Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ CÔ LẬP PALMATINE CHLORIDE TỪ THÂN RỄ CÂY
HOÀNG ĐẰNG (FIBRAUREA TINCTORIA L.)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH Y DƯỢC
CBHD: ThS Nguyễn Minh Hoàng
SVTH: Đặng Hoài Thương MSSV: 1553010202
Tp Hồ Chí Minh , tháng 05 năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ CÔ LẬP PALMATINE CHLORIDE TỪ THÂN RỄ CÂY
HOÀNG ĐẰNG (FIBRAUREA TINCTORIA L.)
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH Y DƯỢC
SVTH: Đặng Hoài Thương MSSV: 1553010202
ThS Nguyễn Minh Hoàng Khóa: 2015 - 2019
Tp Hồ Chí Minh , tháng 05 năm 2019
Trang 3SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG i
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý giá trong những năm tháng trên giảng đường đại học Chính những kiến thức mà Thầy Cô giảng dạy là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy Nguyễn Minh Hoàng, người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thiện đề tài thực tập này
Ngoài ra không thể thiếu sự giúp đỡ của những người bạn thực tập và các em học việc trong phòng Hóa – Môi trường Mọi người đã luôn động viên, chia sẻ những khó khăn vui buồn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện thực tập
Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến Cha Mẹ tình cảm sâu sắc tận đáy lòng con Nhờ sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt và tạo mọi điều kiện cho con có thể phát huy hết được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm yêu thích của mình Con sẽ cố gắng và nỗ lực bước đi hết con đường tốt đẹp mà Cha Mẹ đã dành cho con
Xin cảm ơn tất cả mọi người!
Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Sinh viên
Đặng Hoài Thương
Trang 42.2.Phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1 Quy trình chiết xuất chung palmatine trong rễ cây hoàng đằng 14
2.2.2 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp ngâm 15
2.2.2.1.Khảo sát thời gian chiết 16
2.2.2.2.Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết 17
Trang 5SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG iii2.2.3 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương
pháp đun khuấy từ hồi lưu 18
2.2.3.1.Khảo sát thời gian chiết bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 19
2.2.3.2.Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 20
2.2.4 Khảo sát than hoạt tính dùng để tinh chế 21
2.2.5 Cô lập và xác định các thành phần có trong hỗn hợp palmatine 21
3.1.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết tối ưu 26
3.1.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ ngâm chiết tối ưu 28
3.1.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ than hoạt tính của phương pháp ngâm 29
3.2.Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 32
3.2.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết 32
3.2.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu 34
3.2.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ than hoạt tính của phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 36
3.3.Kết quả cô lập và nhận danh hợp chất thu được 38
3.3.1 Kết quả sắc kí bản mỏng 38
3.3.2 Kết quả chạy HPLC 40
3.3.3 Kết quả cô lập palmatine 42
3.3.4 Kết quả đo điểm nóng chảy 43
3.3.5 Kết quả chạy phổ cộng từ hạt nhân NMR 44
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trang 7NMR: Nuclear Magnetic Resonance
1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13C-NMR: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy cv: Coefficient of variability
TLTK: Tài liệu tham khảo
Trang 8Hình 2 2: Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11 13
Hình 2 3: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz 13
Hình 2 4: Quy trình chiết palmatine bằng phương pháp ngâm 14
Hình 2 5: Ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh 15
Hình 2 6: Chưng cất thu hồi dung môi 15
Hình 2 7: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm 16
Hình 2 8: Sơ đồ khảo sát lượng ethanol tối ưu bằng phương pháp ngâm 17
Hình 2 9: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu 18
Hình 2 10: Sơ đồ khảo thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 19
Hình 2 11: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 20
Hình 2 12: Bản nhôm sắc kí 22
Hình 2 13: Các bước thực hiện sắc ký cột 24
Hình 2 14: Đo điểm nóng chảy của palmatine 25
Hình 3 1: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo thời gian bằng phương pháp ngâm 27
Hình 3 2: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo lượng ethanol bằng phương pháp ngâm 29
