Còn tại Malaysia, số lượng loài của Pleurotus cũng khá đa dạng, được chia thành nhiều nhóm dựa trên các đặc điểm khác nhau và hình thái, gồm nhóm A là các loài có hệ sợi dimitic với các
TỔNG QUAN
Giới thiệu về nấm Bào ngư
Nấm Bào ngư (nấm Sò: Oyster) rất phong phú và đa dạng, bao gồm khoảng 40 loài, cho đến nay hầu như các nhà nghiên cứu đều thống nhất chúng thuộc chi Pleurotus (Fr.) Kummer Một số nhà nấm học coi chúng là một họ riêng Pleurotaceae Các nấm Bào ngư Pleurotus spp có khả năng chuyển hoá các chất xơ sợi giàu cellulose và lignin
- thực chất là khả năng phân hủy các polysacchride tự nhiên để tạo nên nguồn carbon cho nấm sinh trưởng phát triển (Lê Xuân Thám, 2010) Loại nấm này có tính thích nghi rộng và có thể trồng được trên các loại phế phẩm công - nông nghiệp khác nhau như bông vải, rơm rạ, mùn cưa, thân cây gỗ, thân lõi ngô, trấu và bã mía (Lê Vĩnh Thúc, 2015) nhờ đó hầu hết các loại phụ phế liệu, các chất phế thải của nông, lâm, công nghiệp đều có thể được nấm Bào ngư sử dụng hiệu quả Đây là nguồn tài nguyên nấm quý đang được công nghệ hóa rộng rãi ở Việt Nam, góp phần phát triển nông thôn, miền núi và giải quyết các loại phụ, phế liệu công, nông, lâm nghiệp giàu chất xơ, góp phần cung cấp sinh khối có giá trị kinh tế cao, bã thải lại là nguồn phân bón sinh học sạch sinh thái
Do vậy, sản lượng nấm Bào ngư nuôi trồng trên thế giới từ 1986-1991 đã tăng rất nhanh: gần 450% (1993), đến 2005 đã tăng tới hơn 3 triệu tấn Không chỉ có giá trị là thực phẩm giàu dinh dưỡng, nấm Bào ngư còn là nguồn dược liệu có tính kháng sinh (P griseus, ) và phòng chống ung thư với polysaccharides liên kết protein tách từ Pleurotus ostreatus (Fr.) Quél., P sajor-caju (Fr.) Sing., P citrinopileatus Sing., (Lê Xuân Thám, 2010)
Với hơn 20 loài và chủng được nuôi trồng trên toàn thế, chi Pleurotus là một trong những nhóm nấm trồng đa dạng nhất Cho đến nay, quan hệ di truyền, cũng như việc phân loại các loài thuộc chi Pleurotus vẫn chưa được hiểu rõ và chưa thống nhất
Kirk và cộng sự (2008) đã phân loại các loài thuộc chi Pleurotus thành khoảng 20 loài Nguyên nhân khiến việc phân loại nhóm nấm này trở nên phức tạp và thường xuyên bị nhầm lẫn là do sự đa dạng trong hình thái và đặc điểm phân bố rộng khắp trên toàn thế giới của chúng Rất nhiều loài mới khi đưa vào nuôi trồng và thương mại hóa đã được gọi bằng những tên không chính xác như loài P pulmonarius ở Ấn Độ thường bị nhầm là P sajor – caju và loài P ostreatus thường bị gọi nhầm là P florida ở châu Âu (David và cộng sự, 2011)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 4
Phân bố của nấm bào ngư
Nấm bào ngư là một nhóm nấm đa dạng với khoảng 40 loài, được xếp vào chi Pleurotus (Fr.) Kummer theo các nghiên cứu đã thống nhất Tại Việt Nam, hiện đã ghi nhận khoảng 15 loài nấm bào ngư, bao gồm P abalonus, P cornucopiae, P cytidiosus, P djamor, P eryngii, P floridanus, P globulifer, P limpidus, P ostreatus.
P pulmonarius, P sajor-caju, P salmoneostramineus, P spicilifer, P versiformis, P blaoensis, tuy nhiên số loài lưu mẫu thực sự rất ít, không quá 9 loài Phần lớn các cơ sở khác chỉ có 2- 3 loài mà thôi Không thấy ghi nhận loài nào có độc, hầu hết các loài
Pleurotus đều dược Singer ghi nhận là có thể ăn được; thực tế quá nửa số loài trên đã được nuôi trồng phổ biến ở nước ta Trong đó đáng lưu ý có P abalonus được nuôi trồng xuất khẩu, được thị trường khu vực và thế giới coi trọng (Lê Xuân Thám, 2010)
Theo nghiên cứu của Lê Xuân Thám, Nhật Bản có 4 loài Pleurotus, trong khi Mexico có 8 loài phổ biến nhất, bao gồm P ostreatus, P columbinus và P sajor-caju Tại Argentina, Lechner và các cộng sự đã mô tả chi Pleurotus bao gồm các loài Pleurotus albidus và Pleurotus cystidiosus.
Pleurotus djamor, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius và Pleurotus rickii
Bresadoa Còn tại Malaysia, số lượng loài của Pleurotus cũng khá đa dạng, được chia thành nhiều nhóm dựa trên các đặc điểm khác nhau và hình thái, gồm nhóm A là các loài có hệ sợi dimitic với các tế bào dạng nhánh xương, mũ trơn hoặc có lông tơ hướng về chân, không có bao gốc như các loài P cyatheicolus, P djamor, P lilaceilentus, P luctuosus, P problematicus, còn nhóm B là các loài có hệ sợi monomitic như P eugrammus, P hyacinthus, P australis, P platypodus, P subviolaceus, P penangensis,
P musae, P aureovillosus, , P chrysoeehizus, P decipiens, P olivascens, P japonicus và một số loài không có mấu nối và cysistidia như P armeiacus, P alcasiae, P spathulatus, P omnivagus, và một số nhóm khác (Corner, 1981)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 5
Các khóa phân loại thường sử dụng
1.3.1 Khóa phân loại nấm đến cấp chi bằng các đặc điểm đại thể
Theo Friesian, chi nấm Pleurotus bao gồm các loài nấm đặc trưng bởi phần rìa phiến bằng phẳng và thuộc nhóm pleurotoid Các đặc điểm chung của chi nấm này bao gồm mũ nấm nhiều thịt, mềm dẻo với bề mặt có màu sắc đa dạng Cuống nấm thường không có hoặc nếu có thì ngắn, mọc lệch hoặc biến dạng, không có bao gốc Bào tầng dạng phiến không tách ra theo chiều dọc, không xoăn hoặc lượn sóng, với phần rìa bằng phẳng, không có răng cưa hoặc dạng sáp Bào tử có màu trắng đến màu hoa cà nhạt, thường mọc trên gỗ (Largent., 1977).
