Nghiên cứu quy trình chiết tách xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của rễ cây rẻ quạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ CHÍNH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY RẺ QUẠT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ CHÍNH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY RẺ QUẠT Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.NGND ĐÀO HÙNG CƯỜNG Đà Nẵng - Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Chính MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU THỰC VẬT HỌC HỌ LAY ƠN (IRIDACEAE) 1.2 GIỚI THIỆU CHI BELAMCANDA 1.3 TỔNG QUAN VỀ RẺ QUẠT 1.3.1 Giới thiệu chung rẻ quạt 1.3.2 Hình thái thực vật rẻ quạt 1.3.3 Đặc điểm bột dược liệu 1.3.4 Phân bố, thu hái chế biến 1.3.5 Tác dụng dược lý - Công dụng 1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY RẺ QUẠT 1.4.1 Các hợp chất endion 1.4.2 Dẫn xuất stilbene 1.4.3 Các flavonoit .10 1.4.4 Các hợp chất phenolic 10 1.4.5 Các isoflavonoit 11 1.4.6 Các hợp chất iridal 13 1.5 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BELAMCANDA CHINENSIS (BCL) 14 1.5.1 Hoạt tính kháng viêm 14 1.5.2 Hoạt tính điều trị bệnh tiểu đường 14 1.5.3 Hoạt tính chống oxi hóa chống đột biến .15 1.5.4 Hoạt tính chống ung thư tuyến tiền liệt .15 1.5.5 Hoạt tính chống ung thư vú 16 1.5.6 Hoạt tính kháng nấm 16 1.5.7 Tác dụng estrogen .16 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Hóa chất .20 2.1.3 Dụng cụ .20 2.1.4 Các loại máy móc, thiết bị 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phương pháp chiết Soxhlet 21 2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 24 2.2.3 Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) 26 2.2.4 Phương pháp kết tinh lại .32 2.2.5 Phương pháp sắc kí mỏng 32 2.3 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 37 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 37 2.3.2 Xác định số tiêu hóa lý 39 2.3.3.Phương pháp chiết tách chất từ rễ rẻ quạt với dung môi nhexane, ethyl acetate, dichloromethane, methanol phương pháp Soxhlet 41 2.3.4 Tinh chế chất rắn thu từ dịch chiết 43 2.3.5 Chạy sắc kí mỏng dịch tan chất rắn sau tinh chế 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 47 3.1.1 Độ ẩm 47 3.1.2 Xác định hàm lượng tro 47 3.1.3 Kết thành phần hàm lượng kim loại nặng .48 3.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ RỄ CÂY RẺ QUẠT VỚI CÁC DUNG MÔI N-HEXANE, ETHYL ACETATE, DICHLOROMETHANE, METHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOXHLET 49 3.2.1 Khảo sát thời gian chiết tốt bột rễ rẻ quạt 49 3.2.2 Kết xác định thành phần hóa học có dịch chiết rễ rẻ quạt 53 3.3 TINH CHẾ CHẤT RẮN 65 3.3.1 Đuổi dung môi dịch chiết, thu chất rắn kết tủa 66 3.3.2 Chọn dung môi kết tinh lại 66 3.3.3 Kết tinh lại chất rắn, thu chất rắn tinh khiết 67 3.4.CHẠY SẮC KÍ BẢN MỎNG DỊCH TAN CHẤT RẮN SAU KHI TINH CHẾ 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT PGE2 Prostaglandin E2 BCL Belamcanda chinensis CCl4 Carbon tetrachloride SOD Hepatic cytosolic superoxide dismutase GSH-px Glutathione per-oxidase