phân tích tổng hợp và khảo sát một số đột biến nổi trội trên gene angptl3 đối với bệnh cao lipid trong máu

- ∞0∞ -

HỒ BẢO AN

PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ

ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3

ĐỐI VỚI BỆNH CAO LIPID TRONG MÁU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- ∞0∞ -

HỒ BẢO AN

PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ

ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3

ĐỐI VỚI BỆNH CAO LIPID TRONG MÁU

Mã số sinh viên: 1953012001 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Hồ Bảo An

Ngày sinh: 28/12/2001 Nơi sinh: Bình Thuận Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y dược Mã học viên : 1953012001 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Hồ Bảo An

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Trương Kim Phượng

Học viên thực hiện: Hồ Bảo An Lớp: DH19SH01 Ngày sinh: 28/12/2001 Nơi sinh: Bình Thuận

Tên đề tài: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI

TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3 ĐỐI VỚI BỆNH CAO LIPID TRONG MÁU

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên Hồ Bảo An được bảo vệ Khóa luận trước Hội đồng:

TS Trương Kim Phượng

Lời cảm ơn

Đầu tiên, em xin cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ chí Minh và quý thầy cô trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã tận tình dạy bảo và truyền dạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn GS TS Lê Huyền Ái Thúy – Trưởng khoa Công nghệ Sinh học, TS Lao Đức Thuận đã làm việc trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã tạo điều kiện giúp đỡ em tận tình trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trương Kim Phượng đã hỗ trợ hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp, cô đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm cho em thực hiện hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với Cha Mẹ, gia đình, những người bạn thân yêu nuôi dưỡng, dạy bảo con để con có được ngày hôm nay, động viên con để giảm tải những áp lực trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

DANH MỤC VIẾT TẮT

ANGPTL3 Angiopioetin – like 3

IDT Integrated DNA Technology

NCBI National Central Biology Information

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình I.1 Cấu trúc của cholesterol (Peng et al., 2008) 4

Hình I.2 Cấu trúc của lipoprotein (A) và phân loại các lipoprotein (B) 6

Hình I.3 Các nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới (WHO) 12

Hình I.4 Các ca tử vong do bệnh tim mạch gây ra ở Việt Nam (GBD) 13

Hình I.5 Vị trí của gene ANGPTL3 trên NST số 1 13

Hình I.6 Cấu trúc của protein ANGPTL3 15

Hình I.7 Vai trò của ANGPTL3 trong việc ức chế LPL (Chen et al., 2021) 16

Hình III.1 Biểu đồ Forest plot biểu thị tỷ lệ tổng thể xuất hiện đột biến gene ANGPTL3 ở bệnh nhân cao lipid máu 35

Hình III.2 Đồ thị Funnel plot của bộ dữ liệu xác định đột biến gene ANGPTL3 ở bệnh nhân cao lipid máu 35

Hình III.3 Kết quả điện di 7 mẫu được phân tích 41

Hình III.4 Biến thể c.496-66insA trên vùng intron 1 gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M2 42

Hình III.5 Thể đột biến dị hợp c.496-133G>A trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M2 43

Hình III.6 Thể đột biến dị hợp c.496-141G>C trên vùng intron số 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M2 43

Hình III.7 Biến thể c.469-157insA trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M7 44

Hình III.8 Thể đột biến dị hợp c.469-133G>A trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M7 45

Hình III.9 Thể đột biến dị hợp c.469-127G>A trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M7 45

Hình III.10 Thể đột biến dị hợp c.496-99C>T trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M7 46

Hình III.11 Thể đột biến dị hợp c.496-66G>A trên vùng intron 1 của gene ANGPTL3 ở sản phẩm PCR mẫu M7 46

Hình III.12 Biến thể c.531C>T (p.Asp177Asp) trên exon 2 gene ANGPTL3 ở sản

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng I.1 Các đặc điểm phân biệt lipoprotein 7

Bảng I.2 Đặc điểm và chức năng của các apolipoprotein 7

Bảng I.3 Một số gene liên quan đến bệnh cao lipid máu gây ra bởi yếu tố di truyền 9Bảng I.4 Các nguyên nhân nguyên phát phân loại theo phân loại Frederickson 11

Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR 28

Bảng II.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 29

Bảng III.1 Phân loại và số lượng thu thập các nghiên cứu 31

Bảng III.2 Các nghiên cứu phân tích đột biến trên gene ANGPTL3 33

Bảng III.3 Chỉ số Proport – tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gene ANGPTL3 ở bệnh nhân cao lipid trong máu 34

Bảng III.4 Chỉ số Proportion – tỷ lệ xuất hiện đột biến ANGPTL3 ở các châu lục trên thế giới 36

Bảng III.5 Chỉ số Proportion – tỷ lệ xuất hiện đột biến theo phương pháp nghiên cứu 37

Bảng III.6 Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến theo từng exon của gene ANGPTL3 38

Bảng III.7 Trình tự cặp mồi khuếch đại vùng exon 2 của gene ANGPTL3 39

Bảng III.8 Thông số vật lý của cặp mồi khuếch đại trình tự mục tiêu exon 2 của gene ANGPTL3 40

Bảng III.9 Kết quả xác định các vị trí biến thể xuất hiện trên một số mẫu bệnh 51

1.1 Cấu trúc của cholesterol 4

1.2 Vai trò của cholesterol 4

1.3 Cấu trúc của lipoprotein 5

1.4 Phân loại của lipoprotein 5

2 Bệnh cao lipid trong máu 8

2.1 Định nghĩa về bệnh cao lipid trong máu 8

2.2 Nguyên nhân gây ra bệnh cao lipid trong máu 9

2.3 Phân loại bệnh cao lipid trong máu 10

3 Tổng quan về bệnh tim mạch 12

3.1 Tình hình bệnh tim mạch trên thế giới 12

3.2 Tình hình bệnh tim mạch ở Việt Nam 12

4 Tổng quan về gene ANGPTL3 13

4.1 Thông tin về gene ANGPTL3 13

4.2 Thông tin về protein ANGPTL3 14

4.3 Tính chất đột biến trên gene ÀNGPTL3 liên quan đến một số bệnh lý 16

4.4 Các nghiên cứu về đột biến trên gene ANGPTL3 trên thế giới 17

4.5 Tình hình nghiên cứu về gene ANGPTL3 tại Việt Nam 19

5 Phương pháp phân tích tổng hợp 19

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

1 Vật liệu nghiên cứu 23

1.1 Công cụ phần mềm 23

2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.1 Khai thác dữ liệu hệ thống tổng quan khoa học 25

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

1 Kết quả khai thác dữ liệu hệ thống tổng quan khoa học 31

2 Kết quả phân tích tổng hợp 32

3 Thiết kế trình tự mồi ở vùng exon 2 của gene ANGPTL3 38

4 Kết quả khảo sát thực nghiệm phân tích đột biến trên mẫu máu người mắc bệnh cao lipid trong máu tại Việt Nam 40

4.1 Kết quả tách chiết DNA 40

4.2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng gene mục tiêu ANGPTL3 41