1.3.2 Khóa phân loại dựa trên sự kết hợp các đặc điểm hiển vi của các chi Friesian với khóa phân loại của Singer
Largent đã dựa trên những đặc điểm của các loài trong nhóm chi của Friesian và khóa phân loại của Singer để miêu tả chi Pleurotus mang các đặc điểm gồm bề mặt mũ thường có lông măng và chúng cũng không chứa dextrin, phần thịt mũ không có trạng thái hóa keo; phần mô của bào tầng nếu không mang hạt sẽ chuyển sang màu xanh lá cây ngã sang xanh dương khi tác dụng với KOH, các sợi nấm ở bào tầng đan xen không theo quy luật; bào tử hình trụ, không chứa tinh bột hay dextrin; không có các clamp (mấu nối); các cheilocystidia nếu có trên phần rìa mép của bào tầng thường nhỏ, mỏng manh, không dễ thấy; rìa bào tầng đều bằng phẳng (không có dạng răng cưa) khi trưởng thành; quả thể không phát sáng, mọc trên gỗ hoặc nền đất, không mọc trên các thực vật như rong rêu (Largent và Watling, 1977)
1.3.3 Khóa phân loại của Daniel E Stuntz
Trong khóa phân loại này, chi Pleurotus được miêu tả thuộc nhóm Pleurotoid với các đặc điểm: quả thể mọc độc lập, không mọc trên các loại nấm khác, mũ nấm mềm mịn, có nhiều thịt Cuống nấm ngắn thường đính lệch một bên, bào tử có màu trắng tới màu vàng nhạt, hoặc màu kem đến màu hoa cà nhạt; các phiến có thể phân bố dày hoặc mỏng, cuộn vòng quanh, không thường xoăn hay uốn cong, lượn sóng, phần rìa phiến bằng phẳng, không có răng cưa
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 6
Về các đặc điểm hiển vi, Pleurotus có hệ sợi monomitic với vách mỏng hoặc dày, dấu in bào tử đa dạng; cheilocystidia hình thành ở phần rìa phiến, còn pleurocystidia có thể có hoặc không nhưng không bao giờ có dạng metuloid (Largent và Watling, 1977)
1.3.4 Khóa phân loại mới nhất của Largent
Chi Pleurotus được xếp trong họ Tricholomataceae được phân biệt với các chi khác qua các đặc điểm: basidia không có các cấu trúc hạt chứa sắt; bào tử có sắc tố xanh hoặc không; bào tử đảm (basidiospores) không có tinh bột hoặc dextrin; bào tử có màu trắng, kem hoặc vàng nhạt; cuống thường mọc lệch tâm hoặc không có, hình trụ hoặc gần hình trụ; bào tầng dạng phiến mỏng, rìa phiến trơn, bằng phẳng, bào tầng phát triển tốt; quả thể không mọc trên rêu, mũ nấm lớn và có nhiều màu sắc Đặc điểm riêng của chi được miêu tả gồm quả thể hầu như có kích thước từ vừa đến lớn, đường kính trung bình của mũ khoảng từ 2- 5cm Bề mặt mũ thường trơn, không có lông, nếu có thường có lông măng, màu sắc mũ đa dạng như trắng, xám, nâu, vàng đất, xanh dương, hiếm khi có xanh lá Bào tầng thường có màu trắng hoặc kem nhạt, rìa phiến thường bằng phẳng và chạy dọc về phía cuống Bào tử thường gồm các màu trắng, kem hoặc xám tím Cuống thường ngắn, đính lệch tâm, hiếm khi không có cuống, một số loài có vòng bao chân Môi trường sống chủ yếu là gỗ, một số hiếm mọc trên nền đất và thường xuất hiện ở những nơi mà thực vật bị chôn vùi Bào tử có dạng hình trụ hoặc gần hình trụ, trơn, không chứa tinh bột; hệ sợi nấm phân bố không theo quy luật với vách có độ dày mỏng khác nhau (Largent và Baroi, 1988)
1.3.5 Khóa phân loại của Lê Bá Dũng về các loài thuộc chi Pleurotus phân bố ở
Trong khóa này, chi Pleurotus được miêu tả gồm các đặc điểm như mũ nấm chất thịt, ít khi chất bì dai hay chất màng, cuống nấm chất thịt lệch, ở bên hoặc không có, gắn liền với tổ chức của mũ nấm Phiến nấm lõm, mọc thẳng, mọc dài hoặc do phát triển từ giữa mà ra Bào tử không màu, ít khi có màu hồng nhạt hay tím nhạt, hình chữ nhật dài đến hình hạt đậu, không có thể hình cầu (Lê Bá Dũng, 2003)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 7
Phân loại một số loài thuộc chi Pleurotus dựa trên đặc điểm hình thái
Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland Đồng danh: Pleurotus cornucopiae var cornucopiae (Paulet) Rolland 1910, Pleurotus cornucopiae subsp cornucopiae (Paulet) Rolland 1910, Pleurotus ostreatus var cornucopiae (Paulet) Pilát 1935, Pleurotus ostreatus f cornucopiae (Paulet) Quél
1886, Pleurotus sapidus Sacc 1887 (Roskov và cộng sự, 2016)
Mũ nấm rộng 40 – 150 (– 300) mm, lồi lên khi tai nấm còn non, sau đó tai nấm sẽ hạ xuống và lõm ở trung tâm, rìa mép tai nấm thẳng hoặc cong vào, tai nấm dày, có màu nâu xám nhạt đến màu vàng kem hơi nâu, bề mặt mũ trơn láng, tuy nhiên ở giữa tai nấm có một ít cụm lông tơ, đôi khi rìa mép tai nấm cũng có một ít lông tơ Các phiến nấm nằm sát khít nhau, chạy từ rìa mép mũ nấm đến gần chân cuống nấm, tạo thành những rãnh liên kết nhau như mạng lưới bao phủ gần hết cuống nấm Phiến khá mỏng, chiều rộng ≤ 10 mm, có màu xanh xám đến màu màu đất son; rìa mép phiến khá nguyên vẹn và cùng màu với phiến hoặc có màu hơi nâu hơn Cuống nấm có kích thước 30 –
