, cánh hoa ngoài màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy Củ nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm Chứa tinh dầu (3-5%) màu vàng nhạt, thơm, ngoài ra còn có tinh bột, canxi oxalat và chất béo.

Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông ở các tỉnh phía Bắc và mùa khô ở các tỉnh phía Nam Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau khi đã ra lá Hoa mọc trên những thân của những chồi năm trước Những thân đã ra hoa thì năm sau không mọc lại nữa và phần thân rễ của chúng trở thành những "củ cái" già, sau 1 – 2 năm bị thối, cho những nhánh non nảy chồi thành các cá thể mới

Hình I 1 Curcuma longa L

I.1.2 Sự phân bố và nguồn gốc của Nghệ

Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy từ Ấn Độ, ở đây nó được trồng ở vùng đồng bằng và trên các đảo Người Ấn dùng một loại tinh chất từ nghệ để rửa mắt trong việc chữa viêm kết mạc Từ thời xa xưa, cây nghệ đã được trồng ở nhiều nơi về sau trở nên hoang dại, trước hết là ở Trung Quốc Ngày nay, nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á Ở Việt Nam, nghệ có trữ lượng khá dồi dào và được trồng ở khắp các địa phương, từ vùng đồng bằng ven biển đến vùng núi cao trên 1500m

I.1.3 Thành phần hóa học

Thân rễ của cây nghệ Curcuma longa L chứa các sắc tố góp phần tạo nên màu đặc

trưng, cùng với tinh dầu, các chất định hương, flavonoid, các chất tạo vị đắng, carbohydrate, protein, chất khoáng và vitamin Thành phần hóa học của nghệ được thể hiện ở bảng sau

Bảng I 1 Thành phần hóa học của nghệ Curcuma longa L

Niacin mg 4,8

Hai thành phần có hoạt tính chính của nghệ là curcuminoid và các chất dễ bay hơi (tinh dầu) Curcuminoid là hợp chất tạo nên màu vàng đặc trưng, chiếm 2 – 6%, là hỗn hợp của 3 loại, trong đó hàm lượng curcumin là cao nhất, sau đó là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Tinh dầu chiếm khoảng 5%, có thành phần chính là các sesquiterpen đặc trưng cho từng loài Trong đó quan trọng nhất là các chất định hương α & β–turmerone và ar-turmerone tạo nên mùi đặc trưng cho nghệ[18][20]

I.2 Curcuminoid I.2.1 Tính chất hóa lý

Là dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, nhiệt độ nóng chảy 179- 183 0C, không mùi, bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng Khi ở dạng dung dịch curcuminoid dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ, tan trong chất béo, ethanol, methanol, diclometan, acetone, acid acetic băng và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở 25 0

C) Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngã tím, tan trong môi trường acid có màu đỏ tươi[9][13]

Bảng I 2 Tính chất hóa lý của curcuminoid

Tên thông thường Curcumin Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin

Tên hóa học

Di-cinnamoyl methane

4-Hydroxy cinnamoyl methane

bis-4-Hydroxy cinnamoyl

methane Công thức phân tử C21H20O6 C20H18O5 C19H16O4

Nhiệt độ nóng 179 – 183 0C 167 – 168 0C 222 – 224 0C

chảy

Dạng tinh thể Hình trụ màu vàng Vô định hình màu vàng cam

Hình phiến màu đỏ tím Tỉ lệ trong hỗn

I.2.2 Cấu trúc của Curcuminoid

Curcuminoid là nhóm chất màu chiết xuất từ thân rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa

L.) Curcuminoid là những dẫn xuất diarylheptan gồm curcumin, demetoxycurcumin, bisdemetoxycurcumin và gần đây còn tìm thấy có một ít cyclocurcumin Chúng là những hợp chất phenolic, hầu hết các dẫn xuất đều khác nhau nhóm thế trên gốc phenyl Lượng curcumin trong bột nghệ khoảng 3-6% Hỗn hợp curcuminoid khoảng 60% curcumin (cur), 19% demetoxycurcumin (DMC), 12% bisdemetoxycurcumin (BDMC)[14][15]

Hình I 2 Công thức hóa học chung của curcuminoid Bảng I 3 Cấu trúc các thành phần của curcuminoid