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 Kết luận 55

1.1 Khai thác dữ liệu - Phân tích tổng hợp 55

1.2 Kết quả thực nghiệm bằng quy trình PCR và giải trình tự Sanger 55

2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD) là bệnh có đến hơn 18,5 triệu ca tử vong mỗi năm, là một trong những bệnh có số người mắc phải và tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2019; Global Burdern of Disease (GBD), 2019) Ở Việt Nam, ước lượng có đến 240.161 ca tử vong do mắc bệnh tim mạch với số ca tử vong do đột quỵ là cao nhất là 135.999, chiếm 56,6% số ca tử vong do bệnh tim mạch (GBD, 2019)

Bệnh cao lipid trong máu là bệnh được xác định bởi nồng độ lipid trong máu bất thường, chủ yếu là các chỉ số cholesterol tổng, triglyceride, làm thay đổi các mức độ cholesterol tổng, LDL-C, triglyceride và mức độ lipoprotein tỷ trọng thấp (High Density Lipoprotein, HDL), vì vậy bệnh cao lipid trong máu là một trong những nguy

cơ chính gây ra các bệnh tim mạch trên toàn thế giới (Bezerra et al., 2023; Pirillo et

al., 2021) Một số báo cáo cho rằng gene ANGPTL3 có liên quan đến bệnh cao lipid

máu, bởi gene này ức chế hoạt động của Lipase lipoprotein và Endothelial lipase làm giảm nồng độ LDL trong cơ thể

Gene Angiopioetin-like 3 (ANGPTL3) dài 8794 bp, với 6 intron và 7 exon, gene nằm ở vị trí nhiễm sắc thể số 1p31.1 - p22.3 (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022; Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023; NCBI) Gene ANGPTL3 mã hóa cho

protein ANGPTL3 tham gia vào quá trình ức chế LPL, làm tăng các mức độ LDL, triglyveride và VLDL

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu nhằm xác định tính chất đột biến trên gene

ANGPTL3 Nghiên cứu của Stizel và các cộng sự (2017), đã thực hiện phân tích các

đột biến mất chức năng của gene ANGPTL3, các đột biến mất chức năng trong nghiên

cứu bao gồm các đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung, và đột biến điểm được xác định trong 21.980 người mắc CAD và 158.200 ca chứng Kết quả cho thấy những

người mang biến thể dị hợp của gene ANGPTL3 cho thấy giảm 17% mức độ

triglyceride và 12% mức độ LDL-C trong cơ thể

Do đó việc xác định một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh cao lipid trong máu trên bệnh nhân Việt Nam, cụ thể là xem xét các đột biến điểm trên gene

ANGPTL3 mang lại ý nghĩa khoa học,thiết thực đối với việc tiên lượng, chẩn đoán và

điều trị bệnh cao lipid trong máu Do đó, nhằm nắm bắt tình hình, chúng tôi thực hiện

chuyên đề Khóa luận tốt nghiệp: “PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT

MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3 ĐỐI VỚI BỆNH

CAO LIPID TRONG MÁU” Mục tiêu:

Sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để phân tích đột biến trên gene

ANGPTL3 được thu thập ở một số mẫu máu ở bệnh nhân cao lipid trong máu ở Việt

Nam

Khảo sát mức độ xuất hiện biến thể trên gene ANGPLT3 ở người bệnh cao

cholesterol trong máu trên thế giới cùng với đặc điểm trình tự một số exon của gene

ANGPTL3 trên người bệnh cao cholesterol Việt Nam Đồng thời, xây dựng dữ liệu

về trình tự tham chiếu, bộ mồi phù hợp với các quy trình phân tích, phát hiện biến thể gây nên bệnh cao cholesterol trong máu

Nội dung nghiên cứu:

Thu thập dữ liệu về cơ sở phân tử của bệnh cao lipid trong máu, tập trung vào

tính chất đột biến trên các exon thuộc gene ANGPTL3 liên quan đến bệnh cao lipid

trong máu trên thế giới và Việt Nam

Khảo sát in silico bộ mồi của quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định tính chất đột biến điểm ở gene ANGPTL3

Thực hiện quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến điểm nổi trội ở Việt Nam, cụ thể là các mẫu bệnh phẩm máu có chỉ số cao cholesterol được thu nhận tại Việt Nam

I TỔNG QUAN

1 Tổng quan về cholesterol

1.1 Cấu trúc của cholesterol

Cholesterol hiện diện trong các tế bào nhân thực (Eukaryote) và một số nhóm loài thuộc nhân sơ (Prokaryote), cholesterol là một hợp chất chứa 27 carbon với ba vùng cấu tạo chính bao gồm một đầu ưa nước, một đầu kỵ nước (giúp cho cholesterol không bị trộn lẫn vào nước) và vùng trung tâm chứa bốn vòng hydrocarbon giúp cho

cholesterol có độ cứng (Schade et al., 2020; Craig et al., 2018) Vùng trung tâm của

cholesterol là vùng mang chức năng chính của tất cả các steroid hormone, nhờ những cấu tạo đó mà cholesterol được đóng gói chung với apoprotein để được mang đi khắp cơ thể thông qua các mạch máu, bên cạnh đó, cơ thể con người có thể tổng hợp cholesterol tự do và cũng có thể thu nạp cholesterol từ hấp thụ chất dinh dưỡng (Hình

I.1) (Craig et al., 2018)

Hình I.1 Cấu trúc của cholesterol (Peng et al., 2008)

1.2 Vai trò của cholesterol

Trong tế bào động vật có vú và con người, cholesterol được tổng hợp chủ yếu thông qua con đường tiền chất acetate hoặc hấp thu các nguồn thực phẩm hoặc ở gan

(Russell et al., 1992) Cholesterol là một phân tử sinh học đem lại nhiều chức năng

cần thiết cho con người, từ sinh sản đến vận chuyển chất dinh dưỡng đến những quá trình hoạt động của tế bào, cholesterol có ở khắp mọi nơi trong cơ thể giới động vật

(Craig et al., 2018) Cholesterol là một hợp chất có vai trò quan trọng trong màng tế

bào, là thành phần chính trong việc đảm bảo tính vẹn toàn và tính lỏng của màng tế bào và là tiền chất để tổng hợp các hormone steroid được sản xuất bởi tuyến thượng

thận, các acid mật và vitamin D (Craig et al., 2018; Cerqueira et al., 2016; Russell et

al., 1992) Sự điều hòa cân bằng nội mô cholesterol trong cơ thể được thực hiện thông

qua 3 con đường chính: (1) điều hòa hoạt động sản xuất thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp, (2) hoạt hóa và điều hòa enzyme khử HMG – CoA và những enzyme khác trong con đường sinh tổng hợp cholesterol, (3) điều hòa sự tổng hợp 7α - hydroxylase trong

acid mật (Russell et al., 1992) Sự bất thường về lượng cholesterol trong cơ thể là yếu

tố tác động xấu đến sức khỏe con người, đặc biệt có liên quan đến các bệnh lý tim

mạch (Cerqueira et al., 2016)