110 x 10 – 20 mm, đính gần tâm hoặc đính lệch Các cuống liên kết với nhau thành chùm Cuống có hình trụ, đôi khi thon dần về phía chân cuống, thể chất rắn chắc, có màu kem hơi trắng hoặc màu kem isabella và chuyển dần thành nâu be khi gần đến chân cuống, đôi khi có màu hoa cà nhạt Cuống nấm được bao phủ bởi các rãnh tạo ra bởi các phiến chạy từ mũ xuống, giống như mạng lưới và có nhiều lông tơ ở phía cuối chân cuống nấm Thịt nấm màu trắng ở mũ và cuống, có màu nâu trong ở dưới bề mặt và gần phiến nấm Nấm có mùi tiểu hồi và ngọt Vị nấm chua hoặc nhạt như vị của bột Dấu ấn bào tử có màu hơi trắng đến màu hoa cà (Bas và cộng sự,1990) Bào tử có kích thước 7 – 10,5 x 3,5 – 5 àm; Q = 1,7– 2,4; Q trung bỡnh = 1,9 – 2,0, hỡnh thuụn đến hỡnh trụ Đảm hỡnh chựy, kớch thước 30 – 45 x 5 – 7 àm, cú 4 bào tử đảm Khụng cú liệt bào, nhưng có những tế bào basidiole (những đảm không thể trưởng thành, không có khả năng sinh bào tử, chúng không có cấu trúc cuống bào tử đính trên đầu (Kirk và cộng sự, 2008) cú hỡnh am - pun, kớch thước 20 – 35 x 5 – 7 àm Cỏc sợi nấm ở thể nền bào tầng đan xen không theo quy luật; hệ sợi nấm có dạng mono- hoặc dimitic; sợi nấm nguyên thủy rộng (3 –) 5 – 13 àm, vỏch mỏng đến dày; thỉnh thoảng xuất hiện cỏc sợi khung xương rộng 3 àm, vỏch dày Lớp cận bào tầng dày từ 20 – 30 àm Cỏc sợi nấm của lớp
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 8 bỡ mũ nấm sắp xếp song song với thể nền, dày 50 – 120 àm, cấu tạo bởi cỏc sợi nấm vỏch mỏng, rộng 3 – 7 àm Phần trờn của cuống nấm bao phủ bởi những nhõn tố cú dạng bỡnh cổ thút, 2 – 30 x 7 – 9 àm Thể nền mũ nấm dạng monomitic đến dimitic (Bas và cộng sự, 1990)
P cornucopiae có những đặc điểm rất đặc trưng như: phiến nấm kéo dài từ mũ nấm xuống đến chân cuống nấm, tại cuống các phiến nấm tạo thành các gờ nối với nhau giống như mạng lưới; mũ nấm có màu xám nhạt, mùi giống với tiểu hồi, bào tử ngắn và rộng và thể nền đôi khi có dạng dimitic (Bas và cộng sự, 1990)
Hình 1.1 Pleurotus cornucopiae (Paulet) Roland (Bas và cộng sự, 1990; BioImages:
The Virtual Field- Guide (UK))
Pleurotus cystidiosus O.K Mill Đồng danh: Pleurotus abalonus Y.H Han, K.M Chen & S Cheng 1974, Pleurotus cystidiosus subsp abalonus (Y.H Han, K.M Chen & S Cheng) O Hilber ex
O Hilber 1997, Pleurotus cystidiosus subsp abalonus (Y.H Han, K.M Chen & S
Cheng) O Hilber 1993, Pleurotus cystidiosus var cystidiosus O.K Mill 1969, Pleurotus cystidiosus var formosensis Moncalvo 1995, Stilbum macrocarpum Ellis & Everh 1886, Pleurotus cystidiosus subsp cystidiosus O.K Mill 1969 (Roskov và cộng sự, 2016)
Nấm mọc đơn lẻ hoặc thành cụm chồng lên nhau Mũ nấm hình quạt, kích thước 13-17 x 8,5-9,5 cm, có màu nâu đến nâu xám, bề mặt có nhiều vảy nâu đen hình thành do nứt vỡ, đặc biệt nhiều ở rìa nấm Rìa tai nấm nguyên vẹn, cứng, uốn cong vào trong Cuống nấm nâu đến xám, thường lệch về một bên, dài 3,6-5 cm, rộng 2,2-3,5 cm, thon dần về phía chân Thịt nấm chắc, màu trắng khi tươi, cứng và dai khi khô Phiến nấm trắng khi tươi, vàng khi khô, rộng 4-10 mm, mỏng dần về phía cuống, chạy từ mũ nấm đến đầu cuống.
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 9
Bào tử trong suốt, có dạng từ hình trụ - que, vách mỏng, bề mặt trơn láng, kích thước (11 –) 12 – 16 (– 18) x 4 – 6 àm, Q = 3,01 Đảm cú từ 2 – 4 bào tử đớnh, kớch thước 37 – 44 x 5,2 – 9 àm Lớp cận bào tầng hẹp, khụng dễ thấy, dày khoảng 5 àm Không có cheilocystidia (liệt bào ở đỉnh bào tầng) Pleurocystidia (liệt bào ở mặt bên của bào tầng) cú dạng chựy, kớch thước 50 x 7 – 7,8 àm Cỏc sợi nấm của lớp bỡ của mũ nấm sắp xếp song song với thể nền, dày 80 - 100àm, cỏc sợi nấm cú mấu nối, màu nõu, phõn nhỏnh nhỏ, đường kớnh 3 – 5 àm; một số sợi nấm trong số đú cú vỏch dày, màu nõu và cú hỡnh dỏng giống cystidia, đường kớnh 3,6 – 5,2 àm Hệ sợi ở mũ nấm cú dạng monomitic, cỏc sợi nấm cú mấu nối, vỏch mỏng, trong suốt, đường kớnh 3,8 – 9,4 àm
Hệ sợi ở cuống nấm cũng có dạng monomitic; với những tế bào tận cùng có dạng liệt bào, kớch thước 3,9 – 4,7 x 3,6 – 6 àm, vỏch dày, đường kớnh từ 3 – 7,8 àm Thể nền của bào tầng cấu tạo bởi các sợi nấm nguyên thủy, vách mỏng, có mấu nối, có đường kớnh 5,2 – 10 àm và cỏc sợi vỏch dày đường kớnh 3,6 – 4,2 àm (Lechner và cộng sự, 2004)
Khi nuôi cấy sợi nấm P cystidiosus trên môi trường thạch, ban đầu sợi nấm có đặc điểm là màu trắng, bề mặt mịn màng và hình thành các sợi khí khổng, tương tự như các loài thuộc chi Phyllosticta khác.