AAS Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử GC-MS Phương pháp sắc ký ghép khối phổ DANH MỤC BẢNG Số Tên bảng Trang hiệu 1.1 Các flavonoit có rẻ quạt 10 1.2 Các hợp chất Phenolic rẻ quạt 10 1.3 Các isoflavonoit có rẻ quạt 11 1.4 Các hợp chất Iridal rẻ quạt 13 2.1 Tỷ lệ hệ dung môi Cloroform/Butanol chạy sắc kí 46 mỏng dịch tan chất rắn 3.1 Kết khảo sát độ ẩm bột rễ rẻ quạt 47 3.2 Kết khảo sát hàm lượng tro bột rễ rẻ quạt 48 3.3 Thành phần hàm lượng kim loại nặng rễ rẻ 48 quạt 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến khối 49 lượng sản phẩm chiết dung môi n-hexane 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến khối 51 lượng sản phẩm chiết dung môi ethyl acetate 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến khối 52 lượng sản phẩm chiết dung môi diclomethane 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến khối 52 lượng sản phẩm chiết dung môi methanol 3.8 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết n- 54 hexane rễ rẻ quạt 3.9 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết 56 ethyl acetate rễ rẻ quạt 3.10 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết dichloromethane rễ rẻ quạt 58 3.11 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết 60 methanol rễ rẻ quạt 3.12 Hoạt tính cấu tử có dịch chiết rễ rẻ 61 quạt 3.13 Khảo sát tính tan chất rắn dung mơi 66 3.14 Sự kết tinh chất rắn dung mơi 67 DANH MỤC HÌNH Số hiệu Tên hình Trang 2.1 Hình ảnh rẻ quạt 19 2.2 Sơ đồ cấu tạo chiết Soxhlet 22 2.3 Sơ đồ thiết bị đo quang phổ hấp thụ nguyên tử 25 2.4 Cấu tạo hệ thống sắc ký khí 28 2.5 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 40 3.1 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết n- 54 hexane rễ rẻ quạt 3.2 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết ethyl 56 acetate rễ rẻ quạt 3.3 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết 57 dichloromethane rễ rẻ quạt 3.4 Sắc ký đồ biểu thị thành phần hóa học dịch chiết 59 methanol rễ rẻ quạt 3.5 Chất rắn kết tủa thu từ dung mơi 66 3.6 Q trình kết tinh lại chất rắn 68 3.7 Hình ảnh sắc kí mỏng với dung môi theo tỉ lệ 68 61 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid (0.48%); Methyl tetradecanoate (1.25%); Tetradecanoic acid (7.95%); n-hexadecanoic acid (3.47%); Octadecanoic acid (0.65%);4H-1-benzopyran-4-one,5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-6methoxy- (4.99%) e Nhận xét chung thành phần hóa học định danh bột rễ rẻ quạt Bằng phương pháp GC-MS, số thành phần hóa học dịch chiết từ rễ rẻ quạt khô định danh Tổng kết xác định 20 cấu tử dịch chiết khác từ rễ rẻ quạt khô, bao gồm acid hữu cơ, este acid hữu cơ, hợp chất phenolic, aldohexoses, flavonoid Trong đó, dịch chiết định danh nhiều cấu tử methanol với 12 cấu tử Trong dịch chiết, có chung cấu tử Tetradecanoic acid với hàm lượng dịch chiết cao Bảng 3.12 thể hoạt tính cấu tử định danh dịch chiết rễ rẻ quạt Bảng 3.12 Hoạt tính cấu tử có dịch chiết rễ rẻ quạt STT Tên cấu tử 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5dihydroxy-6methylBenzofuran, 2,3- dihydro(Coumaran) Cấu trúc