1.3 Cấu trúc của lipoprotein

Do cấu trúc kỵ nước của cholesterol do đó nó không thể tan tốt trong mạch máu, vì vậy cholesterol được đóng gói trong lipoprotein có chứa phospholipid và

apolipoprotein (Apo) (Wang et al., 2018) ) Lipoprotein là một đại phức hợp giữa lipid và protein (Genest et al, 2003) Cấu trúc chung của lipoprotein là hình cầu,

chúng chứa nhiều thành phần khác nhau với lõi trung tâm được cấu tạo bởi lõi lipid, nơi chứa các cholesterol ester và trygliceride, lipoprotein có lớp ưa nước bên ngoài

bao gồm apolipoprotein, phospholipid và các cholesterol tự do (Hình I.2-A) (Huff et

al., 2022) Nhờ những cấu trúc đặc trưng này mà lipoprotetin có thể dễ dàng di chuyển

khắp cơ thể thông qua máu và đến các tế bào (Huff et al., 2022; Craig et al., 2018)

1.4 Phân loại của lipoprotein

Dựa vào kích thước của các apolipoprotein, kích thước phân tử và mật độ lipid nên chúng đóng một vai trò quan trọng trọng việc phân loại lipoprotein thành năm loại chính: chylomicron, lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low-density Lipoprotein, VLDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate-density Lipoprotein, IDL), lipoprotein mật độ thấp (Low-density Lipoprotein, LDL), và lipoprotein mật độ cao

(High-density Lipoprotein, HDL) (Hình I.2.B, Bảng I.1, Bảng I.2) (Lent-Schochet et

al., 2022; Tulenko et al., 2002; Ginsberg et al., 1998) Trong đó, HDL còn được xem

như là một “cholesterol tốt” có thể đảo ngược quá trình vận chuyển cholesterol, LDL

được xem như “cholesterol xấu” có thể thúc đẩy gây ra các bệnh tim mạch

(Lent-Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002) Cấu trúc cảu các lipoprtoein được mô tả

chi tiết như sau:

Hình I.2 Cấu trúc của lipoprotein (A) và phân loại các lipoprotein (B)

− Chylomicron được tổng hợp từ ruột non, có kích thước lớn (đường kính 100 – 1000 nm, tỷ trọng > 0,95 g/ml), và giàu triglyceride, nhưng chỉ chứa lượng nhỏ protein trong phân tử, có chức năng vận chuyển các triglyceride từ ruột đến các mô

trong cơ thể (Durrington et al., 2007)

− VLDL (đường kính 40 – 50 nm, tỷ trọng > 1,006 g/ml) là các phân tử lipoprotein được tổng hợp từ gan, nhỏ hơn chylomicron VLDL cũng trải qua các trình tự chuyển hóa tương tự chylomicron, chúng loại bỏ trygliceride khỏi lõi trung

tâm và sản phẩm cuối cùng của chúng là LDL (Charlton‐Menys et al., 2008; Durrington et al., 2007; Genest et al, 2003)

− IDL (đường kính 25 – 30 nm, tỷ trọng 1,006 – 1,019 g/ml) là những lipoprotein VLDL còn sót lại sau khi chúng cạn kiệt triglyceride, vì vậy phải thu nạp thêm cholesterol và hình thành nên IDL, các IDL bị khử lipid bởi các hepatic lipase (HL)

để hình thành các LDL (Genest et al., 2003)

− LDL (đường kính 20 – 25 nm, tỷ trọng 1019 – 1063 g/ml) rất giàu cholesterol và có kích thước vừa đủ để có thể thâm nhập vào trong nội mô mạch máu, và có thể

xâm nhập vào trong các mô do đó chúng có thể tương tác với mọi tế bào trong cơ thể, chức năng chính của LDL là vận chuyển cholesterol để đưa cholesterol vào trong tế

bào (Genest et al, 2003)

− Tương tự như LDL, HDL có khả năng khả năng xâm nhập vào trong nội mô mạch máu nhưng có kích thước nhỏ hơn (đường kính 6 – 10 nm, tỷ trọng 1063 – 1210 g/ml) HDL được xem xét về khả năng thu thập những cholesterol thặng dư từ quá trình vận chuyển từ các mô ngoại vi xuyên qua các dịch ngoài bào để đưa cholesterol trở về lại gan và để phá hủy cholesterol bởi túi mật, chuyển đổi thành muối mật hoặc

chuyển đổi để “tái sản xuất” trở lại cho các lipoprotein (Durrington et al., 2007)

Bảng I.1 Các đặc điểm phân biệt lipoprotein Lipoprotein Mật độ (g/ml) Kích thước

Bảng I.2 Đặc điểm và chức năng của các apolipoprotein Apoliprotein

phối tử của thụ thể LDL

Apoliprotein (Apo)

Khối lượng

phân tử Lipoprotein Chức năng B-48 264000 Chylomicron

Hình thành cấu trúc của chylomicron và tham gia quá trình bài tiết chylomicron từ

gan

C-I 6630 Chylomicron, VLDL, IDL, HDL

Hoạt hóa LCAT, ức chế LPL, ức chế CETP, ức chế ApoE

đính vào LRP

C-II 8900 Chylomicron, VLDL, IDL, HDL

Hoạt hóa LPL, suy giảm dẫn đến tang triglyceride trong

máu toàn phần

C-III 8800 Chylomicron, VLDL, IDL, HDL

Ức chế LPL, ngăn chặn hoặc

thay thế ApoE đính vào LRP

E 34145 Chylomicron, VLDL, IDL, HDL

Protein đa chức năng Điều chỉnh LPL, CETP, LCAT, HP, phối tử thụ thể LDL,

phối tử LRP

Chú thích: LCAT: enzym lecithin-cholesterol acyl transferase; LPL: enzyme lipoprotein lipase; CETP: Protein trung chuyển Cholesteryl ester; LRP: thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp liên quan đến protein; HP: hepatic lipase Tài liệu tham khảo: Lent-Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002; Ginsberg et al., 1998

2 Bệnh cao lipid trong máu

2.1 Định nghĩa về bệnh cao lipid trong máu

Bệnh cao lipid trong máu là bệnh được xác định bởi nồng độ lipid trong máu bất thường, chủ yếu là thay đổi các mức độ cholesterol tổng, LDL-C, triglyceride và mức độ lipoprotein tỷ trọng thấp (High Density Lipoprotein, HDL), vì vậy bệnh cao lipid trong máu là một trong những nguy cơ chính gây ra các bệnh tim mạch trên toàn

thế giới (Bezerra et al., 2023; Pirillo et al., 2021) Theo Tổ chức Y tế thế giới WHO,

có khoảng 1/3 số ca mắc bệnh nhồi máu cơ tim có sự đóng góp của cao cholesterol Việc cao lipid trong máu gây ra 2,6 triệu ca tử vong (chiếm 4,5% trong tổng số ca tử vong) và 29,7 triệu ca (DALYS) Theo thống kê của Global Burdern of Disease, ước lượng hơn 40 nghìn ca tử vong do có nồng độ cao cholesterol LDL ở Việt Nam (2019)