Hình 3 3: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất tinh chế cao thô theo tỉ lệ than hoạt tính 31
Hình 3 4: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo thời gian bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 33
Hình 3 5: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất chiết hợp chất từ rễ cây hoàng đằng theo lượng ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu 35
Hình 3 6: Biểu đồ biểu diễn hiệu suất tinh chế cao thô theo tỉ lệ than hoạt tính 37
Trang 9SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG viiHình 3 7: Kết quả sắc kí bản mỏng theo từng hệ dung môi ở bước sóng UV-Vis 254
nm 39
Hình 3 8: Kết quả sắc kí bản mỏng theo từng hệ dung môi ở bước sóng UV-Vis 365 nm 39
Hình 3 9: Kết quả chạy HPLC của mẫu chiết ở bước sóng UV 280 nm 41
Hình 3 10: Kết quả chạy HPLC của mẫu chiết ở bước sóng UV 320 nm 41
Hình 3 11: Bảng mỏng các giai đoạn sắc kí cột 43
Hình 3 12: Cấu trúc palmatine 44
Trang 10SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3 1: Kết quả số liệu thực tế thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm 26Bảng 3 2: Kết quả xử lý thống kê thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm 26Bảng 3 3: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ ngâm chiết tối ưu 28Bảng 3 4: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ ngâm chiết tối ưu 28Bảng 3 5: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp ngâm 30Bảng 3 6: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ than hoạt tính tối ưu bằng phương pháp
đun khuấy từ hồi lưu 30Bảng 3 7: Kết quả số liệu thực tế của thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun
khuấy từ hồi lưu 32Bảng 3 8: Kết quả xử lý thống kê của thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun
khuấy từ hồi lưu 33Bảng 3 9: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp
đun khuấy từ hồi lưu 34Bảng 3 10: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp
đun khuấy từ hồi lưu 35Bảng 3 11: Kết quả số liệu thực tế của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp đun
khuấy từ hồi lưu 36Bảng 3 12: Kết quả xử lý thống kê của tỉ lệ than hoạt tính bằng phương pháp đun
khuấy từ hồi lưu 37Bảng 3 13: Kết quả giá trị Rf sắc kí bản mỏng 40Bảng 3 14: Các phân đoạn sắc ký cột 42Bảng 3 15: Dữ liệu phổ 1H và 13C của hợp chất palmatine cô lập được với tài liệu
tham khảo của tác giả Marek 44
Trang 11SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị (Rao và cs., 2002) Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật (Wink, 1999)
Theo tổ chức Y Tế Thế Giới, 80% dân số ở các nước đang phát triển sử dụng y học cổ truyền hoặc thuốc từ thảo dược để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe Nhu cầu về dược liệu, các sản phẩm từ dược liệu có xu hướng ngày càng gia tăng Theo báo cáo của Bộ Y Tế tính đến năm 2016, nước ta đã ghi nhận có hơn 5.000 loài thực vật được sử dụng làm thuốc
Cây hoàng đằng còn có tên gọi khác là nam hoàng liên, dây vàng giang, có tác dụng thanh nhiệt tiêu viêm, lợi thấp, giải độc (Dược điển Việt Nam IV, 2009) Hoàng đằng có vị đắng, tính hàn, được dùng làm thuốc bổ chữa các chứng viêm tấy, kiết lỵ, tiêu chảy, sốt rét, bệnh về gan, nóng trong người, lở ngứa ngoài da, mắt đỏ có màng, viêm tai chảy mủ (Đỗ Huy Bích và cs., 2004) Ngoài ra, trong nhiều năm trở lại đây, rất nhiều nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính và dược học của hoàng đằng cũng như các thành phần chiết xuất từ rễ cây hoàng đằng, trong đó palmatine chloride được chứng minh là một trong những thành phần chính tạo nên dược tính cao của rễ cây hoàng đằng Palmatine chloride chiết từ hoàng đằng có thể dùng chữa đau mắt, tiêu chảy, lỵ như hoàng đằng (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Trong xu hướng của nền sản xuất dược phẩm ngày nay, các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưu tiên sử dụng hơn Mặt khác, palmatine chloride có ưu
điểm là ít độc, ít tác dụng phụ Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy
trình chiết tách và cô lập palmatine chloride từ thân rễ cây hoàng đằng (Fibraurea
Trang 12SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 2
tinctoria L.)” nhằm chủ động hơn về nguồn nguyên liệu dược phẩm cho đất nước và
ứng dụng trong lĩnh vực y dược, thực phẩm,… Mục tiêu đề tài:
- Khảo sát lượng dung môi, thời gian ly trích, tỉ lệ than hoạt và phương pháp tối ưu trong quy trình chiết tách palmatine chloride có trong thân rễ cây hoàng đằng
(Fibraurea tinctoria L.)