Pleurotus khác Tuy nhiên, khi sợi nấm bắt đầu mọc nhanh hơn thì bắt đầu xuất hiện ngày càng nhiều các bó cuống bào tử màu đen rất đặc trưng, phần đầu có dạng hình cầu mang chất lỏng màu đen chứa cỏc bào tử vụ tớnh, đường kớnh phần đầu 0,4 – 0,9 àm, phần chõn dài 0,6 – 1,25 àm, rộng 0,1 – 0,2 àm Bú cuống bào tử này hỡnh thành từ cỏc sợi nấm có mấu nối vách mỏng, các tế bào của sợi nấm này thay đổi dần hình dạng khi tiến ra phía ngoài, đến tế bào ngoài cùng thì tế bào có dạng bào tử đính hình trụ, màu đen bóng, kích thước 5,2 – 6,2 x 14,5 – 17 mm (Lechner và cộng sự, 2004)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 10
Hình 1.2 Pleurotus cystidiosus O.K Mill ( Lechner và cộng sự, 2004;
(A)– Tai nấm, (B) – Bào tử đảm, (C) – Đảm, (D) – Cấu trúc hiển vi bào tử vô tính,
(E) –Bó cuống bào tử; (F) – Hình thái sợi nấm Pleurotus cystidiosus khi nuôi cấy
Thước tỉ lệ 1 = 30 àm cho hỡnh B và D, thước tỉ lệ 2 = 10 cm cho hỡnh A
Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr Đồng danh: Lentinus sajor- caju (Fr.) Singer 1951 (Index Fungorum)
Mũ nấm rộng 3 – 11 cm; dạng hình quạt hoặc dạng hình phễu; thể chất dai – mềm khi còn non, trở nên dai hơn khi trưởng thành; có màu màu trắng, trắng xám, màu nâu vàng xám đến nâu xám; bề mặt trơn láng hoặc có lông măng, đôi khi có những vảy nhỏ màu nâu, thường có đường rãnh đồng tâm mờ; rìa mép mũ nấm cong vào đến duỗi thẳng, thường gợn sóng và xé rách khi tai nấm già Thịt nấm màu trắng; mỏng, độ dày từ 4 – 8 mm, càng gần cuống thì càng dày hơn Các phiến chính kéo dài từ mũ nấm đến phần đầu cuống nấm; chiều rộng phiến 0,5 – 3 mm; có màu trắng đến màu vàng, chuyển thành màu nâu vàng nhạt khi tai nấm già; rìa mép phiến nguyên vẹn đến có răng cưa Cuống nấm có thể đính ở giữa hoặc đính lệch tâm hoặc đính ở bên mũ nấm, kích thước (dài x rộng) 0,2 – 2,5 x 0,6 – 1,2 cm; màu trắng hoặc cùng màu với mũ nấm Tai nấm có vòng cổ, khi còn non vòng cổ chắc và rất chuyên biệt, khi già vòng cổ chuyển thành dạng mấu nhú hoặc gần như biến mất, tai nấm màu trắng đến màu nâu vàng nhạt Hệ sợi nấm dạng dimitic; sợi nguyờn thủy cú chiều rộng 4 – 5 àm, trong suốt; sợi khung xương liờn kết cú vỏch dày, rộng 3 – 7 àm, trong suốt và phõn nhỏnh Pleurocystidia không có hoặc hiếm khi xuất hiện, nếu có thì dạng hình chùy, kích thước 30 – 40 x 7 –
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 11
9 àm, trong suốt Cheilocystidia cú dạng gần như hỡnh chựy, kớch thước 15 – 25 x 4 – 7 àm, trong suốt Đảm cú dạng hỡnh chựy, trong suốt, kớch thước 15 – 20 x 4 – 4,5 àm; mỗi đảm đính 4 bào tử Bào tử có dạng hình trụ dài, hẹp, kích thước 6 – 8 x 1,8 – 2,2 àm; bề mặt lỏng, trong suốt; khụng cú phản ứng tinh bột (khụng chuyển thành màu xanh đậm khi tiếp xúc với thuốc thử Melzer) Thể nền bào tầng đan xen không theo quy luật
Bề mặt mũ nấm có các chùm sợi nấm nhô cao lên (Bi và cộng sự, 1993)
Hình 1.3 Pleurotus sajor-caju (Fr).Fr (Pegler, 1983)
(A) – Tai nấm, độ phóng đại 1 lần, (B) – Bào tử, (C) – Đảm, (D) – Cheilocystidia,
(E) – Chùm sợi bên (hyphal peg), (F) – Sợi nguyên thủy, độ phóng đại 500 lần, (G)
– Sợi khung xương - liên kết (skeleto – ligative hyphae), độ phóng đại 500 lần Tất cả hình không có ghi chú đều có độ phóng đại 1000 lần
Pleurotus pulmonarius has multiple synonyms, including Pleurotus araucariicola, Pleurotus ostreatus var pulmonarius, Pleurotus ostreatus f pulmonarius, Pleurotus pulmonarius var juglandis, Pleurotus pulmonarius var lapponicus, and Pleurotus pulmonarius var pulmonarius These synonyms reflect the historical taxonomic confusion surrounding this species However, the accepted scientific name for this mushroom is Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél.