Danh pháp quốc tế của:

Curcumin: 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione Demetoxycurcumin: 1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta1,6-diene-3,5-dione

Bisdemetoxycurcumin: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione Ngoài thành phần chính là curcuminoid như trên, trong thân rễ nghệ còn có một số đồng phân hình học của chúng, như đồng phân cis – trans curcumin[6]

I.2.3 Hoạt tính sinh học của curcuminoid

Hoạt tính sinh học chủ yếu của curcuminoid là kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng virus và kháng một số loại ung thư Nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm ở các nước trên thế giới đã khẳng định từ lâu rằng hoạt chất curcumin có tác dụng huỷ diệt tế bào ung thư vào loại mạnh Tại Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng curcumin điều trị ung thư và kết luận rằng curcumin có thể kìm hãm sự phát tác của tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang Curcumin còn là chất bổ cho dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương, chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn có hiệu lực Từ nǎm 1993, các nhà khoa học thuộc Đại học Harvard (Mỹ) đã công bố 3 chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và 1 trong 3 chất đó là curcumin[8][9]

Hình I 3 Công thức cấu tạo của curcumin

Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá

Nhóm ceton: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

Tác dụng chống oxy hóa

Trong hoạt động sống hằng ngày, cơ thể luôn sản sinh ra các gốc tự do Các gốc tự do này có khả năng phản ứng rất cao với các hợp chất sinh học trong cơ thể dẫn đến tổn thương mô, quá trình lão hóa sớm Curcuminoid có khả năng chống oxy hóa mạnh, trung hòa cũng như ngăn cản sự tạo thành các gốc tự do như peroxide, hydroxyl Phân tích cấu trúc của curcuminoid thì nhóm –OH trên vòng benzene giữ vai trò quan trọng trong khả năng chống oxy hóa của curcuminoid, chúng sẽ ngăn cản sự peroxide hóa lipid trong cơ thể Nhờ hoạt tính này mà curcuminoid có khả năng giúp phòng chống các bệnh tim mạch, chống lão hóa, tương tự như vitamin E, C và β-caroten[11][18]

Tác dụng khánh nấm, kháng oxy hóa

Curcuminoid kháng mạnh trên vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus và vi khuẩn gram âm như Samonella typhi tương tự như Penicillin và Streptomycin Đối với nấm, curcuminoid ức chế các nấm như Trychophyton gypcum, Candida

albicans, nhất là Aspergillus parasiticus phóng thích aflatoxin, tác nhân gây nhiễm

độc gan thường xảy ra khi dùng thực phẩm đóng hộp[11][18]

Hoạt tính kháng ung thư:

Ung thư là một căn bệnh nan y từ trước đến nay Yêu cầu của thuốc trị ung thư là ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển và di căn của ung thư Tuy nhiên nhược điểm chung của đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay là không có sự chọn lọc cao, đều dễ bị lờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng tóc, buồn nôn Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất

đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu Curcumin là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính Có tác dụng kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối Kết quả là các tế bào ung thư bị vô hiệu hóa nhưng không gây ảnh hưởng đến tế bào lành tính, đồng thời ngăn ngừa sự hình thành tế bào ung thư mới Ngoài ra curcumin còn có tác dụng loại bỏ các men gây ung thư, bắt các gốc tự do gây ung thư Bởi vậy, curcumin có thể giúp cơ thể vừa phòng ngừa vừa chống ung thư một cách hiệu quả[11][18]

I.2.4 Ứng dụng của curcuminoid

Curcuminoid dùng trong dược phẩm đòi hỏi có độ tinh khiết cao, thường trên 95% và dễ hấp thu trong cơ thể người sử dụng Curcuminoid có thể ở dạng bột, viên hay dạng lỏng

Bảng I 4 Một số loại thuốc có thành phần chính là curcuminoid

Esteem Curcumin C3 complex

with Bioperine (InnoMark Inc.) Hoa Kỳ Curcuminoid 95% Piperine Tinh nghệ curcumin (Nghệ An) Việt Nam Curcuminoid 200 g Piperine