- Cô lập và tinh sạch palmatine thu được bằng sắc kí cột
- Định danh và xác định cấu trúc của palmatine thu được bằng một số phương pháp như: sắc kí bản mỏng, đo điểm nóng chảy, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Trang 13SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 3
1.1 Tổng quan về cây hoàng đằng
Hoàng đằng còn có tên là nam hoàng liên, thích hoàng liên, dây vàng giang, khau khem (Tày), co lạc khem (Thái), tốt choọc, t’rơn (K’dong) Tên khoa học Fibraurea
tinctoria L và Fibraurea recisa Pierre, thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) (Đỗ Huy
Bích và cs., 2004)
Phân loại thực vật: Bộ: Ranunculales
Họ: Menispermaceae
Chi: Fibraurea
Loài: Fibraurea tinctoria L
Hình 1 1: Cây hoàng đằng Fibraurea tinctoria L
Phân bố: chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, từ một số đảo lớn của Indonesia, Philippines, Malaysia đến Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và một số tỉnh phía nam Trung Quốc Ở Việt Nam, cả hai loài đều thấy có ở hầu hết các tỉnh miền núi và
trung du Tuy nhiên loài Fibraurea tinctoria L có vùng phân bố rải rác cả ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Còn loài Fibraurea recisa Pierre lại gặp nhiều hơn ở các tỉnh
Trang 14SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 4phía nam Các tỉnh có nguồn hoàng đằng phong phú là Yên Bái, Lào Cai (các huyện vùng núi thấp), Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình (các huyện phía tây), Quảng Nam, Lâm Đồng, Phú Yên và các tỉnh Tây Nguyên (Đỗ Huy Bích và cs.,2004)
1.1.1 Đặc điểm thực vật
Cây hoàng đằng là một cây dây leo to, rất dài có thể vươn tới ngọn cây lớn Rễ và thân già có vỏ ngoài nứt nẻ và gỗ màu vàng Thân non nhẵn, màu lục Lá mọc so le, hình trái xoan hoặc thuôn mũi mác, dài 9-8 cm, rộng 3-7 cm, phiến dài và nhẵn, 3 gân chính rõ, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới nhạt; cuống lá dài 5-14 cm, phình ở hai đầu Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành chùm phân nhiều nhánh, thường ngắn hơn lá; hoa nhỏ, màu vàng lục; 3 lá đài ngoài nhỏ hình trái xoan, hơi nhọn, 3 lá đài trong khum, rộng và dài hơn; cánh hoa 3, hơi rộng hơn lá đài trong; nhị 3, đối diện với cánh hoa, cong vào trong, bao phấn nhẵn, chỉ nhị rộng dài bằng bao phấn Quả hình trái xoan, khi chín màu vàng, chứa hạt dày, hơi dẹt Mùa hoa quả tháng 3 -7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004) Những đoạn thân và rễ hình trụ thẳng hoặc hơi cong, dài tới 10 cm đến 30 cm, đường kính 1 cm đến 3 cm, có khi tới 10 cm Mặt ngoài màu nâu có nhiều vân dọc và sẹo của cuống lá (đoạn thân) hay sẹo của rễ con (đoạn rễ) Mặt cắt ngang có màu vàng gồm 3 phần rõ rệt: phần vỏ hẹp, phần gỗ có những tia ruột xếp thành hình nan hoa bánh xe, phần ruột ở giữa tròn và hẹp; thể chất cứng, khó bẻ gãy, vị đắng (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
Cây hoàng đằng Fibraurea tinctoria L rất giống loài hoàng đằng Fibraurea
recisa Pierre, nhưng khác nhau ở chỗ lá có mũi nhọn rõ; cụm hoa ngắn hơn, ít phân
nhánh; lá đài ngoài hình tam giác, mép nham nhở; nhị 6, chỉ nhị dài hơn bao phấn Mùa quả: tháng 5-7 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Trang 15SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 5Năm 1969, Ito K và Furukawa H đã tìm ra một furanoid diterpene mới trong hoàng đằng là fibleucin (Ito K và cs., 1969)
Năm 1986, Itokawa và cộng sự đã phát hiện ra ba diterpenglycoside mới là tinophylloloside , fibleucinoside và fibraurinoside (Itokawa và cs., 1986)
Năm 2007, Su C R và cộng sự tìm ra bốn loại furanoditerpenoid là fibrauretin
A, fibrauretinoside A, epi-fibrauretinoside A, epi-12-palmatoside G và một glucoside
ecdapseoid mới là fibraurecdyside A (Su C R và cs., 2007)
Năm 2008, Su C R và cộng sự đã tìm thấy sáu furanoditerpenoid mới là
epi-8-hydroxycolumbin, fibaruretin B, C, D, E, F được cô lập từ thân của cây hoàng đằng (Su C R và cs., 2008)
1.1.3 Tác dụng dược lý
1.1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn:
Palmatine có tác dụng ức chế sự phát triển của Streptococcus hemolyticus và
Staphylococcus aureus ở nồng độ 0,05% và 0,1%; còn đối với các loại vi khuẩn khác,