2.2 Nguyên nhân gây ra bệnh cao lipid trong máu

Lối sống sinh hoạt không lành mạnh cũng có thể ảnh hưởng đến mức độ lipid trong máu, tuy nhiên mức độ lipid trong máu cũng bị tăng cao do nguyên nhân di truyền, bị ảnh hưởng bởi sự khiếm khuyết của đơn hay đa gene trong cơ thể (Shattat

et al., 2015; Stewart et al., 2020) Yếu tố di truyền dẫn đến một số dạng rối loạn: giảm

lượng lipoprotein lipase (gây rối loạn cao chylomicron trong máu mang tính gia đình), suy giảm thụ thể LDL (gây rối loạn cao cholesterol trong máu mang tính gia đình), sự gia tăng sản xuất và bài tiết VLDL, gây rối loạn cao triglyceride trong máu mang

tính gia đình) (Bảng I.3) (Shattat et al., 2015) Bệnh cao lipid trong máu không có

triệu chứng cụ thể, nhưng nhìn chung bệnh được phát hiện khi thực hiện xét nghiệm lâm sàng hoặc được xác định ở những trường hợp cấp cứu do đột quỵ hoặc suy tim, những bệnh nhân có nồng độ cholesterol trong máu cao có thể xuất hiện những mảng

u vàng dưới da và dưới hốc mắt (Stewart et al., 2020)

Bảng I.3 Một số gene liên quan đến bệnh cao lipid máu gây ra bởi yếu tố di truyền

TT Tên gene mục tiêu

Vị trí trên NST - tổng số

exon

Chiều dài (bp) - Sự định vị trên trình tự

“NC” Chức năng

Tần số đột biến trên gene mục tiêu ở bệnh

cao lipid trong máu (Nguồn trích

dẫn)

1 LDLR NST 3

22 exon

44389 bp NC_000003.12

(179148126 179240093)

Phối hợp với LDL để cải thiện quá trình vận chuyển cholesterol

90% trên bệnh cao cholesterol trong máu

mạch bổ sung)

Mã hóa protein ApoB-100 và ApoB-48

5% trên bệnh cao

cholesterol mang tính gia đình

TT Tên gene mục tiêu

Vị trí trên NST - tổng số

exon

Chiều dài (bp) - Sự định vị trên trình tự

“NC”

Chức năng

Tần số đột biến trên gene mục tiêu ở bệnh

cao lipid trong máu (Nguồn trích

369847 bp NC_000001.11 (55039548 55064852)

Duy trì điều hoá lượng cholesterol

~ 2% trên bệnh cao cholesterol trong máu (Mikhailova

et al., 2019)

4 ANGPTL3 NST 1

7 exon

8794 bp NC_000001.11 (62597520 62606313)

Ức chế nội sinh, ức chế lipoprotein lipase (LPL) và lipase nội mô

0,3% trên các bệnh lý cao lipid máu

(Bea et al.,

2021; Stitziel

et al., 2017) Chú thích: LDLR: Low Density Lipoprotein Receptor; APOB: Alipoprotein B,

PCSK9: Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

2.3 Phân loại bệnh cao lipid trong máu

Bệnh lipid trong máu được phân thành năm loại khác nhau, dựa trên 5 kiểu hình

của Federickson và các cộng sự (1975) chi tiết như sau (Tulenko et al., 2002; Pappan

et al., 2022; Majanović et al., 2021; Nouh et al., 2019):

Kiểu hình I là một rối loạn lipid không phổ biến gây ra bởi việc khiếm khuyết hoạt động của LPL dẫn đến việc khử triglyceride bị trì trệ và khiến cho thời gian phân hủy chylomicron bị chậm lại, gây ra bệnh cao triglyceride trong máu và dẫn đến các rối loạn ở tuyến tụy

Kiểu hình II là kiểu hình phổ biến nhất bao gồm hai loại là IIa và IIb Kiểu hình IIa bao gồm dạng đơn gene hiếm gây ra bởi sự khiếm khuyết thụ thể LDL, ngoài ra còn có thể gây ra bởi đa gene, dạng này phức tạp hơn và cần đến yếu tố môi trường từ đó gây ảnh hưởng xấu đến con đường chuyển hóa LDL, dẫn đến mắc bệnh cao cholesterol trong máu mang tính gia đình Kiểu hình IIb gây ra bệnh rối loạn cao lipid trong máu tổ hợp mang tính gia đình, kiểu hình này ít phổ biến và nó được xác định bởi sự cao cholesterol và triglyceride trong máu, nguyên nhân là bởi sự đột biến đơn gene hoặc đa gene gây nên sự tích tụ cholesterol LDL và triglyceride

Kiểu hình III là tình trạng rối loạn lipid hiếm gặp, bởi rối loạn này được xác định bởi sự tăng cao chylomicron và VLDL, gây ra bởi sự mất chức năng tổng hợp của ApoE, sự đột biến này của ApoE làm tăng cao chylomicron và các tàn dư VLDL trong máu Khi các hạt này tồn tại càng lâu, thì các LPL sẽ bị suy giảm khả năng phân hủy triglyceride, từ đó tạo ra các hạt cholesterol giàu triglyceride

Kiểu hình IV là một dạng rối loạn lipid phổ biến thông qua chỉ số triglyceride được tăng cao bởi vì mức độ VLDL tăng cao nhưng vẫn duy trì bình thường mức độ VLDL, và nó được di truyền trong tự nhiên, do đó rối loạn này được gọi là cao triglyceride trong máu mang tính gia đình

Kiểu hình V là dạng hiếm gặp nhưng lại có những đặc điểm tương đối tương đồng với loại IV, bởi vì cũng được xác định bằng mức độ triglyceride, ngoài việc tăng sự tổng hợp triglyceride, mà còn giảm khả năng khử các chylomicron và VLDL, các đặc điểm này tương đồng với sự suy giảm LPL

Bảng I.4 Các nguyên nhân nguyên phát phân loại theo phân loại Frederickson Phân

loại Kiểu rối loạn Lipoprotein bị tăng cao xuất hiện Tần số I Familial hyperchylomicrons Chylomicron Cực kỳ

hiếm gặp

IIa Familial hypercholesterolemia LDL Phổ biến

IIb Familial combined

hyperlipidemia LDL và VLDL

Ít phổ biến

III Familial dysbetalipoprotein IDL Hiếm gặp

IV Endogenous Hyperlipemia VLDL Phổ biến

V Familial hypertriglyceride Chylomicron và VLDL Phổ biến

3 Tổng quan về bệnh tim mạch

3.1 Tình hình bệnh tim mạch trên thế giới

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD) là bệnh có đến hơn 18,5 triệu ca tử vong mỗi năm, là một trong những bệnh có số người mắc phải và tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2019; Global Burdern of Disease (GBD), 2019) Theo dữ liệu của WHO (2019), bệnh tim mạch là một nhóm bệnh rối loạn tim mạch và mạch máu bao gồm bệnh tim mạch vành, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh cao huyết áp, đột quỵ,… đây là những bệnh lý thuộc vào các bệnh về tim mạch (WHO, 2019) Theo WHO (2019), hơn 80% số ca mắc bệnh lý tim mạch tử vong là bởi vì bị suy tim và đột quỵ, 33,3% diễn ra chủ yếu ở người dưới 70 tuổi (Hình I.3)