Mũ nấm có hình quạt hoặc hơi tròn, khi non có dạng lồi, rìa mép uốn cong vào, sau đó chuyển thành dạng phẳng đến dạng phễu; độ dày tai nấm từ mỏng đến trung
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 12 bình; có màu xám nâu nhạt đến trắng hơi vàng; kích thước (dài x rộng) (15) 30 – 100 x (20 –) 50 – 100 mm; bề mặt trơn láng hoặc phủ ít lông tơ, hiếm khi có vảy, thường có lông tơ ở gần vị trí liên kết với cuống Phiến nấm dạng dày đặc, kéo dài từ rìa mũ nấm đến phần đỉnh cuống nấm; khá mỏng, rộng ≤ 5 mm; có màu trắng đến màu kem; rìa mép nguyên vẹn hoặc có một phần răng cưa, cả phiến cùng một màu hoặc rìa mép có màu hơi nâu hơn một chút Không có cuống nấm hoặc có cuống ngắn; kích thước 10 x 2 –
10 mm; đính gần giữa đến đính lệch 1 bên; thể chất rắn chắc; có màu hơi trắng; thường có lông tơ Thịt nấm màu trắng Mùi ngọt đặc trưng hoặc giống với tiểu hồi hoặc mùi nhẹ đến mùi nấm Vị đặc trưng của nấm đến hơi đắng Dấu ấn bào tử có màu hơi trắng đến màu kem, hơi vàng hoặc màu nâu vàng nhạt (Bas và cộng sự, 1990)
Phương pháp định danh nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm có tính dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Enzyme này xúc tác tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn khi có một đoạn mồi đã bắt sẵn trên khuôn Phương pháp này được được phát minh bởi nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis năm 1985 với mục đích thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự DNA ban đầu
Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm 3 bước:
Bước 1: Biến tính DNA mạch đôi thành mạch đơn
Bước 2: Bắt cặp giữa mồi và trình tự đích mạch đơn
Bước 3: Kéo dài để tạo thành mạch mới từ mồi
Mỗi chu kỳ được lặp lại nhiều lần, tuy nhiên không nên vượt quá 40, để từ đó sản phẩm PCR tăng theo lũy thừa (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)
Năm 1977, Frederick Sanger và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp giải trình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’-OH dùng để liên kết với nucleotide kế tiếp (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)
Quy trình của phương pháp Sanger gồm 2 bước như sau:
Bước 1: Cài đặt 4 phản ứng tương ứng với 4 loại ddNTP Các phản ứng này có chung các thành phần sau: DNA mạch đơn khuôn mẫu, mồi, DNA polymerase, [α-32P]ATP và hỗn hợp các loại nucleotit tương ứng.
Phản ứng có ddT: dGTP,dCTP, dATP, ddTTP
Phản ứng có ddA: dGTP, dCTP, dTTP, ddATP
Phản ứng có ddG: dATP, ddGTP, dCTP, dTTP
Phản ứng có ddC: dGTP, dATP, ddCTP, dTTP
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 16
Trong mỗi phản ứng, mạch đơn DNA được tổng hợp dựa trên DNA bản mẫu, khi một ddNTP được gắn vào đầu 3’ của mạch thì quá trình tổng hợp của một mạch sẽ bị ngừng lại Kết quả là nhiều DNA mạch đơn được tổng hợp với nhiều độ dài khác nhau khi phản ứng kết thúc, mỗi mạch đều kết thúc bằng cùng một loại ddNTP tương ứng từng phản ứng Các mạch đơn với độ dài khác nhau này sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide để từ đó xác định trình tự của đoạn DNA
Bước 2: Điện di trên gel polyacrylamide, chụp hình gel bằng phóng xạ tự chụp trên phim X-ray và đọc kết quả Lưu ý: trình tự đọc được trên gel là trình tự bổ sung với trình tự của mạch DNA bản mẫu
1.5.2.2 Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến
Máy giải trình tự tự động ngày nay hoạt động dựa trên những cải tiến của phương pháp Sanger Trong đó, phản ứng giải trình tự với bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang được thực hiện trong cùng một microtube và được nạp vào máy giải trình tự sau khi DNA mẫu đã được tinh sạch Máy giải trình tự sẽ tự động nạp đầy gel và nạp mẫu DNA vào một đầu của vi ống, các đoạn DNA sẽ được phân tách trong gel nhờ một hiệu điện thế lên vi ống và di chuyển về đầu còn lại của vi ống Ở cuối ống có một cửa sổ quang học cho phép đầu đọc bằng tia laser ghi nhận từng vạch DNA di chuyển qua với màu huỳnh quang tương ứng Tín hiệu này sẽ được máy tính chuyển thành sắc ký đồ (chromatograph) và trình tự tương ứng (Lê Huyền Ái Thúy và cộng sự 2016)
Quy trình giải trình tự DNA bằng máy tự động như sau:
Bước 1: Chuẩn bị DNA bản mẫu
Bước 2: Thiết lập phản ứng giải trình tự
Bước 4: Nạp mẫu và giải trình tự
Các phương pháp định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có kiến thức chuyên môn, trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 17
1.6 Các nghiên cứu liên quan đến các loài thuộc chi Pleurotus ở Việt Nam
Các nghiên cứu về chi Pleurotus trong nước phần lớn là các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi trồng, một số ít các nghiên cứu là về phân loại và khảo sát giá trị dinh dưỡng, cũng như tác dụng dược học của một số loài trong chi nấm này Trong khi đó, các nghiên cứu về lai tạo hay di truyền của chi Pleurotus thì hầu như không tìm thấy
Các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi trồng nấm Pleurotus chủ yếu tập trung vào phương pháp sản xuất giống và nuôi trồng Đối với sản xuất giống, các nghiên cứu đã khảo sát các loại cơ chất nhân giống, điều kiện ủ tơ tối ưu Về nuôi trồng, các yếu tố như loại cơ chất trồng, thành phần dinh dưỡng, vitamin và kim loại được đánh giá ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi nấm.
Ở Việt Nam, một số loài nấm Pleurotus đã được các nhà phân loại học trong nước phát hiện và định danh Tiêu biểu như nhóm tác giả Lê Xuân Thám phát hiện ra loài Pleurotus cystidiosus var blaoensis tại Bảo Lộc, Lâm Đồng và các loài Pleurotus sajor-caju, P florida, P pulmonarius tại khu vực Cát Tiên, Đồng Nai (Lê Xuân Thám, 2010).