thí nghiệm trên ống kính không thấy kết quả rõ rệt Tác dụng kháng khuẩn của palmatine kém so với các loại kháng sinh thường dùng Palmatine còn có tác dụng chống nấm như nấm gây viêm âm đạo (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
1.1.3.2 Tác dụng kháng Trypanosoma:
Palmatine với nồng độ 1:4000 và 1:2000 đối với Trypanosoma lewisi (Kent) ức
chế được 75-100%, còn với nồng độ thấp hơn (1:8000) thì ức chế được khoảng 50-70% Đối với hệ thần kinh trung ương: palmatine thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, tiêm xoang bụng với liều 25-50 mg/kg có tác dụng ức chế hoạt động tự nhiên và hoạt động phản xạ của chuột nhưng không làm giảm trương lực cơ nếu tăng liều (100 mg/kg) thì tác dụng giảm trương lực cơ xuất hiện (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
1.1.3.3 Tác dụng đối với hệ tim mạch:
Palmatine và jatrorrhizin trên tĩnh mạch đều có tác dụng hạ huyết áp, tác dụng này của palmatine mạnh hơn jatrorrhizin Trên thỏ thí nghiệm, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg làm huyết áp hạ tới 70% và kéo dài trong 5 giờ; không có hiện tượng quen thuốc Trên mèo gây mê, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 2 mg/kg có tác dụng đối kháng với hiện tượng tăng áp do adrenalin và noradrenalin gây nên Trên tiêu bản
Trang 16SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 6tuần hoàn chi sau của ếch, palmatine hoàn toàn đối kháng được tác dụng co mạch do adrenalin gây nên Trên chuột cống trắng gây thiếu máu cơ tim thực nghiệm bằng cách thắt động mạch vành tim, palmatine tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg có tác dụng giảm tần suất xuất hiện rối loạn nhịp tim và giảm tỷ lệ tử vong của động vật thí nghiệm
Palmatine có tác dụng đối kháng với loạn nhịp tim trên các mô hình do chloroform gây nên trên chuột nhắt trắng, do ouabain gây nên trên chuột lang và do aconitin gây nên trên chuột cống trắng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
Ngoài ra, hoàng đằng còn chủ trị viêm họng, mụn nhọt mẩn ngứa, viêm bàng quan (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
1.2 Sơ lược về palmatine chloride
1.2.1 Phân loại
Palmatine (IUPAC: 2, 3, 9, 10-tetramethoxy-5, 6-dihydroisoquinolino [2, 1 - b] isoquinolin-7-ium; chloride), có công thức hóa học là C21H22ClNO4, là một alkaloid có cấu trúc protoberberin, nhân isoquinolin
Hình 1 2: Palmatine chloride
Trang 17SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 7
1.2.2 Tính chất hóa lý 1.2.2.1 Tính chất vật lý
- Palmatine là alkaloid ở thể rắn, màu vàng, không mùi, vị đắng, ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, tan trong ethanol, methanol, ít tan trong chloroform, không tan trong ether Palmatine không có C bất đối, không có đồng phân quang học (Từ Minh Kóong, 2007)
- Nhiệt độ nóng chảy: 203 - 2040C (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
1.2.2.2 Tính chất hóa học
Hóa tính của Nitơ : Nguyên tố N của palmatine là hydroxyd amoni bậc 4 đem tính kiềm cho phân tử, có thể cho muối cloride với HCl
Môi trường kiềm Môi trường acid
Hóa tính của oxy: có hóa chức ete có thể thủy phân cho alcol, riêng OH trong hydroxyd amoni bậc 4: N không vững bền, trong môi trường kiềm dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là palmatinal tương ứng
Trang 18SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 8bột vô định hình trắng có độ chảy là 2150C là dl – tetrahydropalmatine sulfat, cho tác dụng với amoniac thu được dl – tetrahydropalmatine base, kết tinh trắng, độ chảy 140 - 1470C Trái lại l– tetrahydropalmatine trắng đem oxy hóa bằng iod sẽ chuyển thành palmatine màu vàng
Hóa tính của nhóm methoxy (-OCH3): trong công thức của palmatine có bốn nhóm chức methoxy (-OCH3) nên có thể kết hợp với aceton hay cloroform tạo các phức chất (Từ Minh Kóong, 2007)
ciprofloxacin cũng như làm giảm sự xuất hiện của Pseudomonas aeruginosa tốt hơn
berberine (Aghayan và cs., 2017)
1.2.3.2 Tác dụng kháng nấm
Palmatine có tác dụng kháng nấm tốt và ức chế đáng kể sự phát triển của Candida
albicans, Candida glabrata, Candida krusei và Candida parapsilosis, thể hiện mạnh