98% 2,1 mg BIOMOR Curcumin (Healthy

Curcuminoid 95% 500 mg Bromelain 100 mg

Dược tính của curcumin chiết từ Curcuma longa L khó có thể ứng dụng rộng rãi vì

quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh chóng của nó trong gan và thành ruột Curcumin không bền vững trong ruột và một lượng rất nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái biến Tuy nhiên, việc kết hợp với piperine sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu và giảm đào thải của curcumin trong máu lên rõ rệt Piperine là một chất có khả năng ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình chuyển hoá ở gan và quá trình oxy hóa men ở ruột Với thử nghiệm trên chuột, người ta chia chuột làm

hai nhóm Một nhóm chỉ cho dùng curcumin với liều là 2 g/kg thể trọng, nhóm còn lại cũng dùng với liều là 2 g/kg thể trọng nhưng có kết hợp với piperine liều 20 mg/kg thể trọng Kết quả kiểm tra huyết thanh trong giờ đầu tiên và các giờ tiếp theo cho thấy nồng độ curcumin trong huyết thanh tăng lên đáng kể Piperine đã làm tăng nồng độ curcumin trong huyết thanh cao hơn hẳn tại thời điểm 1 giờ và 2 giờ sau khi uống thuốc (đỉnh điểm ở giờ thứ 2) so với nhóm đối chứng Vậy piperine đã cải thiện khả năng hấp thu curcumin vào máu, thời gian lưu của thuốc được kéo dài hơn, mức độ bán rã giảm đáng kể Thử nghiệm đã cho thấy sinh khả dụng của curcumin khi kết hợp với piperine đã tăng 154% Khi cho thử nghiệm trên các tình nguyện viên, với những người chỉ cho dùng liều curcumin 2 g/kg thể trọng thì sau khi kiểm tra, trong huyết thanh hầu như không tìm thấy curcumin hay với nồng độ rất thấp Với những người cho dùng đồng thời piperine liều 20 mg/kg thể trọng với curcumin liều 2 g/kg thể trọng, kết quả kiểm tra huyết thanh cho thấy nồng độ của cucumin tăng rất cao trong vòng 1 giờ đầu sau khi uống thuốc Thử nghiệm chứng minh được, ở người tính sinh khả dụng của curcumin được kết hợp với piperine đã tăng lên 2000% Nghiên cứu chỉ ra rằng, piperine làm tăng hoạt tính sinh học của Curcumin, giúp tăng hiệu quả hấp thu curcumin trên động vật thí nghiệm và cả trên các tình nguyện viên được thử nghiệm[21]

I.2.5 Phương pháp chiết xuất, cô lập tinh chế I.2.5.1 Phương pháp chiết suất

Phương pháp chiết suất là sử dụng một loại dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng hoà tan chất cần tách, tinh chế và cô lập hợp chất mong muốn

Trong thành phần của bột nghệ khô ngoài curcuminoid còn có chất béo chiếm khoảng từ 8-9% bột nghệ.[14] Chất béo là chất không phân cực nên ta sử dụng dung môi không phân cực để kéo chất béo ra khỏi bột nghệ Các dung môi thường dùng là: n-hexan, ether dầu hỏa…[14]

⮚ Phương pháp chiết bằng hệ thống Soxhlet

Củ nghệ tươi đã được làm sạch rửa bằng khử ion nước, thái lát và phơi khô dưới ánh nắng mặt trời trong một tuần và làm khô một lần nữa ở 500C trong tủ sấy trong 6 giờ Thân rễ khô đã được cắt trong miếng nhỏ, nghiền thành bột bằng máy điện tử Xấp xỉ 20 gm của mẫu đã được đưa vào một cái túi và được đặt trong một hệ thống chiết Soxhlet, đã được thiết lập với các dung môi khác nhau từ không phân cực đến cực 150 ml dung môi đã được bổ sung và chiết suất theo nhiệt độ sôi của nghệ trong 6 giờ

Các dung môi sử dụng là hexane, chloroform,ethyl acetate, methanol, và aceton Và mẫu khô được chiết xuất với hexane trong 2 giờ và chiết xuất hexane đã loại bỏ chất béo và bột nghệ được tái chiết với methanol trong 6 giờ.[14]