Hình I.3 Các nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới (WHO)

3.2 Tình hình bệnh tim mạch ở Việt Nam

Ở Việt Nam, ước lượng có đến 240.161 ca tử vong do mắc bệnh tim mạch (Hình I.4) với số ca tử vong do đột quỵ là cao nhất là 135.999, chiếm 56,6% số ca tử vong do bệnh tim mạch (GBD, 2019) Bên cạnh đó, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong của

bệnh lý tim mạch được chẩn đoán ở bệnh viện tương ứng với 9,0% và 18,6% (Anh

Hien et al 2020) Một trong những nguyên nhân chính gây nên bệnh lý tim mạch là

do lối sống không lành mạnh chủ yếu là việc sử dụng thuốc, chế độ ăn uống không phù hợp, ít vận động thể dục thể thao, những lối sống này có thể thể hiện ở các bệnh nhân thông qua các chỉ số tăng huyết áp máu, tăng đường trong máu và béo phì (WHO)

Hình I.4 Các ca tử vong do bệnh tim mạch gây ra ở Việt Nam (GBD)

4 Tổng quan về gene ANGPTL3

4.1 Thông tin về gene ANGPTL3

Gene Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) mã hóa protein ANGPTL3, đây là yếu tố điều hòa chính của quá trình chuyển hóa lipoprotein Gene ANGPTL3 dài 8794

nucleotide, với 6 vùng intron và 7 vùng exon, gene nằm ở vị trí nhiễm sắc thể số

1p31.1 - p22.3 (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022; Tikka et al., 2016; Luo et

al., 2023; NCBI) (Hình I.5)

Hình I.5 Vị trí của gene ANGPTL3 trên NST số 1

4.2 Thông tin về protein ANGPTL3

ANGPTL3 thuộc một trong họ protein ANGPTL gồm có từ ANGPTL1 - ANGPTL8, họ protein ANGPTL có những vùng cấu trúc tương tự nhau như vùng peptide tín hiệu N-terminal (SP), vùng xoắn N-terminal (Coil-coiled domain, CCD), vùng liên kết và vùng C-terminal giống fibrinogen (Fibrinogen-like domain, FLD); trong đó ANGPTL3 chứa 4 cyteines bảo tồn liên quan đến liên kết disulfide nội phân

tử của FLD đóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid ở người (Santulli et

al., 2014; Liu et al., 2021)

Protein của ANGPTL3 có cấu trúc bao gồm 460 amino acid (a.a) và có khối lượng

phân tử khoảng 70 kD, được biểu hiện và bài tiết tại tế bào gan, cấu trúc của ANGPTL3 có vùng tín hiệu peptide đặc biệt (0 – 17 a.a), một vùng xoắn kép đầu N (N-terminal coiled-coil domain, CCD), và một vùng tương đồng fibrinogen đầu C (C-

terminal fibrinogen like domain, FBG) (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022; Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023) Vùng xoắn kép đầu N (17 – 210 a.a) đặc biệt là

vùng amino acid 32 - 55, là vùng có khả năng ảnh hưởng đến mức độ triglyceride trong máu thông qua việc ức chế hoạt tính xúc tác của hai enzyme ngoại bào là LPL

và các lipase nội bào (Edothelial lipase, EL) (Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023)

Vùng tương đồng fibrinogen (237 – 455 a.a) liên kết với các thụ thể intergrin (các protein xuyên màng) αvβ3 và gây ảnh hưởng lên sự tạo mạch máu, tương tự chức

năng với angiopioetin (Tikka et al., 2016) Đoạn liên kế ngắn (221 – 222 a.a và 224

– 225 a.a) đóng vai trò như là một vùng cắt furin, vùng này được cho rằng là khi ANGPTL3 được cắt nhỏ ở vùng này có thể nâng cao khả năng hoạt động ức chế LPL

và EL ở vùng CCD (Hình I.6) (Ono et al., 2003; Tikka et al., 2016)

Hình I.6 Cấu trúc của protein ANGPTL3

*Cơ chế hoạt động của ANGPTL3 trong việc ức chế LPL

Quá trình phân hủy Triglycerid-rich lipoprotein bằng LPL đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển và chuyển hóa, cung cấp lipid cho việc sử dụng năng

lượng hay dự trữ năng lượng (Su et al., 2018) Việc có thể ức chế hoạt tính của LPL là bởi cấu trúc đặc biệt của ANGPTL3 Vùng xoắn cuộn đầu N của ANGPTL3 tồn

tại 3 amino acid quan trọng Aspartic acid (Asp), Histidin (His), Glutamine (Gln), 3 amino acid này có khả năng đính vào vùng glycosylphosphatidylinositol gắn liền với lipoprotein tỷ trọng cao đính protein 1 (Glycosylphosphatidylinositol Anchored High-density Lipoprotein Binding Protein 1, GPIHBP1), protein GPIHBP1 được biểu hiện ở tế bào nội mô mao mạch và vận chuyển LPL đến lòng mao mạch, gây ức chế

quá trình vận chuyển LPL, bên cạnh đó hiệu quả ức chế LPL của ANGPTL3 được cải thiện khi kết hợp với ANGPTL8 (Hình I.7) (Quagliarini et al., 2012)

Hình I.7 Vai trò của ANGPTL3 trong việc ức chế LPL (Chen et al., 2021)

Chú thích: Capillary lumen: Lòng mao mạch; Free fatty acids: Các acid béo tự do; TGRL

(Trgliceride-rich lipoprotein): Các lipoprotein giàu triglyceride; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol gắn liền với lipoprotein tỷ trọng cao đính protein 1; HSGP: Heparan sulfate proteoglycans.

4.3 Tính chất đột biến trên gene ANGPTL3 liên quan đến một số bệnh lý

Các đột biến mất chức năng của gene ANGPTL3 được tìm thấy ở người bệnh với

tình trạng nồng độ triglyceride cực kỳ thấp và các nhà khoa học khám phá đột biến

mất chức năng của gene ANGPTL3 có khả năng bảo vệ khỏi bệnh xơ vữa động mạch,

bởi vì khi đột biến xảy ra ANGPTL3 không còn khả năng ức chế LPL do đó các LPL di chuyển vào các lòng mao mạch thực hiện chức năng của mình là phân hủy các

lipoprotein (Ruhanen et al., 2020)

Nghiên cứu của Pisciotta và các cộng sự (2012) đã thực hiện quy trình PCR và giải trình tự trên 4 cá thể của 3 gia đình khác nhau, và kết quả thu nhận được 3 biến

thể trên gene ANGPTL3: c.1198+1G>T (p.G400VfsX5) thuộc intron 6, c.55delA

(p.I19LfsX22) và c.439_442delAACT (p.N147X) đều thuộc exon 1 Ba biến thể này được tiếp tục phân tích sinh hóa cho thấy ba biến thể này liên quan đến thiếu sự hiện

diện của ANGPTL3, từ đó liên quan đến giảm lượng triglyceride chứa trong

lipoprotein và mức độ HDL trong máu (Pisciotta et al., 2012)