nhất trên Candida parapsilosis (MIC 16 mg/L) Palmatine ức chế tổng hợp chitin từ cả nấm men và các giai đoạn tăng trưởng của nấm Candida albicans một cách không cạnh
tranh (Park và cs., 1999) Hỗn hợp của palmatine chloride và berberin chloride có thể
được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh thối da thỏ do Microsporum canis gây ra (Xiao
và cs., 2015)
1.2.3.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư
Palmatine ức chế sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền liệt (Hambright và cs., 2014) Trong nghiên cứu tìm các nguồn tự nhiên cho các tác nhân trị liệu và phòng ngừa biến chứng tiểu đường, các tác giả đã chỉ ra palmatine là một trong
Trang 19SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 9các alkaloid có tác dụng ức chế aldose reductase ở nồng độ ≤ 50 μg / ml (Jung và cs., 2008)
1.2.3.4 Một số công dụng khác
Hoạt chất palmatine chữa đau mắt, tiêu chảy, kiết lỵ, viêm âm đạo do nấm Tetrahydropalmatine clorua được chế từ palmatine là thuốc an thần giảm đau (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)
1.3 Lịch sử nghiên cứu
1.3.1 Trong nước
Năm 2002, Đào Thanh Tùng so sánh 3 phương pháp chiết xuất palmatine từ hoàng đằng thu được kết quả như sau: phương pháp ngâm nóng với dung môi là nước cho hiệu suất tính theo dược liệu là 1,1%, chiết xuất ngược dòng gián đoạn với dung môi là acid acetic cho hiệu suất 1,3%, trong khi đó sử dụng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96% , thời gian chiết là 16 giờ cho hiệu suất đạt 1,94 % (Đào Thanh Tùng, 2002)
Theo nghiên cứu của Lê Trường Minh và cộng sự vào năm 2016, chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatine từ hoàng đằng cho độ tinh khiết là 97,31% (Lê Trường Minh và cs., 2016)
Năm 2018, Nguyễn Thị Lan Hương đã tiến hành khảo sát ba loại hạt nhựa cationit: Tulsion CXO – 9, Dower HCR – S, Purolite C100 thu được kết quả hạt Tulsion CXO – 9 là loại cationit acid yếu có dung lượng hấp phụ đạt 122,89 mg/g sau 4 giờ và giải hấp phụ bằng dung dịch HCl 3%/ EtOH 96% đạt hiệu suất 68,49% sau 3 giờ Hiệu suất của quá trình phân lập đạt 87,5% tính theo lượng palmatine có trong dịch chiết hoàng đằng, sản phẩm palmatine thu được có độ tinh khiết 81% (Nguyễn Thị Lan Hương, 2018)
Từ Minh Kóong đã thực hiện chiết palmatine bằng phương pháp chiết ngược dòng gián đoạn với dung môi là cồn 800, dịch chiết được rút ra thu hồi cồn Cặn thêm nước nóng và HCl thu được tủa palmatine clorid, hòa tan tủa trong cồn 900, tẩy màu bằng than hoạt, thu dịch lọc để 24 giờ cho kết tinh, lọc và rửa tinh thể bằng cồn 900 (Từ Minh Kóong, 2007)
Trang 20SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 10
1.3.2 Ngoài nước
Một nghiên cứu của Li Jixian và cộng sự chiết xuất palmatine từ Hoàng đằng bằng phương pháp ngâm dưới áp suất giảm, với dung môi H2SO4 1% trong 12 giờ, áp suất duy trì 0,04MPa – 0,05MPa, nhiệt độ 50 – 600C, thời gian chiết là 2 giờ, chiết 2 lần Điều chỉnh pH dịch chiết bằng dung dịch NaOH đến pH 9-10, để yên trong 12 giờ sau đó lọc để loại bỏ tạp chất, cho vào dịch lọc 7-8% NaCl, để lạnh trong 12 giờ, lọc thu được tinh thể palmatine (Li Jixian và cs., 2011)
Năm 2001, Liu Youping và cộng sự đã đưa ra phương pháp ngâm để chiết xuất palmatine từ hoàng đằng, dung môi chiết là H2SO4 0,2%, thời gian chiết lần 1 là 48 giờ, 3 lần còn lại mỗi lần là 24 giờ Tạo tủa thô bằng dung dịch NaCl 7%, kết tinh lại trong ethanol tuyệt đối ở pH = 2 bằng dung dịch HCl 5% Kết quả cho thấy lượng palmatine là 85% Bên cạnh đó, Liu Youping và cộng sự cũng tiến hành chiết xuất palmatine từ hoàng đằng bằng phương pháp ngâm với dung môi H2SO4 0,2% sau đó dùng nhựa macropopous D101 để phân lập và tinh chế Cho dịch chiết nồng độ 0,5 mg/mL chảy qua cột có chứa hạt macropopous D101 và rửa giải bằng ethanol 40%, cô dịch rửa giải đến cắn thu được palmatine thô (Liu Youping và cs., 2001)
Năm 2013, F S Hall và cộng sự đã tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất và phân
lập palmatine từ Tinospora cordifolia Palmatine thu được có thể tăng cường đáng kể
nồng độ enzyme chống oxy hóa như glutathione (GSH), superoxide effutase (SOD), catalase và ức chế peroxid hóa lipid do đó cho thấy vai trò của nó trong quá trình giải độc Cả hoạt động của enzyme và phân tích mô học đều cho thấy chất gây ung thư da bị ức chế bằng cách thêm palmatine vào chế độ ăn uống hằng ngày (Hall và cs., 2013)