Tam Kiệt thì mô tả các loài P ostreatus, P pulmonarius … (Trịnh Tam Kiệt, 2011)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 18
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian thực hiện
˗ Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phía Nam, Viện Nấm học và Công nghệ sinh học – Liên hiệp các Hội Khoa học kỹ thuật Việt Nam ˗ Thời gian thực hiện: 09/2018 – 05/2019
Sơ đồ thí nghiệm
Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm
Đối tượng nghiên cứu
4 mẫu nấm Bào ngư xám thương mại thu thập từ các trại trồng ở Long An và Bến Tre Các mẫu nấm này được bán ở thị trường Thành phố Hồ Chí Minh
Thu thập các giống nấm Bào ngư xám
Xử lý, phân lập, sấy khô
Phân tích đặc điểm hình thái
So sánh với các mô tả định danh
Phân loại các giống nấm
BLAST trình tự với dữ liệu của NCBI
Xây dựng cây phát sinh loài
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 19
STT Ký hiệu Nguồn gốc
1 XLA1a Công ty nấm Minh Phương, phường Khánh Hậu, TP
2 XLA2b Chợ Mới, phường 2, TP Tân An, Long An
3 XBT3b Chợ Phường 2, Bến Tre (Trại Châu Thành)
4 XLA4a Công ty nấm Minh Phương, phường Khánh Hậu, TP
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
- Tủ cấy vô trùng - Tủ sấy
- Cân kỹ thuật - Kính hiển vi
- Máy điện di - Máy giải trình tự
- Máy đọc gel - Máy spin
- Máy nghiền mẫu - Máy cô quay
- Máy ly tâm - Máy vortex
- Ống nghiệm - Que cấy thẳng
- Đĩa petri - Đèn cồn becher
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 20
- Khay đá - Microtube 1.5ml và 0.5ml
2.4.3 Môi trường và hóa chất
- CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) - Hi-Di Formamide
- CIA ( Chloroform-Isoamyl alcohol) - NaOAc (pH 5.2)
- TE (Tris-EDTA) pH 8 - Ethanol 70%, 99%
- Agarose - Bộ kit ISOLATE II
- Gel Red PCR and Gel Kit
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Thu thập và xử lý mẫu
Phương pháp thu thập và xử lý mẫu, phân lập và giữ giống được thực hiện theo Trịnh Tam Kiệt (Trịnh Tam Kiệt, 2011)
Mẫu thu được tại các trại trồng được đựng trong hộp nhựa và ký hiệu riêng từng mẫu Sau đó đưa mẫu về phòng thí nghiệm, tiến hành đo đạc các thông số, các đặc điểm
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 21 của mẫu, đồng thời sấy khô mẫu ở nhiệt độ 50- 60 o C để lưu giữ, để bảo quản mẫu khô được chứa trong các túi polyme có silicagel để hút ẩm tránh bị nấm mốc, vi khuẩn và côn trùng phá hoại
2.5.2 Phân lập và giữ giống mẫu
Chọn quả thể non hay quả thể sắp hình thành bào tử thành thục để phân lập Môi trường được sử dụng là PDA, nuôi ở nhiệt độ 25- 27 o C Khi nấm có được hệ sợi, tiến hành cấy chuyền để thu được hệ sợi thuần, sau đó cấy vào ống giữ giống, môi trường giữ giống là môi trường thạch nghiêng MYA, bảo quản giống ở nhiệt độ 4- 5 o C
2.5.3 Phân tích hình thái và định danh nấm
Để nghiên cứu hình thái nấm, các nhà khoa học sử dụng cả nấm tươi và nấm khô Phương pháp giải phẫu và phân tích mẫu nấm được tiến hành theo hướng dẫn của Largent (1977a; Largent và cộng sự 1977b).
Các cấu trúc được phân tích gồm: mũ nấm, bào tầng, bào tử, đảm, liệt bào, bề mặt và thể nền của mũ nấm Kết quả phân tích được so sánh với các mô tả của các nhà phân loại học khác để xác định loài cho các giống nấm thu thập Kích thước các cấu trúc đại thể được đo bằng thước Calip Kích thước các cấu trúc hiển vi được đo bằng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính
Các chủng nấm sau khi đã làm thuần sẽ được cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng MYA Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Sau 3-5 ngày, bảo quản ở 4ºC Mỗi chủng được giữ làm 4 đơn vị
Khóa phân loại được sử dụng kết hợp giữa khóa phân loại mới nhất của Largent, khóa phân loại các loài Pleurotus ở Malaysia và khóa của Lê Bá Dũng (Largent, 1988; Corner, 1981; Lê Bá Dũng, 2003)
2.5.4 Định danh các chủng vi nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.5.4.1 Tách chiết DNA bộ gen của các chủng nấm
Dựa trên quy trình của Hosaka và Uno (2011) và quy trình của Saghai-Maroof và cộng sự (1984) với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ˗ Lấy mẫu nấm khụ cho vào eppendorf cú chứa 50 àl dung dịch CTAB 2x
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 22 ˗ Nghiền mẫu ˗ Thờm 450 àl dung dịch CTAB 2x sau đú ủ ở 65ºC – 1h ˗ Làm mỏt, bổ sung 500 àl CIA và votex đều ˗ Ly tâm 15000 rpm, 7 phút ở nhiệt độ phòng ˗ Thu 300 àl phần dịch nổi cho vào eppendorf mới cú chứa 300 àl isopropyl alcohol ˗ Ủ lạnh -20ºC trong 30 phút ˗ Ly tâm 15000 rpm, 7 phút ở 4ºC ˗ Loại bỏ phần dịch ˗ Thờm 500 àl Ethanol 70% ˗ Ly tâm 15000 rpm, 7 phút ở 4ºC sau đó loại bỏ phần dịch ˗ Lặp lại bước trên 2 lần ˗ Để khô ở 45ºC ˗ Thờm 50 àl TE và bảo quản ở -20 ºC cho tới khi sử dụng
2.5.4.2 Khuếch đại vùng trình tự ITS bằng kỹ thuật PCR
Quá trình khuếch đại vùng trình tự ITS được thực hiện trên máy luân nhiệt
(Bio-rad, Hoa Kỳ) với các thông số được thể hiện ở bảng 2.2
Bảng 2.2 Thành phần cho phản ứ ng PCR thể tớch 25 àl
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tớch (àL)
6 Dream Taq DNA polymerase 0,05U/àL 1,25
Tổng thể tích 1 phản ứng 25
(*): Trình tự các mồi thể hiện ở Phụ lục 3, theo White và cộng sự (1990)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 23
Chu kỳ luân nhiệt cho phản ứng PCR như hình 2.2
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự ITS
2.5.4.3 Kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1.2 %, dung môi TAE 0,5X (pH 8,0) Sử dụng thang DNA 1kb, thuốc nhuộm Gel Red, điện di ở điện thế 130V, 30 phút sau đó đọc kết quả bằng máy Geldoc
2.5.4.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit ISOLATE PCR and Gel Kit, hãng sản xuất Bioline – Anh quốc
2.5.4.5 Tiến hành PCR sequensing và giải vùng trình tự ITS của các chủng nấm
DNA samples are amplified and sequenced using the BigDye Terminator ver3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and the 3500x DNA Analyzer (Applied Biosystems).