hóa học [26] Hoạt tính [27] Kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư, chống oxy hóa Kháng khuẩn, chống viêm 1,2,3- Hương phẩm, phụ gia, propanetriol, kháng nấm, làm chất monoacetate dẻo 62 2-methoxy-4vinylphenol Chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, hương liệu Ethanone, 1-(4- Chống viêm khớp, hydroxy-3- chống bệnh đường methoxyphenyl)- ruột, trị hen, xơ vữa (Apocynin) động mạch Hexanoic acid (Acid caproic) Hương liệu, phụ gia 3-hydroxy-47 methoxybenzoic Kháng khuẩn, chống acid oxy hóa (acid Isovanillic) Chất chống oxy hóa, Methyl ngăn ngừa ung thư, tetradecanoate giảm choloesterol, chất bôi trơn Chất chống oxy hóa, Tetradecanoic acid (Acid myristic) ngăn ngừa ung thư, chất bôi trơn, hạ cholesterol, cầm máu, trị giun tròn, kháng khuẩn 63 Kháng khuẩn, Chất chơng oxy hóa, chất 10 n-hexadecanoic bơi trơn, hạ acid cholesterol, thuốc trừ (Acid Palmitic ) sâu, trị giun, chống androgen, làm hương vị, ức chế 5-Alpha reductase Hương vị, chất bôi 11 Octadecanoic trơn, ức chế alpha acid reductase, chống (Acid Stearic) cholesterol,nước hoa, mỹ phẩm 4H-1- 12 benzopyran-4- chống tăng sinh, chống one, 5,7- nấm, chống viêm, dihydroxy-2-(4- chống oxy hóa hydroxyphenyl)- hoạt động chống động 6-methoxy- kinh (Hispidulin) 13 14 Octanoic acid Sát khuẩn, trị nấm, diệt (Acid Caprylic) côn trùng n-decanoic acid Diệt nấm, diệt côn (Acid Capric) trùng, kháng khuẩn 1H-Indene, 2,315 dihydro-1,1,6trimethyl- - 64 Chống lại bất 16 Nonadecanoic thường cấu trúc acid, methyl ester nhiễm sắc thể, kháng u Chống viêm, chống ung thư, hạ cholesterol, ngăn chặn 17 9,12- nhiễm độc gan, chống octadecadienoic côn trùng, chống dị acid (z,z)- ứng, chống viêm khớp, (Acid linoleic) chống mụn trứng cá, chống bệnh động mạch vành, chống bệnh Eczema Giảm đau, chống lão hóa, chống viêm khớp, xơ vữa động mạch, chống ung thư, chống co giật, chống bệnh trí nhớ, chống đái tháo đường, kháng 18 Vitamin E viêm, chống vô sinh, chống thiếu máu cục bộ, chống nhiễm bạch cầu, chống co thắt, chống huyết khối, chống hạ đường huyết, bảo vệ tim mạch, có tác dụng giãn mạch, 65 kích thích hệ thống miễn dịch làm việc bình thường, có tác dụng bảo vệ mắt, bảo vệ da chống tia độc hại, giữ ẩm cho màng tế bào, giúp tế bào não thu nhận chất dinh dưỡng, thải chất cặn bã 19 Undecane, 2methyl Tác dụng ức chế miễn dịch, chống lại tổn 20 D-allose thương gan, ngồi cịn có ức chế hình thành bạch cầu động vật Từ Bảng 3.12, nhận thấy cấu tử định danh từ rễ Rẻ quạt có cấu tử có hoạt tính chống ung thư, cấu tử có hoạt tính chống oxy hóa, cấu tử có hoạt tính chống viêm, cấu tử có hoạt tính kháng khuẩn, cấu tử có hoạt tính kháng nấm số cấu tử với hoạt tính sinh học quang trọng khác 3.3 TINH CHẾ CHẤT RẮN Trong tất cấu tử định danh từ dịch chiết cấu tử Tetradecanoic acid với hàm lượng phần trăm dịch chiết cao nên định tách kết tinh cấu tử 66 3.3.1 Đuổi dung môi dịch chiết, thu chất rắn kết tủa Đối với dung môi, tiến hành gom dịch chiết thời gian chiết, đuổi dung môi đến khoảng 30ml, cho vào ống nghiệm, để tủ lạnh 24 giờ,sau ly tâm, thu chất rắn, gộp chung chất rắn