Trang 21SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 11
2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng, phạm vi thí nghiệm
- Nguyên liệu: Thân rễ cây hoàng đằng (Fibraurea tinctoria L.) từ công ty cổ phần
trà thảo dược Trường Xuân Nguyên liệu được sấy khô, xay thành bột
- Thời gian, địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại PTN Hóa – Môi trường Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất
- Ethanol 96% (VN-Chemsol Co., Việt Nam) - Methanol (VN-Chemsol Co., Việt Nam)
- Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc) - Acid clohydric (Công ty CP bột giặt và hóa chất Đức Giang)
- n-Butanol (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
- NH3 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc) - Chloroform (VN-Chemsol Co., Việt Nam) - NaCl (Xilong Scientific Co., Trung Quốc) - NH4OH (VN-Chemsol Co., Việt Nam) - Silica gel 60 F254 (Merck)
- Palmatine chuẩn (Phòng Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hóa học – Số 01, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh)
Trang 22SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 12- Bể ổn nhiệt Memmert WB7
- Cân kỹ thuật Ohaus PA1402, cân phân tích Shimadzu ATX224 - Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE
- Máy HPLC Ultimate 3000 – Dionex (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) và đầu dò khối phổ MSQ Plus (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) tại phòng Hóa học và Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, Q.1, Tp Hồ Chí Minh)
- Phổ NMR: đo phổ bằng máy Bruker Avance III 500 MHz tại Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân thuộc Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Q Cầu Giấy, Hà Nội
Hình 2 1: Cân kỹ thuật OHAUS PA1402 (trái) và cân phân tích SHIMADZU ATX224 (phải)
Trang 23SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 13
Hình 2 2: Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11
Hình 2 3: Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz
Trang 24SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 14
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình chiết xuất chung palmatine trong rễ cây hoàng đằng
Hình 2 4: Quy trình chiết palmatine bằng phương pháp ngâm
Trang 25SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 15
2.2.2 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp ngâm
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 gam bột hoàng đằng bỏ vào bình thủy tinh ngâm với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu Sau quá trình chiết thô, rút dịch chiết lần một Gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch, phần bã đem chiết thêm hai lần
Hình 2 5: Ngâm nguyên liệu trong bình thủy tinh
Bước 2: Thu dịch chiết palmatine
Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung môi ở nhiệt độ 780C
Hình 2 6: Chưng cất thu hồi dung môi
Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml Khuấy kỹ và để lắng 6h Lọc lấy dịch trong
Bước 4: Kết tinh palmatine
Trang 26SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 16Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3 Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 40C trong 24 giờ Lọc thu tủa
Hòa tan tủa trong ethanol 96%, đun sôi cách thủy Thêm than hoạt tính, đun sôi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 40C trong 3 ngày Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml) Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 600C trong 4-5h Cân và tính hiệu suất
2.2.2.1 Khảo sát thời gian chiết
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình thủy tinh Tiến hành ngâm với dung môi ethanol 96% trong các thời gian khảo sát là 8 giờ, 16 giờ và 24 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2 7: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm
Trang 27SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 17
2.2.2.2 Khảo sát tỉ lệ ngâm chiết
