TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây hoàng đằng
Đặc điểm thực vật
Cây hoàng đằng là một cây dây leo to, rất dài có thể vươn tới ngọn cây lớn Rễ và thân già có vỏ ngoài nứt nẻ và gỗ màu vàng Thân non nhẵn, màu lục Lá mọc so le, hình trái xoan hoặc thuôn mũi mác, dài 9-8 cm, rộng 3-7 cm, phiến dài và nhẵn, 3 gân chính rõ, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới nhạt; cuống lá dài 5-14 cm, phình ở hai đầu Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành chùm phân nhiều nhánh, thường ngắn hơn lá; hoa nhỏ, màu vàng lục; 3 lá đài ngoài nhỏ hình trái xoan, hơi nhọn, 3 lá đài trong khum, rộng và dài hơn; cánh hoa 3, hơi rộng hơn lá đài trong; nhị 3, đối diện với cánh hoa, cong vào trong, bao phấn nhẵn, chỉ nhị rộng dài bằng bao phấn Quả hình trái xoan, khi chín màu vàng, chứa hạt dày, hơi dẹt Mùa hoa quả tháng 3 -7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004) Những đoạn thân và rễ hình trụ thẳng hoặc hơi cong, dài tới 10 cm đến 30 cm, đường kính 1 cm đến 3 cm, có khi tới 10 cm Mặt ngoài màu nâu có nhiều vân dọc và sẹo của cuống lá (đoạn thân) hay sẹo của rễ con (đoạn rễ) Mặt cắt ngang có màu vàng gồm 3 phần rõ rệt: phần vỏ hẹp, phần gỗ có những tia ruột xếp thành hình nan hoa bánh xe, phần ruột ở giữa tròn và hẹp; thể chất cứng, khó bẻ gãy, vị đắng (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
Cây hoàng đằng Fibraurea tinctoria L rất giống loài hoàng đằng Fibraurea recisa Pierre, nhưng khác nhau ở chỗ lá có mũi nhọn rõ; cụm hoa ngắn hơn, ít phân nhánh; lá đài ngoài hình tam giác, mép nham nhở; nhị 6, chỉ nhị dài hơn bao phấn Mùa quả: tháng 5-7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Thành phần hóa học
Trong hoàng đằng chủ yếu là palmatine với tỷ lệ 1 đến 3% Ngoài ra còn có một ít jatrorrhizin, columbanim, berberine
Năm 1967, Hori T và cộng sự tìm ra một diterpenoid cô lập từ hoàng đằng là fibraurin (Hori T và cs., 1967)
Năm 1969, Ito K và Furukawa H đã tìm ra một furanoid diterpene mới trong hoàng đằng là fibleucin (Ito K và cs., 1969)
Năm 1986, Itokawa và cộng sự đã phát hiện ra ba diterpenglycoside mới là tinophylloloside , fibleucinoside và fibraurinoside (Itokawa và cs., 1986)
Năm 2007, Su C R và cộng sự tìm ra bốn loại furanoditerpenoid là fibrauretin
A, fibrauretinoside A, epi-fibrauretinoside A, epi-12-palmatoside G và một glucoside ecdapseoid mới là fibraurecdyside A (Su C R và cs., 2007)
Năm 2008, Su C R và cộng sự đã tìm thấy sáu furanoditerpenoid mới là epi-8- hydroxycolumbin, fibaruretin B, C, D, E, F được cô lập từ thân của cây hoàng đằng (Su
Tác dụng dược lý
Palmatine có tác dụng ức chế sự phát triển của Streptococcus hemolyticus và
Staphylococcus aureus ở nồng độ 0,05% và 0,1%; còn đối với các loại vi khuẩn khác, thí nghiệm trên ống kính không thấy kết quả rõ rệt Tác dụng kháng khuẩn của palmatine kém so với các loại kháng sinh thường dùng Palmatine còn có tác dụng chống nấm như nấm gây viêm âm đạo (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Palmatine ở nồng độ 1:4000 và 1:2000 ức chế Trypanosoma lewisi (Kent) từ 75-100%, còn ở nồng độ thấp hơn (1:8000) ức chế khoảng 50-70% Về hệ thần kinh trung ương, palmatine thí nghiệm trên chuột nhắt trắng cho thấy liều 25-50 mg/kg tiêm xoang bụng có tác dụng ức chế hoạt động tự nhiên và phản xạ của chuột, nhưng không làm giảm trương lực cơ Tuy nhiên, khi tăng liều lên 100 mg/kg, tác dụng giảm trương lực cơ xuất hiện (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004).