Nghiên cứu của Musunuru và các cộng sự (2010) đã thực hiện đã thực hiện phương pháp giải trình tự exon, tập trung ở các vùng exon, vùng mã hóa các protein trên trên 38 thành viên của 3 thế hệ một gia đình mắc bệnh cao lipid máu tổ hợp mang tính gia đình (FCHL) Kết quả nghiên cứu cho thấy hai trường hợp bệnh nhân là hai

anh em ruột có mang 2 dạng đột biến vô nghĩa đều thuộc exon 1 trên gen ANGPTL3:

E129X và S17X Nhóm nghiên cứu thực hiện thêm phân tích tương quan giữa 2 đột biến S17X và E129X đến FCHL, kết quả cho thấy mức độ LDL và TG trong máu thấp (33 mg/dl [0,9 mmol/l] và 21 mg/dl [0,2 mmol/l]), nghiên cứu kết luận hai đột biến E129X và S17X cho thấy sự giảm nồng độ LDL-C trong máu

Nghiên cứu của Noto và các cộng sự (2012) xác định đột biến trên một số gene

ANGPLT3, APOB, PCSK9, và MTP tương quan với bệnh cao lipid trong máu Kết

quả không tìm thấy đột biến ở các gene APOB, PCSK9, và MTP trong các mẫu nghiên cứu Kết quả phân tích trình tự gene ANGPTL3 xuất hiện các biến thể đột biến trong

8 mẫu với tỉ lệ đột biến tổng thể là 10,25% Trong đó, tính chất đột biến ở những bệnh nhân người Ý có các đột biến lệch khung mới (p.E95del, p.N147fsX1, và p.E119fsX8 đều thuộc exon 1) và các đột biến vô nghĩa mới (p.F295L và p.G56V thuộc exon 1, p.R332Q thuộc exon 6) Đối với tính chất đột biến ở những bệnh nhân người Mỹ xác

định được một đột biến ở gene ANGPTL3 lệch khung mới là p.N121fsX và 2 đột biến

vô nghĩa và đã được công bố trước đây là p.S17X và p.E129X, những người mang đột biến này cho thấy có mức độ triglyceride, cholesteol toàn phần, LDL-C, HDL-C thấp hơn những người không mang biến thể

4.4 Các nghiên cứu về đột biến trên gene ANGPTL3 trên thế giới

Gene ANGPTL3 là một trong những gene quan trọng liên quan đến chuyển hóa lipid Nghiên cứu đột biến gene ANGPTL3 đang nhận được sự quan tâm rất lớn trên

toàn thế giới, đặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứu bệnh tim mạch và bệnh lý lipid máu Nghiên cứu của Dewey và các cộng sự (2017) đã thực hiện giải trình tự exon trên 58335 người tham gia Nhóm thực hiện khảo sát mối liên quan giữa các biến thể mất

chức năng (LOF) ở gene ANGPTL3 và với bệnh xơ vữa động mạch trong 13102 bệnh

nhân và 40430 ca chứng Nghiên cứu thu nhận được 13 biến thể mất chức năng với tỷ lệ xuất hiện là 0,33% ở người mang bệng xơ vữa động mạch và tỷ lệ xuất hiện 0,45% ở người bình thường (OR = 0,59; 95%, CI = 0,41 – 0,85; P=0,004) Kết quả xác định những người mang biến thể mất chức năng có nồng độ TG thấp hơn khoảng 27% đối với những người không mang (P=2,5×10−21), nồng độ LDL-C ở những người mang biến thể thấp hơn khoảng 9% đối với người không mang đột biến (P=2,8×10−5), và nồng độ HDL-C ở người mang đột biến thấp hơn 4% đối với người

không mang đột biến (P=0,02) Từ đó cho thấy các biến thể LOF của gene ANGPTL3

có tiềm năng làm giảm nguy cơ bệnh lý tim mạch

Nghiên cứu của Yang và các cộng sự (2019) nghiên cứu thực hiện sàng lọc trên 80 bệnh nhân FH và 77 người lành bệnh, nghiên cứu thực hiện xác định đột biến trên

6 gene có khả năng gây ra bệnh FH là: LDLR, APOB100, PCSK9, ABCG5, ABCG8, và ANGPTL3 Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác

thực các đột biến có tiềm năng gây bệnh sau khi các đột biến này được xác định bởi phương pháp NGS Nhóm đã xác định được 41 biến thể trong 28 bệnh nhân, trong đó

có 2 đột biến gene ANGPTL3: một được pháp hiện ở vùng exon c.A956G: p.K319R,

đột biến còn lại được phát hiện ở vùng không dịch mã c.*249G>A Đột biến Nhóm

nghiên cứu thực hiện khảo sát in silico về sự ảnh hưởng của đột biến K319R của

ANGPTL3 nhằm xem xét sự ảnh hưởng của đột biến này lên bệnh FH, kết quả cho thấy đột biến K319R ảnh hưởng lên sự biểu hiện của ANGPTL3 và quá trính chuyển hóa cholesterol

Nghiên cứu của Aghasizadeh và các cộng sự (2021) thực hiện giải trình tự của 503 mục tiêu với 350 mục tiêu khoẻ mạnh và 153 mục tiêu mắc bệnh lý tim mạch, nhóm thực hiện giải trình tự Sanger và sử dụng phương pháp PCR để thu nhận được biến thể rs1748195, sau đó được thực hiện khảo sát mối tương quan giữa biến thể này và nồng độ HDL trong máu thông qua các phần mềm SPSS version 20 (IBM Corp, 2011) và MedCalc (version 16.8- Bvba) Kết quả cho thấy biến thể rs1748195 có mối tương quan ấn tượng trong nhóm mang bệnh lý tim mạch (p=0,02) Hơn nữa, cá thể

mang kiểu gene GG của biến thể rs1748195 giúp làm giảm nguy của bệnh lý tim mạch (OR = 0,49; 95% CI = 0,24–0,98; p = 004) khi so sánh với kiểu gene GG trong nhóm chứng

4.5 Tình hình nghiên cứu về gene ANGPTL3 tại Việt Nam

Theo thống kê của Hội Phòng chống tai biến mạch máu não Việt Nam, có 200.000 người Việt đột quỵ mỗi năm do rối loạn mỡ máu Tại Việt Nam, cứ 10 người trưởng thành thì có 3 người mắc bệnh cholesterol cao trong máu và có hơn 50% người mắc bệnh cao cholesterol là phụ nữ ở độ tuổi 50 – 65 tuổi Nghiên cứu của Hoang Thi và các cộng sự (2022) nói về sự tương quan giữa ANGPTL3 và bệnh tiểu đường với kết quả nghiên cứu thu nhận được thông qua việc xây dựng nghiên cứu ca chứng (case study) với 98 người lành bệnh và 103 người mắc bệnh tiểu đường, đã cho thấy nhóm mắc bệnh có nồng độ ANGPTL3 thấp hơn nhóm chứng với sự khác biệt có ý nghĩa là p < 0,05 Tuy nhiên các nghiên cứu về phân tích tính chất đột biến ở gene