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình thủy tinh Tiến hành ngâm với dung môi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 270 ml, 360 ml và 450 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:9, 1:12, 1:15 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2 8: Sơ đồ khảo sát lượng ethanol tối ưu bằng phương pháp ngâm
Trang 28SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 18
2.2.3 Quy trình chiết xuất palmatine trong rễ cây hoàng đằng bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30 gam bột hoàng đằng bỏ vào bình cầu đáy bằng 1000 ml và được đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu với lượng ethanol 96% để khảo sát thời gian chiết tối ưu Sau quá trình chiết thô, gạn lấy phần trong, lọc, ép lấy dịch
Hình 2 9: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu
Bước 2: Thu dịch chiết palmatine
Gộp dịch chiết đã lọc lại với nhau cho vào bình cầu 1000 ml, bỏ thêm 1 viên đá bọt vào rồi tiến hành thu hồi dung môi ở nhiệt độ 780C
Bước 3: Thu tinh thể và loại bỏ tạp chất
Hòa tan cao thu được vào 100 ml nước sôi trong becher 250 ml Khuấy kỹ và để lắng 6h Lọc lấy dịch trong
Bước 4: Kết tinh palmatine
Thêm từ từ dung dịch HCl 10% vào, vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH 2 -3 Cân 5 gam muối NaCl và thêm vào, khuấy đều cho tan hoàn toàn, để yên trong tủ lạnh ở 40C trong 24 giờ Lọc thu tủa
Trang 29SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 19Hòa tan tủa trong ethanol 96%, đun sôi cách thủy Thêm than hoạt tính, đun sôi tiếp 10 phút, lấy ra lọc nóng, thu dịch lọc Để nguội dịch lọc sau đó kết tinh trong tủ lạnh ở 40C trong 3 ngày Lọc lấy kết tinh, rửa bằng ethanol 96% lạnh 2 lần (mỗi lần 5 ml) Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 600C trong 4-5h Cân và tính hiệu suất
2.2.3.1 Khảo sát thời gian chiết bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình cầu 1000 ml và đặt trên máy đun khuấy từ hồi lưu Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung môi ethanol 96% trong các thời gian khảo sát là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng Thời gian tối ưu nhất từ thí nghiệm trên sẽ được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2 10: Sơ đồ khảo thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Trang 30SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 20
2.2.3.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Cân chính xác 30 gam bột hoàng đằng cho vào bình cầu 1000 ml Tiến hành đun khuấy từ hồi lưu với dung môi ethanol 96% theo các thể tích khác nhau là 240 ml, 360 ml và 480 ml tương ứng với tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1:8, 1:12, 1:16 trong khoảng thời gian tối ưu đã được khảo sát ở thí nghiệm trên Dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức tiếp tục được đem đi tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra sơ bộ các cấu tử có trong cao thô bằng sắc ký bản mỏng
Hình 2 11: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ethanol tối ưu bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu
Trang 31SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 21
2.2.4 Khảo sát than hoạt tính dùng để tinh chế
Kết tủa sau khi được hòa tan bằng ethanol 96% tiếp tục đem đi tinh chế với than hoạt tính Tiến hành làm 4 nghiệm thức tinh chế khác nhau ở tỉ lệ than hoạt dùng so với lượng palmatine thô Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần
- Nghiệm thức 1: dùng 1% than hoạt tính - Nghiệm thức 2: dùng 2% than hoạt tính - Nghiệm thức 3: dùng 3% than hoạt tính
Sản phẩm được cân tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng
2.2.5 Cô lập và xác định các thành phần có trong hỗn hợp palmatine 2.2.5.1 Sắc kí bản mỏng
Loại bản mỏng: Bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Độ dài 10 cm Hoạt hóa bản mỏng ở 1050C trong 30 phút
Chuẩn bị ly sắc kí: Ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng Cắt giấy lọc hình thang vừa vào ly sắc kí và để giấy lọc ở mặt trong của ly sắc kí (để bão hòa dung môi trong bình) sao cho có khoảng trống để quan sát đường chạy của hệ dung môi Cho lượng dung môi (khoảng 10 ml) vào ly sắc kí sao cho lớp dung môi cao khoảng 0,5-0,7 cm (mực dung môi phải thấp hơn vị trí vết chấm) Để yên cho dung môi trong ly được bão hòa.