1.1.3.3 Tác dụng đối với hệ tim mạch:
Palmatine và jatrorrhizin trên tĩnh mạch đều có tác dụng hạ huyết áp, tác dụng này của palmatine mạnh hơn jatrorrhizin Trên thỏ thí nghiệm, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg làm huyết áp hạ tới 70% và kéo dài trong 5 giờ; không có hiện tượng quen thuốc Trên mèo gây mê, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 2 mg/kg có tác dụng đối kháng với hiện tượng tăng áp do adrenalin và noradrenalin gây nên Trên tiêu bản
SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 6 tuần hoàn chi sau của ếch, palmatine hoàn toàn đối kháng được tác dụng co mạch do adrenalin gây nên Trên chuột cống trắng gây thiếu máu cơ tim thực nghiệm bằng cách thắt động mạch vành tim, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg có tác dụng giảm tần suất xuất hiện rối loạn nhịp tim và giảm tỷ lệ tử vong của động vật thí nghiệm
Palmatine có tác dụng đối kháng với loạn nhịp tim trên các mô hình do chloroform gây nên trên chuột nhắt trắng, do ouabain gây nên trên chuột lang và do aconitin gây nên trên chuột cống trắng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Hoàng đằng có tác dụng chống choáng phản vệ trên chuột lang thí nghiệm, nâng cao tỷ lệ động vật sống sót qua cơn choáng phản vệ (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Làm nguyên liệu chiết palmatin Dùng làm thuốc chữa đau mắt, sốt rét, lỵ, bệnh về gan, chữa viêm ruột, tiêu chảy và dùng làm thuốc bổ đắng (Bài giảng dược liệu 2, 1998)
Ngoài ra, hoàng đằng còn chủ trị viêm họng, mụn nhọt mẩn ngứa, viêm bàng quan (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
Sơ lược về palmatine chloride
Palmatine (IUPAC: 2, 3, 9, 10-tetramethoxy-5, 6-dihydroisoquinolino [2, 1 - b] isoquinolin-7-ium; chloride), có công thức hóa học là C21H22ClNO4, là một alkaloid có cấu trúc protoberberin, nhân isoquinolin
- Palmatine là alkaloid ở thể rắn, màu vàng, không mùi, vị đắng, ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, tan trong ethanol, methanol, ít tan trong chloroform, không tan trong ether Palmatine không có C bất đối, không có đồng phân quang học (Từ Minh Kóong, 2007)
- Nhiệt độ nóng chảy: 203 - 204 0 C (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Hóa tính của Nitơ : Nguyên tố N của palmatine là hydroxyd amoni bậc 4 đem tính kiềm cho phân tử, có thể cho muối cloride với HCl
Môi trường kiềm Môi trường acid
Hóa tính của oxy: có hóa chức ete có thể thủy phân cho alcol, riêng OH trong hydroxyd amoni bậc 4: N không vững bền, trong môi trường kiềm dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là palmatinal tương ứng
Trong các phản ứng hóa học, palmatine có thể trải qua quá trình khử mạch kép tại nhân giữa, dẫn đến mất màu và tạo thành các hydro alkaloid không màu Khi palmatine màu vàng tươi được khử bằng hỗn hợp Zn + H2SO4, nó mất mạch kép, cho ra sản phẩm là các hydro alkaloid không màu.
SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 8 bột vô định hình trắng có độ chảy là 215 0 C là dl – tetrahydropalmatine sulfat, cho tác dụng với amoniac thu được dl – tetrahydropalmatine base, kết tinh trắng, độ chảy 140 -
147 0 C Trái lại l– tetrahydropalmatine trắng đem oxy hóa bằng iod sẽ chuyển thành palmatine màu vàng
Hóa tính của nhóm methoxy (-OCH3): trong công thức của palmatine có bốn nhóm chức methoxy (-OCH3) nên có thể kết hợp với aceton hay cloroform tạo các phức chất (Từ Minh Kóong, 2007)
Palmatine ức chế sự sinh trưởng của chủng Staphylococcus (Yan yu và cs., 2007) Palmatine có thể ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Helicobacter pyroli (H.P), các nghiên cứu đã cho thấy palmatine có tác dụng điều trị các rối loạn dạ dày và ruột liên quan đến vi khuẩn H.P (Jung và cs., 2014) Nghiên cứu cho thấy palmatine có thể được sử dụng làm phương pháp điều trị bổ sung với mục đích tăng hiệu quả của kháng sinh ciprofloxacin cũng như làm giảm sự xuất hiện của Pseudomonas aeruginosa tốt hơn berberine (Aghayan và cs., 2017)
Palmatine có tác dụng kháng nấm mạnh mẽ, đặc biệt hiệu quả đối với Candida parapsilosis Nó ức chế quá trình tổng hợp chitin, một thành phần quan trọng của thành tế bào nấm Hỗn hợp palmatine chloride và berberin chloride đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị bệnh thối da thỏ do Microsporum canis.
