Định danh bằng hình thái một số chủng nấm bào ngư xám thương mại được bán ở thị trường thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp phân tích cấu trúc nấm
MỤC LỤC
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
- Phương pháp nghiên cứu 1. Thu thập và xử lý mẫu
Phương pháp thu thập và xử lý mẫu, phân lập và giữ giống được thực hiện theo Trịnh Tam Kiệt (Trịnh Tam Kiệt, 2011). Mẫu thu được tại các trại trồng được đựng trong hộp nhựa và ký hiệu riêng từng mẫu. Khi nấm có được hệ sợi, tiến hành cấy chuyền để thu được hệ sợi thuần, sau đó cấy vào ống giữ giống, môi trường giữ giống là môi trường thạch nghiêng MYA, bảo quản giống ở nhiệt độ 4- 5oC.
Phương pháp giải phẫu và phân tích mẫu nấm được thực hiện theo Largent (Largent 1977a; Largent và cộng sự 1977b). Các cấu trúc được phân tích gồm: mũ nấm, bào tầng, bào tử, đảm, liệt bào, bề mặt và thể nền của mũ nấm. Kết quả phân tích được so sánh với các mô tả của các nhà phân loại học khác để xác định loài cho các giống nấm thu thập.
Các chủng nấm sau khi đã làm thuần sẽ được cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng MYA. Khóa phân loại được sử dụng kết hợp giữa khóa phân loại mới nhất của Largent, khóa phân loại các loài Pleurotus ở Malaysia và khóa của Lê Bá Dũng (Largent, 1988;. Dựa trên quy trình của Hosaka và Uno (2011) và quy trình của Saghai-Maroof và cộng sự (1984) với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Quá trình khuếch đại vùng trình tự ITS được thực hiện trên máy luân nhiệt (Bio-rad, Hoa Kỳ) với các thông số được thể hiện ở bảng 2.2. Sử dụng thang DNA 1kb, thuốc nhuộm Gel Red, điện di ở điện thế 130V, 30 phút sau đó đọc kết quả bằng máy Geldoc. So sánh các trình tự với các dữ liệu có trên GenBank thông qua chương trình BLAST của NCBI.
Ghi nhận các trình tự tương đồng có chỉ số Max score cao nhất và kiểm tra tính toàn vẹn của các trình tự này để xem xét tính chính xác của phép so sánh. Phần mềm MEGA phiên bản 7.0 được sử dụng để sắp dóng cột các trình tự ITS và loại bỏ trình tự hai đầu sau khi sắp dóng cột. Khối dữ liệu ITS (576 nucleotide) sau khi xử lý được phân tích bằng 3 phương pháp Neighbor joining (NJ), Maximum parsimony (MP) và Maximum likelihood (ML) với các thông số như sau: cây NJ được dựng với phương pháp p-distance, cây MP được dựng với thuật toán CNI on random trees, cây ML được dựng mô hình Kimura two-parameter; giá trị ủng hộ (bootstrap) lặp lại 1000 lần với mức đạt ý nghĩa khi giá trị ủng hộ lớn hơn 50.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả làm thuần
Kết quả phân tích hình thái các mẫu nấm
Lớp bỡ mũ nấm của giống XLA1a cấu tạo bởi cỏc sợi nấm xếp song song với thể nền, tương tự với các loài P. Như vậy, kết quả phân tích hình thái sơ bộ cho thấy có thể xác định XLA1a thuộc chi Pleurotus và có các đặc điểm hình thái gần nhất với P. Tuy nhiên do vẫn còn thiếu một số đặc điểm như dấu in bào tử, cấu trúc đảm, cystidia bởi mẫu thương mại khi thu vẫn còn non, chưa có đủ các đặc điểm để phân loại đến loài nên cần thu quả thể trưởng thành để có được đầy đủ các chi tiết cho phân tích hình thái.
Phiến có dạng dày đặc, chạy từ mũ xuống phần đầu cuống, màu trắng, rìa mép nguyên vẹn và cùng màu với phiến. Tai nấm có thể mọc dạng đơn lẻ hoặc mọc thành chùm, không có vòng cổ và bao chân. Lớp bì mũ nấm của XLA2b cấu tạo bởi các sợi nấm xếp song song với thể nền, tương tự với các loài P.
Như vậy, kết quả phân tích hình thái sơ bộ cho thấy có thể xác định XLA2b thuộc chi Pleurotus và có các đặc điểm hình thái gần nhất với P. Tuy nhiên do vẫn còn thiếu một số đặc điểm như dấu in bào tử, cấu trúc đảm, cystidia bởi mẫu thương mại khi thu vẫn còn non, chưa có đủ các đặc điểm để phân loại đến loài nên cần thu quả thể trưởng thành để có được đầy đủ các chi tiết cho phân tích hình thái. Phiến có dạng dày đặc, chạy từ mũ xuống phần đầu cuống, màu trắng, rìa mép nguyên vẹn và cùng màu với phiến.
Lớp bì mũ nấm của XBT3b cấu tạo bởi các sợi nấm xếp song song với thể nền, tương tự với các loài P. Tuy nhiên vẫn còn thiếu một số đặc điểm như chưa xác định được sự có mặt của cystidia hay không, chưa có dấu ấn bào tử. Phiến có dạng dày đặc, chạy từ mũ xuống phần đầu cuống, phiến phân nhánh ở mũ và cuống, màu trắng, rìa mép khá nguyên vẹn và cùng màu với phiến.
Lớp bì mũ nấm của XLA4a cấu tạo bởi các sợi nấm xếp song song với thể nền, tương tự với các loài P. Như vậy, kết quả phân tích hình thái cho thái có thể xác định XLA4a thuộc chi Pleurotus và có nhiều đặc điểm tương đồng với các loài P. Tuy nhiên do vẫn còn thiếu một số đặc điểm như dấu in bào tử, cấu trúc đảm, cystidia bởi mẫu thương mại khi thu vẫn còn non, chưa có đủ các đặc điểm để phân loại đến loài nên cần thu quả thể trưởng thành để có được đầy đủ các chi tiết cho phân tích hình thái.
Định danh dựa trên vùng trình tự ITS 1. Kết quả BLAST
Kết quả so sánh trì nh tự cúa các chủng nấm với dữ liệu trên GenB ank. Như vậy dữ liệu phân tích sinh học phân tử đã hỗ trợ các phân tích hình thái và giúp xác định 4 chủng nấm có quan hệ gần nhất với loài Pleurotus pulmonarius. Đối với cây NJ, khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng cách sử dụng phương pháp p-distance.
Kết quả cho thấy 4 chủng XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a có quan hệ di truyền cùng nhóm với loài P.