AGNPTL3 vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng Trong phạm vi thực hiện Khóa luận

tốt nghiệp, nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện khảo sát đột biến trên gene

ANGPTL3 bằng phương pháp phân tích tổng hợp kết hợp với thực nghiệm nhằm làm

rõ hơn các đột biến trên gene ANGPTL3 liên quan đến các bệnh lý cao lipid trong

máu

5 Phương pháp phân tích tổng hợp

Mục tiêu của hệ thống tổng quan (System reviews) là làm giảm các thiên kiến bằng cách xác định, thẩm định và tổng hợp những nghiên cứu có liên quan (Rodseth

et al., 2016) Việc xây dựng hệ thống tổng quan là bước cơ bản để tổng hợp các ước

lượng và ảnh hưởng của nghiên cứu, và quá trình này được gọi là phân tích tổng hợp

(meta-analysis) (Hernandez et al., 2020) Phân tích tổng hợp là một quy trình thống

kê tích hợp các kết quả từ các nghiên cứu độc lập, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu thực chứng Phân tích tổng hợp được sử dụng để khảo sát, tổng hợp và phân tích tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gene mục tiêu và con đường chuyển hóa cholesterol trong máu, xác định tương quan giữa tính chất đột biến trên gene mục tiêu và nguy cơ mắc bệnh cao lipid, cụ thể là nguyên nhân nguyên phát, thông qua chỉ số

Proportion với khoảng tin cậy 95% (Confident interval, CI) và đồ thị Forrest plot Phân tích tổng hợp có nhiều lợi thế hơn những nghiên cứu phát hiện ảnh hưởng của yếu tố can thiệp lên kết quả, thông qua việc cho phép truy cập để xem xét các yếu tố khác nhau (sự thay đổi quần thể nghiên cứu, đối chứng, các yếu tố can thiệp, kết

quả, ) như thế nào giữa các nghiên cứu với nhau (Hernandez et al., 2020)

Chỉ số Proportion thường được sử dụng để tổng hợp kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ của chủ thể trong một nhóm tham gia nghiên cứu Ví dụ như, xác định tỷ lệ xuất hiện đột biến trong gene mục tiêu gây ra bệnh tim mạch Chỉ số Proprotion được biểu diễn dưới dạng phần trăm Chỉ số này khi được đưa vào phân tích tổng hợp theo tỷ lệ giả định tính đồng nhất và ước tính trung bình trên nhiều quần thể khác nhau có thể ít được sử dụng trong lâm sàng Tuy nhiên để đánh giá hệ thống mục tiêu về các ca bệnh trên toàn cầu thì chỉ số Proportion vẫn phù hợp và hiệu quả

Độ tin cậy của kết quả là một yếu tốt quan trọng để đánh giá tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả tổng hợp, có thể được đánh giá thông qua việc sử dụng các giá trị thống kê như khoảng tin cậy (Cònidence interval, CI) và giá trị P (P-value) Khoảng tin cậy càng ngắn thì kết quả càng đáng tin cậy, và với cỡ mẫu càng lớn thì khoảng tin cậy càng ngắn đi Trong một số trường hợp, trung bình quần thể sẽ nằm chính giữa khoảng tin cậy, hoặc trung bình quần thể sẽ nằm trong khoảng tin cậy, tuy nhiên không đảm bảo chắc chắn rằng là trung bình quần thể luôn luôn thuộc khoảng tin cậy được tính ra từ mẫu nghiên cứu này

Trong phân tích tổng hợp có 2 mô hình chính được thực hiện chủ yếu là: mô hình ảnh hưởng bất biến (fixed) và mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random) cho một tiêu chí nhị phân với khoảng tin cậy 95% (CI) Tiêu chí lựa chọn mô hình phân

tích tổng hợp (Hernandez et al., 2020) dựa vào chỉ số I2 (inconsistency) phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong dữ liệu:

− I2 < 50% và P ≥ 0,1: phân tích tổng hợp theo mô hình ảnh hưởng bất biến − I2 ≥ 50% và P < 0,1: phân tích tổng hợp theo mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên

Các bước xây dựng hệ thống tổng quan phân tích tổng hợp được dựa theo sơ đồ của PRISMA (Hình phụ lục 1):

(1) Xây dựng câu hỏi nghiên cứu, đưa ra những phác thảo sơ bộ và đặt ra những tiêu chí nhằm lựa chọn và loại trừ các kết quả nghiên cứu

(2) Tìm kiếm sơ lược các nghiên cứu phù hợp với các tiêu chí đã đề ra từ các cơ sở dữ liệu lớn và phổ biến trên thế giới

(3) Lựa chọn và sàng lọc những nghiên cứu từ tiêu đề, phần tóm tắt và có thể đi sâu hơn vào nội dung của nghiên cứu

(4) Chọn lọc thông tin, xây dựng hệ thống tổng quan, thu thập dữ liệu từ các nghiên cứu

(5) Đánh giá độ tin cậy của dữ liệu và chiết xuất dữ liệu

(6) Xem xét các yếu tố không đồng nhất của các biến số trong bộ dữ liệu (7) Xây dựng mô hình bất biến hoặc ngẫu nhiên để xác định chỉ số Proportion

với độ tin cập 95% (p<0,05) và biẻu thị kết quả thông qua biểu đồ Forrest plot

(8) Đánh giá thiên lệch công bố qua đồ thị Funnel

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu nghiên cứu

- ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) - Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) - Ensemble (http://asia.ensembl.org/index.html) - HGVS (https://www.hgvs.org/)

- Pubmed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) - Google Scolar (https://scholar.google.com/)

- IDT Oligo analyzer (https://www.idtdna.com/calc/analyzer)

1.3 Bộ mẫu bệnh phẩm

Bộ mẫu bệnh phẩm máu được thu thập ở thành phố Hồ Chí Minh (kế thừa từ nghiên cứu khoa học cấp Bộ của giảng viên Trương Kim Phượng, mã số đề tài MBS-2018-08): mẫu máu (M1-M7) của các người bệnh có chỉ số cao cholesterol bất thường (Bảng phụ lục 1) Các mẫu bệnh phẩm máu được sử dụng thực hiện tách chiết và thực

hiện phản ứng PCR, giải trình tự phát hiện đột biến trên gene mục tiêu ANGPTL3

trên 7 mẫu có chỉ số lipid trong máu cao (ký hệu: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7)

1.4 Hóa chất và Thiết bị

1.4.1 Tách chiết DNA

Nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện phương pháp tách chiết DNA bằng cột silica của hãng ABT (TopPURE® BLOOD DNA EXTRACTION KIT, HI-132) Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc DNA mang điện tích âm được đính chọn lọc lên trên

màng silica được bao phủ với các ion mang điện tích dương Nhờ vào việc DNA có thể bám dính vào màng silica, do đó, phần còn lại chỉ cần rửa trôi các tế bào đã bị phá vỡ và tách DNA bám dính trên màng silica bằng cách rửa giải bằng nước cất hoặc

các dung dịch đệm (Dairawan et al., 2020)