2.5.4.6 So sánh các trình tự ITS của các chủng nấm với dữ liệu trên Genbank
Kết quả trình tự được hiệu chỉnh và loại bỏ các trình tự mồi ở 2 đầu bằng phần mềm ATGC ver 8.0 (Genetyx, Nhật)
So sánh các trình tự với các dữ liệu có trên GenBank thông qua chương trình BLAST của NCBI Ghi nhận các trình tự tương đồng có chỉ số Max score cao nhất và kiểm tra tính toàn vẹn của các trình tự này để xem xét tính chính xác của phép so sánh
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 24
2.5.4.7 Xây dựng cây phát sinh loài
Phần mềm MEGA phiên bản 7.0 thực hiện sắp xếp các trình tự ITS thành từng cột và cắt lọc trình tự hai đầu sau khi sắp xếp Khối dữ liệu ITS thu được sau xử lý (576 nucleotide) được phân tích bằng ba phương pháp Neighbor joining (NJ), Maximum parsimony (MP) và Maximum likelihood (ML) Các thông số sử dụng như sau: cây NJ được xây dựng bằng phương pháp khoảng cách p; cây MP được xây dựng bằng thuật toán CNI trên cây ngẫu nhiên; cây ML được xây dựng theo mô hình Kimura hai tham số; giá trị hỗ trợ được đánh giá bằng phương pháp bootstrap với 1000 lần lặp, đạt ý nghĩa khi giá trị hỗ trợ lớn hơn 50%.
Auricularia auricularis-juda được chọn làm nhóm ngoại
Bảng 2.3 Danh sách các ch ủng đưa vào xây dự ng cây phát sinh loài
Tên loài Mã số Genbank Tài liệu tham khảo
P pulmonnarius AY450349.1 Shnyreva và cộng sự, 2015
P ostreatus AY450345.1 Shnyreva và cộng sự, 2015.
P cornucopiae AY450341.1 Shnyreva và cộng sự, 2015.
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 25
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả làm thuần
Sau 2 tháng nuôi cấy, từ 4 mẫu nấm ban đầu phân lập và làm thuần được 4 chủng: XLA1a, XLA2b, XBT3b và XLA4a.
Kết quả phân tích hình thái các mẫu nấm
3.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA1a
- Cấu trúc đại thể: Mũ nấm có dạng quạt hoặc gần như tròn, kích thước 50 – 120 x 80 – 150mm (dài x rộng), mũ nấm có màu xám sẫm, bề mặt trơn láng, có lông tơ ở tâm mũ nấm, rìa mũ nấm nguyên vẹn uốn vào trong Phần thịt từ mỏng đến khá dày, màu trắng, chắc và khá dai Phiến có dạng dày đặc, chạy từ mũ xuống phần đầu cuống, màu trắng, rìa mép nguyên vẹn và cùng màu với phiến Cuống nấm hầu hết là đính lệch
1 bên, một số ít đính ở giữa, màu trắng, hình trụ, hẹp dần từ đỉnh xuống chân cuống, kích thước 3,5 – 8 x 0,7 – 2,2cm, có lông tơ bao phủ ở phần chân, cuống đặc, thịt nấm màu trắng Các tai nấm có thể mọc dạng đơn lẻ hoặc mọc thành chùm Tai nấm không có vòng cổ và bao chân
- Cấu trúc hiển vi: Các basidiole có hình am - pun, kích thước 20 - 25 x 3,3 - 7àm Thể nền bào tầng cú dạng monomitic, đan xen khụng theo quy luật Cỏc sợi nấm của lớp bỡ mũ nấm sắp xếp song song với thể nền, độ dày lớp bỡ 110 – 180 àm Thể nền mũ nấm có dạng monomitic, đan xen không theo quy luật
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 26
Hình 3.1: Đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA1a
(A1, A2) - Hình thái tai nấm mặt trước và mặt sau, (B) - Cấu trúc đại thể của bào tầng, (C) - Hình thái tai nấm cắt dọc, (D) - Đỉnh bào tầng với các basidiole hình am - pun, (E) - Cấu trúc hiển vi của bào tầng, (F) – Cấu trúc bề mặt mũ nấm, (G) –Sợi nấm thể nền mũ nấm
So sánh hình thái mẫu nấm XLA1a với những mô tả của các loài Pleurotus cho thấy:
Nấm XLA1a có hình thái tương đồng với các loài nấm P pulmonarius, P ostreatus và P cornucopiae Mũ nấm có hình quạt hoặc hơi tròn, màu xám và được bao phủ bởi lớp lông tơ mịn Rìa mép mũ nguyên vẹn, uốn cong vào trong.
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 27
Phiến nấm của XLA1a tương đồng với mô tả của 2 loài P pulmonarius, P ostreatus (phiến kéo dài từ mũ xuống phần đỉnh của cuống) và khác với loài P cornucopiae (phiến phân nhánh kéo dài từ mũ xuống gần chân cuống, giống như mạng lưới bao lấy cuống nấm) Độ dày lớp bỡ bề mặt mũ nấm của XLA1a 110 – 180 àm tương đồng với loài P ostreatus (40 - 180àm) hơn là loài P cornucopiae (50 - 120àm) và loài P pulmonarius
(40 - 50àm) Lớp bỡ mũ nấm của giống XLA1a cấu tạo bởi cỏc sợi nấm xếp song song với thể nền, tương tự với các loài P cornucopiae, P ostreatus, P pulmonarius
XLA1a và các loài P ostreatus, P pulmonarius, P cornucopiae đều có các basidiole hình am - pun Xét về kích thước thì basidiole của XLA1a tương tự với basidiole của 2 loài P ostreatus và P cornucopiae Cụ thể: kích thước basidiole của
XLA1a là 20 - 25 x 3,3 - 7àm; của P ostreatus là 20 – 30 x 3 – 7àm; của P cornucopiae là 20 – 35 x 5 – 7àm; khụng cú thụng tin về kớch thước basidiole của P pulmonarius
Hệ sợi nấm XLA1a ở mũ nấm dạng monomitic, trong khi đó theo mô tả của loài
P cornucopiae thì loài này có thể có hệ sợi dạng dimitic hoặc monomitic, còn 2 loài P ostreatus và P pulmonarius thì hệ sợi luôn là dạng monomitic
Kết quả phân tích hình thái sơ bộ xác định XLA1a thuộc chi Pleurotus, có đặc điểm gần giống với loài P ostreatus và P pulmonarius Tuy nhiên, do mẫu thương mại thu thập được còn non, chưa đầy đủ các đặc điểm như dấu in bào tử, cấu trúc đảm, cystidia, nên chưa đủ cơ sở để phân loại đến cấp độ loài Việc thu thập quả thể trưởng thành sẽ cung cấp thêm thông tin để phân tích hình thái chi tiết hơn.