Hình I 4 Hệ thống chiết Soxhlet

Bảng I 5 Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet

- Tiết kiệm dung môi, không tốn công lọc và châm thêm dung môi - Dung môi chiết nóng dễ hòa tan

- Chiết kiệt hợp chất do dung môi luôn đổi mới

- Kích thước trụ làm giới hạn khối lượng chiết - Chất chiết trong bình bị đun nóng lâu dễ phân hủy

- Thiết bị phức tạp khó sản xuất quy mô lớn

⮚ Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

Ngâm chiết là một phương pháp chiết suất đơn giản nhất, lợi dụng vào sự khuếch tán của chất cần chiết vào lượng lớn dung môi Phương pháp đun khuấy từ hồi lưu là một biến thể của phương pháp ngâm chiết Hiệu quả của phương pháp này được tăng cao nhờ có sự khuấy trộn thường xuyên kết hợp với gia nhiệt trên máy khuấy từ Ống sinh hàn được lắp thêm để ngăn dung môi bay hơi Nên chiết theo kiểu chiết phân đoạn, chia lượng dung môi ra nhiều lần, để chiết kiệt chất trong mẫu cây[7][17]

Các bột khô (3 g) được chiết suất với 70% ethanol (30 ml) trên máy lắc với 210 rpm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày Dịch chiết được lọc qua máy lọc chân không Phần dung môi sau khi lọc được thu nhận lại Tiếp tục thêm dung môi mới vào mẫu bột

khô đem chiết tiếp Quá trình được lặp đi lặp lại đến khi dịch chiết là không màu.[22]

Bảng I 6 Ưu và nhược điểm của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu

- Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện - Có sự khuấy trộn và gia nhiệt làm tăng hiệu quả chiết

- Phù hợp cơ giới hóa, sản xuất quy mô lớn

- Tốn nhiều công sức lọc, châm dung môi mới - Tốn nhiều dung môi mới chiết kiệt chất ra khỏi mẫu cây

I.2.5.2 Phương pháp cô lập và tinh chế

⮚ Phương pháp kết tinh

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp kết tinh là dùng một dung môi hữu cơ có độ tan chọn lọc với hợp chất quan tâm để tách, tinh chế và thu sản phẩm tinh khiết Bằng cách tạo dung dịch bão hoà ở nhiệt độ cao (thường là nhiệt độ sôi của dung môi), các tạp chất sẽ ở lại trong dung dịch Sau đó kết tinh lại một số lần trong cùng một dung môi, hoặc trong các dung môi khác nhau, người ta có thể thu được tinh thể chất cần tinh chế ở dạng khá tinh khiết

Đồ thị sau thể hiện được mối quan hệ giữa nhiệt độ và tính tan, từ đó ta có thể chọn

Hình I 5 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ tan và nhiệt độ

được dung môi phù hợp cho quá trình kết tinh

Các bước chính trong phương pháp kết tinh[7][17] Bước 1: Hòa tan chất rắn

Xác định dung môi thể hiện tính tan tỉ lệ với nhiệt độ là một đồ thị dạng dốc (thí nghiệm thử – sai, tra sổ tay), đun nóng dung môi mong muốn đến điểm sôi

Hòa tan chất rắn trong lượng tối thiểu dung môi sôi trong erlen

Bước 2: Loại bỏ tạp chất không tan

Gạn lấy dịch trong bằng pipet Pasteur hay lọc dịch nóng qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất không hoà tan

Bước 3: Kết tinh

Làm nguội dung dịch thật chậm cho tới khi bằng với nhiệt độ phòng

Nếu xuất hiện tinh thể, làm mát hỗn hợp trong tủ lạnh và chuyển sang bước 4 Nếu tinh thể không xuất hiện, thực hiện gây kết tinh

Gây kết tinh:

Cọ đầu đũa thủy tinh vào thành erlen

Cho thêm chất rắn nguyên chất vào dung dịch để tạo mầm, nếu có thể Làm mát dung dịch bằng tủ lạnh