*Thiết bị:

- Bể ổn nhiệt - Máy vortex - Tủ lạnh

- Máy ly tâm lạnh

*Hóa chất:

- PBS (Phosphate-buffered saline) - Proteinase K

- CL

- Ethanol 96% - WB1

- WB2 - EB

1.4.3 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng trình tự gene mục tiêu ANGPTL3, sau đó

thu nhận sản phẩm và sẽ được đem đi giải trình tự

*Thiết bị:

- Máy PCR - Tủ hút

*Hóa chất:

- Master mix; - Mồi xuôi - Mồi ngược - Mẫu DNA - Nước cất

1.4.4 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di dựa vào điện tích âm của DNA, do đó trong môi trường điện trường các DNA sẽ di chuyển dần về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển của DNA dựa vào khối lượng và cấu trúc của chúng

*Thiết bị

- Bồn điện di - Máy đọc gel

*Hóa chất:

- Gel Agarose - 20X TAE Buffer - Gel Red

- Loading dye 6X

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Khai thác dữ liệu hệ thống tổng quan khoa học

Khai thác dữ liệu khoa học dựa trên các nguồn dữ liệu trên NCBI, Google Scholar, tạp chí Nature với các từ khoá: ANGPTL3, mutation, variants, hyperlipidemia, dyslipidemia, được cập nhật đến tháng 3/2023 Thu thập các thông

tin từ các nghiên cứu thực nghiệm về gene mục tiêu cũng như ảnh hưởng lên con đường chuyển hóa cholesterol, lipid như: đặc điểm phân tử của gene mục tiêu, các dạng biến thể xuất hiện trên gene mục tiêu, ảnh hưởng của các biến thể này lên các bệnh lý như tim mạch, cao lipid máu, đột biến nổi trội gây mất chức năng, cấu trúc của gene mục tiêu,…

2.2 Phân tích tổng hợp

Phương pháp phân tích tổng hợp được sử dụng để khảo sát tỷ lệ xuất hiện đột biến của gene mục tiêu ảnh hưởng đến các bệnh lý chuyển hóa lipid trong máu Dựa vào phân tích chỉ số Proportion với độ tin cậy 95%, phân tích tổng hợp giúp làm rõ làm rõ các đặc điểm phẩn tử của gene đến các bệnh lý chuyển hóa lipid máu trong quần thể người Dựa vào nghiên cứu của Basu và các cộng sự (2017), phương pháp phân tích tổng hợp bao gồm các bước chính sau:

Bước 1: Xây dựng ý tưởng nghiên cứu

Bệnh tim mạch ảnh hưởng như thế nào đến đời sống con người? Nguyên nhân gây ra bệnh tim mạch có sự ảnh hưởng của bệnh cao lipid trong máu Đột biến gene

gây ra bệnh cao lipid trong máu như thế nào? Gene ANGPTL3 và đột biến của nó ảnh

hưởng như thế nào đến bệnh cao lipid trong máu? Tỷ lệ xuất hiện đột biến gene

ANGPTL3 trên bệnh cao lipid trong máu hoặc các bệnh có sự ảnh hưởng rõ rệt bởi

bệnh cao lipid trong máu Sự tương quan giữa các đột biến gene ANGPTL3 đến bệnh

cao lipid trong máu trong quần thể người

Bước 2: Tìm kiếm và khai thác hệ thống cơ sở dữ liệu

Xác định các từ khóa ANGPTL3 mutation, variants, LOF ANGPTL3 gene,

hyperlipidemia, dyslipidemia, ANGPTL3 inhibitor, … được sử dụng trong khai thác dữ liệu trên các cơ sở dữ liệu NCBI, PubMed, và Google Scholar được cập nhật đến tháng 3/2023 để tìm kiếm và thu thập các công bố khoa học phù hợp với các tiêu chí đề ra

Bước 3: Tiêu chí lựa chọn để trích xuất dữ liệu và phân tích tổng hợp

Tiêu chí lựa chọn các nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm về gene ANGPTL3

(bệnh chứng, đoàn hệ), loại bệnh – mẫu bệnh phẩm (mẫu máu, …), tổng số mẫu

bệnh/đối chứng và số mẫu đột biến, phương pháp phân tích đột biến, dạng đột biến/exon mang đột biến, năm nghiên cứu, …

Bước 4: Sử dụng phương pháp phân tích tổng hợp phù hợp

Phân tích chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến gene ANGPTL3 ở các nhóm

bệnh cao lipid trong máu, phân tích trên nhóm người bệnh ở các châu lục khác nhau, phân tích trên từng exon của gene mục tiêu

Bước 5: Sử dụng phần mềm phân tích tổng hợp phù hợp

Nghiên cứu sử dụng phần mềm MedCalc® phiên bản 20.218 để thực hiện phân

tích chỉ số Proprotion của gene ANGPTL3 ở người bệnh cao lipid trong máu Bước 6: Phân tích ảnh hưởng của bộ dữ liệu

Lựa chọn mô hình phân tích mức độ ảnh hưởng bằng cách thực hiện xác định tỷ lệ bất đồng nhất của bộ dữ liệu I2 nhằm xác định mức độ ảnh hưởng của từng dữ liệu (cỡ mẫu, số lượng đột biến, …)

Bước 7: Phân tích tổng hợp

Bước 8: Trích xuất lết quả phân tích tổng hợp dưới dạng bảng số liệu và đồ thị

2.3 Khảo sát in silico

Tiến hành thu thập trình tự nucleotide của gene ANGPTL3 từ Genebank để làm

trình tự tham chiếu phục vụ cho việc khảo sát mồi

Thực hiện khảo sát các tính chất vật lý của cặp mồi dựa vào IDT Oligo analyzer nhằm khảo các các thông số như: %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc dị bắt cặp, cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự bắt cặp, …

Xem xét độ đặc hiệu của cặp mồi nằm trên vùng mục tiêu, độ tương đồng, bằng các phần mềm như BLAST và Annhyb

- Thêm vào 200 µl PBS và tiếp tục cho thêm vào 20 µl Proteinase K Sau đó vortex đều và nhẹ, ủ ở nhiệt độ 60oC cho đến khi ly giải hoàn toàn

- Thêm 200 µl Ethanol (96-100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 ml Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Thêm 500 µl WB1 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Thêm 500 µl WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng /1 phút

- Chuyển cột sang tube 1,5ml mới Thêm 50 µl EB buffer và ủ hai phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới - DNA thu được được bảo quản ở nhiệt độ -20 oC

2.4.2 Đo mật độ quang *Quy trình thực nghiệm

- Thực hiện pha loãng DNA (d: độ pha loãng 20 lần)

- Sau đó, thu huyền dịch chuyển vào cuvette Tiến hành đó OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm, thu nhận thông số nồng độ DNA và chỉ số A260/A280

2.4.3 Phản ứng PCR và giải trình tự Sanger *Quy trình thực hiện:

Thực hiện phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 µl Thành phần và chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng II.1 và bảng II.2

Bảng III.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl)

Master mix 25 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1

H2O 22