Dung môi chạy sắc kí: Sử dụng các hệ dung môi kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh
- Hệ 1: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 7 : 1: 2 (Dược điển Việt Nam IV, 2009)
- Hệ 2: Methanol : NH4OH 25% : nước tỉ lệ 8 : 1 : 1 (Siwon và cs., 1980) - Hệ 3: Chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1
- Hệ 4: n-Butanol : acid acetic : nước tỉ lệ 14 : 3 : 4 (Shariatgorji và cs., 2009)
Sản phẩm thu được hòa tan trong methanol Chấm mẫu sản phẩm bằng ống vi quản lên trên bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F254 Chiều dài chạy mẫu là 8 cm Bình khai triển được bão hòa bằng hệ dung môi khảo sát Hiện hình bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm, 365 nm và ghi nhận Rf hiện trên bản
Giá trị Rf = ả ể ủ ấ ( )
Trang 32SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 22
2.2.5.2 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)
Kết quả phân tích mẫu cao thô ly trích từ rễ hoàng đằng được thực hiện tại Phòng Hóa học và các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, TP HCM)
Chất chuẩn
Hình 2 12: Bản nhôm sắc kí
Trang 33SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 23- Sấy silica gel ở 1100C trong bốn giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm 30 phút
Cột thủy tinh có đường kính ϕ = 20 mm, chiều dài d = 400 mm rửa sạch, sấy khô, dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá
Bước 3: Nạp mẫu lên cột sắc kí
Nghiền mịn mẫu rồi trộn đều với silica gel theo tỷ lệ 1 : 1 về khối lượng Nạp hỗn hợp mẫu và silica gel vào cột Dùng pipet Pasteur cho một lượng nhỏ dung môi giải ly lên đầu cột, tranh thủ dùng dung môi này để rửa sạch thành cột do dung dịch mẫu bị dính lên thành cột Cho một lớp bông gòn dày khoảng 5 mm đặt nhẹ lên mặt thoáng đầu trên của cột để bảo vệ mặt cột không bị xáo trộn Bước 4: Triển khai cột
Hệ dung môi để giải ly là chloroform : methanol : NH3 tỉ lệ 14 : 7 : 1 Bước 5: Hứng và kiểm tra các phân đoạn
Hứng dung dịch giải ly trong chai bi có đánh số thứ tự Mỗi chai bi có lượng thể tích được đánh dấu ở mức 10 ml
Bước 6: Thu hồi và kiểm tra, định lượng các phân đoạn
Thu các phân đoạn giải ly cột Sau đó, các phân đoạn được sắc ký bản mỏng để gom lại thành những phân đoạn có thành phần giống nhau
Từng phân đoạn được tiến hành thu hồi dung môi để thu palmatine
Trang 34SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 24Nhồi và ổn định cột Nạp mẫu vào cột Triển khai cột
Hình 2 13: Các bước thực hiện sắc ký cột
2.2.5.4 Phương pháp đo điểm nóng chảy
Dùng ống vi quản lấy vừa đủ lượng mẫu thử Đặt ống này vào đúng vị trí, sao cho ống vi quản vào đúng khe soi mẫu, đầu ống có thể quan sát được và nằm chính giữa thị kính Điều chỉnh nhiệt độ ở mức tối đa Khi nhiệt độ đạt 60% điểm nóng chảy dự kiến thì giảm về mức 10 0C/ phút Khi nhiệt độ cách điểm nóng chảy dự kiến 15 0C thì hạ xuống mức 1 0C/ phút
Quan sát chất nóng chảy qua thị kính, ghi nhận nhiệt độ trên nhiệt kế từ khoảng thời điểm lúc chất bắt đầu nóng chảy cho đến khi chảy hoàn toàn
Trang 35SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 25
Hình 2 14: Đo điểm nóng chảy của palmatine
(Mẫu đo tại thời điểm ban đầu (trái) và sau khi nóng chảy hoàn toàn (phải)) 2.2.5.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Kết quả phân tích được thực hiện tại phòng cộng hưởng từ, viện hóa học (nhà A18, số 18, Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Thành phố Hà Nội)
Trang 36SVTH: ĐẶNG HOÀI THƯƠNG 26
3.1 Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất bằng phương pháp ngâm
3.1.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết tối ưu
Kết quả khối lượng cao thô sau các khoảng thời gian chiết khác nhau được ghi nhận ở bảng sau:
Bảng 3 1: Kết quả số liệu thực tế thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm
Nghiệm thức
Lần thực hiện
Khối lượng nguyên liệu
(g)
Thời gian chiết (giờ)
Khối lượng cao
thô (g)
Trung bình khối lượng cao
thô thu được (g)
Hiệu suất (%)
Sau quá trình xử lý thống kê ta được bảng kết quả như sau:
Bảng 3 2: Kết quả xử lý thống kê thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp ngâm
Nghiệm thức
Thời gian chiết (giờ)
Khối lượng cao thô