3.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA2b
Nấm có hình quạt hoặc tròn, kích thước khoảng 5,5 - 8 x 4,6- 6,3cm, màu xám nâu nhạt, bề mặt trơn với lông tơ ở tâm Phần thịt trắng, chắc và dai Phiến dày đặc, chạy từ mũ xuống cuống, màu trắng với rìa mép nguyên vẹn Cuống lệch một bên, hình trụ hẹp dần từ đỉnh xuống chân, kích thước 4,5 – 6,2 x 1 – 1,2 cm, khô ráo, có khe chạy dọc theo chiều dài và phủ lông tơ.
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 28 chắc Tai nấm có thể mọc dạng đơn lẻ hoặc mọc thành chùm, không có vòng cổ và bao chân Mùi nấm nhẹ
- Cấu trúc hiển vi: Các sợi nấm ở thể nền bào tầng đan xen không theo quy luật, đường kớnh 4,7 -9,7àm Thể nền bào tầng cú cỏc basidiole hỡnh am - pun, kớch thước 20 – 25,5 x 4 - 8àm Lớp bỡ mũ nấm song song với thể nền, độ dày lớp bỡ 83 - 115àm Sợi nấm thể nền mũ nấm đường kớnh 5- 10àm Hệ sợi nấm dạng monomitic
Hình 3.2: Đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA2b
(A1, A2) - Hình thái quả thể dạng chùm, (B) –Hình thái tai nấm cắt dọc, (C1, C2) – Hình thái tai nấm riêng lẻ mặt trước và mặt sau, (D) - Đỉnh bào tầng với các basidiole hình am – pun, (E) – Thể nền của bào tầng, (F) –Lớp bì mũ nấm, (G) –Cấu trúc bề mặt mũ nấm, (H)- Sợi nấm thể nền của mũ nấm
So sánh hình thái mẫu nấm XLA2b với những mô tả của các loài Pleurotus cho thấy:
Mũ nấm của XLA2b tương tự với các loài P ostreatus, P pulmonarius, P cornucocopiae: hình quạt hoặc hơi tròn, màu xám, khi non có dạng lồi, bề mặt trơn láng, có lông tơ ở tâm mũ, rìa mép uốn cong vào và nguyên vẹn
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 29
Phiến nấm của XLA2b tương tự với loài P ostreatus và P pulmonarius phiến nấm màu trắng, kéo dài từ mũ đến phần đầu của cuống; khác với loài P cornucopiae có phiến kéo dài từ mũ xuống gần chân cuống nấm
Lớp bì mũ nấm của XLA2b có cấu trúc đặc trưng với các sợi nấm xếp song song với thể nền, tương đồng với các loài phổ biến như P cornucopiae, P ostreatus, P pulmonarius Tuy nhiên, xét về độ dày, lớp bì mũ của XLA2b đạt khoảng 83 - 115 µm, gần nhất với độ dày của P cornucopiae, chứng tỏ sự tương đồng về mặt cấu trúc giữa hai loài này.
50 – 120àm và P ostreatus là 40 - 180àm, cũn lớp bỡ của P pulmonarius là 40 – 50àm
XLA2b, P ostreatus, P pulmonarius và P cornucopiae đều có cấu trúc basidiole hình am – pun Xét về kích thước thì basidiole của XLA2b tương tự với basidiole của 2 loài P ostreatus và P cornucopiae Cụ thể: kích thước basidiole của
XLA2b là 20 – 25,5 x 4 - 8àm; của P ostreatus là 20 – 30 x 3 – 7àm; của P cornucopiae là 20 – 35 x 5 – 7àm; khụng cú thụng tin về kớch thước basidiole của P pulmonarius
Định danh dựa trên vùng trình tự ITS
Trình tự vùng ITS của các mẫu nấm được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) để xác định các chủng nấm có độ bao phủ và độ tương đồng cao nhất Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và các hình 3.6 – 3.9
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 35
Hình 3.6 Kết quả BLAST của chủng XLA1a
Hình 3.7 Kết quả BLAST của chủng XLA2b
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 36
Hình 3.8 Kết quả BLAST của chủng XBT3b
Hình 3.9 Kết quả BLAST của chủng XLA4a Kết quả BLAST cho thấy cả 4 chủng nấm thuộc chi Pleutotus với độ bao phủ là 100%, độ tương đồng là 100% trên Genbank (NCBI)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 37
Bảng 3.1 Kết quả so sánh trì nh tự cúa các chủng nấm với dữ liệu trên GenB ank
STT Tên mẫu Độ bao phủ
(%) Độ tương đồng (%) Tên loài tương đồng
Như vậy dữ liệu phân tích sinh học phân tử đã hỗ trợ các phân tích hình thái và giúp xác định 4 chủng nấm có quan hệ gần nhất với loài Pleurotus pulmonarius
3.3.2 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài
Bộ dữ liệu gồm 9 trình tự thuộc các chủng P pulmonarius, P ostreatus, P cornucopiae và XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a Độ dài trình tự sau đồng nhất hoá còn lại 576 nucleotide Tất cả các vị trí có khoảng trống (gap) đều bị loại bỏ Giá trị ủng hộ (bootstrap) lặp lại 1000 lần
Cây ML được dựng với mô hình Kimura hai thông số (Kimura two-parameter) Kết quả cho thấy 4 chủng XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a cùng nhóm với loài P pulmonarius (Hình 3.10) Đối với cây NJ, khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng cách sử dụng phương pháp p-distance Kết quả cho thấy chủng XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a cùng nhóm với loài P pulmonarius (Hình 3.11)
Cây MP được dựng với thuật toán CNI on random trees Kết quả cho thấy 4 chủng XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a có quan hệ di truyền cùng nhóm với loài P pulmonarius (Hình 3.12)
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 38
Hình 3.10 Cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood (ML) của các chủng Pleurotus
Hình 3.11 Cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbour Joining (NJ) của các chủng Pleurotus
Hình 3.12 Cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Parsimony (MP) của các chủng Pleurotus
SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 39