1.2.3.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư
Palmatine ức chế sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền liệt (Hambright và cs., 2014) Trong nghiên cứu tìm các nguồn tự nhiên cho các tác nhân trị liệu và phòng ngừa biến chứng tiểu đường, các tác giả đã chỉ ra palmatine là một trong
SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 9 các alkaloid có tác dụng ức chế aldose reductase ở nồng độ ≤ 50 μg / ml (Jung và cs., 2008)
1.2.3.4 Một số công dụng khác
Hoạt chất palmatine chữa đau mắt, tiêu chảy, kiết lỵ, viêm âm đạo do nấm Tetrahydropalmatine clorua được chế từ palmatine là thuốc an thần giảm đau (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Lịch sử nghiên cứu
Năm 2002, Đào Thanh Tùng so sánh 3 phương pháp chiết xuất palmatine từ hoàng đằng thu được kết quả như sau: phương pháp ngâm nóng với dung môi là nước cho hiệu suất tính theo dược liệu là 1,1%, chiết xuất ngược dòng gián đoạn với dung môi là acid acetic cho hiệu suất 1,3%, trong khi đó sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96% , thời gian chiết là 16 giờ cho hiệu suất đạt 1,94 % (Đào Thanh Tùng, 2002)
Theo nghiên cứu của Lê Trường Minh và cộng sự vào năm 2016, chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatine từ hoàng đằng cho độ tinh khiết là 97,31% (Lê Trường Minh và cs., 2016)
Năm 2018, Nguyễn Thị Lan Hương đã tiến hành khảo sát ba loại hạt nhựa cationit: Tulsion CXO – 9, Dower HCR – S, Purolite C100 thu được kết quả hạt Tulsion CXO – 9 là loại cationit acid yếu có dung lượng hấp phụ đạt 122,89 mg/g sau 4 giờ và giải hấp phụ bằng dung dịch HCl 3%/ EtOH 96% đạt hiệu suất 68,49% sau 3 giờ Hiệu suất của quá trình phân lập đạt 87,5% tính theo lượng palmatine có trong dịch chiết hoàng đằng, sản phẩm palmatine thu được có độ tinh khiết 81% (Nguyễn Thị Lan Hương, 2018)
Từ Minh Kóong đã thực hiện chiết palmatine bằng phương pháp chiết ngược dòng gián đoạn với dung môi là cồn 80 0 , dịch chiết được rút ra thu hồi cồn Cặn thêm nước nóng và HCl thu được tủa palmatine clorid, hòa tan tủa trong cồn 90 0 , tẩy màu bằng than hoạt, thu dịch lọc để 24 giờ cho kết tinh, lọc và rửa tinh thể bằng cồn 90 0 (Từ Minh Kóong, 2007)
Một nghiên cứu của Li Jixian và cộng sự chiết xuất palmatine từ Hoàng đằng bằng phương pháp ngâm dưới áp suất giảm, với dung môi H2SO4 1% trong 12 giờ, áp suất duy trì 0,04MPa – 0,05MPa, nhiệt độ 50 – 60 0 C, thời gian chiết là 2 giờ, chiết 2 lần Điều chỉnh pH dịch chiết bằng dung dịch NaOH đến pH 9-10, để yên trong 12 giờ sau đó lọc để loại bỏ tạp chất, cho vào dịch lọc 7-8% NaCl, để lạnh trong 12 giờ, lọc thu được tinh thể palmatine (Li Jixian và cs., 2011)
Năm 2001, Liu Youping và cộng sự đã đưa ra phương pháp ngâm để chiết xuất palmatine từ hoàng đằng, dung môi chiết là H2SO4 0,2%, thời gian chiết lần 1 là 48 giờ,
3 lần còn lại mỗi lần là 24 giờ Tạo tủa thô bằng dung dịch NaCl 7%, kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối ở pH = 2 bằng dung dịch HCl 5% Kết quả cho thấy lượng palmatine là 85% Bên cạnh đó, Liu Youping và cộng sự cũng tiến hành chiết xuất palmatine từ hoàng đằng bằng phương pháp ngâm với dung môi H2SO4 0,2% sau đó dùng nhựa macropopous D101 để phân lập và tinh chế Cho dịch chiết nồng độ 0,5 mg/mL chảy qua cột có chứa hạt macropopous D101 và rửa giải bằng ethanol 40%, cô dịch rửa giải đến cắn thu được palmatine thô (Liu Youping và cs., 2001)
Năm 2013, F S Hall và cộng sự đã tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất và phân lập palmatine từ Tinospora cordifolia Palmatine thu được có thể tăng cường đáng kể nồng độ enzyme chống oxy hóa như glutathione (GSH), superoxide effutase (SOD), catalase và ức chế peroxid hóa lipid do đó cho thấy vai trò của nó trong quá trình giải độc Cả hoạt động của enzyme và phân tích mô học đều cho thấy chất gây ung thư da bị ức chế bằng cách thêm palmatine vào chế độ ăn uống hằng ngày (Hall và cs., 2013).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
Đối tượng, phạm vi thí nghiệm
- Nguyên liệu: Thân rễ cây hoàng đằng (Fibraurea tinctoria L.) từ công ty cổ phần trà thảo dược Trường Xuân Nguyên liệu được sấy khô, xay thành bột
- Thời gian, địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại PTN Hóa – Môi trường Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Ethanol 96% (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