vào ống nghiệm Chất rắn thu thể Hình 3.5 Hình 3.5 Chất rắn kết tủa thu từ dung môi 3.3.2 Chọn dung mơi kết tinh lại Tiến hành trích lượng chất rắn cho vào ống nghiệm, cho giọt dung môi acid acetic, dichloromethane, methanol, cloroform vào ống nghiệm Đun ống nghiệm bếp cách thủy với nhiệt độ sôi dung môi quan sát tượng Đối với chất rắn ống nghiệm chưa tan hoàn toàn, tiến hành nhỏ thêm từ từ giọt dung môi tương ứng vào tiếp tục đun bến cách thủy, quan sát tượng, thu kết Bảng 3.13 Bảng 3.13 Khảo sát tính tan chất rắn dung mơi Dung mơi Tính tan Ghi chú: Acid Acetic Dichloromethane (+) tan Methanol Cloroform + + (-) không tan 67 Nhận xét: Ở nhiệt độ sôi dung môi acid acetic, dichloromethane, methanol, cloroform chất rắn tan dung mơi methanol cloroform Với dung dịch tan ống nghiệm, để tủ lạnh 24 Sau quan sát kết tinh lại chất rắn Kết thu thể Bảng 3.14 Bảng 3.14 Sự kết tinh chất rắn dung môi Dung môi Methanol Cloroform Kết tinh + - Ghi chú: (+) kết tinh (-) không kết tinh Nhận xét: Trong điều kiện nhiệt độ thấp, dung dịch tan chất rắn dung môi methanol kết tinh lại Vậy sau tiến hành khảo sát kết tinh, chọn dung môi methanol để tinh chế chất rắn 3.3.3 Kết tinh lại chất rắn, thu chất rắn tinh khiết Nhỏ 1ml dung môi methanol vào ống nghiệm chứa toàn chất rắn Tiến hành đun ống nghiệm bếp cách thủy nhiệt độ sôi methanol (650C), nhỏ thêm từ từ giọt methanol vào ống nghiệm đồng thời đun đến chất rắn tan hết tiến hành lọc nhanh qua phễu Dung dịch thu để tủ lạnh 24h Quá trình kết tinh lại sản phẩm thể Hình 3.6 Theo nguyên tắc, chất rắn phải kiểm tra độ tinh khiết phương pháp nóng chảy, phương pháp khối phổ (MS) Nhưng điều kiện thời gian hạn hẹp nên thực phương pháp đo nóng chảy, nhiên nhiệt độ nóng chảy thu chưa thích hợp Ngun nhân chất rắn tinh chế chưa 68 Hình 3.6 Quá trình kết tinh lại chất rắn 3.4 CHẠY SẮC KÍ BẢN MỎNG DỊCH TAN CHẤT RẮN SAU KHI TINH CHẾ Chất rắn thu sau tính chế, hịa tan dung mơi metanol Sau tiến hành chạy sắc kí mỏng với hệ dung môi Cloroform/Butanol với tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 Tiến hành quan sát, thu kết Hình 3.7 Bảng 3.15 Hình 3.7 Hình ảnh sắc kí mỏng với dung mơi theo tỉ lệ 69 Bảng 3.15 Kết chạy sắc kí mỏng dịch tan chất rắn sau tinh chế Tỷ lệ Cloroform : Rf Màu sắc Hình dạng vệt 1:1 Rf = 0.982 Vàng cam Đuôi dài lan rộng 1:2 Rf = 0.901 Vàng cam Đuôi dài lan rộng 1:3 Rf = 0.782 Vàng cam Đuôi dài lan rộng 1:4 Rf = 0.673 Vàng cam Đuôi dài lan rộng 1:5 Rf = 0.527 Vàng cam Đuôi dài lan rộng Butanol Nhận xét Kết chạy sắc kí mỏng dịch tan chất rắn sau kết tinh thấy màu sắc vệt thu màu vàng cam, hình dạng vết dài rộng với diện tích lớn Với tỷ lệ dung mơi Cloroform : Butanol : giá trị Rf = 0.527 Đây giá trị tham khảo để tiến hành sắc kí cột sau với dịch tan chất rắn sau tinh chế 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Qua nghiên cứu thực nghiệm, thu số số vật lý nguyên liệu sau: + Độ ẩm trung bình rễ rẻ quạt khô 6.235% + Hàm lượng tro trung bình rễ rẻ quạt khơ 3.041% + Hàm lượng kim loại nặng Cu (3.93mg/kg), Zn (14.2mg/kg), Pb (0.31mg/kg), As(0.078mg/kg), Hg(