Làm bay hơi vượt quá mức bão hoà của dung môi rồi làm mát một lần nữa

Bước 4: Thu nhận và làm khô

Thu nhận tinh thể bằng cách lọc chân không qua phễu Büchner Rửa sạch các tinh thể bằng một lượng nhỏ dung môi lạnh

Tiếp tục hút cho đến khi các tinh thể gần khô Làm khô mẫu ngay trên phễu lọc chân không, để khô tự nhiên hay cho vào tủ sấy

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được

Hình I 6 Các bước kết tinh và thu tinh thể

đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly

Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau[6][7]

.Các bước tiến hành:

bisdemethoxycurcumin Silica sắc ký cột gel

Khoảng 5 mg cao thô Curcuminoids hòa tan trong acetone được trộn với 8 mg của silica gel Cho hỗn hợp thu được lên cột sắc ký đựng đầy silica gel với chiều dài 46 cm, đường kính 2 cm

Rửa cột bằng hệ dung môi chloroform: methanol với sự gia tăng tính phân cực Tất cả các phân đoạn thu được đem kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn 60 F254 với hệ dung môi chloroform : methanol (95:5) được khai triển và hiện hình như những đốm vàng trên bản

Gộp các phân đoạn có 1 vết chất, có Rf và sắc phổ giống hệt nhau Dung môi được làm bay hơi bằng thiết bị cô quay Các chất thu được từ curcuminoid được ký hiệu và đem đi phân tích bằng phổ UV 420 nm

Thanh lọc các curcuminoids:

Các thành phần của curcuminoids thu thập được từ cột sắc ký được hòa tan trong methanol và nước nóng Sau khi hòa tan xong thêm vào chloroform để có được tỷ lệ methanol: chloroform(5: 2) và giữ ở 50C qua đêm Các tinh thể thu được được tách

ra bằng cách lọc Các tinh thể được kết tủa với ether dầu Độ tinh khiết của mỗi chất được phân tích bằng HPLC

Hình I 7 Cấu tạo cột sắc ký I.2.5.3 Phổ 1H-NMR

Phổ NMR cho ta biết cấu trúc khung sườn carbon – hidrogen của hợp chất hữu cơ, từ đó giúp ta có thể xác định cấu trúc của toàn bộ phân tử Một số hạt nhân nguyên tử có trạng thái spin +1/2 và -1/2 và tính chất này cho phép khảo sát chung bằng phổ NMR, ví dụ: 1H, 13C, 15N, 19F, 31P

Phổ 1H-NMR là một kĩ thuật sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ Phổ proton cho biết được số loại proton có trong phân tử Mỗi loại proton đó có tính chất khác nhau vì thế sẽ có độ dịch chuyển khác nhau trên phổ proton Người ta thường sử dụng TMS là một hợp chất trơ, dễ bay hơi để làm chất chuẩn trong phổ proton và độ dịch chuyển của proton trong TMS được chọn là 0 ppm Độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) cho ta biết vị trí của tín hiệu cách gốc chuẩn TMS bao xa, được đo bằng cách lấy khoảng cách từ TMS (Hz) chia cho tần số hoạt động của máy quang phổ (MHz)

Ngày nay máy quang phổ NMR thường hoạt động ở tần số 60 – 900 MHz, tần số hoạt động của máy càng cao từ trường bên ngoài càng mạnh thì dộ phân cực của phổ thu được càng tốt[11]

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

Nghệ tươi (Curcuma longa L.) được thu mua một lần tại huyện Ngọc Hồi, tỉnh Kon

Tum Đây là nghệ vừa trưởng thành được thu hái sau 9 tháng trồng Sau khi lấy về nguyên liệu được chà sạch vỏ, rửa sạch từ 2 – 3 lần trong nước để loại bỏ bụi đất, cắt bỏ những phần bị hư, úng Để nơi thoáng mát cho ráo nước

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hoá – Môi trường, Khoa công nghệ sinh học, trường đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 10/2015 đến tháng 05/2016

Hình II 1 Nghệ tươi sau khi được rửa sạch, cắt bỏ các phần úng hư

Hình II 2 Nghệ được cắt thành lát mỏng

II.2 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình chung

Hình II 3 Sơ đồ quy trình chiết suất curcuminoid từ thân rễ cây nghệ

Curcuma longa L