- Methanol (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
- Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
- Acid clohydric (Công ty CP bột giặt và hóa chất Đức Giang)
- n-Butanol (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
- NH3 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
- Chloroform (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
- NaCl (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
- NH4OH (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
- Palmatine chuẩn (Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học – Số 01, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
- Bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab (bình cầu đáy bằng 1000 ml nhám 24/29, ống sinh hàn nhám 24/29, bếp khuấy từ)
- Bộ thu hồi dung môi (bình cầu đáy tròn 1000 ml, ống sinh hàn thẳng, nhiệt kế, đầu chưng cất, nhánh thu dung môi)
- Bộ chiết Soxhlet Isolab (Bình cầu đáy tròn 500 ml nhám 24/29, trụ chiết nhám 45/40 + 24/29, ống sinh hàn nhám 45/40)
- Bản nhôm 20 x 10 cm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck)
- Bể ổn nhiệt Memmert WB7
- Cân kỹ thuật Ohaus PA1402, cân phân tích Shimadzu ATX224
- Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE
- Ống vi quản Hirschamann (Đức)
- Tủ sấy đối lưu Memmert ALM400 (Đức)
- Đèn UV Vilber Lourmat VL – 6LC
- Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11
- Máy HPLC Ultimate 3000 – Dionex (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) và đầu dò khối phổ MSQ Plus (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) tại phòng Hóa học và Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, Q.1, Tp Hồ Chí Minh)
- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội
Hình 2 1: Cân kỹ thuật OHAUS PA1402 (trái) và cân phân tích SHIMADZU
Hình 2 2: Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11
Hình 2 3: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình chiết xuất chung palmatine trong rễ cây hoàng đằng
Hình 2 4: Quy trình chiết palmatine bằng phương pháp ngâm
2.2.2 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp ngâm
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 gam bột hoàng đằng bỏ vào bình thủy tinh ngâm với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu Sau quá trình chiết thô, rút dịch chiết lần một Gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch, phần bã đem chiết thêm hai lần
Hình 2 5: Ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh
Bước 2: Thu dịch chiết palmatine
Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung môi ở nhiệt độ 78 0 C
Hình 2 6: Chưng cất thu hồi dung môi
Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml Khuấy kỹ và để lắng 6h Lọc lấy dịch trong
Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3 Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 4 0 C trong 24 giờ Lọc thu tủa
Hòa tan tủa trong ethanol 96%, đun sôi cách thủy Thêm than hoạt tính, đun sôi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 4 0 C trong 3 ngày Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml) Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 60 0 C trong 4-5h Cân và tính hiệu suất
2.2.2.1 Khảo sát thời gian chiết
Đầu tiên, 30g bột hoàng đằng được ngâm với etanol 96% trong các khoảng thời gian 8 giờ, 16 giờ và 24 giờ Sau đó, dung dịch chiết xuất thu được ở mỗi khoảng thời gian sẽ được tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm thu được sẽ được cân và tính hiệu suất, đồng thời kiểm tra sơ bộ các thành phần có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng Qua đó, thời gian ngâm tối ưu nhất sẽ được xác định và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 2 7: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm
2.2.2.2 Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình thủy tinh Tiến hành ngâm với dung môi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 270 ml, 360 ml và 450 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:9, 1:12, 1:15 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2 8: Sơ đồ khảo sát lượng ethanol tối ưu bằng phương pháp ngâm
2.2.3 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 gam bột hoàng đằng bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu Sau quá trình chiết thô, gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch
Hình 2 9: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu
Bước 2: Thu dịch chiết palmatine
Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung môi ở nhiệt độ 78 0 C
Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml Khuấy kỹ và để lắng 6h Lọc lấy dịch trong
Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3 Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 4 0 C trong 24 giờ Lọc thu tủa
Hòa tan tủa trong ethanol 96%, đun sôi cách thủy Thêm than hoạt tính, đun sôi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 4 0 C trong 3 ngày Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml) Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 60 0 C trong 4-5h Cân và tính hiệu suất
2.2.3.1 Khảo sát thời gian chiết bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình cầu 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung môi ethanol 96% trong các thời gian khảo sát là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2 10: Sơ đồ khảo thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
2.2.3.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình cầu 1000 ml Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung môi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 240 ml, 360 ml và 480 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:8, 1:12, 1:16 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2 11: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
2.2.4 Khảo sát than hoạt tính dùng để tinh chế
Kết tủa sau khi được hòa tan bằng ethanol 96% tiếp tục đem đi tinh chế với than hoạt tính Tiến hành làm 4 nghiệm thức tinh chế khác nhau ở tỉ lệ than hoạt dùng so với lượng palmatine thô Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Nghiệm thức 1: dùng 1% than hoạt tính
- Nghiệm thức 2: dùng 2% than hoạt tính
- Nghiệm thức 3: dùng 3% than hoạt tính
Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng
2.2.5 Cô lập và xác định các thành phần có trong hỗn hợp palmatine
Loại bản mỏng: Bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Độ dài 10 cm Hoạt hóa bản mỏng ở 105 0 C trong 30 phút
Chuẩn bị ly sắc kí: Ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng Cắt giấy lọc hình thang vừa vào ly sắc kí và để giấy lọc ở mặt trong của ly sắc kí (để bão hòa dung môi trong bình) sao cho có khoảng trống để quan sát đường chạy của hệ dung môi Cho lượng dung môi (khoảng 10 ml) vào ly sắc kí sao cho lớp dung môi cao khoảng 0,5-0,7 cm (mực dung môi phải thấp hơn vị trí vết chấm) Để yên cho dung môi trong ly được bão hòa.
Dung môi chạy sắc kí: Sử dụng các hệ dung môi kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh
- Hệ 1: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 7 : 1: 2 (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
- Hệ 2: Methanol : NH4OH 25% : nước tỉ lệ 8 : 1 : 1 (Siwon và cs., 1980)
- Hệ 3: Chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1
- Hệ 4: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 14 : 3 : 4 (Shariatgorji và cs., 2009)
Sản phẩm thu được hòa tan trong methanol Chấm mẫu sản phẩm bằng ống vi quản lên trên bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Chiều dài chạy mẫu là 8 cm Bình khai triển được bão hòa bằng hệ dung môi khảo sát Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm, 365 nm và ghi nhận Rf hiện trên bản
2.2.5.2 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)
Kết quả phân tích mẫu cao thô ly trích từ rễ hoàng đằng được thực hiện tại Phòng Hóa học và các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP HCM)
2.2.5.3 Phương pháp sắc kí cột
Phương pháp thực hiện : sắc kí cột cổ điển (Classical open – column chromatography)
Mẫu được nạp theo phương pháp: nạp mẫu khô
- Pha động: khảo sát trước bằng sắc kí bản mỏng và chọn hỗn hợp hệ dung môi giải ly là chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1
- Pha tĩnh: Silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm, Merck
Hình 2 12: Bản nhôm sắc kí
- Sấy silica gel ở 110 0 C trong bốn giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút Cột thủy tinh có đường kính ϕ = 20 mm, chiều dài d = 400 mm rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá
- Chất hấp thu silica gel được nạp vào cột và nén chặt, chiều cao hấp thu là 35 cm
